Enzimología – Inmovilización de enzimas

1

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Como producto del avance de la biotecnología y su aplicación en procesos industriales para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o alimentarios se ha recurrido al uso de enzimas. Éstas presentan grandes ventajas sobre catalizadores no biológicos, entre ellas gran actividad catalítica, a temperatura ambiente y presión atmosférica, y gran especificidad de sustrato. La inestabilidad que presentan en los procesos químicos industriales y la dificultad de poder separarse de sustratos y productos, todos solubles en agua, hacen que las enzimas no se puedan reutilizar. Como alternativa se ideó el método de inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer factible que un proceso biotecnológico sea rentable. Se denomina una “enzima inmovilizada” aquella que está físicamente localizada en una región definida del espacio, manteniendo su actividad catalítica y pudiendo ser usada repetida y continuamente. Las ventajas del proceso: a) aumento de la estabilidad b) reutilización de los componentes c) la enzima no permanece en la solución al finalizar el tratamiento y d) diseño de reactores adaptables para cada enzima inmovilizada, permitiendo un reciclado de producto que aumente su pureza. Básicamente un reactor comprende un recipiente o tanque con agitación con las enzimas inmovilizadas, una vía de entrada para sustrato y otra de salida para el producto. Las desventajas a) alteración de la enzima respecto de su estado nativo b) heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas proteínas inmovilizadas c) pérdida de actividad d) el sistema puede ser más caro que la enzima nativa.

producto

Tanque agitación

con

sustrato

Métodos de inmovilización Retención física

Atrapamiento

Microencapsulación

Unión química

Inclusión en membranas

Reactores de membrana

Unión a soportes Reticulado

Adsorción

Iónica

Quelación

Covalente

Según se observa en el gráfico los métodos de inmovilización se pueden clasificar en 2 grandes categorías: 1. Retención física. 2. Unión química.

Enzimología – Inmovilización de enzimas

2

1. Retención física: 1.a. Atrapamiento: es la retención de la enzima en cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida por prepolímeros entrecruzables o polímeros de tipo poliacrilamida, colágeno, carraginato o resinas de poliuretano. Una suspensión de la enzima a inmovilizar se la incluye en una solución del monómero. Se inicia la polimerización con cambio de temperatura o adición de reactivo químico. El atrapamiento pueden ser en geles o en fibras, más resistentes éstas últimas. No hay alteración estructural de la enzima pero hay que vigilar el proceso de polimerización. 1.b. Inclusión en membranas 1.b.a. Microencapsulación: las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de sustratos y productos. Las microcápsulas tiene diámetros de 1 a 100 μm permitiendo encapsular enzimas, otro tipo de biomoléculas y células. 2.b.b. Reactores de membrana: se emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato y no permeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa al reactor. La enzima se adsorbe previamente sobre la membrana. 2. Unión química 2.a. Unión a soportes: son los más utilizados y de los que se tiene mayor información. Se han utilizado gran variedad de soportes. Estos deben cumplir ciertas normas para ser empleados: aumentar la interacción con el sustrato, disminuir la inhibición por producto, cambiar el pH aparente óptimo hasta el valor deseado, frenar el crecimiento microbiano y ser fácilmente recuperable para su reutilización. Deberá ser estable en solución y rígido mecánicamente en procesos de flujo continuo. Cuando la enzima inmovilizada se utilice en aplicaciones médicas no deberá provocar reacciones inmunes o de coagulación. Los soportes pueden ser a) inorgánicos naturales (arcilla, bentonita, piedra pómez) o inorgánicos manufacturados (óxido de metales, vidrios de tamaño de poro controlado, cerámicas) y b) orgánicos naturales (polisacáridos o proteínas fibrosas) o sintéticos (poliolefinas, polímeros acrílicos, poliamidas). Las enzimas se pueden unir por adsorción, unión iónica, metálica o por unión covalente. 2.a.a. Adsorción: la enzima se une por fuerzas de van der Waals, interacciones hidrofóbicas y por puentes de hidrógeno. Se deben controlar pH del medio, fuerza iónica y diámetro del poro. Tiene la ventaja de la preparación sencilla, bajo costo, no cambia la especificidad enzimática y los derivados son estables con baja humedad. Desventajas: unión débil al soporte (afectadas por concentraciones elevadas de sustrato, cambios de pH y de fuerza iónica) y poco estables mecánicamente. 2.a.b. Unión iónica: se utilizan intercambiadores orgánicos de iones (DEAE, CM, etc) e inorgánicos (sílice). Tiene las mismas desventajas que el método anterior. 2.a.c. Quelación o unión metálica: utiliza metales de transición, normalmente titanio, como una forma de activar la superficie del soporte. La enzima se acopla a este soporte. 2.a.d. Unión covalente: es el método de inmovilización más utilizado en la industria. El procedimiento de inmovilización consiste en 1) la activación de los grupos químicos del soporte 2) los grupos activados de los soportes reaccionan con aminoácidos de la enzima con la formación de enlaces peptídicos, de arilación, de alquilación, de formación de enlace diazo, base de Schiff o de intercambio tiol-disulfuro. Los aminoácidos de las proteínas más empleados para la formación de enlaces con el soporte son Lys, CysSH, Tyr, Trp. Ventajas: al tener su estructura terciaria estabilizada poseen mayor resistencia a la inactivación. Desventajas: se puede alterar el sitio activo. Se usan bloqueadores del sitio activo y luego se procede a la inmovilización. 2.b. Reticulado: también denominado entrecruzamiento o cross-linking. Utiliza reactivos bifuncionales (dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bis diazonio) que originan uniones intermoleculares irreversibles entre las moléculas de enzima, insolubles en agua pero que no necesitan el uso de soportes adicionales. Son capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

