Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Agrarias Escuela de Graduados

ADICIÓN DE CEPAS LÁCTICAS PROBIÓTICAS EN LECHE EN POLVO 26% MG

TESIS DE MAGÍSTER

PATRICIA CABEZÓN PALOMINOS

VALDIVIA – CHILE 2010

ADICIÓN DE CEPAS LÁCTICAS PROBIÓTICAS EN LECHE EN POLVO 26% MG

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magíster en Ciencia y Tecnología de la Leche

por PATRICIA CABEZÓN PALOMINOS

VALDIVIA - CHILE 2010

Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Agrarias INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGISTER La Comisión Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de Graduados de la Facultad de Ciencias Agrarias que la Tesis de Magíster presentada por el candidato

PATRICIA CABEZÓN PALOMINOS Ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el día 10 de Enero de 2011, como requisito para optar al grado de Magíster en Ciencia y Tecnología de la Leche y, para que así conste para todos los efectos firman:

Profesor Patrocinante: ..…………………………………………… Renate Schöbitz T. Tec. Médico, M.Sc. Food Microbiology Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos Profesores informantes: …………………………………………… Carmen Brito C. Ingeniero en Alimentos, M.Sc. Food Science Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

………………………………………. Fernando Espina U. Ingeniero Agrónomo, M.Sc. Food Science Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

A mis maravillosos padres Lily y Patricio hermanas, cuñaito y sobrino Vicente… el regalo más bello que Dios me ha dado como familia

AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mis agradecimientos sinceros a todas aquellas personas que participaron en la realización de mi memoria de titulo, muy especialmente a la: Profesora Renate Schöbitz por su orientación y valiosas sugerencias a través del curso del estudio y preparación del manuscrito. Cariño y confianza depositada en mí durante el transcurso de tesis y con quien pude compartir momentos muy enriquecedores y gratos en lo académico y personal. Profesora Carmen Brito, por su constante apoyo con su vasto conocimiento en el sector lácteo, motivación, cariño y con quien tuve el placer de compartir mi pasión por la música clásica. A los profesores Alejandro Romero (mi tutor del magíster), Fernando Espina, Marcia Costa, Emilio Teixido, Fernando Asenjo quienes en el transcurso de la memoria, me brindaron su apoyo destacando a las profesoras Marcia Rojas y Mariela Horzella junto con Vivi Riquelme por su incondicionalidad y afecto. A mis panelistas sensoriales, miembros del Icytal y Yanina por buena disposición. A la Cooperativa Agrícola y Lechera de la Unión (Colún), Prolesur S.A. (Soprole), y al Sr. E. Marin del laboratorio Valtek S.A. por su donaciones para este proyecto. Dr Heriberto Fernández, Ricardo Fuentes, Luigi Ciampi, Luís Cristi, Miguel Aguilar, Neve Vendt y Emilio Vigliengo de Chr Hansen y Vagn Westergaard de GEA, por entregarme sus opiniones, cada vez que fueron consultados. A Cristian Pinargote y Mónica Obando por su compañerismo. A mis amigos Alexandra, Javier, Natalia, Álvaro, José Antonio y muy especialmente a la familia que me acogió en su hogar tía Antonieta, tío Arturo, Cristi, Nana, Tere, Martín y Marisol. Sin olvidar a la Sra. Eliana, María José y tía Bernardita.

I

ÍNDICE DE CONTENIDOS Capítulos

Página RESUMEN

1

SUMMARY

3

1 1.1 1.2 1.3

INTRODUCCIÓN Hipótesis Objetivo general Objetivos específicos

5 6 7 7

2 2.1 2.2 2.3

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Alimentos funcionales Microorganismos probióticos Efecto de los probióticos en las alergias atópicas y diarreas por rotavirus Alergias atópicas Diarreas por rotavirus B. lactis Bb12 y L. rhamnosus E800 Leche en polvo Incorporación de cepas probióticas a la leche en polvo Características de los probióticos del estudio B. lactis Bb12 L. rhamnosus E800

8 8 10 19

MATERIALES Y MÉTODO Lugar y duración de la investigación Materiales Materias primas Cepas utilizadas Sustrato para la inoculación de las cepas Bolsas utilizadas para envasar la leche en polvo

37 37 37 37 37 38 38

2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.4 2.4.1 2.5 2.5.1 2.5.2 3 3.1 3.2 3.2.1 3.2.1.1 3.2.1.2 3.2.1.3

19 20 21 25 26 34 34 35

II

ÍNDICE DE CONTENIDOS Capítulos 3.2.2 3.2.2.1 3.2.2.2 3.2.2.3 3.2.2.4 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.2.1 3.3.2.2 3.3.2.3 3.3.2.4 3.3.3 3.3.3.1 3.3.3.2 3.3.3.3 3.3.3.4 3.3.4 3.3.4.1 3.3.4.2 3.3.5

3.3.6

3.3.7

3.3.8

Página Equipos Unidad de liofilizado Máquina envasadora con sistema barrido Cámara de almacenamiento termoreguladas Cámara de congelación Metodología de trabajo Obtención de cultivo celular en fermentador Control del cultivo celular Determinación de absorbancia Neutralizante Control microscópico de los cultivos Recuento de microorganismos probióticos Liofilización de los cultivos celulares Concentración celular Congelación Liofilización Refrigeración Control posterior al proceso de liofilización Recuento microbiológico de cada cultivo Análisis de la humedad Inoculación y homogeneización de las cepas en la leche en polvo y almacenamiento a temperatura ambiente Evaluación del efecto de la temperatura de almacenamiento y tiempo de almacenamiento de la leche en polvo sobre la supervivencia de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12 Evaluación del efecto de la temperatura de reconstitución de la leche sobre la viabilidad de las cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12 Evaluación del efecto de las cepas probióticas sobre las características organoléptica de la leche reconstituida, sometida a dos tiempos de reconstitución

38 38 38 38 38 38 38 39 39 39 39 39 41 41 41 41 41 42 42 42 42

43

44

44

III

ÍNDICE DE CONTENIDOS Capítulos 3.3.9 3.3.9.1 3.3.9.2 3.4 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.2 4.3

4.4

4.5

4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.5.4

Página Evaluación físico – química Viscosidad Acidez Diseño experimental y análisis estadístico

48 48 48 48

Y DISCUSIÓN DE PRESENTACIÓN RESULTADOS Cultivo celular de cepas probióticas Crecimiento de L. rhamnosus E800 en caldo GEM Crecimiento de B. lactis Bb12 en caldo GEM Efecto del liofilizado sobre la viabilidad de las cepas probióticas Efecto de la temperatura de almacenamiento en la viabilidad de las cepas probióticas inoculadas en la leche en polvo entera Efecto de la temperatura de reconstitución de la leche en polvo sobre la viabilidad de las cepas probióticas Evaluación de las características sensorial y físico química de los tratamientos sobre la leche en polvo Evaluación sensorial Acidez titulable Viscosidad Textura

50 50 50 51 56 59

75

82

82 89 91 94

5

CONCLUSIONES

96

6

BIBLIOGRAFÍA

98

7

ANEXOS

112

IV

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 2 3 4

5 6 7 8 9 10

11

12

13

Página Alimentos con probióticos comercializados en Chile Principales beneficios sobre la salud de las cepas probióticas disponibles en Chile Diseño experimental Parámetros cinéticos obtenidos en las cepas probióticas en los distintos cultivos celulares en caldo GEM a pH 5,8 Efecto del liofilizado en la viabilidad de las cepas probióticas en los distintos cultivos celulares Evolución de los probióticos viables hasta la adición a la leche en polvo

15 18

Evolución de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 25ºC + 2ºC Efecto de tiempo de almacenamiento a 25 + 2ºC en la viabilidad de las cepas probióticas Evolución de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 40ºC + 2ºC Efecto global del almacenamiento en la viabilidad de las cepas probióticas adicionadas a la leche en polvo, después de 60 días Evolución de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) a los 60 días de almacenamiento de la leche en polvo a 25ºC y reconstituidas a 40ºC+ 2ºC Evolución de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) a los 60 días de almacenamiento de la leche en polvo a 25ºC y reconstituidas a 60ºC+ 2ºC Promedio de acidez titulable de los tratamientos al inicio, mitad y fines del almacenamiento a 25ºC + 2ºC al cabo de 60 y 180 min

65

49 54

56 60

67 71 74

78

79

90

V

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1

Página Curva de crecimiento de L rhamnosus E800, (VTT Technical Research Centre of Finland) en caldo G.E.M a 37ºC, con control de pH a 5,8

51

2

Curva de crecimiento de B. lactis Bb12 (Chr Hansen) en caldo G.E.M a 37ºC (A) y 39ºC (B), con control de pH a 5,8

52

3

Viabilidad de L rhamnosus E800, (VTT Technical Research Centre of Finland), (T1), (A) y B. lactis Bb12 (Chr Hansen), (T2), (B) durante el almacenamiento a 25ºC y 40ºC

63

4

Interacciones entre las temperaturas de cámara y los días de almacenamiento sobre la viabilidad de las cepas probióticas

64

5

Recuento promedio de células viables de los tratamientos con probióticos después de los 60 días de almacenamiento a 40ºC

