UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTÉCNIA CAMPUS II

CARACTERIZACIÓN DE LOS PROCESADORES Y ANÁLISIS DE LA CALIDAD DE LA LECHE Y EL QUESO DEL MUNICIPIO DE TÉCPATAN, CHIAPAS

TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: IRENE GUADALUPE OCHOA PÉREZ DIRECTOR: MC. JOSÉ BERNARDO SÁNCHEZ MUÑOZ DIRECTOR EXTERNO: DR. JOSÉ NAHED TORAL ASESOR: DR. JOSÉ LUIS CRUZ LÓPEZ

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas

Mayo, 2013

I

DEDICATORIA

A DIOS

Al Dios todo poderoso que me permite vivir y luchar todos los días, regalarme la sabiduría necesaria para lograr mis objetivos, con todo mi amor y respeto a él se lo debo todo. He peleado la buena batalla, he acabado la carrera, he guardado la fe. II Timoteo 4:7.

A mis padres Sr. Isidro Ochoa y Sra. Esperanza Pérez

Con eterno amor a ellos, por darme la vida, amor, paciencia, apoyo incondicional, por sus consejos que siempre me han brindado y la educación lo que hacen de mi una mujer con valores. Hijos obedeced en el señor a vuestros padres, porque esto es justo. Efesios 6:1

A mis Hermanos Oralia, Luis y Nayeli

Con mucho Cariño, por sus infinitos apoyos, por ser los mejores hermanos que uno puede tener. A Oralia por su apoyo económico, moral y ver en ella un ejemplo a seguir. Amaos los unos a los otros con amor fraternal. Romanos 12:10.

MVZ. IRENE GUADALUPE OCHOA PEREZ.

AGRADECIMIENTOS II

A mi Director, Codirector y Asesor de Tesis MC. José Bernardo Sánchez Muñoz

Mi infinita gratitud, por todo su apoyo, su tiempo brindado y dedicación mostrada en todo momento para la realización de este trabajo. Dr. José Nahed Toral MC. José Luis Cruz López

Agradezco a Dios por sus consejos y apoyo brindado en todo momento de mi carrera. Reten el consejo, no lo dejes; Guárdalo, porque eso es tu vida. Proverbios 4:13. A mi Amigo Luis

Por ser un excelente compañero y amigo durante toda la carrera y ayudarme a culminar este trabajo, esperando nuestra amista perdure a través del tiempo. En todo tiempo ama el amigo, y es como un hermano en tiempo de angustia. Proverbios 17:17.

Agradezco a ECOSUR por el apoyo económico otorgado para la realización del presente trabajo de investigación a través del proyecto FORDECYT-CONACYT “Gestión y estrategias de manejo sustentable para el desarrollo regional en la cuenca hidrográfica transfronteriza Grijalva “clave 12011. A la Química. María

E. por su tiempo dedicado y apoyo en las pruebas realizadas en este

trabajo. A los propietarios de las queserías muestreadas en el municipio de Tecpatan, Chiapas por su disponibilidad y permitirme realizar este estudio.

LISTA DE CONTENIDO

Pág. III

I.

INTRODUCCION .............................................................................................. 1

II.- REVISION DE LITERATURA ............................................................................ 2 2.1 Definición de la leche ...................................................................................................... 2 2.2. Características fisicoquímica de la leche...................................................................... 2 2.3. Caracteres organolépticos .............................................................................................. 4 2.4. Composición de la leche ................................................................................................. 6 2.5 Análisis de la calidad de la leche.................................................................................... 8 2.5.1. Prueba de alcohol .................................................................................................... 8 5.2.2. Determinación de acidez titulable .......................................................................... 9 2.5.3 Densidad de la leche .............................................................................................. 10 2.5.4. Método Lacticheck .................................................................................................. 11 2.5.5. Métodos para el recuento celular Delaval Cell Counter. ..................................... 11 2.6. El Queso y su Clasificación ........................................................................................ 12 2.7. Proceso de elaboración del queso crema de Chiapas. ............................................ 15 2.8. Análisis microbiológico de la leche ............................................................................... 16 2.9. Análisis Microbiológico del Queso ................................................................................ 17 2.10. Pruebas Microbiológicas ............................................................................................. 17 2.10.1. Bacterias Coliformes ........................................................................................... 19 2.10.2. Determinación de microorganismos Coliformes totales en placa. ................... 20 2.10.3. Determinación de Mesofilos Aerobios ................................................................ 21 2.10.4. Determinación de Staphylococcus aureus ......................................................... 25 2.10.5. Determinación de Salmonella spp. .................................................................... 26 2.10.6. Determinación de Listeria monocytogenes. ....................................................... 28 2.11. Inocuidad ..................................................................................................................... 29

III. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................ 31 3.1. Localización del área de estudio. ................................................................................. 31 3.1.1. Descripción de la población. .................................................................................. 32 3.2. Metodología .................................................................................................................... 32 3.2.1. Toma de muestra ................................................................................................... 33 3.2.2. Determinación de la composición Físico-química de la leche ............................ 33 3.2.3. Determinación de la calidad Microbiológica de la leche y Quesos .................... 34

IV

3.3. Análisis estadístico. ....................................................................................................... 35

IV. RESULTADOS Y DISCUSION ....................................................................... 36 V. CONCLUSIONES ............................................................................................. 63 VI. LITERATURA CITADA .................................................................................... 65

V

LISTA DE CUADROS

Pág.

Cuadro 1. Propiedades físico-químicas naturales de le leche.

3

Cuadro 2. Composición promedio de la leche

7

Cuadro 3. Composición química de las estructuras funcionales

8

Cuadro 4. Tipos de quesos

13

Cuadro 5. Reacciones Bioquímicas y serológicas de Salmonella spp.

27

Cuadro 6. Características de los procesadores de leche del municipio de Tecpatan, Chiapas. Cuadro 7. Composición físico química de la leche con la que elaboran el queso en el municipio de Tecpatan. Cuadro 8. Análisis de la calidad higiénico sanitario de la leche con la que es elaborado el queso en el municipio de Tecpatan. Cuadro 9. UFC de Coliformes Totales de leche con la que se elabora el queso en el municipio de Tecpatan.

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47

48

Cuadro 10. Resultados de las pruebas presuntivas y confirmatorias para la determinación de Staphylococcus aureus en leche en el municipio de

50

Tecpatan Cuadro 11. UFC de Staphylococus aureus de leche con que se elaboran los quesos en el municipio de Tecpatan. Cuadro 12.UFC/ml de Mesofilos aerobios en la leche con que se elaboran los quesos en el municipio de Tecpatan. Cuadro 13.Determinacion de bacterias Salmonella Spp, y Listeria monocytogenes en leche mediante pruebas presuntivas y confirmatorias. Cuadro 14.Identificacion de Salmonella spp, y Listeria monocytogenes en leche del municipio de Tecpatan. Cuadro 15. UFC de Coliformes Totales en queso elaborado en el municipio de Tecpatan.

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55

Cuadro 16.Resuldtados de pruebas presuntivas y confirmatorias para la determinación de Staphyococcus aureus en queso del municipio de Tecpatan. VI

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Cuadro 17.UFC de Staphylococus aureus en quesos elaborados en el municipio de Tecpatan. Cuadro 18.UFC de Mesofilos Aerobios en queso elaborado en el municipio de Tecpatan. Cuadro 19.evaluacion de bacterias Salmonella spp. y Listeria monocytogenes en queso mediante pruebas presuntivas y confirmatorias. Cuadro 20.Identificacion mediante pruebas confirmatorias de Salmonella spp. y Listeria monocytogenes en queso en el municipio de Tecpatan.