Enzimología – Inmovilización de enzimas

3

El co-reticulado es el entrecruzamiento de la enzima con proteínas sin actividad enzimática, ricas en Lys (albúmina bovina). Impide la pérdida de actividad por efectos de difusión del sustrato. Uno de los métodos más novedosos en entrecruzamiento consiste en la cristalizacion de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído. La propia enzima actúa como su soporte. Estos cristales soportan altas temperaturas, pHs extremos y la acción de proteasas. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN La inmovilización altera el comportamiento de las enzimas. Generalmente se incrementa la estabilidad conformacional de las mismas (métodos de uniones de tipo covalente y aun más, con la adición de grupos bifuncionales), se aumenta la protección frente a proteasas y se evita la agregación intermolecular. Se produce una alteración del microentorno de la enzima debido a su interacción con el soporte, haciendo por ejemplo que enzimas sensibles al oxígeno, como nitrogenasas ó hidrogenasas, vean favorecida su actividad cuando están inmovilizadas, debido a que la fuerza iónica que tiene el entorno disminuye la concentración efectiva de oxígeno en el medio. Pueden perder total o parcialmente la actividad por interacciones con el soporte, por impedimento del paso del sustrato al sitio activo, por interacción con grupos cargados del soporte o por cambios conformacionales que den formas inactivas. Otros cambios que afectan la actividad enzimática, aumentándola o disminuyéndola, son producidos por efectos de difusión del sustrato al sitio activo (por insolubilidad del soporte en el medio de reacción, por impedimentos estéricos o por efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte) y por efectos en el microentorno enzima-soporte. APLICACIONES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS -Biosensores: son de gran utilidad en el campo del diagnóstico clínico. Se determinan niveles sanguíneos de glucosa (electrodo de D-glucosa. Ver más adelante), lactato, urea, colesterol, creatinina y ácido úrico. Hay biosensores para control de calidad en la industria alimentaria, para la determinación de contaminación microbiana o detección de polución ambiental, presencia de residuos tóxicos, pesticidas, herbicidas o microorganismos. Analito

Otros compuestos

Enzima inmovilizada Superficie de inmovilización

Esquema de biosensor Traductor

Amplificador

Resultado La superficie externa de la capa de enzima está expuesta a la solución a analizar. El sustrato se difunde en la capa de enzima y se transforma en un compuesto electroactivo que se mide por el traductor.

Electrodo de glucosa (Updike y Hicks, 1967): la D-glucosa oxidasa se inmoviliza en un gel de poliacrilamida y se mantiene alrededor de un electrodo de oxígeno mediante un trozo de acetato de celulosa. La enzima inmovilizada cataliza la reacción: β-D-glucosa + O2 D-glucono-1,5-lactona + H2O2

Enzimología – Inmovilización de enzimas

4

El electrodo de oxígeno mide la pérdida de oxígeno de la solución que se produce a una velocidad que depende de la concentración de D-glucosa presente. Se utilizan también electrodos que miden el H2O2 producido. Otras aplicaciones: - médicas: en enfermedades causadas por alteración o carencia de una determinada enzima. La entrega eficaz de la enzima al tejido adecuado tiene cierto éxito mediante el uso de liposomas. Se utilizan enzimas con actividad antitumoral: la L-asparaginasa se inmoviliza en un hemodializador y captura a la Asn circulante, necesaria para el desarrollo de leucemias y cánceres diseminados. La tripsina o la colagenasa se utilizan para eliminar tejidos muertos de heridas, quemaduras, úlceras, etc. Estas enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o fibras que formarán parte del tejido de apósitos y vendas. - farmacéuticas: obtención de antibióticos beta lactámicos y fármacos ópticamente puros. - alimentarias: en hidrólisis de proteínas, de hidratos de carbono, en las mejoras de las características organolépticas de ciertos alimentos, en la obtención de edulcorantes y aditivos alimentarios. - químicas: síntesis de acrilamida, péptidos, fragancias e insecticidas, tratamiento de aguas residuales.

