UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL

CARACTERIZACIÓN Y PRUEBAS DE CONGELABILIDAD SEMINAL EN ASNOS BAUDET DU POITOU.

Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO.

FRANCISCA ANDREA EBEL BARRERA VALDIVIA – CHILE 2012

PROFESOR PATROCINANTE  

____________________________________________ 

Alfredo Ramírez Reveco.

PROFESOR COPATROCINANTE

_______________________________________ Omar Ulloa Guzmán.

PROFESORES INFORMANTES

_______________________________________ Marcos Moreira Espinoza.

PROFESORES INFORMANTES

_______________________________________ Juan Sebastián Galecio Naranjo.

FECHA DE APROBACIÓN: 17 de Agosto de 2012

ÍNDICE

Capítulos

Página

1. RESUMEN…………………………………………………………………….

1

2. SUMMARY…………………………………………………………………….

2

3. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….

3

4. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………....

9

5. RESULTADOS…………………………………………………………….…..

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6. DISCUSIÓN...…………………………………………………………….…...

20

7. REFERENCIAS……………………………………………………….………

24

8. ANEXOS……………………………………………………………….……...

26

9. AGRADECIMIENTOS…………………………………………………...…..

34

1   

1. RESUMEN

Con la finalidad de realizar estaciones de monta mediante la inseminación de yeguas con semen criopreservado de asnos Baudet du Poitou para mejorar la calidad mular y aumentar el fomento de la producción mular del Ejército de Chile, se propone la caracterización y la realización de pruebas de congelabilidad seminal en asnos de esta raza.   Para este estudio se utilizaron eyaculados de dos asnos Baudet du Poitou del Ejército de Chile los cuales fueron caracterizados en términos físico-químicos y funcionales, y posteriormente criopreservados con Botucrio® o HM-0. Finalmente, las muestras criopreservadas fueron descongeladas y evaluadas mediante análisis espermático asistido por computadora (CASA) en términos de su congelabilidad según viabilidad, integridad acrosomal y parámetros de motilidad. Los resultados de volumen seminal y recuento espermático observados a partir de la evaluación físico-química de los eyaculados frescos fueron 48,6±16,1 mL y 376±205 x106/mL, respectivamente. Los valores obtenidos a nivel de pH y osmolaridad fueron 7,4±0,1 y 286±6,5 mOsm/kg, respectivamente. En el caso de los parámetros funcionales, la viabilidad y la morfología fue de 81,7±6,6% y 77,3±8,7%, respectivamente, mientras que la motilidad total y progresiva fue de 87,8±7,6% y 63,6±13,5%, respectivamente. En cuanto a las características de movimiento, los espermatozoides de los ejemplares analizados presentaron mayores velocidades (VCL, VAP y VSL) en comparación a lo reportado en la literatura para semen asnal. Por otro lado, las muestras seminales criopreservadas con Botucrio® evidenciaron resultados superiores de congelabilidad en comparación con el uso de HM-0 (P0,05). Se concluye que los resultados obtenidos a partir de la evaluación de los eyaculados frescos corresponden a una caracterización seminal disponible para manejo clínico y reproductivo de estos sementales. Por otra parte, las pruebas de congelabilidad demostraron que Botucrio® otorga una mayor protección a los espermatozoides asnales durante la criopreservación en comparación con HM-0 según viabilidad y parámetros de motilidad post-descongelación. De este modo, Botucrio® puede ser utilizado en la criopreservación seminal de asnos Baudet du Poitou mientras que HM-0 no es capaz de crioproteger a los espermatozoides asnales de esta raza. Palabras clave: asno Baudet du Poitou, semen, diluyentes de criopreservación.