VII

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58

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61

LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Tipos de productos elaborados en el municipio de Tecpatan. Figura 2. Pruebas para determinar la calidad de la leche y queso que realizan los procesadores del municipio Tecpatan. Figura 3. Principales servicios con los que cuentan los procesadores del Municipio de Tecpatan. Figura 4. Equipo con el que cuentan los procesadores del Municipio de Tecpatan. Figura 5. Tipo de material y utensilios con lo que cuentan los procesadores del Municipio de Tecpatan. Figura 6. Vestimenta con el que cuenta el personal de trabajo en las queserías del Municipio de Tecpatan.

VIII

39 41

42

43

44

45

RESUMEN El

objetivo de este estudio fue: i) Caracterizar a los procesadores de leche, ii)

Analizar la composición físico-química y microbiológica de le leche con la que se elaboran los quesos y iii) Evaluar la calidad microbiológica

de los quesos

elaborados en el municipio de Tecpatán Chiapas. Para el primer caso se utilizó el método de encuesta y la técnica de entrevistas semi estructuradas, aplicada a 14 procesadores de leche, con 32 preguntas en cuatro apartados: Características generales, aspectos económicos, aspectos higiénico-sanitarios e infraestructura.

Para la composición físico química de la leche se determinó grasa, proteína, lactosa, solidos no grasos, punto crioscopico, agua agregada analizador

de

leche

Lacticheck,

determinándose

utilizando el

además Cel.

Somática

clasificándose la calidad de acuerdo a la norma NMX-F-700-COFOCALEC-2004.

Para el análisis microbiológico se determinó las UFC de Coliformes Totales (CT), UFC Mesofilos aerobios, UFC de Staphylococus aureus ausencia de Salmonella Spp. y Listeria monocytogenes en leche como en queso de acuerdo a la NOM243-SSA1-2010,

Los

resultados

obtenidos

permitieron

clasificar

a

procesadores de acuerdo al volumen de leche y kilogramos de queso

los que

procesan. Se identificaron dos grupos: grandes (grupo A) y pequeños procesadores (Grupo B). El volumen de leche que procesan para el grupo A, fue de 2,100±1,935.6 l, mientras que para grupo B de 465±228.6 l, en lo referente a los kg de quesos que elaboran en el grupo A, fue de 200±201, y para el grupo B, de 73±83, se observaron diferencias en cuanto a edad de los procesadores, tipo de producto que elaboran, centros de venta del producto e infraestructura y equipo con el que cuentan.

Respecto a la composición fisicoquímica de la leche de acuerdo a la norma, esta se clasifica como leche clase 1, no encontrándose diferencias entre grupos, y con un valor para grasa, en el grupo A, de 42.2±4.9 g o % y para el B de 50.5 ± 10 g . Se observó diferencia en el número de células somáticas presentes en la leche IX

por arriba de lo establecido por la norma NMX-F-700-COFOCALEC-2004, entre los dos grupos que se analizaron siendo para el grupo A de 555,250±218,973.9 Cs/ml y para el grupo B de 950,000±358,417 CS/ml. Con respecto al análisis microbiológico de la leche no se cumplió con lo establecido por la norma ya que se encontró un alto contenido de Coliformes Totales para el grupo A y B con 162±75 x 103 UFC y 160±73.786 x 103 UFC respectivamente, así también se encontró un alto contenido de UFC para

Staphylococus aureus y Mesofilos

aerobios en donde los valores se encontraron muy por arriba de lo establecido en la norma oficial NOM-243-SSA1-2010.

No se detectó la presencia de Salmonella spp y Listeria monocytogenes en la totalidad de las muestras de leche. Para el caso de los quesos, se observó que el 100% de los quesos se elaboran con leche bronca y que el 100% se encontró valores con alto grado de contaminación, las muestras no cumplen con las normas microbiológicas establecidas por la norma oficial mexicana NOM-243-SSA1-2010 para quesos en cuanto a UFC de Coliformes Totales, Staphylococus aureus y Mesofilos aerobios. Por otro lado el 100% de las muestras resulto negativa a Salmonella spp y se reporta la presencia de Listeria monocytogenes en una de las muestra. Se concluye que en general la leche con la que se elabora el queso en el municipio de Tecpatán es de excelente calidad físico química, sin embargo, es necesario mejorar las condiciones higiénicas y sanitarias del proceso de elaboración del queso para reducir los riesgo para la salud de los consumidores.

X

I. INTRODUCCION

El estado de Chiapas es una entidad agropecuaria, donde se centra la mayor actividad económica y social. Del total de la población económicamente activa, (PEA) este sector absorbe casi el 60%, a su vez la actividad ganadera cuenta con el 36%, de la superficie total del estado, el 33% está dedicado a actividades pecuarias, en donde encontramos un rebaño bovino de 2, 400,000 cabezas. Se estima que en el estado se produce 1 000 000 litros diarios de leche (340 millones anuales), lo que significa el 2.8% del total nacional, los volúmenes varían a lo largo del año, dependiendo la época lluvia o seca. Hoy día, dentro de la producción de lácteos, el queso enfrenta problemas que dificultan su comercialización, debido al proceso artesanal de producción con leche sin pasteurizar, el queso es altamente perecedero y su consumo constituye un riesgo potencial para la salud. Es por ello que la inocuidad, es parte fundamental de la calidad, la ausencia de agentes que puedan dañar la salud e integridad de las personas, sean físicos fragmentos de vidrio, alambre, entre otros, químicos plaguicidas, toxinas, o biológicos (microorganismos patógenos) en los alimentos. Es muy importante producir, almacenar, transportar y ofrecer al consumidor final productos que no sean dañinos para la salud, tanto humana como animal, a medida que los consumidores adquieren

mayor conciencia sobre la importancia de consumir

alimentos sanos y de calidad, demandan a sus

mayores controles sobre los

alimentos que se producen. El presente trabajo de investigación tuvo por objetivo realizar la caracterización de los procesadores de leche y determinar la calidad fisicoquímica y microbiológica de la leche y los quesos del municipio de Tecpatan.

1

II.- REVISION DE LITERATURA

2.1 Definición de la leche

La leche es un líquido muy complejo producido solamente por las hembras mamíferas. El principal propósito de la leche es el de proveer de nutrientes y de protección a los animales lactantes, hasta que sean capaces de consumir alimentos sólidos (Hazard, 1997). La leche es un producto íntegro no alterado ni adulterado y sin calostros (primera leche de la vaca después del parto), del ordeño higiénico, regular y completo de las hembras mamíferas sanas y bien alimentadas y es uno de los pocos alimentos que puede ser considerado como equilibrado. Es aceptada por la población como el alimento más estable y básico, independientemente de la edad de los consumidores. Leche: producto íntegro y fresco del ordeño total y sin interrupción de una hembra lechera en buen estado de salud, bien nutrida, limpia y descansada. Dicho producto ha de ser obtenido higiénicamente y estará exento de sustancia extrañas y calostro. Desde un punto de vista biológico, se define a la leche como "un producto estéril que satisface los requerimientos nutritivos del lactante de la especie homóloga sin ningún tipo de contaminación física o química" (Keating, 2002).

2.2. Características fisicoquímica de la leche La leche tiene una estructura física compleja con tres estados de agregación de la materia: • Emulsión, en la que se encuentran, principalmente, las grasas. • Disolución coloidal de parte de las proteínas.

2

• Disolución verdadera del resto de las proteínas, la lactosa y parte de los minerales. Por tanto, podemos definir la leche como una suspensión coloidal de partículas en un medio acuoso dispersante.

Las partículas son de dos tipos: unas tienen forma globular, de 1,5 al 0 micras de diámetro y están constituidas por lípidos; las otras son más pequeñas, de 0,1 micras de diámetro y corresponden a micelas proteicas que llevan adosadas sales minerales (Amiot, 1991).

Al dejarla en reposo o al someterla a una centrifugación ligera, se puede separar una fracción grasa, la crema, más o menos amarillenta. Si, tras el reposo, se hierve, se favorece la aglutinación de la grasa, y se forma una película semisólida en la superficie, la nata (Magariño, 2000).