Enzimología – Inmovilización de enzimas

5

APLICACIONES CLÍNICAS DE ENZIMAS USO Y DETERMINACIÓN DE ENZIMAS EN LABORATORIOS CLÍNICOS Las enzimas como reactivos ofrecen las ventajas sobre los procedimientos químicos de poseer mayor eficacia catalítica y especificidad. Esto hace que se pueda realizar un análisis rápido, reproducible y adaptable fácilmente a sistemas automatizados de determinadas sustancias presentes en medios complejos como sangre, suero, plasma u orina sin necesidad de etapas previas de purificación. Las enzimas se miden en los fluidos corporales como ayuda al diagnóstico y también para seguir los efectos del tratamiento médico. Entre otras actividades en el laboratorio clínico se realiza 1) la determinación de actividades enzimáticas y 2) el dosaje de sustratos por enzimas específicas. 1) Medida de enzimas: las enzimas se encuentran en alta y baja concentración en sangre. Las que poseen alta concentración son aquellas que tienen un rol específico intravascular. Las de baja concentración no cumplen función en la sangre. Cuando hay una injuria en un tejido u órgano, por un cambio en la permeabilidad de la membrana celular o por muerte celular, pueden pasar enzimas a la circulación. Se observa un aumento de la actividad y luego un decaimiento, dependiendo de su estabilidad y de la capacidad de captación del sistema retículoendotelial. Debido a que el metabolismo de los órganos es similar, encontramos pocas enzimas órganoespecíficas. Entre ellas tenemos: -Alcohol deshidrogenasa en hígado. -Fosfatasa ácida en próstata. Otras se encuentran en distintas proporciones en cada órgano o tejido. En el siguiente gráfico vemos la variación sanguínea de distintas enzimas frente a una injuria cardíaca. CPK

Actividad

CPK Creatinfosfoquinasa LDH Lactato deshidrogenasa TGO Transaminasa glutámico- oxalacética HBDH α-hidroxibutirato deshidrogenasa

TGO

LDH

HBDH

Normal

1

3

6

Días

Por otro lado tenemos las llamadas isoenzimas. Éstas catalizan la misma reacción y están en distintos órganos o tejidos. Se diferencian entre sí por su desplazamiento electroforético. Así por ejemplo tenemos la creatinfosfoquinasa (CPK). Dímero con subunidades M y B. Tiene tres isoenzimas: CPK1 (BB)(cerebro), CPK2 (MB)(miocardio) y CPK3 (MM)(músculo esquelético). En un infarto cardíaco la CPK2 tiene su máxima actividad a las 24 hs de producido. Comienza a decaer y toma importancia la CPK3 a las 48 hs, para también decaer. La enzima lactato deshidrogenasa es un tetrámero con subunidades H y M. Se han determinado 5 isoenzimas que se encuentran en miocardio, hematíes, cerebro, riñón, hígado y músculo esquelético, todas ellas con distinto porcentaje de subunidades. La fosfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliza los monoésteres del ácido fosfórico en medio alcalino. Tiene distintas isoenzimas, una (o dos) hepática, una enteral y otra ósea, todas ellas diferenciables por su corrida electroforética. Se han encontrado otras variantes, una placentaria y otra que aparece en procesos cancerosos.

Enzimología – Inmovilización de enzimas

6

La actividad enzimática desconocida se mide normalmente mediante análisis cinéticos o continuos y la cantidad de enzima debe ser la limitante de la velocidad. Un buen ensayo debe comprender temperatura y pH óptimos para la reacción, fuerza iónica adecuada y también niveles saturantes de sustrato, cosustratos y cofactores. De esta forma se asegura que la reacción sea de orden 0 y que la velocidad o actividad hallada dependa exclusivamente de la concentración de enzima presente. (cc de sustrato > 10 a 20 Km). Hay enzimas que utilizan NAD, NADP o FAD como cofactores. Estas enzimas son sencillas de medir debido a las propiedades ópticas de aquellos. Muchas enzimas son difíciles de analizar, pero en algunos casos la adición de otras enzimas (enzimas acopladas) que usan estos cofactores simplifica su medida. La aspartato aminotransferasa (AST o TGO) fue la primer enzima medida usando una enzima acoplada, la malato deshidrogenasa (MDH). La reacción es la siguiente: AST