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2. SUMMARY

CHARACTERIZATION AND TESTS OF SEMINAL FREEZABILITY IN POITOU DONKEYS. In order to perform breed seasons through artificial insemination of mares with cryopreservated Poitou donkey semen to enhance the mular quality and improve the encouragement of mular production of Chilean Army, it was proposed the characterization and tests of seminal freezability in Poitou donkeys. The study was performed from two Poitou donkeys belonging to Chilean Army in which the ejaculates were taken for physical-chemical and functional characterization and then cryopreservated with Botucrio® or HM-0. Finally, the cryopreservated samples were thawed and analyzed with the computer assisted sperm analysis (CASA) in terms of their freezability, specifically by viability, acrosomal integrity and motility parameters. The results of seminal volume and sperm count obtained from the physical-chemical evaluation were 48,6±16,1 mL and 375,7±205,4 x106/mL, respectively. The values observed for pH and osmolarity were 7,4±0,1 and 286±6,5 mOsm/kg, respectively. The results of the functional evaluation of viability and morphology were 81,7±6,6% and 77,3±8,7%, respectively, while the total and progressive motility were 87,8±7,6% and 63,6±13,5%, respectively. In relation to the sperm motility characteristics of the ejaculates analyzed, it was observed higher sperm velocities (VCL, VAP and VSL) than those reported for donkey sperm in the literature. The samples cryopreserved with Botucrio® showed better results of freezability compared to HM-0 (P0,05). It was concluded that the results of fresh semen evaluation represent a seminal characterization available for clinical and reproductive management of these donkeys. Otherwise, tests of seminal freezability showed that freezing extender Botucrio® provide better protection for storage of frozen donkey spermatozoa than HM-0 in terms of their post-thaw viability and motility parameters. In this way, Botucrio® can be used in the Poitou donkey semen cryopreservation while HM-0 is unable to cryoprotect to sperm donkeys of this breed. Keywords: Poitou donkey, semen, freezing extenders.

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3. INTRODUCCIÓN

3.1

ANTECEDENTES GENERALES

Durante siglos se ha reconocido al macho asnal como donador genético para la producción mular. La mula es un animal híbrido generado mediante la cruza de una hembra equina (Equus caballus) y un macho asnal (Equus asinus), la cual es muy deseada en el medio rural porque reúne las mejores características, fuerza y resistencia, de estas dos especies en un único animal (Oliveira 2005). De esta forma, las mulas son más fuertes, menos temperamentales, más longevas y más resistentes a enfermedades que los equinos. Dentro de los asnos utilizados para la producción mular, la raza Baudet du Poitou es la más antigua y la más reconocida mundialmente en esta área por la generación de mulas rústicas, potentes y de gran tamaño, las que han sido utilizadas preferentemente en actividades agrícolas y propias del Ejército (Kugler y col 2008). El Baudet du Poitou es un asno de gran tamaño (1.35-1.56 metros y 350-420 kg) con miembros fuertes, articulaciones firmes y cascos de gran tamaño. El cuello es largo y grueso, la espalda es larga y recta y la grupa es corta y poco desarrollada. Lamentablemente el Baudet du Poitou es una raza en peligro de extinción aunque existen señales alentadoras respecto a su recuperación (Kugler y col 2008). En 1997 el SABAUD (Asociación Francesa para la Protección del Baudet du Poitou) contabilizó 132 machos y 278 hembras de esta raza asnal en todo el mundo donde un tercio corresponde al sector de Poitou (Francia), un tercio al resto de Francia y un tercio a países extranjeros (SABAUD 2011 1). En Chile según el Censo Agropecuario del 2007 existe una población de équidos de 326.786 cabezas, de las cuales 7.157 corresponden a mulares y 15.307 a asnales (INE 2007 2). De esta población nacional, el Ejército aporta con un ganado de 1.392 équidos, dentro de los cuales 583 son mulares y solo 5 del total de asnos corresponden a la raza Baudet du Poitou, los que fueron importados como reproductores desde Francia el año 2007 por el Ejército de Chile con la finalidad de mejorar la calidad mular de esta institución en la infantería de montaña a lo largo del país. En adición, desde el 2007 hasta la fecha se han generado 140 mulas por cruza de asnos Baudet du Poitou (Ortiz 2012 3). En consecuencia, y teniendo en cuenta: 1) los beneficios que este asno representa para la producción mular en las unidades de montaña del Ejército de Chile; 2) la futura realización de estaciones de monta mediante la inseminación con semen criopreservado de asnos Baudet du Poitou para aumentar el fomento de la producción mular en esta institución; y 3) la escasez de estos reproductores en Chile y en el mundo, es que se hace necesaria la preservación del material genético mediante bancos de semen congelado. ____________________________________________________________________________ Sitio oficial de la SABAUD (Association de Sauvegarde du Baudet du Poitou). Última actualización en el año 2011. http://www.baudet-du-poitou.fr/Sabaud.htm. 2 INE, Instituto Nacional de Estadísticas de Chile. 2007. VII Censo Nacional Agropecuario 2006-2007. 3 Exposición del Coronel Francisco Ortiz S. del Ejército de Chile en el seminario “Equinos de tiro: Importancia Económica y Social en el Chile Actual”. 2012. Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. 1