En el caso de que se coagulen las proteínas, se obtendrá una masa friable más o menos blanquecina, la cuajada, y un resto líquido más o menos turbio que corresponde a la fracción hidrosoluble con la lactosa disuelta, el suero.

Los valores de las principales propiedades físico-químicas de la leche natural se muestran en el cuadro 1.

Cuadro 1. Propiedades físico-químicas natural de la leche. PROPIEDAD

VALOR

Densidad

1.028-1.035

pH

6.4-6.8

punto Crioscopico

-0.52-0.54 °C

Punto de Ebullición

100.5°c

Conductividad eléctrica

0.005 ohm /-1 Fuente: Hazard, 1997

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Por tanto, podemos definir la leche como una suspensión coloidal de partículas en un medio acuoso dispersante. Las partículas son de dos tipos: unas tienen forma globular, de 1,5 al 0 micras de diámetro y están constituidas por lípidos; las otras son más pequeñas, de 0,1 micras de diámetro y corresponden a micelas proteicas que llevan adosadas sales minerales (Hazard, 1997).

2.3. Caracteres organolépticos La leche es un compuesto líquido, opaco, de color blanco marfil y con el doble de viscosidad que el agua. Esa coloración se torna ligeramente azulada cuando se añade agua o se elimina la grasa. Es, precisamente, este componente, la porción lipídica, el que da aspecto amarillento a la superficie cuando la leche se deja un tiempo en reposo; los causantes son los pigmentos carotinoides que hay en los pastos con que se alimenta a los animales. El sabor de la leche es delicado, suave, ligeramente azucarado; su olor tampoco es muy intenso, aunque sí característico. La grasa que contiene presenta una acusada tendencia a captar los olores fuertes o extraños procedentes del ambiente, por lo tanto la leche como tal tiene sus propias características organolépticas:

Textura La leche tiene una viscosidad de 1,5 a 2,0

centipoises a 20 ºC, ligeramente

superior al agua (1,005 cp.). Esta viscosidad puede ser alterada por el desarrollo de ciertos microorganismos capaces de producir polisacáridos que por la acción de ligar agua aumentan la viscosidad de la leche (leche mastitica, leche hilante).

Color El color normal de la leche es blanco, el cual se atribuye a reflexión de la luz por las partículas del complejo caseinato-fosfato-cálcico en suspensión coloidal y por los glóbulos de grasa en emulsión. Aquellas leches que han sido parcial o totalmente descremadas o que han sido adulteradas con agua, presentan un color 4

blanco con tinte azulado. La leche de retención o mastiticas presentan un color gris amarillento. Un color rosado puede ser el resultado de la presencia de sangre o crecimiento de ciertos microorganismos. Otros colores (amarillo, azul, etc), pueden ser producto de contaminación con sustancias coloreadas o de crecimiento de ciertos microorganismos. Una leche adulterada

con suero de

quesería puede adquirir una coloración amarilla-verdosa debida a la presencia de riboflavina (Hazard, 1997).

Sabor El sabor natural de la leche es difícil de definir, normalmente no es ácido ni amargo, sino más bien ligeramente dulce, gracias a su contenido en lactosa. A veces se presenta con cierto sabor salado por la alta concentración de cloruros que tiene la leche de vaca que se encuentra al final del periodo de lactancia o que sufren estados infecciosos de la ubre (mastitis); otras veces el sabor se presenta ácido cuando el porcentaje de acidez en el producto es superior a 22-33 ml N a OH 0,1 n/100 ml (0,2 - 0,3 % de ácido láctico). Pero en general, el sabor de la leche fresca normal es agradable y puede describirse simplemente como característico.

Olor El olor de la leche es también característico y se debe a la presencia de compuestos orgánicos volátiles de bajo peso molecular, entre ellos, ácidos, aldehídos, cetonas y trazas de sulfato de metilo. La leche pude adquirir, con cierta facilidad sabores u olores extraños, derivados de ciertos alimentos consumidos por la vaca antes del ordeño, de sustancia de olor penetrante o superficies metálicas con las cuales ha estado en contacto o bien de cambios químicos o microbiológicos que el producto puede experimentar durante su manipulación. Si se consideran olores y sabores aceptables aquellos comprobadamente provenientes de la alimentación y susceptibles de ser eliminados en el proceso industrial (Magariño, 2000)

5

2.4. Composición de la leche

La leche es un líquido la cual está compuesta por agua, grasas, proteínas, azúcares (lactosa), minerales, vitaminas y algunas sustancias presentes en menor concentración, como son: enzimas, nucleótidos, lecitinas y gases disueltos, así como otros elementos sin valor nutritivo de color blanco-amarillento y de apariencia opaca, su olor es poco característico, pero si la ración contiene compuestos aromáticos puede adquirir olores anormales (Keating, 2002).

Desde el punto de vista nutricional, se define como un alimento completo cuyos componentes se encuentran en una proporción adecuada y contiene de forma balanceada la mayoría de los nutrientes esenciales, además de ser muy digestible, su peso específico oscila entre 1.028-1.034 y disminuye cuando es rica en grasa (Hazard, 1997) La leche de vaca, es la que con más frecuencia se consume, tiene 87.5 % de agua, 35 % de proteínas ( caseína, lactalbúmina y lactaglobulina ), 45 % de lactosa, 6% de (fosfatos y cloruro de sodio), grandes cantidades de vitaminas a, b y d, además de pocas cantidades de vitamina c (Hazard, 1997). La leche se encuentra constituida por más de 10.000 diferentes moléculas y cada una posee un papel diferente al proveer de nutrientes (energía, proteína, grasa, minerales y vitaminas) o protección inmune. La composición de la leche de las diferentes especies está designada para alcanzar determinadas necesidades del lactante de cada especie. El principal componente de la leche es el agua, seguido fundamentalmente por grasa (ácidos grasos saturados en mayor proporción y colesterol), proteínas (caseína, lactoalbúminas y lactoglobulinas) e hidratos de carbono (lactosa principalmente). Así mismo, contiene moderadas cantidades de vitaminas (a, d, y vitaminas del grupo b, especialmente b2, b1, b6 y b12) y minerales (fósforo, calcio, zinc y magnesio). Las proteínas de la leche están entre las de mayor valor

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biológico, es decir son las que mejor se ajustan a las necesidades proteicas del cuerpo humano (Hazard, 1997). Así podemos mostrar los rangos normales de la composición de la leche como se muestra en el cuadro 2. Cuadro 2. Composición promedio de la leche Componente

porcentaje %

Agua

86

Proteína

3.6

Lactosa

5

Grasa

4.1

Minerales

0.72

Total (sólidos totales)

12.02 Fuente: McDonald, 1999

Composición química de las estructuras funcionales.

La leche tiene estructuras funcionales las cuales están compuestas por caseína, proteína de la leche que se une por medio de fosfato de calcio y magnesio dando paso a las estructuras denominadas micelas, estas partículas otorgan el color blanco opaco característico de la leche, como se muestra en el cuadro siguiente.

Composición química de las estructuras de reserva

Las estructuras de reserva están compuestas principalmente por lípidos o grasa butírica formando lo que llamamos glóbulos de grasa, los carotenoides de la grasas son responsables del color amarillo de la leche. Teniendo los trigliceridos 7

como porcentaje el 96 %, fosfolipidos el 0.8-1.0 %, carotenoides, colesterol y vitaminas el 1.0 %. (Hazard, 1997).

Cuadro 3. Composición química de las estructuras funcionales. Composición micelas

%

Agua

70

Caseína

28

Calcio

0.9

Magnesio

0.03

Fosfato

0.66

Ac. Cítrico

0.15 Fuente: Hazard, 1997

2.5 Análisis de la calidad de la leche

Se habla frecuentemente de calidad, pero no siempre se atiende al significado completo y al concepto verdadero de este término. Por una parte, la leche, al ser segregada, adquiere en cada caso individual ciertas características físicas y químicas que determinan su composición. Por otra parte, hay que tener en cuenta el estado de salud del animal productor, ya que la leche, así como puede ser un excelente alimento, puede también constituir un peligroso medio de difusión de enfermedades (Keating, 1986).