72

6

Recuento de cultivos probióticos a los 60 días de almacenamiento de la leche en polvo a 25ºC y reconstituidas a 40ºC y 60ºC

76

7

Células viables de los cultivos probióticos por efecto de la temperatura de reconstitución

77

8

Promedio de los resultados de validación del panel sensorial de la leche en polvo en test triangular

84

9

Promedio de los resultados de evaluación sensorial de la leche en polvo a 60 min (A) y 180 min (B) de reconstitución en test triangular

86

10

Lectura de viscosidad en función de la velocidad de rotación, tratamientos y tiempo de reconstitución 60 min (A) y 180 min (B)

92

VI

ÍNDICE DE ANEXOS Anexo

Página

1

Composición del medio de fermentación GEM utilizado para el cultivo de L .rhamnosus E800 y B. lactis Bb12

112

2

Esquema general de propagación y concentración

113

3

Colonias de L. rhamnosus E800 en agar MRS 5,2

114

4

Colonias de B. lactis Bb12 en agar MRS- AB

115

5

Recuentos microbiológicos de la leche en polvo

116

6

Programa para el entrenamiento de panelistas en evaluación sensorial implementado

117

7

Cuestionario de selección de panelistas

118

8

Ficha de evaluación sensorial para el reconocimiento de un sabor básico

120

9

Concentración de soluciones utilizadas para prueba de reconocimiento de gustos básicos

121

10

Ficha de evaluación sensorial

122

11

Tabla de significación estadística para el test Triangular

123

12

Valores densidad óptica (600nm) y recuento bacteriano de cultivo batch Cepa L rhamnosus E800 Cepa B. lactis Bb12 – tiempo 1 Cepa B. lactis Bb12 – tiempo 2

124

12a 12b 12c

124 125 125

VII

Anexo

Página

13

Recuento de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 25ºC + 2ºC

126

14

Recuento de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 40ºC + 2ºC

127

15

Recuento de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas a 25ºC + 2ºC y reconstituida A 40ºC

128

16

Recuento de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas a 25ºC + 2ºC y reconstituida A 60ºC

129

17

Determinación del valor del tiempo de reducción decimal (D25 y D40) a partir de la recta de regresión (D= 1/K). Ejemplo de cálculo

130

18

Análisis estadístico para el recuento de probióticos almacenados a 25ºC+2ºC y 40ºC+2ºC

131

19

Análisis estadístico para el recuento de probióticos almacenados A 25ºC + 2ºC

133

20

Análisis estadístico para el recuento de probióticos almacenados a 40ºC + 2ºC

134

21

Análisis estadístico para el recuento de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas a 25ºC + 2ºC y reconstituida a 40ºC + 2ºC y 60ºC + 2ºC

135

22

Análisis estadístico para el recuento de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas a 25ºC + 2ºC y reconstituida a 40ºC+ 2ºC

137

23

Análisis estadístico para el recuento de probióticos viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas a 25ºC + 2ºC y reconstituida a 60ºC+ 2ºC

139

VIII

Anexo 24 24ª

24b

25

Página Resultados de la validación del panel sensorial de leche en polvo en test triangular Resultados test triangular para la evaluación de leche en polvo en comparación con leche en polvo con ácido láctico incorporado Resultados test triangular para la evaluación de leche en polvo en comparación con leche en polvo oxidada con sulfato de cobre incorporado

141 141

141

142

25a 25b 25c

Resultados evaluación sensorial de leche en polvo en test triangular Resultados tiempo 0 Resultados tiempo 30 Resultados tiempo 60

142 143 144

26

Análisis de viscosidad de los tratamientos

145

27

Análisis estadístico de viscosidad de los tratamientos

146

28

Descripción técnica del material de trilaminado de las bolsas

149

1

RESUMEN

El objetivo de esta investigación fue, cuantificar la supervivencia de las cepas probióticas L. rhamnosus E800 (VTT Biotechnology) y B. lactis Bb12 (Chr. Hansen) en leche en polvo durante su almacenamiento y evaluar el efecto de dos condiciones de reconstitución sobre la viabilidad de las cepas. La suplementación en seco de la leche en polvo se realizó a partir de cepas comerciales de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12, cultivadas y liofilizada en los laboratorios del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos (ICYTAL, UACh). Para el estudio se formularon tres tratamientos con tres repeticiones leche en polvo: a) inoculada con L rhamnosus E800, b) con B lactis Bb12, c) con una mezcla de ambas cepas en una proporción de 1:1. Los tratamientos se almacenaron a 25ºC y 40ºC y fueron envasados al vacío por dos meses, la evaluación de la viabilidad de las cepas se realizó quincenalmente. Para la evaluación del efecto de la temperatura de reconstitución de la leche sobre la viabilidad, el producto se reconstituyó y mantuvo a 40ºC y 60ºC durante 10min. También, se realizó la evaluación sensorial de la leche a los 0, 30 y 60 días de almacenamiento. Para ello se reconstituyó a 40ºC y se mantuvo a 20ºC durante 60 y 180min. Los resultados de los recuentos arrojaron para L. rhamnosus E800, una concentración inicial log 7,7± 0,2 ufc/g y B. lactis Bb12 alcanzó log 7,6 ± 0,5

2

ufc/g y en la mezcla de ambos se obtuvo log 7,6 ± 0,3 ufc/g y log 7,3 ± 0,4 ufc/g respectivamente. La concentración de ambas cepas hasta el día 60 se mantuvo sobre log 6,0 ufc/g, cifra límite para tener un efecto terapéutico del probiótico. Se presentó una pérdida de viabilidad durante el almacenamiento a 40ºC, siendo esta disminución más significativa (p0,05) por la incorporación de los probióticos frente al control. Sin embargo, la acidez y la viscosidad fueron los parámetros físicos químicos que presentaron diferencias (p 106 ufc/g en el intestino delgado y >108 ufc/g en el colon. Sin embargo una ingesta de 105 ufc/g ha sido sugerida como la mínima para proveer efectos terapéutico (Roy, 2005). Una vez que los microorganismos probióticos alcanzan el intestino, son capaces de permanecer allí durante un corto período de tiempo en estado no proliferativo. Sin embargo, para establecerse como habitante permanente del tubo gastro intestinal, deben adherirse a las células epiteliales intestinales o a la capa de mucus. La adhesión a la mucosa intestinal es el primer paso en la colonización, y muchos autores lo consideran un prerrequisito para ejercer efectos beneficiosos en el huésped, como la exclusión competitiva de bacterias enteropatógenas o la inmunomodelación (Bernet et al., 1993). Otro de los criterios de evaluación y selección incluyen la existencia de actividades funcionales. Entre los principales podemos citar su contribución metabólica, la inhibición de patógenos y la inmunomodulación, que hace referencia a un amplio espectro de efectos sobre la inmunidad celular y humoral (Díaz, 2008). Entre los beneficios nutricionales imputados al consumo de probióticos en productos lácteos se incluye el aumento de la absorción de minerales como el calcio, zinc, hierro, manganeso, cobre y fósforo, debido a que la acidez del medio facilita la ionización de éstos y la formación de sales solubles

13

asimilables. Igualmente, por la acción microbiana aumenta la digestibilidad de la proteína del yogurt y la bio-disponibilidad de vitaminas como la riboflavina, facilitando la utilización de haciendo estos nutrientes. El consumo de bacterias probióticas también contribuye, mediante la producción de enzimas específicos, al aprovechamiento de otros nutrientes en el intestino. Muchas bifidobacterias

poseen

glicosidasas

con

capacidad

para

metabolizar

carbohidratos no digeribles de la dieta (Cummings et al., 2001 citado por Diaz, 2008). La concentración mínima y/o frecuencia de consumo de microorganismos probióticos necesarios para provocar un resultado benéfico aún no está clara. Sin embargo, en la diarrea infecciosa aguda mayores dosis de probióticos dada por corto tiempo son más efectivas que dosis baja. En tanto en las enfermedades inmunológicas como las alergias, el efecto depende de la duración del tratamiento (Bertazzoni y Benini, 2008). Roy (2005), señala que un producto fermentado debería contener 106 ufc de bifidobacterias por gramo de producto al momento de ser consumido. Japón desarrolló un estándar para leches fermentadas y bebidas acidolácticas de 107 bifidobacteria por g o mL de producto para ser considerado un alimento probiótico (Ishibashi et al., 1993 citado por Pérez, 2003). Thompkinson y Kharb (2007), señalan que para una fórmula infantil el contenido de células viables a lo largo de la vida útil recomendable, debería ser 106 a 108 ufc/g de polvo de fórmula.

14

Los productos probióticos comercializados actualmente se pueden dividir en tres tipos: a)

los alimentos fermentados convencionales a los que se les adiciona probióticos y que se consumen principalmente con fines nutritivos (yogures, quesos, leches etc.)

b)

las leches cultivadas y fermentadas, utilizadas básicamente como, vehículos de bacterias probióticas (leche acidófilas etc)

c)

los suplementos dietéticos o preparaciones farmacéuticas liofilizadas (Collado et al., 2003).

