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TEMA 1. Análisis Químico y Análisis Instrumental Tipos de Análisis.- Campo de aplicación.Complementariedad de los análisis.- Límites de detección y cuantificación. Rango dinámico.Interferencias en los análisis: señal y ruido, integración de señales, solapamiento de señales
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Hechos, situaciones, necesidades Análisis del fósforo
Casos y situaciones
Uso 1: Minerales de fósforo como fertilizantes
Fosforita (Ca3(PO4)2) Variedad criptocristalina del apatito Roca sedimentaria Compuesta fundamentalmente por fosfato cálcico Especificación Química
P2O5 26,88% CaO 33,00% Fe2O3 9,00% SiO2 3,00% Al2O3 5,00% MgO 0,10%
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Hechos, situaciones, necesidades
Casos y situaciones
Análisis del fósforo
Uso 2: El fósforo como elemento esencial
El P es un elemento esencial para la vida
Ligado al Ca
necesario para el desarrollo del esqueleto y los músculos
0,8 al 1,1% del peso total del cuerpo
Las plantas lo necesitan para crecer y desarrollar su potencial genético No es abundante en el suelo En formas disponibles para la planta
sales orgánicas e inorgánicas
Se absorbe paralelamente al Ca Llega mejor a nuestro organismo si es en compañía de la vitamina D 3
Hechos, situaciones, necesidades Análisis del fósforo
Casos y situaciones
Uso 2: El fósforo como elemento esencial
El papel que juega el fósforo es muy importante:
metabolismo de los hidratos de carbono contracción de los músculos absorción de la glucosa en el intestino, los riñones, equilibrio ácido-base en la sangre tejido nervioso, etc
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Importancia y uso del fósforo
Producción de ATP
encargado de guardar energía
Nucleoproteínas celulares en conexión con el ADN y los fosfátidos (ej. Fosfoglicéridos)
intervienen en la formación de numerosas enzimas que oxidan la glucosa
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Importancia y uso del fósforo
Alimentos ricos en P:
Almendras, ajo, avena, maíz, lentejas, coles, lechuga, cebolla, manzana, arroz, apio, patata, puerro, fresa, tomate, pepino, castañas, setas, alcachofas, avellanas nueces Carne, pescado y lácteos (P y Ca)
Proporción necesaria para el ser humano se equilibra con la de Ca:
Lactantes 200 mg diarios Adolescentes 900 mg diarios Adultos y 700 mg 6
Importancia y uso del fósforo
Déficit o exceso de P:
debilidad muscular alteraciones óseas Raquitismo afecciones intestinales Hiperparatiroidismo glomerculonefritis.
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Niveles y matrices - Fósforo
Fosforita
Suelos (movilidad- biodisponibilidad)
P2O5 26,88%; CaO 33,00%; Fe2O3 9,00%; SiO2 3,00%; Al2O3 5,00% MgO 0,10%
100 ppm, total- 10 ppm disponible (citrato)
Alimentos
Naranjas 300 mg/Kg
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Métodos analíticos para P según las matrices
Fosforita: 11,7 % de P
Gravimétrico:
Mg(NH4)PO4.6H2O (forma de precipitación) Mg2P2O7 (forma de pesada) 1 g de fosforita genera 0,4201 g de Mg2P2O7 Precisión 0,2%; tiempo de análisis 5 h
Espectrofotométrico
Disolución en H2SO4 Color azul 820 nm con reactivo molíbdico
є = 5000 l.mol-1.cm-1 (~10 – 50 ppm)
1 g de fosforita 117000 ppm de P 9
Análisis de fósforo
Suelos (movilidad- biodisponibilidad)
Alimentos
100 ppm, total- 10 ppm disponible (citrato)
Naranjas 300 mg/Kg
Como analizar??? Qué métodos???