2.5.1. Prueba de alcohol

Esta prueba permite detectar de forma rápida y cualitativamente el termo estabilidad de la proteína

(propiedad de coagulación) de una leche cruda. El

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alcohol que se agrega a la leche provoca la precipitación de las micelas presentes en ésta, cuando es afectada la termo estabilidad. Se mezclan cantidades iguales de leche y alcohol a 68% (éste ya puede ser comprado en esta concentración), si se produce la coagulación quiere decir que la acidez de la leche es demasiado elevada. Esta prueba se realiza con un alcoholímetro, el cual es un tubo compuesto por una pistola, barril y copa (Alais, 1984)

Este instrumento se introduce en un recipiente con leche sólo para tomar una pequeña muestra y debe agitar un poco. Esto debe hacerse debido a que la grasa, al ser menos densa, se sube y se oxida, por lo que la prueba puede dar negativa. Si la prueba da positiva se debe confirmar con la prueba de acidez cuantitativa. La prueba de alcohol se fundamenta en que la leche cruda debido a que a medida de que se incrementa la acidez por la acción de las bacterias se modifica las estructuras proteicas y la leche se coagula. La concentración de alcohol varía entre 68 – 75% dependiendo del destino final que se le dará a la leche. Normalmente la leche positiva a la prueba de alcohol tiene mal sabor y olor. Esta prueba de utiliza como indicador de calidad de la leche cruda debido a que a medida que se producen ácidos, se modifican las estructuras proteicas y la leche se coagula (se corta) cuando se mezcla con alcohol o se somete a ebullición.

5.2.2. Determinación de acidez titulable

Los valores normales de acidez titulable en leche están comprendidos entre 16°D y 19°D (grados Dornic) que expresado en porcentaje del ácido mayoritario serían 0.16-0.19% de ácido láctico. Las alteraciones en la leche durante la síntesis o almacenamiento pueden originar cambios en la acidez. Además, determinadas adulteraciones hacen variar estos valores: el aguado la rebaja, el desnatado y adición de suero no la modifican y la neutralización la rebaja considerablemente. Aunque existen diferentes modos de expresar la acidez 9

la forma más habitual de expresión son los grados Dornic (ºD) y el porcentaje de ácido láctico (Hazard, 1997).

La leche fresca tiene normalmente de 16-19°Dornic, una acidez inferior a 16°D son sospechosas de aguado, neutralización, o de proceder de vacas con mamitis. valores de acidez superior a 19°d son imputables a leches de más de 10 horas (ordeño de la noche) y valores superiores a 23°D corresponden a leches muy ácidas que han perdido la estabilidad térmica por lo que no podrían pasteurizarse y/o esterilizarse, ya que se produciría una coagulación (Alais, 1984).

Si a la muestra de leche se le ha adicionado Dicromato potásico, es preciso tener en cuenta la acidez debida a dicho conservador. En el caso de leches no alteradas se puede considerar que 1 g de Dicromato potásico aumenta la acidez en las mismas proporciones que 0.6 g de ácido láctico.

2.5.3 Densidad de la leche

La densidad es una propiedad física utilizada para comparar las masas de diferentes sustancias o de una misma bajo diferentes condiciones. En la densidad de la leche influyen todos los constituyentes normales, así como todas aquellas sustancias extrañas que se adicionan de forma fraudulenta, tanto sólidos como líquidos. Existen muchas causas que actúan variando la densidad de la leche, como son la composición química, la temperatura de medición, la temperatura de almacenamiento, el tiempo transcurrido desde el ordeño, el ordeño fraccionado, la centrifugación y otras operaciones tecnológicas (Carrion, 2001)

Para la determinación de la densidad de la leche se emplea la técnica de lacto densimetría. Los lactodensímetros son aerómetros, cuerpos flotadores de vidrio lastrados en su parte inferior con varilla graduada, y que en ocasiones pueden llevar incorporado un termómetro, permitiendo la lectura paralela de la densidad y la temperatura. Cuando el aerómetro se introduce en la leche sufre un impulso 10

hacia arriba igual al peso del higiene inspección y control alimentario líquido desaloja (principio de Arquímedes), quedando el valor de densidad reflejado en la varilla graduada. La determinación puede realizarse en leche completa o en suero lácteo (Calvinho, 2001).

2.5.4. Método Lacticheck

En respuesta a las necesidades crecientes de la industria de lácteos para mantener la calidad de la leche desde la ordeña al consumidor, el lacticheck lc-01 permite obtener resultados rápidos, precisos y a un bajo costo para leche bronca y leche procesada. Resultados para grasa, sólidos no grasos, proteína, densidad y agua agregada. Basado en espectroscopia ultrasónica, este equipo no requiere del uso de reactivos químicos corrosivos o costosos. La calibración sencilla de dos canales facilita la configuración para el análisis de leche de vaca, cabra, oveja o búfalo según se requiera.

Además de ser portátil, ligero y compacto, el lacticheck lc-01 es confiable; proporcionando resultados que muestran una buena correlación respecto a los métodos químicos de referencia en sólo una fracción del tiempo requerido por estos métodos.

Procedimiento: La muestra recolectada beberá estar a 37 °C, aproximadamente, se colocara en un vaso de precipitado, con suficiente muestra, se coloca en el receptor del lacticheck y se esperara hasta que arroje los resultados en la pantalla. (Lacticheck, 2007)

2.5.5. Métodos para el recuento celular Delaval Cell Counter.

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El Delaval Cell Counter (DCC) es un equipo portátil, que funciona con batería y posee un medidor óptico de células somáticas de la leche. Esto permite estudiar el estado de salud de la ubre de la vaca, también posibilita el estudio de los estándares higiénicos en la leche del tanque. El equipo utiliza casettes los cuales succionan cantidades pequeñas de leche, ya dentro del casettes, la leche se mezcla con reactivos que llegan al núcleo de las células somáticas, lo cual permite su conteo, mediante un sensor de flourescencia.

Esto se traduce en el número de células somáticas en leche, el cual aparece rápidamente en la pantalla del equipo. Su principio es similar al utilizado por el equipo FOSS y nos da datos precisos sobre el estado de salud de la ubre de la vaca lechera. 2.6. El Queso y su Clasificación

De acuerdo a la FAO/OMS: Queso: “es el productos fresco o madurado obtenido por la coagulación y separación de suero de la leche, nata, leche parcialmente desnatada, mazada o por una mezcla de estos productos”. de acuerdo a la composición: “ es el producto, fermentado o no, constituido esencialmente por la caseína de la leche, en forma de gel más o menos deshidratado que retiene casi toda la materia grasa, si se trata de queso graso, un poco de lactosa en forma de ácido láctico y una fracción variable de sustancias minerales (Veisseyre,1990).

Clasificación y criterios de clasificación:

a) De acuerdo al contenido de humedad se clasifican en quesos duros, semiduros y blandos.

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b) De acuerdo al método de coagulación de la caseína, se clasifican en quesos al cuajo (enzimáticos), queso de coagulación láctica (ácido láctico), queso de coagulación de ambos métodos. c) De acuerdo al microorganismo utilizado en la maduración y la textura del queso, se clasifican en quesos de ojos redondeados, granulares y quesos de textura cerrada. Según (González, 2002) clasifica los quesos de la siguiente manera. Cuadro 4. Tipos de quesos, Según González, 2002. 1. Quesos duros (26-50% de humedad). madurados por bacterias: muy duros (26-34%). parmesano duros (36-46%) emmenthal, cheddar semiduros (45-50%) gouda 2. Madurados internamente por mohos: semiduros (42-52%) roquefort 3. Madurados superficialmente por bacterias semiblandos (45-55%), limburger 4. Quesos blandos: madurados superficialmente por mohos (48-55%), brie, camembert. 5. Quesos blandos: no madurados (50-80%). cottage, mozzarella 6. Otros tipos: en salmuera, de suero, fundidos.

