UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL USO DE AZUL BRILLANTE DE CRESILO EN LA SELECCIÓN DE OVOCIT

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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL

USO DE AZUL BRILLANTE DE CRESILO EN LA SELECCIÓN DE OVOCITOS BOVINOS: IMPLICANCIAS EN LA MADURACIÓN NUCLEAR Y CITOPLASMÁTICA IN VITRO.

Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO

RODRIGO ALEJANDRO CARRASCO BRAVO VALDIVIA – CHILE 2012

PROFESOR PATROCINANTE

Dr. MARCELO RATTO F. Nombre

PROFESOR CALIFICADOR

Dr. JORGE OLTRA C. Nombre

PROFESOR CALIFICADOR

Firma

Dra. CLAUDIA LETELIER V. Nombre

FECHA DE APROBACIÓN:

Firma

27 de Junio de 2012

Firma

A mis padres y hermanos por el apoyo constante.

ÍNDICE

Capítulos

Página

1. RESUMEN…………………………………………………………….

1

2. SUMMARY……………………………………........................................

2

3. INTRODUCCIÓN…………………………………..………………...

3

4. MATERIAL Y MÉTODOS……………………….....………………...

8

5. RESULTADOS…………………………………….................................

13

6. DISCUSIÓN………………………………………..................................

15

7. REFERENCIAS...……………………………………………………...

18

. ANEXOS……………………………………………………………..

21

. AGRADECIMIENTOS……………………………………………….

22

1

1. RESUMEN

El desarrollo in vitro de ovocitos de bovinos, considerando las etapas de maduración, fecundación y cultivo hasta blastocisto está generalmente limitado a un éxito del orden del 40%. Existe evidencia indicando que la calidad intrínseca del ovocito es el factor clave que determina la proporción de blastocistos que se desarrollaran y que los métodos de selección no son eficaces en identificar ovocitos de calidad. Esta información sugiere la necesidad de implementar técnicas no invasivas para estimar o identificar la competencia para el desarrollo de ovocitos. Azul brillante de Cresilo (BCB) es una tinción vital usada para la selección de ovocitos previo a la maduración en función de la actividad de la enzima Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. El objetivo de nuestro experimento fue determinar si el uso de BCB nos permite seleccionar ovocitos de mayor potencial de maduración citoplasmática y nuclear. Para esto se cultivaron ovocitos de bovino inmaduros por 90 minutos en un medio con BCB al 26 µM, una vez finalizado el período se clasificaron los ovocitos según la coloración del citoplasma, pudiendo ser azul o incolora. Así se establecieron 3 grupos de trabajo: positivos (con citoplasma azul, BCB+), negativos (citoplasma incoloro, BCB-) y un grupo control. El grupo control no fue expuesto a BCB y se depositó directamente en el medio de maduración. Después de 24 horas de maduración los ovocitos fueron sometidos a la evaluación de maduración nuclear y maduración citoplasmática; para la maduración nuclear se utilizó una tinción con Orceína acética y para la maduración citoplasmática se usó una tinción con la lectina de Lens culinaris conjugada con un fluorescente. Del total de ovocitos sometidos a la prueba un 49% y un 51% fueron clasificados como BCB+ y BCB- respectivamente. Tras 24 horas de maduración el grupo BCB+ tuvo una proporción mayor de ovocitos progresando a metafase II (81%, P

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