Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
01-118
SELECCIÓN DE CONSORCIOS BACTERIANOS NATURALES PARA LA PRODUCCIÓN DE HIDRÓGENO BIOLÓGICO Verónica Laura Martínez(1), Rodrigo Enrique García(1), Gustavo A. Curutchet(2)(3), Juan Isidro Franco(4) (1) Dirección General de Investigación y Desarrollo (DGID), Armada Argentina. Laprida 201, Vicente López, Buenos Aires, Argentina,
[email protected] (2) Centro de Estudios Ambientales Escuela de Ciencia y Tecnología e Instituto de Investigaciones e Ingeniería Ambiental. Universidad Nacional de San Martín,
[email protected] (3) CONICET. (4) Laboratorio de Pilas de Combustión PEM a Hidrógeno (CITEDEF-EST), San Juan B. de La Salle 4397, Villa Martelli, Buenos Aires, Argentina.
RESUMEN Los procesos actuales de producción de hidrógeno consumen una gran parte de la energía que producen y/o dependen del consumo de combustibles fósiles, lo que los hace poco eficientes y dañinos para el medio ambiente. La obtención de hidrógeno a partir de sistemas vivos, por fermentación de materia orgánica considerada desecho, es una alternativa prometedora para el futuro. En especial si se considera que la producción de hidrógeno biológico se encuentra intrínsecamente asociada a la degradación de la materia orgánica fermentada. En este trabajo exploramos la eficiencia de distintos consorcios bacterianos para realizar fermentación anaeróbica de carbohidratos. Los consorcios evaluados provinieron de tierra de campo, compost y barros de una planta de tratamiento cloacal. Los cultivos que produjeron la mayor cantidad de hidrógeno fueron aquellos en los que se empleo como inóculo barros y compost. Ambos alcanzaron una concentración máxima acumulada de aproximadamente 30% de hidrógeno biológico en la mezcla gaseosa el día 8 del proceso de fermentación. Palabras Claves: hidrógeno, fermentación oscura, consorcios bacterianos, barros, compost, energía sustentable.
1. INTRODUCCIÓN El gas hidrógeno es lo que se denomina un vector de energía, lo cual significa que almacena energía utilizable. Los sistemas que funcionan con energía de H2 son limpios ya que su combustión produce principalmente vapor de agua como residuo. No es tóxico para los sistemas vivos si se fuga a la atmósfera y no contamina tierras ni napas de agua. Puede utilizarse para generar energía en celdas de combustible que son más eficientes que los motores de combustión interna [1].
Pero este gas no existe naturalmente en su forma molecular en la Tierra, por lo tanto, el H2 debe producirse. Existen diversos recursos disponibles para producirlo, como por ejemplo el gas natural y el carbón. Las tecnologías de producción que resultan más atractivas son las tecnologías sostenibles, e incluyen recursos que son renovables, como energía solar, eólica, hidroeléctrica, geotérmica o mediante fermentación de biomasa. Esta diversidad de métodos de producción y aplicaciones convierte al H2 en una gran promesa a futuro como vector de energía [2].
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
01-118
Uno de los procesos que se perfila como más importante es la fermentación anaeróbica. Es un proceso metabólico de degradación de materia orgánica que realizan ciertos sistemas vivos. Produce energía para el microorganismo y metano que se libera al ambiente, junto con otros productos como el H2. Esta fermentación se denomina metanógena, o digestión anaeróbica, dado que es el camino metabólico que existe cuando no está presente el oxígeno como aceptor final de electrones. Existen bacterias estrictamente anaerobias, y anaerobias facultativas, capaces de fermentar por estas vías. Estas comunidades bacterianas que existen naturalmente, llamadas consorcios, logran degradar la biomasa a una mezcla de compuestos gaseosos actuando en pasos sucesivos, cuando los desechos de algunas son sustrato de otras (Figura 1) [3]. Las bacterias productoras de H2 se encuentran naturalmente en ambientes donde ocurre esta degradación, junto con otras especies de bacterias.
En el presente trabajo se evaluaron tres tipos de consorcios: tierra de campo obtenida de los predios del DGID, compost comercial para abono y barros de una PTAS (planta de tratamiento de aguas servidas) de una corbeta de la Armada Argentina. En estos consorcios se espera hallar una alta proporción de bacterias productoras de H2 al ser ambientes anaerobios y en donde ocurre la degradación de materia orgánica [4] [5]. Los géneros más estudiados en la literatura, y que se espera encontrar en estos consorcios pertenecen a los géneros Clostridium y Enterobacter [6]. Luego de un pre-tratamiento con calor [7], y al cultivar en condiciones anaeróbicas, se espera seleccionar de estos consorcios sólo las bacterias esporulantes fermentativas productoras de H2 y eliminar las metanógenas, ya que estas últimas disminuyen el contenido de hidrógeno en la mezcla porque lo incorporan a la molécula de metano.