De la variedad de alimentos con probióticos disponibles en el mercado, la mayor parte corresponde a lácteos principalmente leches y productos fermentados como yogurt y bebida láctea, siendo el formato mas popular el de “dosis diaria” facturando en Europa alrededor 1,2 billones de euros en año 2003 (Saxelin, 2008). En America latina el mercado de yogurt con probióticos tuvo un crecimiento anual del 32% entre los años 2005 y 2007. Se estima que el crecimiento del mercado de alimentos con probióticos en Estados Unidos entre los años 2006 y 2011 será cercano al 5% (Champagne, 2009). En Chile el primer producto alimenticio con probióticos fue el “Uno al día”, el cual fue lanzado al comercio el año 1998 por la empresa Soprole. En la actualidad, todas las principales empresas de productos lácteos del país elaboran productos probióticos. La Tabla 1 muestra los productos probióticos actualmente presentes en el mercado nacional. Cabe destacar que existen

15

varios productos en venta en farmacias que contienen bacterias lácticas deshidratadas (generalmente por liofilización). Aunque algunas de ellas son probióticos reconocidos, no son comercializados como tal sino como agentes restauradores de la microbiota (Cáceres y Gotteland, 2010). Tabla 1.

Alimentos con probióticos comercializados en Chile

Nombre del producto

Empresa

Super Calo Vilib Activia

Calo Colun Danone

Bio BioOk Chamyto Nan Pro1 Nan HA Nan Pro 2 y 3 Nan 2 y 3 Nestum Nestum Plus Nestum Nestum Plus Nido 1+3+y 5+ Yoplait Bioplus Linea Next Uno al día

Soprole

Kaiku

Surlat

Tipo de Alimento

Género/Especie (cepa del probiótico incorporado

Empresa proveedora del probiótico Chr. Hansen Danisco Danone

Loncoleche Loncoleche Nestle Nestle

Bebida láctea Bebida láctea Yogurt y Bebida láctea Leche y yogurt Bebida láctea Bebida láctea Fórmula láctea

L. casei CRL431 L. acidophilus NCFM B. animalis spp.lactis DN173 010 B. animalis spp.lactis Bb12 L. casei CRL431 L johnsonii La1 B. animalis spp.lactis Bb12

Nestle

Fórmula láctea

Nestle

Cereal infantil

L rhamnosus GG B. longum BB536 B. animalis spp.lactis Bb12

Nestlé

Nestle

Leche en polvo

L paracasei ST11

Nestlé

Quillayes

Yogurt

Soprole

Fuente: Cáceres y Gotteland, 2010

L. acidophilus La5, B. Animalis spp.lactis Bb12 Yogurt, leche y B. animalis spp.lactis Bb12 bebida láctea Bebida láctea L rhamnosus HN 001 (DR20) Yogurt L rhamnosus GG, B. Animalis spp.lactis Bb 420

Chr Hansen Chr. Hansen Nestlé Nestlé Nestlé

Chr. Hansen Chr. Hansen Danisco Danisco/ Valio

16

No obstante, estudios han evidenciado que la supervivencia de las cepas probióticas

presentes

en

productos

lácteos

comerciales

se

afectan

negativamente durante su almacenamiento refrigerado. Es así como Collado (2004), estudiando la viabilidad de las bacterias lácticas y bifidobacterias presente en los productos fermentados comerciales refrigerados a 4ºC, encontraron que sus recuentos disminuyeron paulatinamente hasta un 50-60% de los recuentos iniciales al cabo de su fecha de caducidad, momento a partir de cual se redujeron drásticamente, siendo los productos de pH más ácido los que presentaron una disminución más acusada. Según Shah (2010), los factores responsable de la pérdida de la viabilidad de las bacterias probióticas son: la acidez y el H202 producido por las bacterias del yogurt, la pos acidificación, presencia de oxigeno disuelto, a la permeabilidad al oxigeno del envase, la disponibilidad de nutrientes y promotores de crecimiento, el nivel de inoculación, tiempo de fermentación, temperatura de almacenamiento y el antagonismo entre las bacterias. Al respecto Roy (2005), señala que en los productos fermentados pueden ocurrir cuatro tipos de interacciones entre probióticos y cultivos iniciadores: estimulación, retraso e inhibición o ningún efecto. Las interacciones pueden ser mas intensas cuando los probióticos son agregados al mismo tiempo con los cultivos iniciadores. Heller (2001), señala que se ha observado tales efectos en el yogurt adicionado de agentes probióticos donde se ha encontrado que el contenido de células viables de bifidobacterias decrece en presencia de los cultivos iniciadores de aquel, posiblemente debido a sustancias inhibitorias

17

elaboradas por L. delbrueckii ssp bulgaricus y S. thermophilus, como ácido láctico y peróxido de hidrógeno, este último producido principalmente por L. delbrueckii ssp. bulgaricus. Cáceres y Gotteland (2010), realizaron una revisión de las cepas probióticas actualmente adicionadas a los productos lácteos comercializados en Chile, encontrando que son 11 las cepas probióticas principalmente en productos lácteos refrigerados donde se incluyen las cepas Lactobacillus casei CRL431, L. acidophilus NCFM, L. johnsonii NCC533 (La1), L. acidophilus La5, L. rhamnosus HN001 (DR20), B. animalis spp. lactis 430, B. animalis spp. lactis DN173 010, L. rhamnosus GG, L. paracasei ST11, B. longum BB536 y B. animalis spp. lactis Bb12 (Tabla 2). La importancia de conocer las cepas se encuentra en que los efectos benéficos sobre la salud son cepa específica, es decir, que una cepa determinada ejerce sólo algunas de las propiedades descrita para los probióticos (Cáceres y Gotteland, 2010). La suplementación de probióticos a las fórmulas infantiles es la tendencia en la elaboración de fórmulas de continuación en el mercado español donde se incluyen B. longum, St. thermophilus, B. lactis, L. rhamnosus GG. Con ello se intenta promover el desarrollo de una flora intestinal compuesta, de forma predominante, por bifidobacterias como las que existen en los lactantes con lactancia materna y así, conseguir las ventajas que de ello se deriva sobre el tránsito intestinal y la protección frente a los patógenos intestinales (Ferrer et al., 2005).

18

Tabla 2.

Principales beneficios sobre la salud de las cepas probióticas disponibles en Chile

Beneficios para la salud

L. L. L. L. rhamnosus johnsonii acidophilus acidophilus

L. casei

L. L. B. rhamnosus paracasei lactis

B. lactis

B. B. lactis longums

GG

La1

NCFM

La5

CRL431

HN 001 (DR20)

NCC2461 ST11

Bb12

DN173010

420

BB536

Digestión de la lactosa Inmunoestimulante

no

-

si

-

si

-

-

-

-

-

-

si

si

si

-

si

si

si

-

si

si

Anti-bacteriano Anti-diarreico

si si

si -

si si

si si

si -

si si

-

-

-

Constipasión/ tránsito intestinal Anti-inflamatorio Función intestinal de barrera Anti-alérgico

-

-

-

si (colitis colagenosa) -

si (modelo animal) si

-

-

-

si

si

-

-

si si

si -

-

si

-

-

-

-

si -

-

si

-

-

-

-

si

si

-

si

si

Anticarcinogénico Anti H. pylori

si no

si

si .

si (con Bb12)

-

-

si (modelo animal) si (modelo animal) -

si -

-

si -

-

-

si

-

-

-

si (con La5) -

-

-

-

Analgésico

Fuente: Cáceres y Gotteland, 2010

si (modelo animal)

19

Thompkinson y Kharb (2007), señalan que existen estudios donde se ha demostrado que la flora gastrointestinal de los lactantes alimentados con fórmulas infantiles es diferente de aquellos que reciben leche materna. Al respecto, Dubey y Mistry (1996), compararon muestras de fecas provenientes de lactantes alimentados con leches maternizadas (fórmulas infantiles), y de alimentados con leche materna, donde se encontró una mayor presencia de bifidobacterias en las últimas. Lo anterior atribuido al factor bifidu estimulante de la leche materna. Los principales usos de los productos probióticos en la alimentación infantil son la prevención y el tratamiento de diarreas, modulación del sistema inmune y promoción de mecanismos protectores del organismo para las dermatitis atópicas y alergias (Ferrer y Dalmau, 2005).

2.3.

EFECTO DE LOS PROBIÓTICOS EN LA ALERGIA ATÓPICA Y LA DIARREA POR ROTAVIRUS

2.3.1. Alergias atópicas Las enfermedades alérgicas constituyen una causa importante de morbilidad en los países industrializados, habiendo crecido su incidencia en forma alarmante durante las últimas décadas. Se generan como respuesta inmunológica frente a los alérgenos. La “hipótesis de la higiene” pretende justificar su aumento asociado al drástico cambio que ha existido desde un estilo de vida con alta exposición a los microorganismos a otro actual con una exposición baja (Stone, 2003). En Chile, la dermatitis atópica afecta entre el 6 al 20% de los niños (Rojas, 2004).

20

La sintomatología del cuadro alérgico se genera por la producción de IgE alérgeno específico, la cual se une a receptores de alta afinidad en la superficie de mastocitos y basófilos que típicamente se localizan en las superficies mucosales y perivasculares. El reencuentro de la IgE con el alérgeno provoca la degranulación de la célula que vierte mediadores proinflamatorios preformados al ambiente extracelular, como histaminas, proteasas y proteoglicanos.

