Técnicas de sensibilidad in vitro a los antifúngicos Javier Pemán Unidad de Micología Servicio de Microbiología Hospital Universitario La Fe Valencia Palma de Mallorca, 11 febrero 2010

Detección de resistencias in vitro
¿Son un problema real?


La teoría (técnicas estandarizadas)


La práctica (técnicas para la vida diaria)

Fracaso de la terapia antifúngica Huésped: Huésped: ––Estado Estadoinmune inmune ––Persistencia Persistenciadel delfoco: foco:

Hongo: Hongo:

Cuerpos Cuerposextraños extraños Abscesos Abscesos

••Resistencia ResistenciaAF AF ••Célula fúngica Célula fúngica ••Tamaño Tamañopoblación población

––Lugar Lugarde delalainfección infección ––Incumplimiento Incumplimientotto. tto.

Antifúngico: Antifúngico: •• Dosis Dosis •• Farmacocinética Farmacocinética •• Actividad Actividad •• Interacciones Interacciones

Puntos de corte CMI (µg/ml) Sensible SDD / I Resistente Fluconazol ≤8 16-32 ≥ 64 Itraconazol ≤ 0,125 0,25-0,5 ≥1 5-FC ≤4 8-16 ≥ 32 Voriconazol ≤1 2 ≥4 Caspofungina ≤2 >2* Anidulafungina ≤2 >2* Micafungina >2* ≤2



Oficial

** No No sensible sensible

CLSI M27-S3, 2008 (Candida spp.)

Anfotericina B

≤1

≥2

Oficioso

Patrón habitual de sensibilidad Levaduras

Patrón habitual de sensibilidad Hongos filamentosos

Predicción respuesta clínica • CMI

• Otros factores: • • • •

Inmunidad Estado general Localización infección Cuerpos extraños

CMI  : fracaso terapéutico CMI  : no éxito terapéutico

Estudio Sensibilidad AF Métodos estandarizados • CLSI: • Levaduras: • Dilución: M27-A3 (2008) • Difusión: M44-A2 (2009)

• Filamentosos: • Dilución: M38-A2 (2008) • Difusión: M51-P (2009)

• Dermatofitos: • M38-A2 (2008)

• EUCAST: • Levaduras: • Edef 7.1 (2008)

• Filamentosos: • Edef 9.1 (2008)

Estudio Sensibilidad AF Métodos comerciales disponibles

• Dilución: • Sensititre YeastOne • Fungitest • Difusión agar: • Etest • Neo-Sensitab

Métodos estandarizados diferencias

CLSI, M27-A3 •Problemas: Lectura de anfotericina B

•Solució Solución: Utilizar Utilizar Etest Etest oo Calcular Calcular la la CMF CMF C. albicans ATCC 200955

EUCAST, Edef 7.1 • Problemas: – No estandarizado para C. neoformans – Presencia glucosa en el medio – Baja correlación con ITR – Incremento de la DO: • Presencia de burbujas aire • Cristalización del AF – Carencia de puntos de corte clínicos

EUCAST, Edef 7.1

• Presencia glucosa en el medio:: – Dificultad crecimiento C. glabrata – Puede contaminarse más fácilmente – Detecta menos resistencias*

*Espinel-Ingroff A, JCM 2005; 43:3884

M44-A2 • Medio: • Mueller-Hinton Agar (2% glucosa) + 0,5% Azul Metileno

• Inó Inóculo: • 1–5 x 106 UFC/mL

• Incubació Incubación (35 ºC) : • 20-24 h

• Buena correlación con M27-A3 ATCC 22019

M44-A2 

Solo estandarizado para CAS, FLZ y VOR: – Puntos de corte (mm): (mm): S

FLC 25

También Tambiénhay haybuena buena correlación con otros correlación con otrosAF AF

S-DD

R

FLZ

≥ 19 1515-18

≤ 14

VOR

≥ 17 1414-16

≤ 13

CAS

≥ 11

M44-A2

• Problemas : FLC 25

– Sólo estandarizado para CAS, FLZ y VOR – Lectura azoles – C. krusei y C. glabrata – CMI vs diámetro inhibición

M44-A2

FLC 25

• C. krusei y C. glabrata : – A las 24 h no detecta bien las resistencias

Prolongar Prolongar tiempo tiempo incubación incubación (48h) (48h)