De estos tres consorcios se seleccionarán los más eficientes para una segunda etapa de
optimización de la producción y para un trabajo en colaboración con CITEDEF (Instituto de
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
Investigaciones Científicas y Técnicas para la Defensa). 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Consorcios El criterio de selección de consorcios consistió en elegir materiales de fácil obtención no estériles, que ocurrieran en la naturaleza y en dónde hubiera un alto grado de anaerobiosis preferentemente con degradación activa. Por ello, se optó por tierra de campo recolectada de los predios de la DGID a una profundidad de alrededor de 15 cm. [4], compost comercial utilizado para abono de cultivos y barros de una planta de tratamiento cloacal [5]. Dicha planta está localizada a bordo de la corbeta A.R.A. Guerrico de la Armada Argentina. 2.2 Pre-tratamientos Para eliminar la mayor cantidad posible de microorganismos no deseados, como las bacterias metanógenas, y seleccionar las esporas de las productoras de hidrógeno se pre-trataron los consorcios con calor, manteniéndolos sumergidos en un baño a 70ºC durante 50 minutos. 2.3 Incubación Los consorcios pre-tratados se adicionaron a 100 ml de medio rico de cultivo con sacarosa como fuente de carbono. Dicho medio se preparó empleando por litro, 30g de sustrato (sacarosa), 2g de bicarbonato de amonio, 1,2g de fosfato monopotásico, 200 mg de sulfato de magnesio heptahidratado, 200 mg de molibdato de sodio dihidrato, 200 mg de cloruro de calcio dihidratado, 200 mg de sulfato de manganeso monohidrato, 200 mg de Sulfato de hierro. La solución se amortiguó con 0.05 M 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid monohydrate (MES; J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). Estos ensayos se realizaron por triplicado, más un control (blanco). Los ensayos “blanco” contenían las bacterias sin fuente de carbono, ni nutrientes, es decir diluidas en el mismo volumen de agua. Dichas preparaciones se volcaron en tubos Erlenmeyer de 500 ml. y se les eliminó el contenido de oxígeno mediante una purga con
01-118
gas nitrógeno. Luego se sellaron herméticamente con tapones de hule y cinta aislante. Se incubaron en estufa a 38ºC hasta los días 2 (48 hs), 3 (72 hs), 7 (168 hs) y 8 (192 hs) en que se trasladaron al laboratorio para la determinación del porcentaje de hidrógeno biológico en la mezcla gaseosa, por cromatografía. El día de preparación de los tubos e inicio del cultivo se registró como día 0 (hora 0). Por restricciones de tiempo inherentes al mencionado laboratorio, los análisis se realizaron el mismo día del traslado para todas las muestras, excepto para las detalladas a continuación: Muestras de barros, día 3 (72 hs): del total de cuatro muestras, dos de ellas se analizaron el día del traslado y las dos restantes (que incluyó al blanco) se analizaron al día siguiente. Muestra de compost, día 3 (72 hs): todas las muestras se analizaron el día siguiente al traslado. Todas las muestras retiradas de la estufa el día 8 se analizaron el día 11. Los tubos que no se analizaron el mismo día del traslado se almacenaron a temperatura ambiente hasta su medición. 2.4 Porcentaje de H2 Cromatografía. El porcentaje de H2 en la mezcla se determinó mediante cromatografía gaseosa en un cromatógrafo Hewlett Packard 5890, en el laboratorio de Servicios Analíticos de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA), utilizando el gas nitrógeno como carrier y una columna HP-MOLESIEVE de 30 m x 0,536 mm x 50,00 µm. La columna es no polar, y tiene la capacidad de detectar hidrógeno, además de otros gases como neón, argón, oxígeno, nitrógeno, metano y monóxido de carbono. Para cada muestra el máximo en la concentración de H2 se observó alrededor del minuto y medio, finalizando la corrida a los tres minutos. Una muestra de gas de un Erlenmeyer inoculado con compost, se dejó cromatografiar por 1 hora para observar otros posibles compuestos en la muestra. Volumen en jeringa. Este método consiste en el procedimiento directo de extraer con una jeringa 30 ml de gas de un tubo Erlenmeyer e inyectarlos inmediatamente en una celda PEM de 0,5V ± 0,01V conectada a un motor eléctrico. Se registran el tiempo que tarda el motor en detenerse y el volumen final de gas presente en
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
01-118
la jeringa. A partir de una ecuación simple se determina el porcentaje que el gas consumido representa. Se midieron ambos duplicados, no se midieron los blancos. Este método se validó en un trabajo previo [8].