Dependiendo

de

los

órganos

afectados

aparecen

manifestaciones diferentes como asma, rinitis, dermatitis atópica o síntomas gastrointestinales (Marshall, 2004).

2.3.2. Diarreas por rotavirus Las infecciones por rotavirus son la mayor causa de las diarreas graves durante la infancia y la adolescencia. Desde el punto de vista clínico, la mucosa intestinal se ve afectada y se modifica la composición de la microbiota intestinal, lo que da lugar a un episodio de diarrea osmótica seguida de un crecimiento excesivo de alguna de las poblaciones bacterianas no dominantes (Ciarlet y Estes, 2001). La infección por rotavirus es responsable de alrededor de 600.000 muertes anuales y aproximadamente 40% de las hospitalizaciones por diarrea en menores de 5 años de edad en todo el mundo, lo que la convierte en la causa más importante de diarrea en este grupo de población. El rotavirus puede provocar desde una infección asintomática en menores de 3 meses, hasta una diarrea grave con deshidratación que puede ocasionar la muerte. En países en

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desarrollo, la tasa de infección más alta ocurre entre los 3 y 11 meses de vida y en los países desarrollados durante el segundo año de vida. Además del elevado costo social, los aspectos económicos son importantes por la excesiva demanda a los centros asistenciales debido a la alta tasa de morbilidad (OPS, 2007). El Ministerio de Salud de Chile indicó que hasta noviembre del 2008, por el sistema de vigilancia epidemiológica para rotavirus en hospitales centinelas en menores de cinco años, se han notificado 6.149 casos de diarreas, de ellas 26,5% fueron positiva a rotavirus (Chile, Ministerio de Salud; 2008b).

2.3.3. B. lactis Bb12 y L. rhamnosus La cepa B. lactis Bb12 presenta estatus GRAS otorgado por la FDA a solicitud de la empresa Nestlé US para su incorporación en alimentos para infantes y niños (Mogersen et al., 2002). Varios estudios con B. lactis Bb12 evidencian que la cepa presenta un efecto preventivo frente al desarrollo de diarrea aguda en niños incluyendo la causada por rotavirus (Cáceres y Gotteland, 2010). La forma mencionada en que la cepa podría prevenir o aminorar la diarrea en niños corresponde a la mejora de los mecanismos de defensa del tracto gastrointestinal por el aumento de la producción de moco y secreción de IgA (Kaila, et al., 1992). En este sentido Juntumen et al. (2001), observaron que la adhesión de B. lactis Bb12 en infantes sanos fue 31% en comparación de la cepa L. acidophilus La-5 que presentó sólo un 4%. Efecto que se potencia en presencia de B. lactis Bb12 con L. rhamnosus del 31 a 39% en niños sanos. En

22

casos de diarreas por rotavirus se incrementó la adhesión al epitelio gastroinstestinal del 26 a 44%. Existe un gran número de estudios que avalan las propiedades de B. lactis Bb12, en recién nacidos y en prematuros, lo cual apoya la inocuidad de esta cepa. En prematuros con antibioterapia, la administración de este probiótico resultó en una mayor ganancia de peso comparado con los niños del grupo control, además de una menor concentración de calprotectina fecal (un marcador de inflamación), una mayor concentración fecal de IgAs y de ácidos grasos volátiles y un pH fecal más ácido. Este probiótico contribuye además, a regular la microbiota intestinal en estos niños (Mohan et al., 2008). Estas observaciones podrían explicar los resultados de ensayos clínicos que muestran que su administración previene la enterocolitis necrotizante en prematuros de muy bajo peso (Cáceres y Gotteland, 2010). Por otra parte, las propiedades inmunoestimulantes de B. lactis Bb12 tanto local como sistémicas han sido confirmadas en varios estudios (Cáceres y Gotteland, 2010). Dichas propiedades podrían explicar su efecto positivo en niños con alergia; la suplementación de fórmulas hidrolizadas con B. lactis Bb12 resulta en una recuperación más temprana que en aquellos que recibían la fórmula control sin probióticos (2 meses vs. 6 meses), (Isolauri et al., 2000). Dentro de las propiedades funcionales de la cepa de L rhamnosus E800, que se encontraron en estudios disponibles, se menciona su actividad

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antimicrobiana contra E. coli, S. aureus, B cereus y C. perfringes1 demostrada en estudios in vitro, asi como favorecer la microbiota del colon (Kontula et al., 2002). Dentro de la especie Lactobacillus rhamnosus, la cepa L. GG es el probiótico más estudiado, con más de 100 ensayos clínicos publicados que han estudiado sus efectos sobre la salud. Numerosos estudios han evaluado los efectos de LGG sobre la diarrea. Un análisis del efecto de LGG en el tratamiento de la diarrea aguda, mostró que éste no afectaba el volumen de deposición emitida pero disminuía significativamente la duración de los episodios de diarrea, particularmente en aquellos producidos por rotavirus, además de disminuir el riesgo de diarrea y la duración de hospitalización.

Por otra parte, la

administración perinatal de LGG en lactantes con antecedentes familiares de atopia redujo la incidencia de eczema atópico durante sus 4 primeros años de vida comparado con aquellos que no recibieron el probiótico (Cáceres y Gotteland, 2010). En un estudio realizado en niños alimentados con una fórmula infantil suplementada con la cepa L. rhamnosus LGG, durante los primeros seis meses de vida se ha observado que el consumo de este podría mejorar la tasa de crecimiento de los bebes (Vendt et al., 2006), lo cual puede estar relacionado con una mayor eficiencia en la absorción de nutrientes en estos niños. Otra cepa perteneciente a la especie es Lactobacillus rhamnosus HN001 también llamada DR20, aislada a partir del queso Cheddar. Estudios clínicos 1 VTT Technical Research Centre of Finland. Hoja informativa. Lactobacillus rhamnosus VTT E – 97800 – a potencial novel probiotic strain

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donde se realizaba la administración de HN001 a madres con antecedentes de atopia durante el periodo de gestación y luego a los lactantes durante 6 meses resultó en una menor prevalencia de eczema comparado con aquellos que recibieron el placebo (Cáceres y Gotteland, 2010). Una manera de llevarles estos beneficios a la población infantil es mediante la incorporación de cepas probióticas a la leche en polvo, lo cual permitiría su masificación más aún si contamos con sistemas de distribución de alimentos complementarios y un ahorro por concepto de costo de refrigeración y de mayor vida útil. Aunque de acuerdo al catastro realizado por Cáceres y Gotteland, (2010) existen en el mercado nacional fórmulas lácteas con probióticos (Tabla 2), el precio oneroso por unidad no favorece un amplio acceso a toda la población chilena. Otra vía de prevenir el desarrollo de enfermedades atópicas es promoviendo el desarrollo de Bifidobacterium en neonatos mediante el consumo prenatal con probiótico de las embarazadas. Un estudio realizado por Gueimonde et al. (2006), concluyó que el consumo de Lactobacillus GG en embarazadas, 2 a 4 semanas previo al nacimiento estimuló el crecimiento de las especies B. breve y B. infantis a los cinco días de nacido de los infantes en comparación con el grupo de embarazadas con placebo. La ventaja de la presencia de B. infantis es que corresponde a una cepa que predomina en la leche materna y que secreta polisacáridos que favorecen su adherencia en el epitelio intestinal (Shah et al., 2003).

25

2.4.

LECHE EN POLVO

La leche en polvo, es un producto de fácil conservación que presenta la ventaja de contener todo el extracto seco de la leche en un volumen muy reducido (Amiot, 1991). Se utiliza como materia prima en la fabricación de leche reconstituida y de alimentos para niños. Los alimentos infantiles en polvo actualmente en el mercado mundial comprenden un gran número de productos de distintas composiciones, que pueden clasificarse en los siguientes grupos: leche entera normal en polvo, leche entera en polvo con adición de carbohidratos, leche fermentada, leche maternizada y productos con almidón (Vagn Westergaard, 2004). De acuerdo a antecedentes proporcionados por la Oficina de Estudios y Políticas Agrarias (ODEPA) durante 2009, la producción de leche en polvo de nuestro país superaron los 73.400 toneladas constituyendo la segunda forma de consumo de lácteo en el país (Chile, Odepa, 2010). Una valoración del consumo per cápita de leche en polvo en el año 2007 efectuado por la Fundación para la Innovación Agraria arrojó 4 kilos (Chile, Fundación para la Innovación Agraria, s/f). En tanto, según datos aportados por Ministerio de Salud (Chile, Ministerio de Salud, s/f), durante el 2009 los kilos de leche distribuidos a los beneficiarios del Programas Nacional de Alimentación Complementaria fueron para Leche Purita Fortificada 5.180 toneladas destinada a menores de 18 meses y para niños prematuro 85.2 toneladas, donde se incluyen recién nacidos con peso de

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nacimiento menor 1500 gr y/o prematuros menores de 32 semanas de gestación y hasta 12 meses de edad (Chile, Ministerio de Salud, 2003). La leche Purita Mamá fue 2.377,7 el total de toneladas distribuidos el año 2009.