M44-A2

FLC 25

• Lectura de los azoles:: – Presencia de colonias en el interior del halo

Ignorar Ignorar las las microcolonias microcolonias dentro dentro del del halo halo inhibición inhibición

Sensititre Yeast One Y09 • Medio:

• RPMI (MOPS) + 1,5% glucosa, pH 7±0,1 • Indicador colorimétrico (Alamar Blue)

• Inóculo:

• 1,5 - 8 x 103 UFC/mL

• Incubación (35 ºC) :

•• Fluconazol Fluconazol •• Itraconazol Itraconazol

• Lectura:

•• Posaconazol Posaconazol •• Voriconazol Voriconazol

• 24 h

• Cambio color (rosa → azul) • NO por turbidez

Lectura

•• Anfotericina Anfotericina B B •• 5-fluorocitosina 5-fluorocitosina

•• Anidulafungina Anidulafungina •• Caspofungina Caspofungina •• Micafungina Micafungina

Sensititre Yeast One Control growth AMB-16 µg/mL

.25 16 2 1 .06

FLC-256 µg/mL ITR-16 µg/mL KTC-16 µg/mL 5-FC-64 µg/mL

CMI de anfotericina B: El pocillo azul con la concentració concentración más baja de antifú antifúngico CMI de azoles: El pocillo azul o pú púrpura con la concentració concentración má más baja de antifú antifúngico

Sensititre Yeast One • Problemas: • “Trailing” • Efecto paradójico

Sensititre Yeast One

• Presencia de “trailing”:: • Dificultad de apreciar el cambio de color en algunas cepas • En azoles

•• No No prolongar prolongar la la incubación incubación (18-24 (18-24 h) h) •• Incubar Incubar aa 35ºC 35ºC (muy (muy importante importante con con ITR) ITR)

Sensititre Yeast One • Efecto paradójico:: • Crecimiento a concentraciones > CMI • Más frecuente con ITR y candinas

No No valorar valorar su su aparició ó n al aparici aparición al informar informar la la CMI CMI

ETEST

Levaduras Hongos filamentosos

• Medio:

• RPMI (MOPS) + agar 2% glucosa, pH 7±0,1

• Inóculo:

• 0,5 McFarland (1 – 5 x 106 UFC/mL)

• Incubación (35 ºC):

• 24 – 48 h (Candida spp) • 48 – 72 h (Cryptococcus neoformans) • 18 – 48 h (H filamentosos)

 

Problemas: Problemas:

–– –– ––

Humedad Humedad de de la la placa placa Lectura Lectura azoles azoles Lectura Lectura anfotericina anfotericina BB

• Lectura:

• AMB: CMI intersección del halo con la tira de Etest • Azoles: CMI inhibición aparente del crecimiento (~80%)

ETEST • Azoles:

Leer Leeraacontraluz contraluz

… y en la práctica diaria? • ¿Cuándo hacer un antifungigrama?: • • • •

Hemocultivo Líquidos orgánicos estériles Ante un fracaso terapéutico Estudios epidemiológicos

• ¿Cómo hacerlo? • • • • •

Sensititre YeastOne Levaduras y Etest filamentosos Neo-Sensitab M44-A2 (FLU, VOR y CAS) → levaduras M51-P → h filamentosos (no dermatofitos)

… y en la práctica diaria? • Dilución en agar: • CHROMagar Candida + fluconazol (8 mg/L)

Patterson TF; J Clin Microbiol 1996; 34:3237-9

… y en la práctica diaria? 

CHROMagar Candida + fluconazol (8 mg/L)

CHROMagar

CHROMagar + Fluconazol (8 mg/L) Patterson TF; J Clin Microbiol 1996; 34:3237-9

… y en la práctica diaria? • ¿y si sale un aislado resistente?: • Confirmar que es un cultivo puro • Confirmar la identificación • Confirmar CMI por método estandarizado de dilución (M27-A3 o M38-A2)… • O enviar aislado a un Lab de Referencia

y para saber algo más…

Expert Rev Anti Infect Ther 2009; 7:107-119

www.TIMM2011.org

5th Trends in Medical Mycology 2 – 5 October 2011 Valencia Conference Centre Valencia, Spain