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¿Está mi proteína fosforilada? ¿Dónde? Ejemplo
Un péptido de secuencia p-KRPSQRHGSKYamida Tripsina
rompe las cadenas C-terminales de la arginina (R) origina dos fragmentos de péptido
¿Cuál está fosforilado?
m/z 591 Æ HGSKY-amida m/z 852 Æ KRPpSQR
MALDI-MS
m/z 591 Æ se mantiene no contiene el fosfato no existe m/z 852 sino m/z 772, (852-80 u) Æ fosforilado
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Fosfoproteínas
Serina, treonina, tiroxina Æ fosforilación
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Límites de detección y cuantificación. Rango dinámico
Criterios numéricos para seleccionar métodos analíticos
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Límite de detección
“La concentración que proporciona una señal instrumental (y) significativamente diferente del blanco o señal de fondo”
LODÆ y = yB + 3sB LOQ Æ y = yB + 10sB
Sensibilidad (y) = a + 3sy/x
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Límite de detección
Sensibilidad (y) = a + 3sy/x = 1,52 + 3 × 0,433 = 2,189 y = bx + a Æ x = LOD = (y-a)/b = (2,189-1,52)/1,93 = 0,67 pg Por tanto, LOD = (3 sy/x)/b y LOQ = (10 sy/x)/b 15
Parámetros de calidad analítica a partir de la curva de calibrado
LOD = límite de detección; LOQ = límite de cuantificación LOL = limite de respuesta lineal o rango lineal. 16
Límite de detección y límite de cuantificación
Recta de calibrado: y = bx +a
Límite de detección
LD= SB + 3 s B LD = a + 3sy/x CLD = (LD-a)/b
Límite de cuantificación
LQ= SB + 10 s B LQ = a + 10 sy/x CLQ = (LQ-a)/b 17
Exactitud y precisión
IMPRECISO E INEXACTO
PRECISO PERO INEXACTO
PRECISO Y EXACTO
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Exactitud
Se analizan uno o varios materiales estándar de referencia
Para evitar errores aleatorios y sistemáticos:
n = 20 o 30 análisis repetidos
Exactitud = media – valor verdadero
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Parámetros de calidad para la precisión
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Características de los métodos analíticos de uso habitual Métodos Basados en la reacción
Basados en radiaciones Electromagnéticas
Absorción
Emisión
Basados en el intercambio de electrones en una interfase
Basado en la medida de masas
Señal
Muestra
Rango
Precisión
Tiempo
Gravimetría
Disuelta
1-10-3 M
< 1%
1–3h
Volumetría
Disuelta
1- 10-3 M
< 1%
15 min
Disuelta
µg ml-1 (ppm)
1-5 %
5 min
< 5%
30 min
Espectroscopia UV-visible (molecular)
Radiación UV-visible
Espectroscopia Infrarroja (molecular)
Radiación IR
Espect. Absorción Atómica
Radiación UV-visible
Disuelta
µg ml-1/ng ml-1 (ppm ó ppb)
1-5 %
3-5 min
Espectr. Emisión Atómica
Radiación UV-visible
Disuelta (multielemental)
µg ml-1/ng ml-1 (ppm ó ppb)
1-5 %
3-5 min
Fluorimetría (emis. molecular)
Radiación UV-visible
Disuelta
µg ml-1/ng ml-1 (ppm ó ppb)
1-5 %
10 min
Fluorescencia rayos X
Rayos X
Sólida
µg ml-1 (ppm)
1-5 %
15 min
Polarografía
Intensidad de corriente
Disuelta
10-3-10-5 M
1-5 %
30 min
Potenciometría
Diferencia de potencial
Disuelta
1-10-5 M
1-5 %
15 min
Culombimetría
Cantidad de electricidad
Disuelta
10-3-10-5
1-5 %
15 min
Espectrometría de masas
Relación masa/carga
Gas/vapor
µg ml-1/pg ml-1 (ppm/ppt)
∼5%
15 min
Sólida o disuelta
mg análisis cualitativo
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Señal analítica y método analítico
Técnicas espectroscópicas basadas en la interacción de la radiación electromagnética con las moléculas o especies: Tipos de señales Espectros de bandas
Interacción de moléculas con radiación policromática Absorción o Emisión
Espectros de línea
Átomos-radiación electromagnética Interacciones más restringidas en cuanto al rango de la longitud de onda que las originan Absorción o Emisión
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Espectros de banda
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Espectros de línea
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Área y altura de la señal
El área de un pico o señal es una medida de la cantidad de un analito presente en la muestra, siempre que la detección se produzca de forma lineal Ruido en la línea base. La ausencia de ruido y la estabilidad de la línea base son indicadores de la calidad de la medida
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Altura de la señal
La altura de los picos es una medida alternativa, siempre que le pico sea gaussiano
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Asimetría de la señal Indica la intervención de otras interacciones no previstas
Anchura de la señal
Es un indicador de la selectividad de la interacción 27
Resolución de las señales
Es el grado de separación de dos señales próximas
Resolución elevada
Buena calidad del análisis y de los resultados
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Resolución
Resolución= Rs = 2(tR2 –tR1)/(w1 + w2)
Si los picos son simétricos, se utiliza la anchura a la mitad de la altura del pico de la señal, w0.5:
R=1
Rs ≈ (tR2 –tR1)/(w0.5,1 + w0.5,2) los picos están resueltos al nivel de la línea base pueden medirse de forma precisa
En la práctica los picos no suelen ser iguales ni simétricos, y se precisa una resolución próxima a 2, o superior.