Según la NOM-121-SSA1-1994, para que un queso pueda llamarse queso no podrá utilizarse en su fabricación, grasas vegetales almidones ni harinas, en la etiqueta debe indicarse el contenido mínimo de proteína y grasa, así como el máximo de humedad. Los quesos pueden elaborarse con leche entera, parcialmente descremada, semidescremada, crema o doble crema y su clasificación es la siguiente:

Queso fresco Se caracteriza por su elevado contenido de humedad, sabor suave y un periodo de vida de anaquel corto, por lo que debe de estar refrigerado. Se consideran como quesos frescos: canastos, panela, fresco, rancheros, sierra, blanco, 13

enchilado, adobado, Oaxaca, asadero, mozzarella, adobera, cottage, crema, doble crema, petit suisse, entre otros (NOM-121-SSA1-1994).

Queso madurado estos son los quesos de pastas más duras, semiduras o blandas sometidos a un proceso de maduración mediante la adicción de microorganismos, mohos o bacterias bajo condiciones controladas de tiempo, temperatura y humedad para provocar en ellos cambios bioquímicos y físicos, que se les confieran la consistencia y el sabor característicos. Aquí se encuentran los quesos: cheddar, chéster, chihuahua, manchego, brick, edam, gouda, gruyere, emmental, cheshire, holandés, amsterdam, butterkase, cabrales, camembert, roquefort

y danablu,

entre otros. (NOM-121-SSA1-1994).

Procesado Resultado de la mezcla de quesos madurados fundidos, a los que se les pueden agregar ingredientes y especias; dentro de estas clasificaciones están los quesos fundidos y para untar, como el queso amarillo y la mayoría de los que se venden en rebanadas cuadradas (NOM-121-SSA1-1994).

Para la NMX-F-713-COFOCALEC-2005, la descripción del queso puede utilizarse los siguientes criterios de clasificación: por la especie de mamíferos de la cual proviene la leche utilizada, el queso se clasifica en: Elaborado con leche de vaca Elaborado con leche de cabra Elaborado con leche de oveja Elaborados con mezclas de leches de vaca, cabra, oveja u otras especies. Elaborados con leches de otros mamíferos.

Por el tipo de agente utilizado para la coagulación, los quesos pueden ser obtenidos a partir de: Coagulación enzimática por cuajo logrado por la adición de la enzima renina. 14

Coagulación enzimática de origen microbiano, las que por la adicción de enzimas de origen microbiano autorizadas. Coagulación por acidificación química, la que se logra cuando se agregan agentes acidulantes autorizados. Coagulación mixta, lograda cuando se utiliza combinados cualquiera de los tipos de arriba señalados.

Por el tiempo de añejamiento el queso pueden ser:

Fresco El producto que no es sometido a un proceso de maduración, presenta un alto contenido de humedad (hasta un 80 % m/m), textura blanda, con o sin corteza, requiere refrigeración para su conservación y se consume preferentemente en los primeros 20 días a partir de su fecha de elaboración (NMX-F-713-COFOCALEC2005).

Madurados El producto es sometido a un proceso de maduración, contiene menos humedad que los quesos frescos (hasta 62 % m/m), puede ser de pasta dura, semidura o blanda, con o sin corteza, pueden o no requerir condiciones de refrigeración para su conservación y se consumen generalmente después de un mínimo de 30 días de maduración (NMX-F-713-COFOCALEC-2005).

2.7. Proceso de elaboración del queso crema de Chiapas.

El proceso de elaboración de este queso singular refleja la creatividad y de cierta forma, las necesidades de conservación que se tuvieron cuando, históricamente comenzó a elaborarse. La historia de este indica que tiene más de un siglo de vida y que pudo originarse en la región norte del estado, en aquellos años, y a principios del siglo XX, las vías de comunicación eran prácticamente nulas, ya que la orografía presente en el estado es bastante accidentada, por lo que los 15

productores de leche tenían que conservar los excedentes de producción en la épocas de lluvias, así que echaron mano de conocimientos empíricos y utilizaron los medios de conservación más antiguos de la historia: la fermentación y la sal.

En el caso de la fermentación, se aprovecharon las bacterias acido lácticas (BAL) nativas de la leche cruda, que con ayuda de las condiciones climáticas desarrollan acidez en la pastas queseras, lo que ayuda a la inhibición del crecimiento de microorganismos patógenos y contribuyen a la calidad sensorial de producto; así mismo la sal además de impartir sabor, ayuda a la disminución de la actividad de agua del queso, modulando el crecimiento de la microflora en la pasta del producto (Villegas et al, 2011).

El queso crema tiene un tiempo promedio de elaboración de 3 días, durante los cuales adquiere parte de sus características típicas, esenciales, como su sabor, aroma, apariencia y textura. El producto se consume fresco, aunque también se deja madurar para el consumo de los clientes más selectivos (Villegas et al, 2011).

Es importante mencionar que el conocimiento tradicional desarrollado por los primeros queseros en el estado de Chiapas se ha trasmitido de generación en generación, socializando el conocimiento históricamente, pero manteniéndolo como un saber-hacer empírico, lo que lo hace un recurso intangible cognitivo, muy importante en los territorios específicos de elaboración del queso: el saber-hacer que tiene menos 100 años de existir y de mantenerse en constante transmisión.

2.8. Análisis microbiológico de la leche Los cultivos en laboratorio son necesarios para identificar los organismos específicos que se encuentran comprendidos en un caso clínico de mastitis y para distinguir los animales sanos de aquellos que presentan un caso subclínico. La fidelidad de los resultados de laboratorio depende de los cuidados sanitarios que se tengan durante la toma de muestra y su manipulación posterior. La buena 16

calidad sanitaria hace referencia

la ausencia de microorganismos patógenos

como Salmonella, coliformes totales, coliformes fecales y listeria monocytogenes entre otros, que son causantes de enfermedades asociadas con infecciones e intoxicaciones generadas por el consumo de alimentos contaminados.

2.9. Análisis Microbiológico del Queso La raza del ganado las condiciones de ordeña, el manejo de la leche y las condiciones del tiempo de reposo de la leche antes del procesamiento son factores que afectan la cuenta final de Mesofilos y coliformes en los quesos y, por consecuencia su sabor final,

es por ello la importancia de la calidad

microbiológica en la elaboración de quesos. (Villegas et al, 2011)

2.10. Pruebas Microbiológicas

La calidad microbiológica de la leche se determina principalmente con la cuenta total de bacterias Mesofílicas aeróbicas (UFC/ml) Coliformes totales (UFC/ml) Staphylococus aureos.

La colección de muestras de leche en forma aséptica para los exámenes microbiológicos puede proveer un diagnóstico válido y correcto para el tratamiento y pronóstico de la mastitis bovina y por lo tanto la calidad de la leche,

un

diagnóstico bacteriológico deberá realizarse en un laboratorio especializado. Las muestras de leche deberán ser recolectadas en tubos estériles y dentro de las primeras 24 horas, cultivarse en un caldo nutritivo de bacterias asociadas a mastitis o agar nutritivo en cajas conteniendo el medio de cultivo.