2.4.1. Incorporación de cepas probióticas en la leche en polvo La adición de probióticos en la leche en polvo puede realizarse durante el secado por pulverización de la leche; cuyo principio es convertir el producto a secar en pequeñas gotas de un tamaño adecuado para posibilitar el secado de las mismas, por contacto con una corriente de aire caliente. Debido al gran tamaño de la superficie de las gotas (1 L de concentrado será atomizado en 1,5 x 1010 partículas de 50 µ con una superficie total de 120 m2), el agua es evaporada casi instantáneamente, transformando las gotas en partículas de polvo (Vagn Westergaard, 2004). Sin embargo, durante este proceso se producen daños en las células y una pérdida de viabilidad del cultivo probiótico (Gardiner et al., 2000), afectando con ello las propiedades tecnológicas y benéficas de los probióticos, lo que se atribuye a los parámetros de proceso empleados como la temperatura del aire de salida, la presión del aire y el contenido de sólidos, entre otros (Desmond et al., 2002). Diversos autores han comprobado una rápida disminución de la viabilidad de las bacterias durante el almacenamiento. Entre los factores que afectan la sobrevivencia (recuento inicial de probióticos en la leche en polvo, temperatura de almacenamiento, contenido de oxígeno, exposición a la luz y material de envasado), se reconoce en general que la temperatura es el factor

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que afecta mayormente, ejerciendo una influencia inversamente proporcional a la sobreviencia (Corcoran et al., 2004; Gardiner et al., 2000).

Espina y Packard (1979), estudiaron la supervivencia de L. acidophilus en el proceso de pulverización para la elaboración de un tipo de leche acidófila conocida como “Sweet Acidophilus” utilizando diferentes temperaturas de salida: 85, 80 y 75ºC y las relacionaron con la viabilidad después de 30 días de los cultivos almacenados a 4ºC. La temperatura de salida óptima fue 75ºC, ya que resultó en una viabilidad más alta, de 4,2% frente a 1,6% de los pulverizados a 80ºC. Sin embargo, Gardiner et al. (2000), recomiendan no utilizar temperaturas de salida mas baja de 70ºC, porque podrían incrementar el contenido de humedad del polvo deshidratado por encima del 5% y ésto podría ser perjudicial para mantener la calidad y actividad de los microorganismos durante el almacenamiento. Por otra parte, Mauriello et al. (1999) citado por Pérez (2003), atribuyen la disminución de la supervivencia a la temperatura de entrada

ya que al mantener la temperatura de salida

constante a 68ºC y trabajando a diferentes temperaturas de entradas: 160º, 180º y 200ºC, obtuvieron los máximos valores de supervivencia a 160ºC. La especie Bifidobacterium es sensible a la temperatura de secado por pulverización. Al respecto, Selvamuthukumaran y Shankar (2006), al evaluar las condiciones optimas de secado por pulverización para la elaboración de leche en polvo con B. bifidum, encontraron valores de reducción en el número de células viables que fluctuaron desde 0,48 hasta 1,38 unidades logarítmicas ufc/g al cabo del proceso de secado. Reportando que la máxima supervivencia

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de las bacterias en la leche en polvo se obtuvieron bajo las condiciones de proceso de temperatura del aire de entrada de 164 + 5ºC, y temperatura del aire de salida 80 + 5ºC y presión de aire de 2,5 kg/cm2. Un posible mecanismo de la pérdida de viabilidad de la bacteria asociado al stress térmico se atribuye al daño directo a nivel de los ribosomas por la desnaturalización de las proteínas o indirectamente a través de la pérdida de magnesio. Los ribosomas son estructuras que contienen alrededor del 38% de la proteína lo que abarca la mayor parte del peso seco de la célula bacteriana (Teixeira et al., 1997) Existen estudios que ponen de manifiesto que además de la mortalidad provocada por el proceso térmico, los efectos no térmicos como la deshidratación o la pérdida del agua ligada de la membrana citoplasmática provocan daños letales y subletales que afectan a la capacidad de resistencia de las células bacteriana supervivientes impidiendo consecuentemente mantener la viabilidad de los probióticos durante el tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente. En este sentido Texeira et al. (1995), demostraron que después del proceso de secado L. delbrueckii ssp bulgaricus es sensible a la lizosima y al NaCl; ambos indicadores de daño a nivel de la pared y membrana celular afectando con ello la viabilidad y las características del probiótico y consecuentemente reduciendo el tiempo de vida útil del producto (Roos et al., 2005). La fracción lipídica de la membana celular es el sitio primario de daño en la célula. Otros posibles sitios en la célula donde puede ocurrir daño en el DNA asociado a la pérdida de plásmidos o al incremento

29

de flujo de DNA asa dentro de la célula debido a la peroxidación de los lípidos de la membrana celular (Desmond et al., 2002). El inconveniente de los métodos tradicionales de incorporación del probiótico por pulverización durante el secado ha llevado a utilizar nuevas estrategias para asegurar la funcionalidad de los microorganismos priobióticos como usar agentes protectores para potenciar la supervivencia de los probióticos como la trehalosa, prebióticos y la fibra soluble (Desmond et al., 2002). Sin embargo, existen estudios que demuestran que un aumento de la concentración de los agente protectores afecta negativamente la supervivenia de las celulas bacterianas después del secado, asociado a la disminución de la actividad del agua en la superficie de la particula y exceso de la temperatura del bulbo humedo. Al respecto, Espina y Packard (1979), reportaron que la supervivencia de L. acidophilus después del secado fue superior con 25% v/s 40% de sólidos no grasos concluyendo que la mayor concentración de sólidos aumenta el tamaño de las particulas atomizadas y consecuentemente el tiempo de contacto con el aire caliente. Actualmente, existe un proceso de secado para alimentos deshidratados que contienen BAL que se ha patentado (ES 2167719T3) utilizando un aparato de secado por pulverización con dos toberas e inyectándo CO2 y/o nitrógeno en el cultivo justo antes que sea pulverizado ajustándo la temperatura de salida entre 50 y 75ºC y el tiempo de residencia del cultivo de forma de obtener un polvo con una actividad de agua del orden de 0,05 – 0,5 (Oficina Española de Marcas y Patentes, 2002).

30

Las mejores supervivencias obtenidas están generalmente unida a a la presencia de un alto título de células en el cultivo así como utilizar bacterias lácticas resistentes a las altas temperaturas; para ello existen nuevas tecnologías para producir bacterias liofilizadas que conservan un alto grado de viabilidad durante el secado y almacenamiento mediante el mecanismos de la respuesta al stress que favorece la adaptación del microorganismo a las condiciones hostiles en los productos alimenticios tales como alta temperatura, pH bajo y alta concentración osmótica (Ross et al., 2005). Al respecto Sunny – Roberts y Knorr (2008), evaluaron la respuesta de L rhamnosus E800 bajo condiciones de estrés osmótico inducido por alta concentración de sucrosa no encontrando cambios significativos en la morfología de la célula ni en la funcionalidad de las enzimas citoplasmáticas.

Se ha descubierto que otros factores que mejoran la habilidad de sobrevida de los cultivos probióticos durante el secado y/o durante la conservación del producto, son el estado fisiológico en que se encuentra el microorganismo adicionado al momento del secado y la implementación de pre-tratamientos térmicos. Al respecto, Corcoran et al. (2004), encontraron que la L. rhamnosus GG durante la fase estacionaria era menos susceptible a los efectos

del

proceso de secado por pulverización. Por su parte, Prasad et al. (2003), demostraron que el pretramiento térmico de la cepa L rhamnosus HN001 a 50ºC por 30 min y el agregado de NaCl (0,6mol/L), mejoró la viabilidad de la cepa durante el almacenamiento a 30ºC.

31

Simpson et al. (2005), reportaron variación de la estabilidad entre especies de Bifidobacterium y entre cepas, respecto a la temperatura encontrando que la mayor parte de las especies estudiadas presentaron una baja tolerancia térmica. Dentro de las especies que presentaron mayor tolerancia térmica, a 57ºC y 60ºC, se encontró a la cepa B. lactis Bb 12. Corcoran et al. (2004), al comparar el comportamiento de las cepas L. rhamnosus GG y L. rhamnosus E 800 no evidenciaron relación entre la tolerancia térmica y la supervivencia al secado por pulverización.

En el

estudio aunque L. rhamnosus GG presentó una menor tolerancia térmica con un valor D61 de 1,32 min en comparación al L. rhamnosus E- 800 de D61 de 2,76 min, presentó una mejor supervivencia durante el secado por pulverización, lo cual se asoció a los fenómenos no térmicos que ocurren durante el proceso, tales como los efecto de la deshidratación. La manipulación genética parece ser una nueva estrategia (Ross et al., 2005). Al respecto Suokko et al. (2004), encontraron que la cepa L. rhamnosus E800 contiene dos genes capaces de codificar la proteína del estrés térmico ClpL1 y ClpL2 transcriptasa cuya expresión es capaz de incrementar la tolerancia de la cepa a alta temperatura, donde la máxima expresión de la proteína ClpL1, ocurrió después de la aplicación de 50ºC por 30 min. En el estudio se evidenció además, que la expresión de la proteína ClpL2 se producía bajo condiciones de tratamiento con peróxido de hidrógeno. Por su parte, Park et al., (2002) citado por Simpson et al., (2005), identificaron al gen rpoD para la cepa B. animalis ssp lactis.