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Distorsión de las señales
Las señales que finalmente se observan en un registro se obtienen generalmente a partir de la respuesta del detector que, en los instrumentos actuales se encuentra digitalizada
La señal (generalmente en forma de pico) se suaviza electrónicamente o mediante un programa adecuado, y se reconstruye con un convertidor D/A para su representación final
Estas operaciones distorsionan el perfil inicial
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Señal y ruido
Ruido
En el caso de una señal pequeña de 10-15 A
gran importancia en la medida de la señal
La eliminación del ruido mejora la señal
A veces es difícil eliminar el ruido cuando este tiene su origen en efectos termodinámicos y cuánticos imposible de evitar en la medida
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Señal y ruido
Generalmente
El valor promedio del la señal correspondiente al ruido, R
El efecto del ruido en el error relativo de una medida
Constante Independiente de la magnitud de la señal, S
aumenta al disminuir el valor de la cantidad medida
La relación señal/ruido (S/R)
para describir la calidad de un método analítico o el funcionamiento de un instrumento parámetro de calidad mucho más útil que el ruido solo
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Señal y ruido
Para una señal de corriente continua, la magnitud del ruido se define como:
“la desviación estándar de numerosas medidas de la intensidad de la señal, la cual viene dada por la media de las medidas”
S/R = media/desviación estándar
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Señal y ruido
La relación señal/ruido es la inversa de la desviación estándar relativa RSD del conjunto de medidas S/R = 1/RSD
Es imposible la detección de una señal cuando S/R < 2 ó 3
Espectro RMN de la progesterona A) S/R = 4,3 B) S/R 43
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Fuentes de ruido en análisis instrumental
Ruido químico:
Variaciones de temperatura o presión
Fluctuaciones en la humedad relativa
Produce estratificación de los sólidos pulverulentos
Cambios de la intensidad de la luz
modifica el contenido de humedad de las muestras
Vibraciones
afectan al equilibrio químico
afectan a materiales fotosensibles
Humos del laboratorio
interaccionan con las muestras o los reactivos 35
Fuentes de ruido en análisis instrumental
Ruido instrumental:
Asociado a los componentes de un instrumento El ruido de los componentes puede tener distinto origen Es una mezcla compleja difícil de caracterizar
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Tipos de ruido instrumental
Ruido térmico o Johnson Ruido de disparo Ruido de parpadeo o 1/f Ruido ambiental
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Ruido térmico, o ruido Johnson
Origen: Agitación térmica de los electrones u otros transportadores de cargas en las resistencias, condensadores, detectores de radiación, celdas electroquímicas y otros elementos resistivos de un instrumento
Se produce aleatoriamente
Origina periódicamente heterogeneidades de carga Crean variaciones de tensión que aparecen como ruido en la lectura
Existe incluso en ausencia de corriente de un elemento resistivo y solo desaparece en el cero absoluto (0 K, -273 ºC) 38
Ruido térmico
raíz cuadrática media o valor eficaz del ruido de la tension dentro de un ancho de banda de frecuencia de ∆f Hz, K: constante de Boltzmann (1,38 x 10-23 J/K) T: temperatura en kelvin R: resistencia del elemento resistivo en ohmios Relación entre el tiempo de ascenso t y el ancho de banda ∆f en un amplificador:
t: (t de ascenso) tiempo de respuesta, en segundos, a un cambio brusco de la señal de entrada - se toma como el tiempo necesario para que la señal de salida aumente del 10 al 90 % de su valor final
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Ruido térmico
Estas variables también se utilizan para
determinar la capacidad de los instrumentos completos para detectar y transmitir información
El ruido térmico puede disminuir al estrecharse el ancho de banda Sin embargo, cuando el ancho de banda se estrecha
el instrumento tarda más en responder a una variación de la señal y se necesita más tiempo para realizar una medida fiable 40
Reducción del ruido térmico
El ruido térmico se puede reducir:
Disminuyendo la resistencia eléctrica de los circuitos instrumentales La temperatura de los componentes de los instrumentos:
Al reducir T de un detector desde T ambiente a la T del nitrógeno liquido (77 K) reducirá el ruido térmico a la mitad