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3.2

CARACTERÍSTICAS SEMINALES

La evaluación seminal es una herramienta utilizada principalmente para determinar la capacidad de fertilización del espermatozoide, y por ende predecir el potencial fértil de un determinado reproductor (Davies-Morel 1999). Además permite la selección de eyaculados para procesos de refrigeración y congelación. Sin embargo, esta evaluación no permite determinar la fertilidad real de un reproductor, la cual deberá ser evaluada mediante métodos directos de fertilidad. En équidos los métodos clásicos de evaluación analizan un conjunto parámetros espermáticos ya que la evaluación aislada de éstos posee un valor limitado en la predicción de calidad seminal. De esta forma, las características más evaluadas corresponden a la integridad de las membranas plasmática y acrosomal, morfología y las velocidades y trayectorias de movimiento debido a que espermatozoides con membranas íntegras, morfología normal y con motilidad rápida y progresiva tendrán una mayor probabilidad de fertilizar al ovocito (Canisso 2008). Los asnos son una de las tres especies domésticas que eyaculan mayores volúmenes seminales, que en orden creciente corresponden al asno, potro y verraco. En adición, también es la especie doméstica que posee mayor recuento espermático y mayor eficiencia espermatogénica por gramo de parénquima testicular (Canisso 2008). De esta forma, Kreuchauf (1984) realizó un estudio donde se evaluaron 204 eyaculados de seis asnos entre 2 y 12 años de edad, reportando que los volúmenes seminales variaron entre 13 y 150 mL (41,9 mL en promedio), no obstante, también señala que algunos reproductores pueden llegar a eyacular cantidades sobre los 200 mL. Este autor además reportó que los reproductores presentaron un recuento espermático que varió de 180 a 1.330 millones de espermatozoides por mL (460 x106/mL en promedio) y un número total de espermatozoides que varío de 4 a 44 billones (18 x109 en promedio). Otros autores también han evaluado estas características en eyaculados asnales reportando valores de 29,2±2,2 mL y 13,3±1,2 x109 (Gastal y col 1996); 56,6±23,1 mL y 280±228 x106/mL (Miró y col 2005); 47,2±28,6 mL, 254±91 x106/mL y 10,3±3,4 x109 (Canisso 2008); y 64,1±2,6 mL, 338±1,7 x106/mL (Miró y col 2009). Por otro lado, la viabilidad espermática en la especie asnal varían de 70 a 85% (Gastal y col 1996, Miró y col 2005, Canisso 2008, Miró y col 2009) mientras que los porcentajes de motilidad total y progresiva varían en promedio de 70 a 100% en el caso de la motilidad total (Trimeche y col 1996, Miró y col 2005, Canisso 2008, Miró y col 2009) y de 70 a 80% en el caso de la motilidad progresiva (Kreuchauf 1984, Gastal y col 1996, Canisso 2008, Miró y col 2009). La motilidad es la característica espermática más comúnmente evaluada en el análisis de calidad seminal. La motilidad total y particularmente la motilidad progresiva son buenos indicadores de viabilidad en equinos y su correlación con la fertilidad es de r=0,34 y r=0,27 en el caso de la motilidad total y progresiva, respectivamente (Davies-Morel 1999, Canisso 2008). Sin embargo, esta evaluación no es capaz de diferenciar espermatozoides mótiles con membrana plasmática íntegra de espermatozoides mótiles con membrana plasmática dañada. Por esta razón, a pesar de que la motilidad espermática debe estar presente para que ocurra la fertilización no necesariamente es un buen indicador de capacidad fecundante debiendo complementar este análisis con el de viabilidad, el que permite distinguir espermatozoides con membranas plasmáticas íntegras o dañadas (Davies-Morel 1999, Canisso 2008, Nascimento y col 2008), las

