TRABAJO PRÁCTICO Nº 12 Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos específicos (Antibiogramas) OBJETIVOS: Conocer las distintas técnicas que permiten establecer el perfil de susceptibilidad de las cepas involucradas en procesos infecciosos de importancia clínica odontológica. Comprender la metodología empleada para obtener dicho perfil de susceptibilidad. Interpretar los resultados entregados por las distintas técnicas para una adecuada indicación terapéutica. La determinación del perfil de susceptibilidad de una cepa puede llevarse a cabo por distintas técnicas. Esta técnica varía según dos criterios fundamentales: 1.- El tipo de microorganismo (de crecimiento rápido, fastidioso, anaerobio estricto) 2.- Según la localización del sitio afectado por la infección (orina, LCR, humores estériles, colecciones poli-microbianas, osteomielitis, hemocultivos) La técnica de difusión en medio sólido (Antibiograma) es una técnica semicuantitativa y es la más utilizada para las cepas de fácil desarrollo, que proviene de sitios que no comprometen la vida del paciente. Ej: Enterobacterias causales de infecciones urinarias bajas, cocos positivos (Streptococcus pneumoniae), cocobacilos Gram negativos (Haemophyllus influenzae) provenientes de infecciones de vías aéreas superiores; cocos positivos (Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa negativo) de piel y partes blandas. Esta técnica fue descripta y se la conoce hasta estos días, como el método de Kirby Bauer. Consiste en realizar una suspensión bacteriana en solución fisiológica a partir de un cultivo puro de 24 hr, mono microbiano, de una cepa biotipificada y caracterizada. El inóculo es comparado con el tubo 0.5 de la escala de Mc Farland equivalente a una suspensión bacteriana de 1.5 x 108 UFC/ml. El inóculo recién preparado se siembra por medio de un hisopo por estriado confluente en una placa con medio Muller Hinton. Dentro de los 20 minutos posteriores a la inoculación de la placa, deben colocarse los discos de los antimicrobianos a probar. Las series antibióticas varían según el microorganismo y el sitio de infección primario (infección urinaria distinta de neumonía) y eso se relaciona con la fármaco dinamia y fármaco cinética de los quimioterápicos empleados.

3 a 4 colonias +

S.aureus Cultivo de 24hs

5 ml Solución Fisiológica

0.5 Mc F

HISOPADO DE LA PLACA

COLOCACIÓN DE DISCOS: Una vez hisopada la placa, se colocan los discos de antibiótico, en sentido de las agujas de reloj, a una distancia que permita la lectura de los halos de inhibición. En una placa de 9 cm de diámetro no deben colocarse más de 6 discos.

INCUBACIÓN Y LECTURA: Las placas se incuban invertidas a 36º C+1 durante 18 a 24 hs dependiendo del microorganismo. La lectura se realiza midiendo los halos de inhibición formados alrededor de los discos con una regla o calibre. Los valores en expresados en mm se interpolan en tablas que establecen los puntos de corte en S (sensible) / I (intermedio) / R (resistente). Y esos resultados son los que se brindan en el informe.

En los casos que la infección se encuentre en sitios estériles del organismo (líquido céfalo raquídeo, humores acuosos, abscesos hepáticos, sepsis, osteomielitis, mediastinitis, endocarditis…) es necesario conocer la concentración de antimicrobianos capaz de inhibir el crecimiento microbiano

(CIM: Concentración inhibitoria mínima) y aquella concentración capaz de provocar la muerte bacteriana (CBM: Concentración bactericida mínima). Otras utilidades, es la de conocer la concentración inhibitoria de nuevas drogas, o la susceptibilidad de microorganismos de difícil desarrollo, anaerobios estrictos (Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis), hongos filamentosos. Para ello se establece una metodología cuantitativa que se puede realizar de tres formas distintas: 1.- Macro dilución 2.- Micro dilución. 3.- Elusión en placa o epsilometría. El fundamento consiste en someter al inóculo microbiano estandarizado (0.5 de Mc Farland) a concentraciones decrecientes de antimicrobiano.