192 horas (8 días) y 38º (9 días). Se evaluó el porcentaje de H2 a distintos tiempos mediante el volumen en jeringa.
2.5 Evaluación funcional del H2
Para evaluar la posibilidad del consorcio de crecer y producir H2 sobre otro sustrato se cultivaron tubos Erlenmeyer de la misma manera que se describe en 2.3 pero reemplazando la sacarosa por glucosa en el medio e incubándolos por 192 horas (8 días). El porcentaje de H2 en estos tubos se registró mediante ambos métodos de cromatografía y volumen en jeringa.
Para evaluar la posibilidad de utilizar el H2 generado por las bacterias en una aplicación práctica se alimentó el gas directamente a una celda de combustible tipo PEM de 0,5V ± 0,01V de la empresa Horizon Fuel Cell Technologies. El gas se extrajo de los tubos perforando el tapón con una jeringa, y se inyectó en la celda que está conectada a un pequeño motor eléctrico.
2.8 Fuente de carbono
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2.6 Viabilidad en el tiempo
3.1 Selección de consorcios
Se cultivó una alícuota de 10 ml de barros en 100 ml de medio preparado en la manera descripta anteriormente durante 120 horas (5 días). Al cabo de este tiempo, se evaluó el contenido de H2 mediante el volumen remanente en jeringa y se procedió a realizar un repique de 10 ml de este cultivo en medio fresco. Este procedimiento de valoración de H2 y repique se repitió por más de 90 días según el siguiente esquema. Para el cultivo Madre 1 se inoculó medio en forma directa con barros frescos de la planta de tratamiento y se repicó regularmente durante un período de 2088 horas (95 días). El inóculo de 10 ml utilizado para iniciar el cultivo denominado Madre 2 se obtuvo de una alícuota de un cultivo previo, congelada un mes antes. Este consorcio se repicó durante 2328 horas (97 días).
Los resultados del análisis mediante cromatografía exhibieron el comportamiento esperado para los tubos blancos al resultar en un porcentaje de H2 que no superó el 0,15% en ningún caso, siendo en la mayoría de estos menor al 0,05%. Para construir las curvas de evolución de H2 (Figura 2) se realizó un promedio entre los datos obtenidos por triplicado para cada punto, excluyendo los blancos (Tabla 1). Hubo un solo dato desviado de la media, ocurrido el día 2 en un tubo con tierra de campo, que fue excluido del análisis según la prueba de Grubbs para valores atípicos (P < 0,05). La tendencia observada para los consorcios de compost y barros es un aumento del hidrógeno acumulado en el Erlenmeyer hasta alcanzar un máximo y luego disminuir. La tendencia observada para el consorcio de tierra de campo es un aumento de hidrógeno acumulado hasta alcanzar un máximo (inferior al de los restantes consorcios) para mantener luego un porcentaje de hidrógeno acumulado estable.
2.7 Temperatura Para evaluar el efecto de la temperatura se procedió a cultivar una alícuota del consorcio de barros de PTAS en medio fresco de la manera descripta con anterioridad. Los tubos Erlenmeyer se incubaron a las temperaturas de 35º y 45º por
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
01-118
Figura 2 – Porcentaje de gas H2 presente en tubos de cultivo de bacterias provenientes de distintas fuentes. Cuadrados rojos: barros de PTAS. Triángulos verdes: compost. Rombos celestes: Tierra de campo. El consorcio de barros PTAS resultó el más eficiente al alcanzar el 50% de su producción (14,34% de H2 en la mezcla gaseosa) en el menor tiempo, es decir antes del día 2 como se observa en la Tabla 1. La tierra de campo resultó el menos eficiente, exhibiendo un 3,5% de H2 en la mezcla gaseosa el día 2. Asimismo, los barros PTAS resultaron también los más eficaces al alcanzar el máximo el día 7, con un promedio de 28,67% de H2. El máximo obtenido con el consorcio de compost fue ligeramente inferior con un 26,67% también el Día 0 2 3 4 7 11
% H2 (Tierra de Campo) 0 3,50 16,67 N/D 13,67 16,33
día 7. El consorcio de tierras también resultó el menos eficaz, exhibiendo un máximo de 16,67% de H2 el día 3. Los resultados muestran una disminución considerable en la producción de hidrógeno biológico el día 11, para los consorcios de barros PTAS (5,87% H2) y compost (15,33% H2). Esto a pesar de que los tubos permanecieron cerrados. La concentración de H2 para el consorcio de tierra de campo se mantuvo relativamente constante a partir del día 3 y hasta el día 11 donde puede observarse un porcentaje de H2 de 16,33%. % H2 (Barros PTAS) 0 15,33 15,70 N/D 28,67 5,87
% H2 (Compost) 0 8,10 N/D 21,67 26,67 15,33