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Según Chavez y Ledeboer (2007), una opción para mejorar la sobrevida de los probióticos contenidos en el alimento es combinando los procesos de secado por pulverización y vacío, de forma de disminuir la temperaturas del proceso iniciando el proceso por pulverización a una temperatura de entrada y salida de 80ºC y 48ºC, respectivamente, seguido por un proceso bajo vacío a 45ºC con presión reducida de 10 mbar durante 24h. Otro factor que reduce la vida útil de los probióticos son la actividad de agua (aw) o contenido de humedad de la matriz del alimento que lo contiene. En este sentido Texeira et al. (1995), evidenciaron que la viabilidad de las bacterias ácido láctica es particularmente afectada cuando la actividad de agua es superior a 0,25. Una técnica especializada para otorgar estabilidad a los microorganismos probióticos en entorno medioambientales de humedad asi como de acidez y presencia de oxígeno, es el microencapsulamiento que busca crear micro-ambientes en el cual la bacteria pueda sobrevivir. Ello facilita la manufacturación de productos fermentados con probióticos, ya que proporciona, condiciones más costantes (Anal y Smith, 2007). Sin embargo, estudios con L rhamnosus GG incorporados en una fórmula infantil en forma encapsulada utilizando suero de proteína como material de encapsulamiento, han evidenciado que este último procedimiento no asegura la supervivencia de los mismo dentro de la cápsula (Weinbreck et al., 2010). Según Anal y Smith (2007), la eficiencia del microencapsulado esta en directa relación con las propiedades fisico-químicas de los materiales de la pared como alginina, carragenato, suero de proteína, chitosan entre otros, del método de microencapsulación empleados como secado por aspersión o secado por

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congelamiento, recubrimiento en lecho fluidificado, extrusión y coacervación entre otros y tamaño de la cápsula donde valores superiores pueden afectar negativamente la textura y la evaluación sensorial del alimento que los contiene. Un método alternativo de incorporación de los probióticos a la leche en polvo que evita la exposición a los daños de la célula asociado al proceso de secado y asegura una mayor supervivencia, es mediante la metodología de incorporación de la cepa al final del secado de la leche en polvo. Vendt et al.(2006), incorporaron la cepa L. rhamnosus GG al final del secado de la leche en polvo, manteniéndose niveles de recuentos de 107 ufc/mL al final de la vida útil de la fórmula. Fumiaki et al. (2009), mezclaron en seco una fórmula infantil comercial con la cepas B. longum BB536, B. breve M -16V y B. infantis M63 con niveles de incorporación de recuento de 1010ufc/g, obteniendo al cabo de 24 meses a 30ºC valores de recuentos de 107ufc/g, atribuyendo los valores a la actividad de agua del producto aw 0,25, lo que evidenció además, la mejor estabilidad en la cepa B. longum BB536. Existe una tecnología patentada (W02008/48731), que extiende la vida útil de fórmula nutricionales que contienen microorganismos probióticos por al menos 15 meses asociada al uso de envases que contenga un material absorbente de humedad como un desecante logrando reducir la actividad del agua (aw) y la humedad residual del producto hasta valores 0,16 y 2,1%, respectivamente (WIPO, 2008).

34

2.5.

CARACTERÍSTICAS DE LOS PROBIÓTICOS DEL ESTUDIO

2.5.1. B. lactis Bb12 Esta cepa de origen animal corresponde a una bacteria Gram–positiva, no móvil, no esporulada, pleomórfica presentándose en forma aislada, en cadena, empalizada o en forma de V, Y, T. Es anaeróbica, ligeramente tolerante al oxígeno. Su rango de temperatura y pH óptimo va entre 37 y 40ºC2 y 6,5 - 7,0 respectivamente (Scardovi, 1984). No crece a pH de 4,5 ni 8,5, degrada hexosas exclusivamente y produce ácido láctico L (+), ácido acético y ácido fórmico (Salminen y Wright, 1998). Dentro de las características bioquímicas de la especie se mencionan, que las hexosas son degradadas exclusivamente por la ruta de la fructosa-6-fosfato, caracterizada por la presencia de la enzima fructosa-6-fosfato fosfocetolasa (F6PPK) típica de este género. Esta vía metabólica conduce a la formación de ácido láctico y acético en una proporción 2:3, sin producción de CO2. Son negativas en la reducción de nitrato, la formación de indol, la licuefacción de gelatina y no producen ácidos a partir de la ramnosa (Scardovi, 1984). Es un microorganismo exigente, ya que requiere factores específicos para su crecimiento, entre estos se destacan amino azúcares, extracto de levadura, manganeso y magnesio, la cisteína o cistina es fuente importante de nitrógeno para su crecimiento.

2 Christian Hansen's Laboratorium (P1 / Sept. 2006). Hoja informativa. F – DVS BB – 12® – Probiot – Tec® - Información de producto

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Es una de las cepas más ampliamente utilizada en el mundo. Además de su uso en productos lácteos fermentados, ha sido incorporada también en leche en polvo y en fórmulas infantiles (Cáceres y Gotteland, 2010). 2.5.2. L. rhamnosus E800 Esta especie, por mucho tiempo fue clasificada taxonómicamente como subespecie de la especie Lactobacillus casei, basado en la similitud de sus perfiles de fermentación y variaciones fenotípicas dentro de la especie. Comparada con L. casei, la bacteria L. rhamnosus presenta habilidades para producir ácido a partir de la ramnosa y de crecer a 45ºC, lo que explica su cambio al grupo taxonómico de especie (Curry et al., 2003). Ello fue posible gracias a la evidencia de homología del DNA determinado mediante la técnica molecular del Reacción de polimerasa en cadena (PCR) y del DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPDs). Es un bacilo que tiende a formar cadenas, además es inmóvil, no esporulado, catalasa negativo. Se caracteriza por crecer a 15ºC y 43ºC, el crecimiento es lento bajo los 35ºC y es nulo a 15ºC. Dentro de su propiedad hererofermentativa facultativa se caracteriza por transformar las hexosas bajos condiciones limitantes hasta ácido L(+) láctico, acético, fórmico y etanol; y las pentosas hasta ácido L(+) láctico y acético (Curry y Crow, 2003). La cepa L. rhamnosus E 800, corresponde a una cepa de colección que presenta fines de investigación, no comercial (Saarela, 2008)3. Siendo el

3 Comunicación personal. María Saarela 7 /10 / 2008. VTT Technical Research Centre of Finland.

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organismo a cargo el Centro de Investigación Técnica VTT (VTT Technical Research Centre of Finland). Corresponde a una cepa aislada desde las fecas de individuos adultos sanos (Kontula et al., 2002). Son anaerobios aerotolerantes4 y su crecimiento se ve favorecido por la anaerobiosis o por tensiones reducida de oxígeno equivalente a 10 - 15% de un organismo aeróbico (Jyoti et al., 2004) y por medios con glucosa, lactosa y sus derivados transformándolas en ácido láctico y en menor proporción en acético (Kontula et al., 2002). Para su crecimiento Liew et al. (2005), estimaron que la concentración de extracto de levadura es el factor más importante, atribuido a que ésta es una excelente reserva de vitaminas del complejo B. Un aspecto importante dentro de su uso en los productos lácteos se relaciona a su habilidad para resistir altas temperaturas y concentración de oxígeno. Tolerar ambientes hostiles en los productos alimenticios tales como: baja humedad, pH bajos y altas concentraciones de azúcar (Sunny – Robert y Knorr, 2008). Cabe mencionar que dentro de la especie existen cepa como L rhamnosus RW – 9595 M, que presenta la habilidad de producir exopolisacáridos (EPS) de gran importancia por su efecto tecnológico en la mejora de la textura y viscosidad de productos fermentados (Peant et al., 2005) y a la producción de componentes del aroma como diacetilo y acetoína (Jyoti et al, 2004).

4 VTT Technical Research Centre of Finland. Ficha Técnica de Lactobacillus rhamnosus VTT E – 97800 – a potencial novel probiotic strain

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1

LUGAR Y DURACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

La investigación se llevó a cabo en la Universidad Austral de Chile (UACh) en la Facultad de Ciencias Agrarias, Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. (ICYTAL). La etapa experimental se realizó durante los meses de abril a diciembre de 2009. 3.2

MATERIALES

3.2.1

Materias primas

3.2.1.1

Cepas utilizadas. Los microorganismos que se utilizaron para este

estudio correspondieron a cultivos liofilizados del tipo DVS (Direct Vat Set): de L. rhamnosus E8005 y B. lactis Bb126. Los criterios tecnológicos de selección fueron sus tolerancias intrínsecas térmica y al oxígeno (Corcoran et al., 2004; Simpson et al., 2005), la mantención de elevados niveles de viabilidad y estabilidad de sus propiedades en los productos deshidratados y la resistencia a la liofilización, características importantes para el desarrollo de los cultivos7.