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cuales deberán estar intactas para el desencadenamiento de los mecanismos fisiológicos del espermatozoide involucrados en la fertilización (De Oliveira 2007). La motilidad espermática puede ser evaluada subjetivamente mediante microscopio óptico u objetivamente mediante el sistema computacional CASA (Computer Assisted Sperm Analysis). Este último provee información adicional sobre las características del movimiento espermático determinando las velocidades y trayectorias de los espermatozoides. No obstante, el elevado costo de este equipo restringe su utilización al área de investigación (Davies-Morel 1999, Canisso 2008). Los parámetros de motilidad más evaluados corresponden a: 1) porcentajes de motilidad: total y progresiva; 2) velocidades de motilidad: rectilínea (VSL), curvilínea o real (VCL) y media (VAP); 3) índices de motilidad: de linealidad (LIN), de rectitud (STR) y oscilación lateral de la cabeza (WOB); 4) amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH); y 5) frecuencia de cruce (BCF). Las velocidades de motilidad indican la rapidez con que los espermatozoides se mueven en una determinada trayectoria mientras que los índices de motilidad indican la forma de la trayectoria de los espermatozoides, donde la linealidad y progresividad de las trayectorias están representadas por LIN y STR, respectivamente. Por último, BCF permite estimar cambios en el patrón de movimiento flagelar mientras que ALH en conjunto de VCL en equinos y VCL y LIN en humanos determinan hiperactividad del espermatozoide (Mortimer 2000, Miró y col 2005). A pesar de los 21 parámetros de motilidad que describe el sistema CASA, Miró y col (2009) señalan que solo 6 de éstos son suficientes para explicar por completo el movimiento del espermatozoide asnal. Estas variables corresponden a: VAP, ALH, LIN BCF, menor oscilación armónica de la cabeza (HLO) y desplazamiento medio angular algebraico (MAD). Se ha evidenciado que la motilidad de los espermatozoides asnales es más rápida, menos lineal y con una mayor intensidad en el movimiento lateral de la cabeza en comparación a los espermatozoides de verracos, debido a la elevada actividad mitocondrial en la pieza intermedia de las células asnales (Flores y col 2008). En comparación con los espermatozoides equinos, los espermatozoides asnales son más rápidos, no obstante, su progresividad es relativamente similar (Quintero-Moreno y col 2003, Miró y col 2005). La morfología espermática también es una característica importante de evaluar debido a que espermatozoides morfológicamente anormales poseen una menor habilidad de fertilización, principalmente por compromiso de la motilidad y de la unión y penetración del ovocito (Miró y col 2005, Canisso 2008). Se estima que los eyaculados asnales presentan en promedio porcentajes de 17 a 20% de espermatozoides morfológicamente anormales (Gastal y col 1996, Miró y col 2005, Canisso 2008, Miró y col 2009). Por último, el pH y la osmolaridad también son parámetros importantes en la evaluación seminal debido a que son útiles en la identificación de alteraciones seminales como modificaciones en el número de espermatozoides viables, modificaciones en la producción espermática, procesos infecciosos o presencia de material extraño como la urea, la cual es la etiología más frecuente de contaminación seminal denominada urospermia. Estas condiciones generan efectos adversos sobre la morfología del espermatozoide (principalmente cabeza y cola), funcionalidad espermática y en casos severos genera incluso ruptura de la membrana plasmática (Davies-Morel 1999). Los valores de pH en el semen asnal varían de 7,0 a 7,7 (Kreuchauf 1984, Gastal y col 1996, Miró y col 2005, Miró y col 2009), por el contrario, no se encontraron referencias respecto a la osmolaridad del semen asnal.