El ruido térmico depende
del ancho de banda de la frecuencia pero es independiente de la propia frecuencia
A veces se denomina ruido blanco por analogía con la luz blanca, la cual contiene todas las frecuencias visibles
El ruido térmico es independiente del tamaño físico de la resistencia 41
Ruido de disparo
Se origina siempre que se produce un movimiento de electrones o de otras partículas cargadas a través de una unión
En un circuito electrónico característico
Las uniones se encuentran en las interfases pn
fotocélulas tubos de vacío
la unión es el espacio vacío entre el ánodo y el cátodo
Las corrientes en tales dispositivos implican una serie de procesos cuantizados
transferencia de electrones individuales a través de la unión 42
Ruido de disparo
Sin embargo, hay una componente aleatoria y la velocidad a la cual ocurren esta sujeta, por tanto, a fluctuaciones estadísticas que se describen con la ecuación
irms: raíz cuadrática media o valor eficaz de las fluctuaciones de corriente relacionadas con la corriente continua promedio, I, e: carga del electrón, 1,60 x 10-19 C ∆f : ancho de banda de las frecuencias consideradas
Al igual que el ruido térmico, el ruido de disparo es un ruido blanco
Sólo puede minimizarse reduciendo el ancho de banda
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Ruido de parpadeo
Es inversamente proporcional a la frecuencia de la señal que se observa
A veces, se le denomina ruido 1/f
Causas no muy bien conocidas Se reconoce por su dependencia de la frecuencia Es significativo para f < 100 Hz
Ejemplo:
deriva con el tiempo observada en amplificadores de corriente continua, medidores y galvanómetros
Puede reducirse bastante usando en vez de resistencias de carbón habituales
Resistencias de filamento enrollado o resistencias de película metálica 44
Ruido ambiental
Mezcla de distintos tipos de ruidos procedentes del entorno
Cada conductor de un instrumento actúa como una antena potencial capaz de captar radiación electromagnética y convertirla en una señal eléctrica
En el entorno existen numerosas fuentes de radiación electromagnética
Líneas de alimentación de corriente alterna Emisoras de radio y de televisión Sistemas de encendido de los motores de gasolina Conmutadores de arco eléctrico Escobillas de motores eléctricos Alumbrado Perturbaciones ionosféricas (ionosfera: parte de la atmósfera ionizada permanentemente debido a la fotoionización que provoca la radiación solar) 45
Ruido ambiental
Algunas fuentes, como las líneas de alimentación y las estaciones de radio
originan ruidos con anchos de banda de frecuencia relativamente limitada
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Aumento de la relación S/R
Existen métodos de hardware y software para mejorar la relación señal/ruido de un método instrumental:
Hardware : filtros, cortadores, escudos, moduladores. Eliminan o atenúan el ruido sin afectar de manera significativa a la señal analítica
Software: utilizan distintos algoritmos de ordenador permiten extraer las señales de entornos ruidosos Necesitan suficiente hardware para acondicionar la señal de salida del instrumento y transformarla de analógica a digital
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ANEXO
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Calibrado mediante adición estándar
Se añaden cantidades conocidas de analito al problema, cuyo contenido en analito se quiere determinar
A partir del aumento de señal se deduce cuanto analito había en la muestra problema
Este método requiere una respuesta lineal frente al analito
La adición de patrón es especialmente apropiada cuando la composición de la muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica 49
Ejemplo de adición estándar
Análisis por emisión atómica Una muestra de concentración inicial desconocida de analito [X]i da una intensidad de emisión Ix. Se añade una concentración conocida de patrón, S, a una alícuota de la muestra y se mide la intensidad de emisión Is+x de esta segunda disolución. La adición del patrón a la muestra modifica la concentración original del analito debido a la dilución, [X]f,, es la concentración diluida del analito, donde f significa "final". Designamos la concentración del patrón en la disolución final como de [S]f La emisión es directamente proporcional a la concentración del analito
Concentración de analito en la disolución inicial Señal de la disolución inicial = Concentración de analito + patrón en la disolución final Señal de la disolución final