Tabla 1 – Promedio del porcentaje de gas H2 presente en tubos de cultivo de bacterias provenientes de distintas fuentes. Blancos no se muestran. N/D: no hay datos (días no incluidos en el esquema de análisis). La corrida cromatográfica prolongada de 1 hora no arrojó otros compuestos detectables en la mezcla gaseosa. El biogás extraído de los tubos e inyectado en una celda de combustible tipo PEM, de la compañía Horizon Fuel Cell Technologies, efectivamente hizo funcionar el motor eléctrico
conectado a la misma, según se pudo constatar mediante observación directa. 3.2 Viabilidad del cultivo en el tiempo Puede apreciarse en la figura 3 que ambos cultivos Madre 1 y Madre 2 se mantuvieron viables y con capacidad de producción de
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
hidrógeno por más de 2000 horas (95 y 97 días, respectivamente). En ambos cultivos se observa una oscilación en la concentración de hidrógeno acumulado, encontrándose valores altos de concentración seguidos de valores bajos y luego valores altos nuevamente.
01-118
También se observa claramente que el cultivo iniciado a partir de los barros frescos produjo una cantidad considerable de H2 inmediatamente, mientras que el cultivo iniciado a partir de congelado comienza a producir H2 después de las 120 primeras horas.
Figura 3 – Dos cultivos se mantuvieron viables y produjeron H2 por más de 90 días. Cuadrados rojos: Madre 1, barros naturales repicados durante 95 días. Rombos celestes: Madre 2, barros congelados repicados durante 97 días. 3.3 Efecto de la temperatura La figura 4 muestra que el consorcio de barros deja de producir H2 casi por completo al incubarlo a una temperatura de 45°C. Es muy probable que esto se deba a la muerte de las bacterias que componen el consorcio. A 38 y 35°C se observa una producción óptima. A 35°C el porcentaje de H2 acumulado alcanza el máximo de 25% a las 120 horas, mientras que a 38°C tarda 168 horas. Sin embargo, a 35°C el porcentaje acumulado disminuye considerablemente a menos de 10% a las 192 horas, en comparación con 38°C que a las 216 horas todavía se mantenía en 20%.
Figura 4 – Comparación del efecto de la temperatura sobre el consorcio de barros. Todos los consorcios partieron de una alícuota congelada. Cuadrados rojos: 38°C. Rombos celestes: 35°C. Triángulos verdes: 45°C. 3.4 Cultivos con glucosa como fuente de carbono El consorcio de barros efectivamente puede crecer y producir H2 utilizando glucosa como
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
fuente de carbono, según era lo esperado (Figura 5, Tabla 2). En esta experiencia se observó un aumento sostenido de la cantidad de H2 acumulado dentro del tubo a lo largo de todo el período que duró la incubación (192 horas), sin llegar a verse una disminución, como sí se aprecia en experiencias anteriores (por ejemplo, con incubación en sacarosa a distintas temperaturas, figura 4). En esta experiencia puede apreciarse también la coincidencia de los valores del porcentaje obtenido mediante cromatografía y a partir del volumen remanente en la jeringa. 4. CONCLUSIONES
01-118
probablemente se deba a que estos organismos están, en mayor o menor medida, naturalmente sujetos a un proceso de degradación anaeróbica en su medio, con lo cual su cultivo ya estaría enriquecido en bacterias anaeróbicas cuyo metabolismo continúa en anaerobiosis en los ensayos de producción, en lugar de tener que “ajustarse” partiendo de un ambiente más aerobio, como es el caso de los consorcios de compost y tierra de campo. El crecimiento y la viabilidad observados a lo largo de tres meses sugieren que existe una alta posibilidad de cultivar este consorcio en un biorreactor continuo. Sería posible optimizar la producción de hidrógeno biológico para obtener un alto porcentaje en forma sostenida; y en base a resultados preliminares, la clave para lograrlo estaría en el control del pH del medio. La temperatura elegida para los ensayos generales fue de 38ºC, aunque a 35ºC también resulta interesante. Se necesitarían más investigaciones en el futuro para determinar lo que sucede con la producción en períodos más prolongados de incubación y a temperaturas cercanas a la ambiente. Asimismo, sería interesante observar también una incubación prolongada con glucosa como fuente de carbono porque en el presente trabajo no se observa una caída de la producción en este medio. Una explicación posible es que la glucosa es una fuente de carbono más directa que la sacarosa.