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3.3

CRIOPRESERVACIÓN ESPERMÁTICA

A partir del descubrimiento accidental de las propiedades crioprotectoras del glicerol se han establecido protocolos de congelación específicos para cada tipo celular. En el caso de la congelación de semen de asnos los primeros trabajos fueron publicados en los años ´60 del siglo XX (Canisso 2008). Actualmente se han reportado protocolos específicos de congelación para semen asnal (Trimeche y col 1998, Vidament y col 2006) y evidencias de nacimientos de crías asnales obtenidas mediante inseminación artificial con semen congelado (Trimeche y col 1998). Sin embargo, a pesar de que esta biotecnología otorga grandes ventajas al ser un instrumento de mejoramiento genético, las bajas tasas de preñez asociadas a la inseminación con semen criopreservado en comparación con el semen fresco o refrigerado sigue siendo el principal inconveniente. Se ha establecido que el proceso de congelación/descongelación disminuye la habilidad de fertilización espermática debido a lesiones en las membranas donde solo el 50% de los espermatozoides son capaces de sobrevivir a este proceso (Canisso 2008, Nascimento y col 2008). De este modo, para que el espermatozoide pueda desempeñar adecuadamente la fertilización del ovocito debe preservar algunas características esenciales como: metabolismo para la producción de energía; presencia de motilidad progresiva; retención de proteínas necesarias para la supervivencia de éste en el tracto reproductor de la hembra; presencia de enzimas acrosomales esenciales para la penetración del ovocito; y membranas plasmática y acrosomal estabilizadas para que ocurra reacción acrosómica, unión y fusión al ovocito (Canisso 2008). En asnos, se ha sugerido que las muestras seminales deben presentar como mínimo 300 millones de espermatozoides por mL y 70% de motilidad progresiva y como máximo 25% de patología morfoespermática para obtener adecuado resultados de congelabilidad (Arruda y col 1989). Trimeche y col (1998) inseminaron asnas con al menos 35% de motilidad total postdescongelación, obteniendo un 62% de preñez (8/13 hembras). De forma similar, Vidament y col (2006) utilizaron muestras con al menos 35% de motilidad total post-descongelación, obteniendo un 64% de preñez en asnas (7/11 hembras) y un 87% de preñez en yeguas (13/15 hembras). Papa y col (1999) reportan la utilización de muestras con al menos 50% de motilidad total y 70% integridad acrosomal para inseminar yeguas, obteniendo un 67% de preñez (2/3 hembras). Pese a que la reducción de temperatura favorece la conservación del semen también es un proceso dañino para la célula espermática. Se estima que solo el 30-40% de los potros producen semen apto para soportar el proceso de criopreservación al igual como ocurre en machos de otras especies animales (Alvarenga y col 2005). De esta forma, el éxito del proceso de criopreservación está determinado por varios factores dentro de los cuales la fluidez de la membrana plasmática durante este proceso es fundamental y determinará la habilidad del espermatozoide de atravesar los rangos críticos de temperatura. Durante el proceso de congelación los lípidos de la membrana plasmática se encuentran en una fase de transición limitando el paso de sustancias a través de ésta lo cual aumenta la susceptibilidad de la membrana a sufrir daños en un proceso denominado “shock térmico” el que se caracteriza principalmente por modificaciones en los patrones de movimiento y aumento de la permeabilidad celular. En adición, para que los espermatozoides sean capaces de sobrevivir al proceso de criopreservación es necesario que estén en un medio que les otorgue nutrientes y protección físico-química asociados a una curva óptima de congelación, disminuyendo la probabilidad de formación de cristales de hielo intracelulares y de alteraciones celulares por estrés osmótico. Los crioprotectores son sustancias presentes en los diluyentes de

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refrigeración y de congelación los cuales protegen parcialmente al espermatozoide durante estos procesos. Los crioprotectores más utilizados en la congelación seminal de équidos corresponden a alcoholes, amidas, azúcares, aminoácidos, proteínas y lípidos presentes en la leche y en la yema de huevo, dimetilsulfóxido (DMSO) y etilenodiaminotetracético (EDTA) (Oliveira 2005, Canisso 2008). Se ha reportado que la asociación de diferentes crioprotectores (como aminoácidos y lipoproteínas) durante la criopreservación espermática presenta una superioridad en la protección de éste debido a la sumatoria de los distintos efectos crioprotectores (Trimeche y col 1998). El glicerol es el crioprotector más utilizado en la congelación de semen de équidos (Oliveira 2005) y se ha sugerido que es esencial en la congelación seminal de asnos (Trimeche y col 1996). Se ha determinado que la concentración ideal de glicerol en los diluyentes de criopreservación de semen asnal es menor o igual a 2,2% (Vidament y col 2006). A pesar de la importancia de este crioprotector en la congelación seminal, el uso de las amidas y sobre todo las formamidas otorgan mayores efectos crioprotectores a los espermatozoides que el glicerol mejorando significativamente los parámetros post-descongelación de motilidad total y progresiva e integridad de membranas. Las amidas poseen menor peso molecular que el glicerol (glicerol=92 vs. metilformamida=59 y dimetilformamida=73) sugiriendo que éstas generan menor estrés osmótico a la célula espermática (Alvarenga y col 2005, Oliveira 2005, Canisso 2008). Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) presentes en la yema de huevo son el crioprotector más eficiente en la protección espermática contra el shock térmico ya que otorga resistencia a la membrana plasmática durante el proceso de congelación/descongelación. Su acción crioprotectora está dada por su característica hidrosoluble y composición lipoprotéica. El mecanismo exacto por el cual las LDL protegen a los espermatozoides se desconoce, no obstante, se ha propuesto que éstas permiten la adaptación del espermatozoide a bajas temperaturas mediante su unión a las proteínas del plasma seminal que inducen capacitación espermática evitando la remoción del colesterol y de los fosfolípidos presentes en la membrana plasmática. Además se ha propuesto que los fosfolípidos de las LDL se unen la superficie celular formando una capa protectora y que estabilizan la membrana plasmática debido a modificaciones estructurales en ésta. La yema de huevo de gallina es la más utilizada en la formulación de diluyentes para équidos utilizando concentraciones de 2 a 20% (De Oliveira 2007, Canisso 2008). Trimeche y col (1997) criopreservaron semen de asnos Baudet du Poitou con diferentes concentraciones de yema de huevo gallina reportando que los mejores resultados de congelabilidad se obtienen con el uso del 5% de ésta. Dentro de los diluyentes de criopreservación utilizados para la congelación seminal, Botucrio® es uno de los más usados a nivel mundial principalmente para la congelación de semen equino. Éste es un diluyente derivado de amidas el cual contiene además otros agentes crioprotectores como aminoácidos, azúcares, yema de huevo y glicerol, los que otorgan mayores resultados de congelabilidad y de fertilidad en comparación con otros diluyentes comerciales ausentes de amidas (Botupharma 2012 4). Por su parte, HM-0 es un diluyente experimental con mínimas condiciones energéticas creado en la Universidad Austral de Chile para la congelación de semen equino basado en yema de huevo y glicerol donde el único componente energético es aportado por la glucosa (3 mM final) y los lípidos de la yema de huevo. _______________________________________________________________________ 4