La leche es un excelente medio de cultivos para determinados organismos, sobre todo para las bacterias mesófilas y dentro de estas la patógenas, cuya 17

multiplicación depende de la temperatura y de la presencia de otros microorganismos competitivos o de sus metabolitos. Debido a esto se han creado métodos para bajar los niveles de contaminación, mediante un manejo más higiénico. Las bacterias en leche no son las únicas fuentes posibles de contaminación, también son las que se encuentra en el equipo, utensilios, aire, polvo, heno, entre otras (Hazard, 1997; Magariño, 2000; Agudelo y Bedoya, 2005). Las bacterias mesofílicas aerobias, se utiliza como indicador de higiene en la obtención y conservación de la leche. Por otra parte Philpot y Nickerson (2000) menciona que todos los días los productores deben aspirar a producir leche con un recuento estándar en placa con menos de 10,000 UFC/ml y un recuento de incubación preliminar menor a 20,000 UFC/ml. Para verificar la calidad microbiana, se realizan pruebas de coloración que indican que tan grande puede ser la carga de microorganismos, la técnica es la siguiente: se toma la muestra y se siembra en medios selectivos, se incuban y se cuentan las colonias, existen medios que permiten prácticamente el crecimiento de todo los microorganismos aerobios, observándose colonias de cualquier bacteria, hasta hongos y levaduras, que son muy comunes en leche y sus derivados (Galván, 2005). Gamazo (2005) menciona que los métodos de recuentos bacteriano, más utilizados son las medidas indirectas del crecimiento microbiano como las medidas de turbidez, o medidas directas como el recuento de colonias tras siembras de diluciones sucesivas de la muestra. Son varias las pruebas o técnicas para el estudio microbiológico de la leche, Cebrián et al., (2005) mencionan que en la práctica se emplean básicamente son dos, el primero es el recuento bacteriano de la leche del tanque, este informa sobre la higiene con la que se ha llevado a cabo los procesos de ordeño y almacenamiento. Mencionan que el recuento debe ser inferior a las 10,000 UFC de Mesofilos aeróbicos/ml (Calvino et al., 2001 y Cebrián et al., 2005), la segunda

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corresponde al aislamiento e identificación; que permite realizar un diagnóstico etiológico individual de mastitis clínica o subclínica. Los recuentos de microorganismos Mesofilos totales, la determinación de este grupo nos dan una ida de la calidad de la materia prima y del proceso de elaboración del producto. Recuentos altos pueden indicar un proceso de alteración del alimento, aunque no es necesario relacionarlo con la presencia de gérmenes patógenos (Gamazo et al., 2005).

2.10.1. Bacterias Coliformes Las bacterias coliformes son bacilos gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, que entre 35 a 37ºc fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones específicas a 48 horas según mencionan la NOM-112-SSA1-1994; Saran y Chaffe (2000), Prescott et al. (2004) y Gamazo et al. (2005). Las bacterias Coliformes, se identifican en Agar sangre como colonias grandes, de 3 a 4 mm, de color grisácea. Otros coliformes como enterobacter y klebsiella, son de tamaño similar, estos microorganismos viven en el estiércol, la cama, el suelo y el agua contaminada (Saran y Chaffer, 2000; Philpot y Nickerson, 2000).

Un alto recuento de coliformes puede indicar: pezoneras rotas, lavado del sistema de ordeño con agua a baja temperatura, grumos de leche sobre la superficie que entra en contacto con la leche, uso incorrecto de químicos para limpiar el equipo de ordeño. Una muestra con gran cantidad de coliformes, estafilococos y estreptococos ambientales suelen indicar la refrigeración inadecuada de la leche (Philpot y Nickerson, 2000). un recuento de 10 UFC de coliformes por ml de la leche del tanque, se tiene un excelente manejo; por otra parte si se obtiene 100 UFC de coliformes/ml, se tiene un buen manejo de la leche así como la salud de la ubre de los animales (Philpot y Nickerson, 2000).

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Los organismos coliformes son capaces de crecimientos aeróbicos ya sea a 35 ± 1°c; en un medio de cultivo liquido lactosado con producción de ácido y gas en un perdido de 48 horas (NMX MX-AA-42-1987). Las bacterias coliformes son de gran importancia ya que están asociados con la contaminación de materia fecal, siendo un riesgo para la conservación del producto a la temperatura ambiente y para la salud del consumidor (Robinson, 2002).

Los coliformes fecales son organismos coliformes capaces de crecimiento aerobio teniendo las propiedades fermentativas a una temperatura de 44 ± 0.5°c. La escherichia coli presuntiva es un organismo coliformes como se describió anteriormente que también produce indol a partir de tripofano a una temperatura de 44°c (NMX-AA-42-1987)

2.10.2. Determinación de microorganismos Coliformes totales en placa. El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales varian el indicador de pH y precipitan las sales biliares (NOM-243-SSA1-2010).

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en el apéndice normativo (NOM-243-SSA1-2010). Procedimiento: Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.

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Vertír de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio. el tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio, solidifique dejando las cajas petri reposar sobre una superficie horizontal fría.

Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad. incluir un control adicional que considere la esterilidad de la solución diluyente adicionando 1 ml directo de esta solución en el mismo medio de cultivo. Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1,0°c en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°c, durante 24 ± 2 horas. Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

2.10.3. Determinación de Mesofilos Aerobios En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 °C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. La cual refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios Mesofilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas. De la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora

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patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar: 1. excesiva contaminación de la materia prima 2. deficiente manipulación durante el proceso de elaboración 3. la posibilidad de que exista patógenos, pues estos son Mesofilos 4. la inmediata alteración del producto 5. El recuento de Mesofilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos. (NOM-243-SSA1-2010).

Preparación de la muestra La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido (NOM-243SSA1-2010).

Material: Medio de cultivo agar triptona-extracto de levadura (agar para cuenta estándar).

Procedimiento: Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado. Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según en b.5.1 preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico, en las cajas petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

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Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo (mesofílicos aerobios 35 ± 2ºC 48 ± 2 h).

Expresión y cálculo de resultados Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar. Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro. Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes guías:

Placas con menos de 25 colonias.- cuando las placas corridas para la menor dilución muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", Placas con más de 250 colonias, cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta 23

parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado".

Colonias extendidas: las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas: Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias. Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja. Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar. Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de la caja. Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están incluidas en punto x) si la caja contiene una sola cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. Reportarlos como crecimiento extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y otra dilución presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden contar las colonias. Placas sin colonias. Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada (NOM-243-SSA1-2010).

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2.10.4. Determinación de Staphylococcus aureus Este método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación mediante las pruebas de cuagulasa y termonucleasa. Este método es adecuado para el análisis de alimentos en los cuales se esperen más de 100 células de staphylococcus aureus por gr. (NOM243-SSA1-2010).

Preparación de la muestra La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido (NOM-243SSA1-2010).

Procedimiento Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilución, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las placas de agar Bar-Parker. Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada dilución. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de staphylococcus aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tenga más de 150 colonias. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al informe se debe agregar la nota de "valor estimado". Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia. Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 ml de caldo de infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºc durante 24 h. inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus.

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Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. el resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa.

Cálculo hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de colonias totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 ml) (NOM-243-ssa1-2010).

Ejemplo 1: Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000 Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es:

Ejemplo 2: Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es:

2.10.5. Determinación de Salmonella spp. La presente técnica para la detección de salmonella spp. En alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos: Pre enriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de salmonella dañadas a una condición fisiológica estable. Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de salmonella spp. e inhibir otros organismos presentes en la muestra. 26

Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a salmonella spp. y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de salmonella spp. y la eliminación de cultivos sospechosos falsos. Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.

Reactivos En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su reparación. las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico (NOM-243-SSA1-2010). En el cuadro 5 se presenta las reacciones bioquímicas para la identificación de Salmonella spp.