MACRODILUCIÓN: 1 ml solución ATB

1 ml Caldo Muller Hinton CC madre de ATB 1 ugr/ml

0.5

0.25

0.175

0.0875

0.043

0.022

1 ml Suspensión bacteriana 2 ml Caldo Muller Hinton Vol. final Inóculo 0.5 Mc Farland

0.25

0.175

0.0875

0.043

0.022

0.011

INCUBACIÓN: La batería de tubos se incuba a 36ºC+ 1ºC por 24 hs en atmósfera común. LECTURA: Se observa el desarrollo microbiano de los tubos. Se considera CIM a aquel tubo que no presente desarrollo turbidimétrico.

Control de crecimiento

0.25

0.175

0.0875

0.043

0.022

0.011

INTERPRETACIÓN: Se considera CIM al primer tubo que no presenta desarrollo microbiano. En nuestro ejemplo corresponde al tubo con una concentración antibiótica de 0.0875 ugr/ml. Para establecer la CBM, los tubos que no presentan desarrollo o turbidez, son repicados a placas de Petri con medio sólido y se incuban a 36ºC + 1ºC por 24 hs en atmósfera común. Se considera CBM al tubo cuya concentración de ATB no permita el desarrollo bacteriano en la placa de Petri.

0.25

0.175

0.0875

0.043

0.022

0.011

Control de crecimiento

Crecimiento positivo Crecimiento negativo

CIM = CBM. Antimicrobiano bactericida

INFORME: El informe microbiológico especifica la cepa, el origen del aislamiento y el título del antibiótico que inhibió el desarrollo microbiano. Ej: Staphylococcus aureus, Cepa aislada de muestra de hueso mandíbula inferior. CIM a Penicilina de 0.0875 ugr/ml INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: Según la farmacocinética, farmacodinamia del antimicrobiano, el odontólogo, cirujano o médico tomará la decisión respecto a la utilidad de dicho antimicrobiano según su perfil de dosificación, vía de administración y condiciones del paciente, etc.

Se sugiere la lectura del Capítulo 31 5ta parte. 561-571. Negroni M Microbiología Estomatológica. Fundamentos y guía práctica. 2da Edición.

Caso problema Paciente de sexo femenino; 40 años de edad; con mala higiene bucal que presenta caries abiertas en sectores anteriores (4.1, 4.2, 3.1, 3.2). con enfermedad gingivoperiodontal activa. Concurre a la consulta por dolor y un absceso y tumefacción extraoral en la zona submentoniana. A la inspección presenta adenopatías submandibular. Ausencia de cuadro febril. No se encuentra bajo tratamiento antibiótico. Se procede a la toma de material del proceso infeccioso, realizando los siguientes pasos: • Antisepsia de la zona • Lavado • Punción aspirativa La muestra es colocada en un medio de transporte VMGA III y se acompaña de 2 extendidos y una alícuota en tubo estéril. Protocolo de investigación microbiológica y diagnóstico presuntivo. Resultados de laboratorio: Examen microscópico directo: Giemsa: Respuesta Inflamatoria positiva. Se observa elementos bacterianos cocoideos intra y extracelulares. Gram: Se observan cocos Gram positivos intra y extracelulares dispuestos de a pares. Cultivo: Staphylococcus aureus y Streptococcus grupo viridans Antibiograma por difusión: Penicilina: S Eritromicina: S Clindamicina: S Gentamicina: S

Tetraciclina: S Amoxicilina Ac. Clavulanico: S Oxacilina: S

El paciente fue medicado con Penicilina. Evoluciona favorablemente en los controles. Regresa a los 3 meses con un cuadro de movilidad dentaria en la zona antero inferior y un proceso infeccioso purulento que drena por medio de una fistula hacia vestibular. Se realiza Rx y una nueva toma de muestra para biopsia y estudio microbiológico. • Toma biopsia y toilette quirúrgica de la zona

Examen radiográfico: Se observan zonas con secuestros óseos. Biopsia: Respuesta inflamatoria con elementos bacterianos cocoides. Diagnóstico compatible con osteomielitis. Examen microscópico directo: Giemsa: Respuesta Inflamatoria positiva. Se observa elementos bacterianos cocoideos intra y extracelulares. Gram: Se observan cocos Gram positivos intra y extracelulares dispuestos de a pares. Cultivo: Staphylococcus aureus Prueba de susceptibilidad por dilución: CIM de penicilina: 0.087ugr/ml CIM de clindamicina: 0.1 ugr/ml Preguntas para trabajar en Clase • ¿A qué atribuye la falla terapéutica del primer tratamiento? • ¿Por qué el laboratorio no informa el perfil de susceptibilidad del Streptococcus grupo viridans? • ¿Por qué ante el diagnóstico de osteomielitis, el profesional solicito al laboratorio una CIM y no un antibiograma por difusión? • ¿Qué información obtiene con el valor de CIM? • ¿Qué información obtiene con el valor de CBM? • ¿Cuáles son los sitios diana de los antibióticos probados en la CIM?