Botupharma, São Paulo, Brasil. 2012. http://www.botupharma.com.br

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3.4

HIPÓTESIS

Es posible obtener congelabilidad de espermatozoides asnales mediante la utilización de los diluyente de criopreservación Botucrio® y HM-0. 3.5

OBJETIVOS

3.5.1

Objetivo general Determinar las características seminales de los eyaculados frescos de asnos Baudet du Poitou y determinar y comparar los parámetros de congelabilidad espermática postdescongelación de los eyaculados de estos asnos utilizando los diluyentes de criopreservación Botucrio® o HM-0. 3.5.2 Objetivos específicos 1) Caracterizar los eyaculados frescos de dos asnos Baudet du Poitou en términos físicoquímicos y funcionales. 2) Evaluar y comparar la viabilidad espermática e integridad acrosomal post-descongelación de los eyaculados de dos asnos Baudet du Poitou criopreservados con Botucrio® o HM-0. 3) Evaluar y comparar la motilidad total y progresiva y las características de movimiento post-descongelación de los eyaculados de dos asnos Baudet du Poitou criopreservados con Botucrio® o HM-0.

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4. MATERIAL Y MÉTODOS

4.1

MATERIAL

Para este estudio se utilizaron dos reproductores asnales de la raza Baudet du Poitou pertenecientes al Haras Miltar Pupunahue (Los Lagos, Región de Los Ríos). El animal 1 tenía 6 años de edad y pesaba 450 Kg. El animal 2 tenía 3 años de edad y pesaba 380 Kg. Ambos animales se encontraban en condiciones saludables determinadas mediante examen clínico general y andrológico, siendo considerados aptos para reproducción. El protocolo del examen clínico general se basó en la determinación del peso vivo, inspección general, frecuencias y constantes (frecuencia cardíaca y respiratoria y temperatura), examen de piel y pelaje, examen de mucosas y examen de nódulos linfáticos. El protocolo del examen andrológico se basó en la inspección y palpación del aparato reproductor externo, la evaluación del comportamiento sexual y de la monta y la evaluación de calidad seminal según los parámetros de volumen seminal, concentración espermática, porcentaje de espermatozoides viables y porcentaje de espermatozoides mótiles. La evaluación y criopreservación de los eyaculados frescos se realizó en el Haras Militar Pupunahue para lo cual se utilizaron los siguientes equipos: espectrofotómetro Accuread IMV Technologies, centrífuga C-28A Boeco, estufa type U15 Memmert, microscopio óptico Standard 25 ICS Zeiss, microscopio de contraste de fases Eclipse E-200 Nikon, platina termorregulada Platcal, refrigerador Fensa, termocupla Datalogger modelo TPD8356 Lascar y tanque de nitrógeno líquido MVE XC Millennium 20 Chat. La evaluación de pH y osmolaridad del semen fresco se realizó en el laboratorio del Instituto de Ciencia Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Austral de Chile, donde se utilizaron los siguientes equipos: pHmetro PL-600 MRC y osmómetro Osmomat030 Gonotec. Además se utilizaron los siguientes equipos para la descongelación y evaluación de los eyaculados criopreservados: máquina de baño térmico Fisher Versa-Bath, cámara digital Basler scA780-54fc acoplada al microscopio de contraste de fases y epifluorescencia Eclipse E-200 POL Nikon y platina termorregulada Platcal. 4.2 4.2.1