2-oxoglutarato + L-aspartato

L-glutamato + oxalacetato MDH

+

L-malato + NAD+

oxalacetato + NADH + H

El oxalacetato formado reacciona según se va produciendo en el proceso catalizado por la MDH, por lo que la medida de la velocidad de conversión de NADH en NAD+ constituye un análisis preciso para la AST. La reacción catalizada por la MDH se produce en condiciones desfavorables ya que la concentración de uno de los sustratos es virtualmente cero, habiendo un tiempo de latencia hasta que llegue el oxalacetato a una concentración óptima para la reacción. Para solucionar esto se debe tratar de que la actividad de la enzima acoplada sea 40 veces mayor que la enzima a ensayar. El NADH debe tener una concentración inicial de por lo menos 0,2 mmol/l para que la absorbancia inicial a 340 nm sea de 1,26 para 1 cm de recorrido. Tanto la fase de latencia como las medidas de velocidad deberían completarse antes de que la reacción se desviara significativamente de la velocidad real por agotamiento del sustrato. 2) Medida de sustratos: los sustratos se miden en la sangre, plasma, suero y orina para ayudar al diagnóstico y control de muchas enfermedades, siendo esencial recoger datos de la población sana a fin de poder compararlos. Existen 2 métodos para el dosaje de sustratos: método de equilibrio y método cinético. -Método de equilibrio Consideremos medir al sustrato S S+C P +Q C es correactante o coenzima y P y Q los productos de la reacción catalizada por la enzima. Cuanto mayor sea la concentración de S y cuanto más elevada sea la Keq, más preciso será su dosaje. Una Keq baja podría traer problemas de insolubilidad de C, inhibición de la enzima o elevada absorbancia inicial. S

Para este método se debe calcular el tiempo para que una reacción alcance el equilibrio (parte b de la curva de reacción) y de esta manera estimar la concentración de sustrato incógnita.

a vo

b

tiempo Esto se logra integrando la ecuación de Michaelis- Menten:

t

=

2,3 Km log So + (So – St) V St V

Enzimología – Inmovilización de enzimas

7

donde t es el tiempo de reacción, So es la concentración inicial de sustrato y St es la concentración a tiempo t. Si se acepta para el cálculo que una conversión del 99 % de S en P es adecuada, log So = 2 St y si So no es muy distinta del Km, podemos aproximar a que t = 5,6 Km. V Si So > Km el tiempo aumentará considerablemente, así como los potenciales problemas causados por la formación de producto. La presencia de activadores o inhibidores reducirán o aumentarán el cociente, respectivamente. -Método cinético Es aquel en que los datos se obtienen cuando la concentración de S varía en función del tiempo, siendo S el limitante de la velocidad. La introducción de analizadores cinéticos permitió seguir el progreso de la reacción, generalmente a un número de intervalos fijos, controlando la linealidad de la curva y calculando la velocidad inicial (vo , parte a de la curva). La sensibilidad para detectar la concentración de sustrato disminuye claramente cuando So > Km. Por lo tanto el límite superior de uso de los métodos cinéticos es So = Km. Si la concentración de S a dosar es Km/20, la desviación de la linealidad es inferior al 3,3 %. Por todo esto es necesario obtener una curva de calibración en un rango de concentración de sustrato para tener en cuenta la no linealidad de la gráfica.

Los indicadores en análisis clínicos rutinarios son el sistema a)NAD(P)- NAD(P)H por sus propiedades ópticas a 340 nm y b) la formación de H2O2 a partir de glucosa (o colesterol o ácido úrico o triacilglicéridos). Al H2O2 formado se lo hace reaccionar con un cromóforo mediante la enzima peroxidasa, dando un producto que absorbe en el visible (505 nm). Ej glucosa + O2 + H2O H2O2