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Ecuación de la adición estándar
[X ]i [S ] f + [X ] f
=
IX I S+X
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Ejemplo El contenido en Na+ de un suero dio una señal de 4,27 mV en un análisis por emisión atómica. A continuación se añadieron 5,00 ml de NaCl 2,08 M a 95,0 ml suero. Este suero enriquecido dio una señal de 7,98 mV. Hallar la concentración original de Na+ en el suero. Los moles de NaCl añadidos son (5,00 x 10-3 l) x (2,08 M) = 0,0104 mol, y la concentración final de NaCl añadido es 0,0104 mol/0,100 = 0,104 M. A partir de la ecuación 27:
[Na ] +
i
[0,104M ] + 0,950[Na + ]i
[Na ] +
f
=
[
]
4,27 mV ⇒ Na + i = 0,113M 7,98mV
[ ]
=95 ml x Na + i /(95 + 5 ml), porque 95,0 ml de suero se diluyeron con 5,0 ml de
patrón. A menudo debemos calcular la concentración de una muestra, después de diluirla desde un volumen inicial Vi a Vf. En el ejemplo anterior la disolución de NaCl 2,08 M se diluyó desde un Vi= 5,00 ml a un Vf = 5,00 + 95,0 = 100,0 ml. La concentración del NaCl se diluye, pues, de 2,08 M a (Vi/Vf) x (2,08 M) = 0,104 M. La cantidad (Vi/Vf) se llama factor de dilución. Por lo general, se usan factores de dilución en lugar de cálculos más laboriosos de moles y litros.
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Procedimiento gráfico para la adición estándar
La ecuación de la recta es y = mx + b. La abcisa en el origen se obtiene haciendo y=0 0 = mx + b X = -b/m La incertidumbre de la abscisa en el origen (la desviación estándar de [X]f, sXf ) es Sy m
1 + n m2
y
2
∑ (x
i
−x
)
2
donde Sy es la desviación estándar de y (Sy/x), m es la pendiente de la recta de mínimos cuadrados, n es el número de puntos (5), y es el valor medio de los 5 datos de y, y x es el valor medio de los 5 valores de x. 53
Calibración mediante adición de un patrón interno
Un patrón interno es una cantidad conocida de un compuesto, diferente del analito que se añade a la muestra desconocida.
La señal del analito se compara con las del patrón interno, y de ese modo se determina el analito presente en el problema.
En la adición estándar, el patrón es la misma sustancia que el analito. En la calibración con patrón interno este es una sustancia distinta al analito.
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Calibración mediante adición de un patrón interno
Los patrones internos son especialmente útiles cuando la cantidad de muestra analizada o la respuesta del instrumento varían algo de experiencia a experiencia, por razones que son difíciles de controlar.
Por ejemplo, una variación de los caudales de gas o de líquido en una experiencia cromatográfica, puede variar la respuesta del detector.
Una curva de calibrado solo es valida si se mantiene el conjunto de condiciones como se obtuvo.
Sin embargo, la respuesta relativa del detector para el analito y el patrón es normalmente constante en un amplio intervalo de condiciones. 55
Calibración mediante adición de un patrón interno
Si la señal del patrón aumenta en un 8,4%, a causa de un cambio en el caudal del disolvente, la señal del analito de ordinario aumenta también en un 8,4%.
Mientras sea conocida la concentración de patrón, se puede deducir la concentración correcta del analito.
Cuando la respuesta relativa del instrumento al analito y el patrón permanece constante a lo largo de un intervalo de concentraciones, decimos que hay una respuesta lineal.
En trabajos rigurosos, esta suposición debe verificarse, porque no siempre es verdadera.
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Calibración mediante adición de un patrón interno
Si el detector responde de igual manera al estándar que al analito, F = 1. Si el detector con intensidad doble al analito que al estándar, F = 2. Si el detector responde con una intensidad mitad al analito que al estándar, F = 0,5.
Factor de respuesta :
Área de la señal del patrón Área de la señal del analito = F Concentración de analito Concentración de patrón
AX AS = F [X ] [S ] 57
CUESTIONES
1.- Realizar el análisis de regresión y calcular sensibilidad, LD y LC para los siguientes datos. Para un absorbancia de 1,582, calcular la concentración y el error asociado: Xi (µg/l As)
Yi (absorbancia)
0,5
0,154
1
0,299
2
0,53
5
1,296
10
2,592
y
2.- En el análisis de Fe en un material de referencia certificado de suelo se determinó mediante espectroscopía atómica una concentración media (n=30) de 15 ± 0,2 mg/kg. Si el valor certificado es de 18 mg/kg, calcular la exactitud y %RSD 58