MÉTODOS

Colecta del semen Previo al inicio del estudio los reproductores fueron sometidos a colectas de semen seriadas durante dos semanas con un intervalo de 48 horas entre ellas durante el mes de enero de 2011 con el fin de eliminar las reservas espermáticas extra-gonadales. Posteriormente los reproductores fueron colectados cada 48 horas utilizando una hembra asnal en celo y una vagina artificial modelo Hannover con envase colector graduado y filtro de nylon para la retención de la fracción gel. Se obtuvieron un total de siete eyaculados por animal (n=14), los cuales fueron

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utilizados para la evaluación seminal y criopreservación (n=14) y el análisis de plasma seminal (n=12). Para la obtención de plasma seminal se separaron 15 mL de cada eyaculado colectado en un tubo Falcon y se centrifugaron a 2700 g por 15 minutos. El sobrenadante de cada tubo fue almacenado a -20°C hasta la realización del análisis de pH y osmolaridad. De cada eyaculado colectado también se separaron 40 µL de semen en dos tubos Eppendorf de 1,5 mL diluidos a 1:10 v/v (para el animal 1) y 1:5 v/v (para el animal 2) con leche descremada mantenida a 37°C para el análisis de motilidad. La muestra restante fue diluida a 1:1 v/v con leche descremada mantenida a 37°C para la determinación de concentración, viabilidad y morfología. Para la congelación seminal dos tubos Falcon con 15 mL de cada muestra diluida fueron centrifugadas 660 g por 15 minutos para la remoción del plasma seminal. Durante el análisis seminal las muestras se mantuvieron temperadas en una estufa a 37°C. 4.2.2 Parámetros evaluados en el semen fresco 4.2.2.1 Parámetros físico-químicos: El volumen seminal se determinó mediante envases colectores graduados. La concentración espermática se determinó mediante un espectrofotómetro calibrado para semen equino. El número total de espermatozoides se calculó matemáticamente mediante la multiplicación de la concentración y el volumen seminal. El pH se analizó mediante un pHmetro y la osmolaridad mediante un osmómetro. 4.2.2.2 Parámetros funcionales: La viabilidad y la morfología fueron evaluadas mediante el método de eosina-nigrosina (50 g/L de eosina y 100 g/L de nigrosina) utilizando una proporción 1:1 v/v con 3 µL de la muestra seminal. Se observaron 200 células en cada evaluación. Para el análisis de viabilidad se utilizó un microscopio óptico 40X y se calculó el porcentaje de células espermáticas vivas considerando células muertas o no viables aquellas células teñidas total o parcialmente de color rosado-púrpura mientras que aquellas células sin tinción (color blanco) fueron consideradas como vivas o viables. En el análisis de morfología se utilizó un microscopio óptico 100X con aceite de inmersión y se determinó el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales considerando cabeza, pieza intermedia y cola. Los parámetros de motilidad fueron analizados mediante el sistema computacional CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) específicamente a través de Sperm-Class Analyzer® (SCA®) v4.2.0.1 (Microptic S.L, Barcelona, España) utilizando 7 µL de semen en duplicado de cada eyaculado, los cuales fueron observados bajo microscopio de contraste de fases 10X(-) acoplado a una platina termorregulada a 37°C. Se analizaron como mínimo 200 células en cada muestra independiente del número de campos, utilizando una configuración de análisis diseñada para la especie equina (Anexo 2). El CASA corresponde a un sistema computacional estandarizado para la evaluación de espermatozoides y se basa en el análisis de 25 imágenes digitales consecutivas por segundo utilizando un microscopio de contraste de fases. En este estudio se evaluaron los porcentajes de motilidad total y progresiva y las siguientes características de movimiento espermático: 1) velocidades de motilidad espermática: velocidad media (VAP), velocidad rectilínea (VSL) y velocidad curvilínea (VCL); 2) índices de motilidad espermática: índice de linealidad (LIN), índice de rectitud (STR) e índice de oscilación lateral de la

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cabeza (WOB); y 3) otros: amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH) y frecuencia de cruce (BCF) (Anexo 3 y 4). Solo aquellos eyaculados que presentaron porcentajes de viabilidad y de motilidad total iguales o superiores al 70% fueron congelados. 4.2.3