La conclusión evidente que arrojan estos resultados es que los consorcios efectivamente son capaces de producir hidrógeno utilizando sacarosa y glucosa como fuente de energía. Se comprobó que la mezcla gaseosa puede generar energía eléctrica al alimentar con la misma una celda de combustible tipo PEM. La posibilidad de emplear H2 biológico en forma directa sin purificar podría resultar altamente ventajosa ya que se eliminarían los costos de procesamiento y purificación. Los consorcios que alcanzaron un mayor volumen de H2 acumulado fueron los de barros PTAS y compost. Se decidió hacer foco en el consorcio de barros que fue el que exhibió una velocidad de producción más alta y que acumuló la mayor cantidad de H2. La mayor capacidad de producción observada en el consorcio de barros % H2 Tubo Tiempo (hrs) (cromatografía) 24 11,67 1 120 26,33 2 168 27 3 192 32 4
% H2 (volumen jeringa) 10 25 23,2 36,8
Tabla 2 – Valores de porcentaje de hidrógeno obtenidos a partir de un cultivo de barros en sacarosa, según las mediciones por cromatografía y por el volumen remanente en una jeringa, según se describe en Materiales y Métodos.
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
01-118
Figura 5 – Gráfico de los valores de la Tabla 2. Rombos celestes: porcentaje medido por cromatografía. Cuadrados rojos: porcentaje valorado según el método de volumen en jeringa. En un futuro se variarán las condiciones de cultivo para determinar las más favorables. Se evaluará la glucosa como fuente de carbono y se variarán las condiciones iniciales de pH y temperatura de cultivo. Esto permitirá enriquecer el cultivo con los microorganismos más adecuados y seleccionar las condiciones de crecimiento que maximicen la producción. Por último, se procederá a la calibración de un método experimental de medición del porcentaje de H2 utilizando una celda de combustible tipo PEM. Para esto se registrarán los datos del porcentaje de H2 que se obtengan de la medición con la celda y se contrastarán con los resultados del análisis de las mismas muestras por cromatografía gaseosa.
[4]. Logan, B.E.; Oh, S.E.; Kim, I.S.; Van Ginkel, S. Biological hydrogen production measured in batch anaerobic respirometers. American Chemical Society, Environmental Science and Technology, Vol. 36 (2002), 2530 2535. [5]. Morimoto, M.; Atsuko, M.; Atif, A.A.Y.; Ngan, M. A.; Fakhru'l-Razi, A.; Iyuke, S. E.; Bakir, A. M. Biological production of hydrogen from glucose by natural anaerobic microflora, International Journal of Hydrogen Energy, Vol. 29 (2004), 709-713. [6]. Kapdan, I.K. y Kargi, F. Bio-hydrogen production from waste materials, Enzyme and Microbial Technology, Vol. 38 (2006), 569-582.
5. REFERENCIAS [1]. Jeong, K.S. y Oh, B.S. Fuel economy and life-cycle cost analysis of a fuel cell hybrid vehicle, Journal of Power Sources, Vol. 105(2002), 58 - 65. [2]. DOE and DOT. Hydrogen Posture Plan: An Integrated Research, Development and Demonstration Plan. US Departments of Energy and Transportation. (2006). [3]. Mitchell, Ralph y Gu, Ji Dong, 2010. Environmental microbiology. [ed.]. 2. WileyBlackwell, New Jersey. Pgs. 259 - 279. Chapter 11.
[7]. Ren, N.Q.; Guo, W.Q.; Wang, X.J.; Xiang, W.S.; Liu, B.F.; Wang, X.Z.; Ding, J.; Chen, Z.B. Effects of different pretreatment methods on fermentation types and dominant bacteria for hydrogen production, International Journal of Hydrogen Energy, Vol. 33 (2008), 4318-4324. [8]. García R.E., Martínez V.L., Sanguinetti A.R., Fasoli H.J. y Franco J.I. Demostración de la posibilidad de alimentación de una batería de combustible por hidrógeno proveniente de la fermentación del azúcar. 3° Congreso Iberoamericano de Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía HYFUSEN 2011. Exposición Nº 01-079.
Cuarto Congreso Nacional – Tercer Congreso Iberoamericano Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2011
01-118