Cuadro 5. Reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella spp. Prueba de sustrato Glucosa (TSI) Lisina descarboxilasa (LIA) H2S (TSI y LIA) Ureasa Caldo de lisina descarboxilasa Caldo dulcitol rojo fenol Caldo KNC Caldo malonato Prueba de indol Prueba de antígeno flagelar Prueba del antígeno somático Caldo lactosa rojo fenol Caldo sacarosa rojo fenol Prueba Voges-Proskauer Prueba rojo de metilo

Positivo Amarillo Purpura Negro Rojo-purpura

Negativo Rojo Amarillo No negro No hay cambio de color

Reacción + + + -

Purpura

Amarillo

+

Amarillo o gas Crecimiento Azul Superficie color violeta Aglutinación Aglutinación Amarillo o gas Amarillo o gas De rosa a rojo Rojo difuso

No hay cambio de color ni gas No hay crecimiento No hay cambio de color Superficie color amarilla No hay aglutinación No hay aglutinación No hay cambio de color ni gas No hay cambio de color ni gas no hay cambio de color Amarillo difuso No hay crecimiento, no hay cambio de color

+ + + +

Citrato de Simmons

Crecimiento color azul

V

Fuente: (NOM-243-SSA1-2010).

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2.10.6. Determinación de Listeria monocytogenes. El método para detectar la presencia de L. monocytogenes se basa en el aislamiento y la diferenciación de especies de listeria spp., principalmente por la fermentación de carbohidratos y la actividad hemolítica de los miembros de este género (NOM-243-SSA1-2010).

Procedimiento Este método debe realizarlo un microbiólogo experimentado, en un ambiente controlado, aislado de áreas de producción de alimentos. Se debe tener especial cuidado en la disposición de aquellos materiales y equipo que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. El método para detectar la presencia de L. monocytogenes se basa en el aislamiento y la diferenciación de especies de Listeria spp., principalmente por la fermentación de carbohidratos y la actividad hemolítica de los miembros de este género.

Esta

técnica

por

ningún

motivo

debe

aplicarla

personal

inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada (NOM-243-SSA1-2010).

Identificación Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar colonias típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35ºc por 24 h. estos cultivos puede mantenerse a 4ºc y utilizarse como inóculo para realizar las pruebas de identificación (NOM-243-SSA1-2010).

Prueba de CAMP para Listeria monocytogenes: Diseño de la inoculación en placas de agar sangre de carnero. Las líneas horizontales representan las estrías de la inoculación de cinco cepas. Las líneas verticales representan las estrías de inoculación de S.aureus (S) y R. equi (R). Las líneas sombreadas indican el incremento de hemólisis en esas regiones.

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Expresión de Resultados Determinar el género y especie de las cepas aisladas. El único miembro del género Listeria de importancia para esta norma es Listeria monocytogenes.

Informe de la Prueba Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la presencia en 25 g o 25 mL de muestra. Y si los resultados son negativos informar ausencia en 25 g o 25 mL de muestra.

2.11. Inocuidad La elaboración artesanal de queso en México, en muchas ocasiones, no incluye la pasteurización de la leche, lo que permite que la cuajada se forme sólo con la flora natural presente y el cuajo añadido. Elaborar queso con leche sin pasteurizar puede hacer del producto un excelente substrato para microorganismos patógenos, convirtiéndolo en un vehículo para la transmisión de enfermedades. Entre 1980 y 1989, en México, el laboratorio nacional de salud pública, publicó que el queso fue involucrado en el 31.47% de los brotes como agente transmisor de enfermedades. Del 2000 al 2002, se informó que los lácteos también siguieron siendo un problema con el 10% de participación. Existen varios patógenos potencialmente presentes en la leche cruda, muchos de los cuales presentan una prevalencia considerable en México. En la mayoría de los casos de brotes alimentarios originados a partir del consumo de quesos frescos, no se encontró al agente etiológico; en los que sí se identificó, se menciona a Staphylococus aureus, e. Coli enterotoxigénica, salmonella spp y Brucella spp. Aunque en la mayoría de los casos de transmisión de enfermedades y causas de muertes, se hace referencia a quesos elaborados a partir de leche cruda, hay que tener presente que en muchos otros, se trata de una pasteurización defectuosa o 29

de contaminación posterior al tratamiento térmico. Algunos creen que las bacterias patógenas en la leche cruda se eliminan durante la maduración de los quesos. Sin embargo no es posible generalizar, debido a la variación implícita en los procesos, además de que los microorganismos pueden comportarse de forma diferente, lo mismo que el sistema inmunológico de cada individuo. (Ramírez, 2011). En cuanto la inocuidad, uno de los aspectos más importantes dentro del proceso del queso es el pH, que está relacionado directamente con la acidez y las fermentaciones lácticas que se realizan en la leche, cuajada y pasta. El pH final del queso nos sirve como referencia para deducir acerca de cómo se llevó a cabo el proceso de elaboración y así mismo para inferir sobre su posible inocuidad. Esto puede ser atribuido alas temperatura ambiente mayor y a las condiciones de colecta, ya que las distancias recorridas por la “ruta”, son mayores, y a la carga microbiana captada por la leche cruda en el predio o rancho. Así mismo se sabe que el transporte de la leche es una etapa crítica para conservar la calidad de la leche cruda, la cual se debe de verificar el estado del vehículo y de los contenedores en los que se realiza la colecta para evaluar la calidad de higiene. (Villegas et al, 2011).

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III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Localización del área de estudio.

El presente estudio se llevó a cabo en el municipio de Tecpatán Chiapas, dicho municipio se encuentra ubicado en las montañas del norte. Esta situado a los 17º 09’09’’ de latitud Norte y 93º 10’35’’ de longitud Oeste y se encuentra en la región Socioeconómica denominada metropolitana.

Limita al norte con el estado de Veracruz y Tabasco; los municipios de Ostuacán y Francisco León, al este con Francisco León y Copainalá, al sur con los municipios de Copainalá, Berriozábal y Ocozocuatla de Espinosa y al oeste con los municipios de Ocozocoautla de Espinosa, Cintalapa y los estados de Oaxaca y Veracruz. 31

Su extensión territorial es de 770.10 km², lo que representa el 6.09% del territorio de la región centro y el 1.68% de la superficie estatal, su altitud es de 320 msnm. La red hidrológica está representada por el río Grijalva o grande y varios afluentes como el Zacalapa y el Totopac. Dentro de su territorio se encuentra gran parte del embalse de la presa Nezahualcoyotl, también conocida como malpaso. El clima es cálido húmedo con lluvias todo el año en el norte y cálido húmedo con abundantes lluvias en verano, hacia el sur. La vegetación predominante es de selva mediana (INEGI, 2005). La INEGI (2007) reporto que el municipio de Tecpatán cuenta con una población de 70 450 bovinos.

3.1.1. Descripción de la población.

La determinación del tamaño de la muestra se tomó de acuerdo al padrón existente

en la dirección de desarrollo agropecuario quien reporto 65

procesadores existentes en el municipio de los cuales se selecciono al azar el 20%, representado por 14 Procesadores cooperantes pertenecientes a la S.P.R. Procesadores de lácteos del municipio de Tecpatán.

3.2. Metodología

La investigación se desarrolló durante el período 2012 e incluyó dos apartados los cuales se obtuvieron a través de la aplicación de un cuestionario semi estructurado aplicado a un total de 14 procesadores integrados en la sociedad cooperativa de procesadores de leche de Tecpatán Chiapas. Además de entrevistas y recorridos realizados en las queserías y rutas de recolección de leche, la Caracterización del procesamiento y comercialización del queso, así como la clasificación de los queseros y tipos de queserías. 1.- Se realizó la clasificación

según volumen de proceso y tipo de queso

elaborados. 32

2.- Se realizó muestreos de leche de las queserías

para determinar, grasa,

proteína, sólidos no graso, lactosa, agua agregada, punto crioscópico, acidez titularle, densidad, prueba de alcohol, células somáticas y UFC de Mesofilos aerobios, UFC de Coliformes totales y UFC Staphylococcus aureus. En cuanto al queso se realizo el análisis microbiológico, determinándose UFC de Coliformes, Mesofilos aeróbicos, Staphylococcus aureus, Salmonella negativo, listeria negativo.