Congelación de las muestras seminales Las muestras de semen diluidas de cada animal fueron centrifugadas según el ítem 4.2.1. El pellet de cada tubo fue resuspendido a un recuento de 80 x106 espermatozoides/mL utilizando los diluyentes de criopreservación Botucrio® o HM-0 (la composición de ambos diluyentes se muestra en el Anexo 5). Para cada diluyente se utilizaron 20 pajuelas plásticas de 0,5 mL las que fueron identificadas con la fecha de colecta, nombre del semental y del diluyente utilizado. Posteriormente éstas fueron traspasadas a un rack y refrigeradas durante 60 minutos a 4°C a una tasa promedio de -0,3°C/min. Luego el rack fue posicionado horizontalmente en una caja de plumavit y expuesto a vapores de nitrógeno líquido a 4 cm sobre el nivel del nitrógeno durante 20 minutos utilizando una tasa de congelación promedio de -5,5°C/min hasta alcanzar los -105,9°C. Finalmente las pajuelas fueron inmersas en el nitrógeno (-196°C) durante 5 minutos y almacenadas en un tanque de nitrógeno líquido por al menos 21 días previo a su evaluación. La rampa de congelación a la cual las células espermáticas fueron sometidas fue determinada mediante el uso de una termocupla acoplada a un dispositivo de registro de datos. La rampa de congelación se muestra en el Anexo 6. 4.2.4

Descongelación del material criopreservado Las pajuelas fueron inmersas en un baño térmico a una temperatura de 37°C por 30 segundos. Se analizaron 2 pajuelas de cada lote (mismo semental y diluyente) evaluándose las siguientes variables de congelabilidad: viabilidad, integridad acrosomal, motilidad total, motilidad progresiva y características de movimiento. 4.2.5 Parámetros evaluados en el semen descongelado 4.2.5.1 Viabilidad e integridad acrosomal: La viabilidad fue evaluada mediante una tinción de fluorescencia en una mezcla de 2 µM de bromuro de etidio y 10 µM de naranja de acridina a una proporción 1:1 v/v con 3 µL de semen descongelado. Éstas fueron observadas bajo microscopio de epifluorescencia 10X(-) con un filtro de longitud de onda de 450-490 nm de excitación y 515 nm de emisión acoplado al sistema computacional CASA. Se consideraron células muertas o no viables aquellas cabezas espermáticas teñidas total o parcialmente de color rojo, mientras que aquellas cabezas teñidas únicamente de color verde fueron consideradas vivas o viables. La integridad acrosomal se analizó mediante el uso de la lectina Pisum sativum agglutinin (PSA) conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC). 50 µL de semen descongelado de cada lote se lavaron con la solución Tris/cítrico para posteriormente esparcir 30 µL de ésta en un portaobjeto y fijarla con metanol durante 1 minuto para permeabilizar la membrana plasmática. A continuación 50 µL de FITC-PSA fueron adicionados a la muestra, la cual se incubó durante 15 minutos para ser visualizada inmediatamente bajo microscopio de epifluorescencia 40X con el medio de montaje Dako. La integridad acrosomal de los espermatozoides se clasificó individualmente de acuerdo a la fluorescencia específica de FITC-PSA exhibida por la cabeza del espermatozoide. La lectina PSA es una fitohemaglutinina con afinidad por los residuos de manosa

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y galactosa de las glicoproteínas presentes en la membrana acrosomal. Esta lectina al conjugarse con FITC permite diferenciar la presencia o ausencia de esta membrana mediante la emisión de fluorescencia. En consecuencia, espermatozoides que exhiben fluorescencia verde intensa en la región acrosomal en contraste con una fluorescencia verde débil en la región subacrosomal y segmento ecuatorial fueron clasificados como acrosomas intactos, mientras que aquellos espermatozoides que exhiben fluorescencia verde débil y/o heterogénea sobre la región acrosomal o fluorescencia verde solo en la región ecuatorial fueron clasificados como acrosomas dañados. 4.2.5.2 Parámetros de motilidad: La motilidad total, motilidad progresiva y las características de movimiento se determinaron bajo las mismas metodologías señaladas en el ítem 4.2.2.2. Asumiendo una disminución del 50% en la viabilidad durante el proceso de congelación y descongelación en relación al porcentaje de viabilidad de los eyaculados frescos (≥70%), se consideró que se obtuvo una adecuada congelabilidad en aquellas muestras seminales con valores iguales o superiores al 35% de viabilidad posterior a la descongelación. 4.2.6

Análisis estadístico Los datos fueron almacenados, tabulados y procesados en una planilla Excel® (Microsoft Office 2007®) y analizados mediante el programa estadístico para datos tabulados EPIDAT 4.0. Se realizó un análisis descriptivo (media±DE) y se comprobó la normalidad y la homocedasticidad de los datos. Para determinar las diferencias entre animales, entre semen fresco y diluyentes y entre diluyentes se utilizó la prueba “t” de Student bajo un nivel de confianza del 95%, considerándose diferencia estadísticamente significativa un valor P