5 Lactobacillus rhamnosus E97-800, VTT Biotechnology. Technical Research Centre of Finland, Espoo 6 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12, Chr. Hansen, Argentina. 7 VTT Technical Research Centre of Finland. Hoja informativa. Lactobacillus rhamnosus VTT E – 97800 – a potencial novel probiotic strain

38

3.2.1.2

Sustrato para la inoculación de las cepas. Se utilizó leche en

polvo 26% de materia grasa (MG)8. 3.2.1.3

Material de empaque del producto terminado: Bolsas utilizadas

para envasar la leche en polvo. Se utilizaron bolsas de material flexible trilaminado9 (Anexo 28), con recubrimiento metálico de aluminio que cumplen con las especificaciones de la Federación Internacional de la Leche 300 (IDF/FIL, 1995), de espesor superior a 74µ. 3.2.2

Equipos

3.2.2.1

Unidad de liofilizado marca Labconco modelo Triad Kansas City, USA.

3.2.2.2

Máquina envasadora con sistema de barrido marca Multivac modelo C100.

3.2.2.3

Cámaras de almacenamiento de leche, termoreguladas a 25ºC+2 y 40ºC+2.

3.2.2.4

Cámara de congelación marca NuAire modelo -86ºC Ultra Low Freezers, USA.

3.3

METODOLOGÍA DE TRABAJO

3.3.1

Obtención de cultivo celular en fermentador

La experiencia se realizó en un fermentador modular10, bajo condiciones controladas de laboratorio y bajo la modalidad de cultivo batch. Se trabajó con

8 Donación de Prolesur S.A. Planta Osorno 9 Donación de Cooperativa Agrícola y Lechera de la Unión, Colún. La Unión, Chile 10 Fermentador modular Gallenakamp, England, 1 L con equipos adicionales agitador magnético Thermolyne, baño termoregulado Haake

39

el caldo de fermentación GEM (Anexo 1) estéril ajustados a pH 6,5; a una temperatura de 37ºC+2 y agitación (50 rpm). En el Anexo 2 se muestra esquemáticamente la propagación de las cepas, la que se realizó según el protocolo descrito por Matto et al. (2006). 3.3.2

Control del cultivo celular

3.3.2.1

Determinación de absorbancia. Se tomaron muestras cada hora y

la lectura de la densidad óptica11 se realizó a 630 nm para B. lactis Bb12, (Matto et al., 2006) y a 600 nm para L. rhamnosus E800, (Saarela et al., 2005). Se utilizó como blanco una muestra de caldo de fermentación (GEM). 3.3.2.2

Neutralizante hidróxido de amonio al 20% (NH4OH).

3.3.2.3

Control microscópico de los cultivos12 Se realizó cada hora

mediante frotis con tinción simple (azul de metileno), para evidenciar la morfología del cultivo y realizar el seguimiento de la densidad. 3.3.2.4

Recuento de microorganismos probióticos. Se realizó cada cuatro

horas. Para la siembra de L. rhamnosus E800 se utilizó el agar MRS basado en el caldo de Man Rogosa Sharpe (MRS13) a pH 5,2 ajustado con HCl 1,0 M (Tharmaraj y Shah, 2003), (Anexo 3) y se incubó a 43ºC durante 72 h. En tanto, para la enumeración del B. lactis Bb12 se siguieron las recomendaciones del fabricante del cultivo liofilizado14, adicionando a un litro de medio base MRS, los siguientes compuestos: 5 mL de una solución antibiótica, constituída por dicloxacilina15 (Sigma Chemical CO, USA) 11 Espectrofotómetro Genesys 5. Spectronic Instruments. 12 Olympus CX21 Microscopy 13 Difco, Laboratories Inc. Detroit 14 Christian Hansen's Laboratorium (2007). Hoja informativa. Alternative method for enumeration of Bifidobacteria in fermented milk products – Guideline Technical bulletin P-12 15 Donación del laboratorio Valtek S.A, Diagnostics. Chile

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disuelta en agua destilada y preparada con una concentración de 0,01% (p/v). Además, se incorporó 10 mL de una solución de cloruro de litio (Merck AG, Darmstadt) preparada al 11,11% (p/p) para finalmente añadir 5 mL de una solución de L-cisteína-HCI preparada al 10% (p/v). Tanto la solución de dicloxacilina como la de cloruro de litio fueron esterilizadas empleando filtros de 0,45 µm (Millipore® Corporation, USA) y se incubó a 37ºC durante 48 h (Anexo 4). Por su parte, la solución de L-cisteína-HCI fue esterilizada en autoclave a 121°C por 15 minutos. Todas estas operaciones fueron realizadas con anterioridad a la incorporación de tales soluciones al agar. El antibiótico impide el crecimiento de L. rhamnosus, permitiendo con ello la enumeración selectiva de bifidobacterias (Sozzi et al., 1990). Según Lapierre et al.(1992), el cloruro de litio es una sustancia comúnmente usada en microbiología para el aislamiento de bifidobacterias dado que suprime el crecimiento de las bacterias lácticas. En tanto, la cisteína es considerada como aminoácido esencial para el crecimiento de bifidobacterias por su contribución en la reducción del potencial redox (Hoover, 2000). Para las diluciones, se utilizó la técnica de siembra en superficie descrita por APHA(1992), y se empleó como diluyente el MRD16. Para ello se disolvió 1 g de proteosa peptona (Difco Laboratories Inc., Detroit) y 8,5 g de cloruro de sodio por litro de agua destilada, ajustando su pH a 7,0 + 0,2 con NaOH 0,1N, medio que presenta la ventaja de otorgar un efecto protector aportado por sus componentes, el cual favorece la recuperación de los microorganismos por su condición isotónica (Bridson, 2006). 16 Maximun Recovery Diluent. Bridson . (2006)

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3.3.3

Liofilización de los cultivos celulares.

La metodología de trabajo comprendió diversos pasos, los cuales serán detallados a continuación. 3.3.3.1

Concentración celular.

A partir del cultivo (3.3.1) se realizó la concentración celular que consistió en la centrifugación17 por 10 min de la suspensión de bacterias contenidas en el caldo GEM en tubos Falcón estériles a 4ºC (9720 rpm) (L. rhamnosus E800) y 4000 rpm (B. lactis Bb12), (Matto et al., 2005). Posteriormente se realizó la suspensión del pellet obtenido en 40 mL de leche en polvo descremada, previamente reconstituida al 10% de sólidos no grasos y tindalizada (95ºC por 30 min durante tres días consecutivos a fin de eliminar las esporas). Se mezcló la leche con el pellet celular en el agitador Vortex por tres minutos. 3.3.3.2

Congelación.

Las muestras (3.3.3.1) en un volumen de 40 mL se mantuvieron a -80ºC18 durante 12 h. Posteriormente se descongelaron, dispersaron en el envase (“shell freezing”) y se congelaron a – 196ºC en nitrógeno líquido. 3.3.3.3

Liofilización.

Se llevó a cabo en el Laboratorio de Bioinsumos del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Para ello, los frascos se introdujeron al equipo y se liofilizaron durante 48 a 72h (Labconco, USA), hasta observar una apariencia seca homogénea sin adherencia en las paredes. 3.3.3.4

Refrigeración.

Las muestras se mantuvieron a temperatura < 5ºC hasta el inicio del estudio. 17 Centrifuga refrigerada Hitachi modelo Himac CR 21GII, Japón 18 Nuaire. Inc. Ultralow freezer. Plymouth,U.S.A.

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3.3.4

Control posterior al proceso de liofilización

3.3.4.1

Recuento microbiológico de cada cultivo, sobre agar MRS

correspondiente a cada cepa, mediante la técnica de siembra en superficie descrita por APHA (1992). Para la enumeración de los microorganismos, 0,1 g del liofilizado se reconstituyó en 9,9 mL del diluyente MRD19, previamente entibiada en un baño maría20, a 37º+ 2ºC, lo que constituyó la dilución 10-2. 3.3.4.2

Análisis de la humedad mediante el secado a peso constante en

estufa regulada a 102 + 1ºC según el método para la Determinación del Contenido de Agua de la Federación Internacional de la Leche 26 (FIL/IDF, 1964) citado por Pinto (1998). El resultado fue expresado en gramo de humedad por 100 g de polvo.

3.3.5

Inoculación, mezcla y

homogeneización de las cepas

liofilizadas en la leche en polvo y almacenamiento a temperatura ambiente. Como sustrato de inoculación se utilizó leche en polvo entera a la cual, antes de la inoculación se realizó un control microbiológico, que se comparó con las especificaciones del Reglamento Sanitario de los Alimentos (Chile, Ministerio de Salud, 2008a), donde se evidenció la ausencia tanto de los patógenos Salmonella en 25 g y S. aureus en 10 g, así como de inhibidores (Anexo 5). Para el estudio de viabilidad de las cepas lácticas, se pesó un gramo de cada probiótico liofilizado (3.3.3.3), para 100g de leche en polvo, según el método

19 Maximun Recovery Diluent 20 Baño de agua: Memmert

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descrito por Vendt et al.(2005)21. Para la mezcla y homogeneización en seco se utilizó agitación manual por 10 min, con el fin de asegurar una distribución homogénea de los cultivos en la leche en polvo entera. Para el estudio organoléptico se agregó cinco gramos de cada probiótico liofilizado (3.3.3.3), a 500g de leche en polvo. Para el control negativo se prepararon bolsas con la misma cantidad de leche en polvo sin inocular. Todas las muestras de leches en polvo suplementadas en seco con los probióticos y los controles se envasaron bajo vacío y se conservaron almacenadas a dos temperatura ambiente (25ºC + 2ºC y 40ºC+ 2ºC), durante dos meses. La temperatura de las cámaras de almacenamiento se controló y registró diariamente.