+ cromóforo

Glucosa oxidasa Peroxidasa

Ac glucónico + H2O2 colorante

+ H2O

USO DE ENZIMAS INMOVILIZADAS PARA MEDIR CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO. a. Tubos reactores Normalmente se utilizan tubos de nylon de 1 mm de diámetro impregnados internamente con la enzima que se halla unida a éstos de forma covalente. Este reactor está adaptado a sistema de flujo continuo en analizadores clínicos que dosan la concentración de sustrato por colorimetría. b. Sondas bioanalíticas (bioensores, vistos anteriormente) c. Reactivos en fase sólida Free et al. (1957) desarrollaron el sistema que se utilizó para la medida de concentración de glucosa en orina. Consistía en una tira de papel (celulosa) sobre la cual se adsorbía el sistema enzimático (glucosa oxidasa, peroxidasa y un cromógeno). El papel cambiaba de color cuando se lo embebía en una solución con glucosa. Posteriormente se fue perfeccionando el sistema y en la actualidad se pueden utilizar enzimas y cromógenos apropiados impregnados en un papel de filtro montados sobre una tira plástica para medir cuali y cuantitativamente la presencia de glucosa en sangre y orina, así como otros compuestos, como colesterol, ácido úrico, triacilglicéridos, urea, creatinina. Se compara el color frente a una escala cromática (visualmente o a través de un microprocesador) y se estima la concentración del sustrato. Son métodos rápidos que sirven para la urgencia clínica. Los datos exactos se los obtienen en el laboratorio. Las enzimas preparados en forma de reactivo en fase sólida son desechables.

Enzimología – Inmovilización de enzimas

8

ANÁLISIS INMUNOENZIMÁTICO Se utiliza para el dosaje de proteínas del suero sanguíneo, factores de coagulación de la sangre, inmunoglobulinas, anticuerpos contra hormonas y un amplio rango de drogas, virus, bacterias y parásitos. El fundamento del método original usando radioisótopos (Radioinmunoensayo- RIA) es el siguiente: Anticuerpo (Ac) + Antígeno (Ag) + Antígeno marcado (Ag*)

Ac—Ag + Ac—Ag*

Las moléculas de Ag (marcado y no marcado) libres compiten por un número fijo y limitado de puntos de unión específicos en las moléculas de anticuerpo. Después de un tiempo de incubación el antígeno libre y el ligado se separan y se los mide frente a una curva patrón. El método tiene muchas desventajas de manipuleo, de vida útil de reactivos y de costo, por lo que se ideó un método alternativo usando marcadores enzimáticos. Las enzimas marcadoras se unen covalentemente a antígenos o anticuerpos y a haptenos (moléculas pequeñas (drogas o esteroides) que no son usualmente inmunogénicas, pero que pueden serlo si son acopladas a una proteína transportadora más grande), mediante diversas reacciones químicas. (Métodos del glutaraldehído, del periodato, de la maleimida, del anhídrido, de la carbodiimida, del imidato bifuncional, etc). Siguiendo el ejemplo anterior, a la enzima unida al antígeno (que reaccionó con el anticuerpo) se le mide la actividad y se estima la concentración del anticuerpo presente. Estos marcadores enzimáticos tienen la ventaja del no uso de radiación, son baratos, el producto marcado tiene una vida útil muy larga y tiene la posibilidad de automatización. Tienen la desventaja que constituyentes del plasma pueden influir en el dosaje de la actividad enzimática.

En la práctica se utilizan soportes en fase sólida, fabricados con distintos plásticos (polivinilos, poliestirenos) que tienen la particularidad de adsorber capas monomoleculares de proteínas sobre su superficie. Si bien algunas moléculas adsorbidas pueden perder algunas determinantes antigénicas, otras quedan inalteradas y son las que van a reaccionar con su respectivo anticuerpo. La presencia del anticuerpo unido al antígeno adsorbido, es detectado por inmunoglobulinas anti-anticuerpo, unidas a enzimas. Antígeno adsorbido a soporte plástico

Anticuerpos

+

Inmunoglobulinas anti-anticuerpo unidas a enzimas

+ Representación de inmunoensayo en fase sólida

Luego de varios lavados, en donde se eliminan las inmunoglobulinas-enzima que no se unieron, se hacen reaccionar a las enzimas unidas al soporte (Complejo Ag-Ac-AntiAc-Enzima) con su sustrato correspondiente (revelado). Frente a curvas de calibración previamente realizadas se puede estimar, por la actividad enzimática hallada, la concentración de Ac

Enzimología – Inmovilización de enzimas

9

buscada. Estos tipos de análisis se denominan ELISA “enzyme linked immunoabsorbent assay”, habiendo muchas variantes respecto del esquema original. La mayoría de las enzimas utilizadas como marcadores son de origen bacteriano o vegetal. Las más usadas son: peroxidasa: glicoproteína que puede ser conjugada por el método del periodato, fosfatasa alcalina de hígado de ternera, ureasa, β galactosidasa y lisozima.