Diagnóstico indirecto Diagnóstico Microbiológico Directo. Implica la demostración del agente microbiano, sus metabolitos o componentes antigénicos en los fluidos orgánicos. Los métodos consisten en: • En fresco Examen microscópico de las muestras obtenidas • Coloraciones (Gram, Giemsa) Cultivos Métodos Inmunológicos (Aglutinación, Inmunofluorescencia, ELISA, etc.) Métodos Moleculares (PCR, sonda, hibridación) Inoculación en animales de experimentación Diagnóstico Indirecto. Implica la demostración de la huella que el agente ha dejado en su contacto con el sistema inmune. El método consiste en Detección de Anticuerpos Pruebas de Inmunidad celular; intradermo reacción La respuesta inmunológica frente a los microorganismos puede ser natural o adquirida. Esta respuesta inmune adaptativa o adquirida, caracterizada por la memoria inmunológica, le permite a un organismo rápida y eficazmente reaccionar frente al reingreso del antígeno. En el laboratorio es posible medir esta respuesta, mediante técnicas de diagnóstico indirecto. Esta respuesta está caracterizada por su especificidad y memoria inmunológica. La especificidad se refiere a la propiedad de responder únicamente frente a un determinado antígeno/epítope. Por lo tanto encontrar en el suero de un paciente anticuerpos detectables frente a un determinado antígeno microbiano hace suponer que el individuo ha estado en contacto con el mismo. La memoria inmunológica se caracteriza por una respuesta rápida frente a los antígenos a los que se ha estado expuesto previamente. Cuando un organismo entra en contacto con un antígeno, aparece precozmente la IgM pentamérica específica que persiste poco tiempo y cuya presencia indica infección en fase aguda (la cual no es siempre detectable). Entre los 7 a 10 días aparece gradualmente la IgG específica que se mantiene en concentraciones elevadas, durante periodos prolongados, o bien durante toda la vida, dependiendo del inmunógeno. Estudiar en un paciente la presencia de anticuerpos en dos muestras apareadas de un individuo, separadas por un intervalo de 15 días, permite establecer el fenómeno conocido como seroconversión, en el cual el segundo suero incrementa la detección de anticuerpo en al menos 2 diluciones del primero. El diagnóstico indirecto o serológico se basa en la detección, en el suero del paciente, de los anticuerpos producidos por los linfocitos B frente a los antígenos de los microorganismos infectantes. Es una reacción inmunoespecífica ya que estos anticuerpos sólo reaccionaran frente a los antígenos que los han originado. Los estudios serológicos permiten hacer diagnósticos indirectos y estudios epidemiológicos para conocer el estado inmunitario de la población. El diagnostico indirecto está indicado: •

Cuando los cultivos son negativos, debido a que los microorganismos no son cultivables (Treponema pallidum - agente etiológico de la sífilis) o porque el paciente se encuentra en tratamiento.

•

En caso de aislamientos mixtos

•

En el caso de microorganismos de crecimiento lento

•

En etapas subagudas donde los microorganismos son difíciles de recuperar.

•

En pacientes asintomáticos o casos atípicos.

•

Para evaluar la eficacia de un plan de inmunización (HBV)

•

Detectar primoinfección y discriminar (Toxoplasmosis en el embarazo)

•

Conocer la etapa en curso de una infección: aguda (IgM) o crónica (IgG).

•

Colaborar en el diagnóstico de infecciones parasitarias. (IgE)

con

infección

nueva

o

activa

Se sugiere la lectura del Capítulo 31 6ta parte. 573-593. Negroni M Microbiología Estomatológica. Fundamentos y guía práctica. 2da Edición.