3.3.6

Evaluación del efecto de la temperatura de almacenamiento

de la leche en polvo, sobre la supervivencia de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12. Para valorar la viabilidad de las bacterias almacenadas a 25ºC + 2ºC y 40ºC+ 2ºC, se realizaron recuentos de bacterias probióticas en muestras del producto mantenido en bolsas de trilaminado en las siguientes etapas: a) inmediatamente después de inocular el cultivo liofilizado a la leche en polvo (tiempo cero), b) durante el tiempo de almacenamiento del producto a los 15, 30, 45 y 60 días.

21 Comunicación Personal, Vendt, N. 8/ 9/ 2008. Department of Pediatrics, University of Tartu, Estonia

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Para la siembra se utilizó la metodología descrita para leche en polvo por la Federación Internacional de la Leche 122C (IDF/FIL, 1996). Se pesaron 10 g de leche en una bolsa del homogeneizador Stomacher22, y se agregaron en 90 mL del diluyente MRD23, calentado a 40º+ 1ºC. Con el objeto de evidenciar la estabilidad de la leche en polvo frente al deterioro, al final del almacenamiento se realizó el control de la actividad de agua (aw) 24 3.3.7

Evaluación del efecto de la temperatura de reconstitución de

la leche sobre la viabilidad de las cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12. El objetivo de este análisis fue determinar la viabilidad de los probióticos en los medios de reconstitución agua y MRD sometidos a dos temperaturas de reconstitución: 40ºC y 60ºC. Los análisis microbiológicos se realizaron el día 0, 30 y 60 a partir de la leche en polvo entera almacenada a 25ºC.

3.3.8

Evaluación del efecto de las cepas probióticas sobre las

características organoléptica de la leche reconstituida, sometida a dos tiempos de reconstitución. Con el objeto de conocer si la mantención a temperatura ambiente, durante 60 y 180 min de la leche reconstituida, afectaba sus características organoléptica, se realizó un estudio de evaluación sensorial de las muestras de leche en polvo 22 Stomacher. Seward Medical, London 23 Maximun Recovery Diluent 24 Paw kit water activity meter, Decagon

45

con y sin la incorporación de la mezcla de cepas probióticas (L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12). Para ello se contó con un panel entrenado según programa de entrenamiento de panelistas (Anexo 6) y validado en evaluación de leche en polvo constituido por 10 jueces, seis pertenecientes al Icytal y cuatro a alumnos de la carrera de Ingeniería de Alimentos de la UACh, los cuales fueron previamente reclutados y seleccionados mediante la aplicación de un cuestionario (Anexo 7) y un test de reconocimiento de sabores básicos, respectivamente (Anexo 8), (Watts et al., 1992). La prueba de reconocimiento de sabores básicos se desarrolló en dos sesiones, en la cual se presentaron diferentes concentraciones umbrales para cada sabor básico. En el Anexo 9 se puede observar los componentes y concentraciones utilizadas para la elaboración de las soluciones. Para esta prueba de selección se utilizó el test Triangular descrito por Watts et al. (1992). La etapa de entrenamiento (Anexo 6) se llevó a cabo en 6 sesiones teóricoprácticas de una hora de duración cada una. Las dos primeras sesiones se dedicaron a discutir el rol de los jueces y el test a utilizar. Las cuatro siguientes se destinaron a la evaluación y discusión de las características sensoriales típicas de la leche en polvo. El entrenamiento se efectuó presentando a los jueces leche en polvo con diferentes grados de deterioro o cambios que pudieran presentarse en la leche en polvo al ser inoculadas las cepas probióticas, utilizando para ello muestra estándar para sabor oxidado, rancidez, amargo y acidez, las cuales fueron preparadas según el protocolo de Hought et al. (1992). Se realizaron evaluaciones en base a sabor, para crear

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memoria sensorial sobre los defectos en leche en polvo entera y familiarizar al juez con el test triangular a emplear (Anexo 10). Dicho test consiste en presentar al panelista tres muestras, de las cuales dos son iguales y una diferente, este test permite determinar mínimas diferencias entre las muestras.

Para llevar a cabo la etapa de validación se realizaron tres sesiones de evaluación sensorial. En ellas se aplicó el test triangular para diferenciar muestras de leche en polvo reconstituídas adicionadas de ácido láctico y sulfato de cobre en su umbral medio según protocolo de Hought et al. (1992). El objetivo que se perseguía al preparar estas soluciones, fue que el producto adquiriera un sabor ácido y metálico (oxidado), aludiendo a posibles cambios que pudieran presentarse en el producto al ser inoculados con cepas probióticas. Además permitía verificar que el panelista fuese capaz de percibir e identificar estos cambios.

Las muestras de leche en polvo utilizadas para el estudio se reconstituyeron según la metodología descrita por Federación Internacional de la Leche 99B (IDF/FIL, 1995). La disolución se realizó mediante agitación manual y se dejó en reposo. Se ajustó la temperatura a 20ºC + 2ºC y se mantuvo la leche a esa temperatura hasta el momento de la degustación a los 60 y 180 min. Cada sesión de degustación correspondiente a los 60 y 180 minutos de la reconstitución se realizó desfasada en 48 h de forma de evitar juicios inconsistentes por

errores de tipo

psicológico

como

cansancio

o

desmotivación. El panel se realizó a los tiempos cero, 30 y 60 días. Al inicio

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del estudio se realizaron 6 sesiones teórico/práctica preliminares de una hora, con el objeto de estandarizar conceptos del método de evaluación y atributos del producto. En cada sesión de degustación se evaluó un set de muestras según la metodología de test triangular (Watts et al., 1992). Entre estas muestras se incluyó el control. Las condiciones de evaluación fueron en cabinas independientes con luz blanca pertenecientes al Laboratorio de Análisis Sensorial del ICYTAL, provistas de tres vasos de plástico tapados conteniendo las muestras codificadas, un vaso de agua potable a temperatura ambiente, toalla nova, galletas tipo cracker, lápiz y ficha de evaluación (Anexo 10). Las pruebas se realizaron en la tarde, entre las 16:00 a 17:00 h. Al inicio de la degustación las muestras correspondientes al mayor tiempo desde su reconstitución (180 min) se encontraban en cada cubículo y posteriormente durante la degustación simultáneamente a cada panelista y en un orden seleccionado al azar (Watts et al., 1992), se entregaban las muestras con 60 min post reconstitución.

La evaluación se realizó en triplicado. La interpretación de las respuestas se realizó utilizando la tabla de significación estadística para el test Triangular (Anexo 11), (Wittig de Penna, s/f), en la cual se identifica si existe diferencia significativa, relacionando el número total de panelistas que participan en la prueba y el número de panelistas que eligió correctamente la muestra diferente.

48

3.3.9

Evaluación físico – química

Con el objeto de detectar efectos atribuídos a las cepas en estudio, se realizaron paralelamente las siguientes mediciones: 3.3.9.1

Viscosidad: mediante un viscosímetro rotacional25 se determinó la

viscosidad de la leche en polvo reconstituida, a una temperatura de 20º +2ºC, utilizando un husillo número 2. 3.3.9.2

Acidez: la determinación de la acidez titulable de la leche en

polvo reconstituida se realizó al tiempo cero y cada 15 días durante los dos meses de almacenaje de la leche, usando el método establecido por la Norma Chilena 1678. 1979 (Chile, INN, 1979).

3.4.

Diseño Experimental y Análisis estadístico

Se estudiaron tres tratamientos con tres repeticiones cada uno. Las variables estudiadas fueron: viabilidad de los probióticos (0, 15, 30, 45 y 60 días) y, características físico-químicas y sensoriales de la leche en polvo con probióticos (0, 15 y 30 días). Tratamiento 1:

Leche en polvo inoculada con L. rhamnosus E800.

Tratamiento 2:

Leche en polvo inoculada con B. lactis Bb12.

Tratamiento 3:

Leche en polvo inoculada con una mezcla de ambos

probióticos en una proporción de 1:1 de L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12.

25 Viscosímetro Visco Star R de Fungilab S.A.

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Tabla 3.

Diseño experimental

Variable Viabilidad de los probióticos según temperatura de almacenamiento de la leche en polvo Viabilidad de los probióticos según temperatura de reconstitución de la leche en polvo Características Sensoriales del producto Característica Física – química del producto

Nivel 0, 15, 30, 45 y 60 días.

Respuesta estudiada Recuentos microbiológicos para cada probiótico.

0, 15, 30, 45 y 60 días.

Recuentos microbiológicos para cada probiótico.

0, 30, y 60 días.

Test Triangular

0, 30 y 60 días

Acidez titulable y Viscosidad

Los resultados de las pruebas físicas y microbiológicas se analizaron mediante un análisis de Varianza Multivariado. Se realizó el test de Levene para realizar el supuesto de homogeneidad de varianzas. En caso de existir diferencias significativas p