3.2.1. Toma de muestra

La adecuada selección de la muestra, la toma correcta y los medios apropiados para su conservación y transporte al laboratorio, son de importancia primordial para obtener resultados significativos y confiables del análisis de los productos. En la toma de muestra se llevó acabo de acuerdo a lo descrito por la norma NOM243-SSA1-2010 para la toma de muestra del queso. Las muestras de leche y queso

fueron tomadas en frascos limpios y tubos

estériles directamente en los botes recolectores de la “ruta” lechera, en cuanto el queso fueron tomadas de la queserías,

fueron

identificadas conservadas y

transportadas en refrigeración al laboratorio de análisis de calidad de la leche de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNACH.

3.2.2. Determinación de la composición Físico-química de la leche Se determinó, la

calidad físico química de la leche utilizando el equipo

LactiCheck, con el cual se evaluó, grasa, proteína, sólidos no graso, lactosa, agua agregada, punto crioscópico, densidad, se determino la fragilidad de la proteína a través de la prueba de alcohol y el grado de contaminación bacteriana por la prueba

de reductasa, acidez titulable, el número de

células somáticas se

determino utilizando el analizador de células somáticas De Laval Cell Counter (DCC). 33

3.2.3. Determinación de la calidad Microbiológica de la leche y Quesos La calidad microbiológica de la leche se determinó mediante el conteo de UFC de Mesofilos aerobios, UFC de coliformes totales y UFC Staphylococcus aureus, salmonella negativo y listeria negativo para lo cual se realizo siembra de la leche en medios selectivos; para el caso de Mesofilos aerobios Agar Triptona-Extracto de Levadura , Coliformes totales se selecciono Agar McConkey,

para la

determinación de Staphylococcus aureus se llevó a cabo mediantes pruebas presuntivas y confirmatoria, las muestras fueron sembradas en medio selectivo Agar Manitol, si las muestras observadas eran de color rojo, se le realizaba cuagulasa positivo.

Para el análisis microbiológico del queso, se tomaron 25 g de la muestra estéril de acuerdo a

la NOM-243-SSA1-2010, determinándose, UFC de Coliformes

Totales , Mesofilos aeróbicos, y Staphylococcus aureus, de los cuales se realizaron tres repeticiones en las diluciones; 1:10, 1:100 y 1:1,000.

La determinación de Salmonella spp y Listeria monocytogenes se realizó mediante pruebas presuntivas y confirmatorias, las cuales se basaron en la siembra de la muestra de leche y queso debidamente estéril, en la muestra de queso se tomo 25 g de muestra y se depositaron 225 mL de caldo peptonado y se incubo durante 24 horas a 35 °C, posteriormente se realizó la siembra en medios selectivos, en el caso de Salmonella se realizo la siembra en Agar Salmonella y Shigella y en Listeria monocytogenes Agar sangre posteriormente se identificaron el tipo de bacteria correspondiente por medio de Tinción de Gram (pruebas presuntivas), las pruebas confirmatorias se basaron en la realización de pruebas bioquímica, para el caso de Salmonella spp, fueron: Oxidasa negativo, prueba de TSI Reacción 2,3,4, Lactosa negativo, Indol negativo, H2S positivo, urea negativo, Citrato de Simons positivo, Motilidad positivo, lisina descarboxilasa positivo, y fenilalanina negativo, y para la identificación de

Listeria monocytogenes las muestras

sospechosas fueron sometidas a las

pruebas bioquímicas correspondientes;

34

Catalasa positivo, Hemolisis positivo, Ureasa Na, TSI reacción 1, Glucosa positivo, Reducción de Nitritos negativo, Gelatinasa negativo, y Motilidad a 25°C positivo. A las muestras que resultaron positivas se le realizo la prueba de CAMP como se describe en la NOM-243-SSA1-2010,

para confirmar la presencia de Listeria

monocytogenes utilizando una cepa de Staphylococcus aureus tal como se describe en la norma antes mencionada.

3.3. Análisis estadístico. Los datos se clasificaran de acuerdo al volumen de producción estadísticas descriptivas de tendencia central,

a través de

media, dispersión Desviación

estándar, para las variables discretas se determino frecuencias representados en gráficos, se utilizo la prueba T para determinar diferencias entre los grupos. Los datos fueron analizados utilizando el programa estadístico SPSS (STATISTICAL PACKAGE FOR THE SOCIAL SCIENCIES) 2005, versión 15.0.

35

IV. RESULTADOS Y DISCUSION

Caracterización de los Procesadores de leche en el municipio de Tecpatan. Se encontró que el 80% del total de la producción de leche del municipio se destina a la elaboración de queso tipo artesanal, como ha sido reportado en otros estudios por (Culebro et al, 2011 y Villegas, 2011). Quienes mencionan que el total de la producción de leche en las diferentes regiones del estado el mayor porcentaje es destinada para la elaboración de queso crema artesanal. En el cuadro 6 se presentan las características de los procesadores de leche del municipio de Tecpatán, en donde se encontró que de acuerdo al leche que procesan, únicamente el 29% son considerados como

volumen de grandes

procesadores (grupo A) con volúmenes de entre 1,000 y 5,000 litros de leche/día y el mayor porcentaje correspondió al grupo de pequeños procesadores (Grupo B) con el 71% que procesan entre 100-800 litros de leche/día, sin embargo no se encontró diferencia en el número de proveedores de leche para ambos grupos; 15 (±5.7) y 8.80 (±5.7), pero si por el volumen de leche que acopian siendo en promedio de 2,100 ± 1,935.6 litros/día y de 465 ±228.6 litros/día para los grupos A y B respectivamente (P ≤0.05), situación que se vio reflejada en el volumen de quesos elaborados por día que en promedio fue de

200 ± 201 kg por día y de a

73 ± 83 kg por día para los grupos A y B respectivamente, con un rendimiento de 9 a 10 litros de leche por kilogramo de queso. Los años de antigüedad de la quesería es de 16.7 (±1.5) en el grupo A

y 9 (±6.1) en el grupo B, estos

resultados son similares a los que reporto Villegas (2010), el cual menciona que el promedio de los años en función de las queserías en la región frailesca es en promedio 10.3 ±3.9 años. El número de empleados en promedio es de 3.5 (±1.2) y 2.0 (±1), es importante mencionar

que todas las queserías empezaron como

pequeños pero han ido aumentando su volumen conforme a los años de experiencia obtenidos, coincidiendo con lo indicado por Villegas (2010), el cual reporta algunos atributos similares de perfil de los productores de queso crema en Chiapas en diferentes regiones del estado. 36

Así mismo Figueroa

et al., (2012), reporta en el estado de Veracruz, una

clasificación de productores de acuerdo a su producción, se encontró que el primer grupo producía en promedio 268,1 ±108,1 k/semana de productos lácteos, el segundo 1.654,7 ±882,8 kg/semana y el tercero 1.762,4 ±411,1 kg/semana, encontrándose diferencia significativa en el volumen de producción de lácteos según el tipo de sistemas de suministro que tiene la empresa.

Grandes A

Cuadro 6. Características de los procesadores de leche del municipio de Tecpatán Chiapas.

Quesería

Litros de Leche

Número de proveedor es

Producción de Quesos kg

Antigüedad de la quesería (años)

Número de Empleados

1 2 3

5,000 1,200 1,200

54 12 23

500 120 120

15 18 18

5 3 4

4

1,000

15

100

16

2

15 (±5.7)

200( ±201)

16.7 (±1.5)

3.5(±1.2)

33 18 23 5 8 5 7 8 8 3 8.80 (±5.7)

70 65 60 60 60 40 30 40 50 10

10 1 7 15 4 20 3 10 15 5

3 2 3 2 1 1 2 3 1 1

73 (±83)

9 (±6.1)

2.0 (±1)

-1.2;