Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología

MANUAL DE PRÁCTICAS LABORATORIO

DE

MICROBIOLOGÍA E HIGIENE

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología

Índice No de Página

Presentación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Instrucciones Generales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Normas de Seguridad en el laboratorio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

Normas para manipular instrumentos de laboratorio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Recomendaciones para la elaboración de informes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PRACTICA 1 Esterilización, Preparación de medios de cultivo y siembra de colonias. . .

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PRACTICA 2 Tinción diferencial de Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PRACTICA 3 Identificación cualitativa de coliformes en leche. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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PRACTICA 4 Análisis microbiológico en pescado. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 PRACTICA 5 Análisis microbiológico en hortalizas. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .

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ANEXOS

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BIBLIOGRAFÍA

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Presentación El cuaderno de prácticas constituye una herramienta es una herramienta de actividades formativas que contribuye al desarrollo de las habilidades necesarias para el manejo adecuado de diferentes técnicas del conocimiento en el área de la microbiología que se presentan a lo largo de la asignatura. La microbiología constituye una rama de la biología experimental, por lo que reviste importancia relevante el utilizar criterios de análisis y comprobarlos de manera práctica. Por ello, el propósito de este cuaderno de prácticas es acompañar una serie de actividades de análisis real, integrándose por una serie de experiencias con las que el Licenciado en Gastronomía se enfrentará en algún momento de su desarrollo profesional. Por lo tanto, es necesario realizar las actividades con la máxima responsabilidad a fin de enriquecernos con lo que dichas prácticas nos proporcionan y asumir de manera responsable las medidas que de cada una de las actividades señalan

Material que deberá proporcionar el alumno al inicio de la primera sesión de laboratorio así como en cada práctica a) Individualmente Bata de trabajo de algodón con manga larga b) Por equipo Una franela para limpiar la mesa sin pelusa, marcador, cinta para rotular o etiquetas, tijeras Cada una de las prácticas está dividida en las siguientes secciones: Número de la práctica: Las prácticas se encuentran secuenciadas en forma cronológica con relación a los planes y programas de estudio establecidos para la asignatura Objetivo de aprendizaje y justificante: Refieren a las necesidades que se pretenden alcanzar al finalizar la actividad así como la finalidad encaminada a la retroalimentación de los temas desarrollados en el aula. Introducción: Establece un marco teórico previo, mínimo necesario que el estudiante deberá cubrir basado en la bibliografía sugerida en el presente material de prácticas encaminado a presentar una visión generalizada del tema o temas a desarrollar de manera experimental. Introducciones Generales para trabajo en laboratorio de microbiología 1. Lee cuidadosamente toda la práctica antes de iniciar cualquier actividad. 2. Para el desarrollo experimental deberás consultar la bibliografía sugerida que se encuentra al final del manual y tus apuntes de clase por lo menos un día previo a la realización del experimento.

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología 3. Prepara con anticipación el material mencionado en la columna Alumno en la lista de materiales de la práctica a realizar, considerando que de no presentarlo completo el día de la misma la práctica será anulada. 4. El material que se enlista en la columna Laboratorio se proporcionará en el mismo; para ello cada equipo de trabajo lo solicitará mediante un vale. 5. Cualquier aspecto dentro del desarrollo experimental sobre el cual existan dudas deberá ser aclarado de manera previamente a fin de evitar incidentes durante el proceso. 6. No se permitirá sacar del laboratorio ningún medio de cultivo microbiano 7. No se admitirán visitas que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad del trabajo que se realiza. 8. En el reporte de las observaciones como parte de los resultados de cualquier procedimiento experimental, se solicita que esquematices con dibujos y con una descripción breve. 9. Al concluir el desarrollo experimental, resuelve el cuestionario lo más pronto posible 10. Deberás realizar un análisis de datos basado en las observaciones establecidas en los resultados del diseño experimental que además tenga fundamento teórico de la bibliografía sugerida o de alguna otra que consideres relevante y que cubra los requerimientos mínimos de contar con una ISSN 11. Escribe una conclusión individual o de equipo en el espacio que para ello existe, mencionando si el, o los propósitos de la práctica se cumplieron.

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UNIVERSIDAD BANCARIA DE MÉXICO “Constancia, Unidad y Trabajo”

FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CARRERA LICENCIATURA GASTRONOMIA

PLAN DE CLAVE ESTUDIO ASIGNATURA EN

PRÁCTICA No.

LABORATORIO DE

1

NOMBRE PRÁCTICA

Nombre del alumno: Nombre del profesor:

DE

NOMBRE DE ASIGNATURA Microbiología e higiene

MICROBIOLOGÍA LA

LA

DURACIÓN (Minutos) 80

TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN, PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA MICROBIANA Fecha: Cuatrimestre: Grupo: Turno:

Objetivo. Conocer y utilizar las principales técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo, su esterilización y su almacenaje, así como la importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Además familiarizar al alumno con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad. 1. FUNDAMENTO Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y re-disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: 1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología 5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos. 6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos. 7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio. 8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato. 9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. Tipos de medios de cultivo. Por su CONSISTENCIA: a) Sólidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada). b) Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o Erlenmeyer. Por su COMPOSICIÓN: a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee. Siembra de microorganismos En términos microbiológicos se entiende por SIEMBRA el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento. PARA UNA CORRECTA REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA SON NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES: 1) Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACIÓN, proceso que consiste en conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista microbiológico.

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•La esterilización Se utilizan dos tipos principales de esterilización: Por MÉTODOS FÍSICOS (calor, filtración, radiaciones). Por MÉTODOS QUÍMICOS (empleo de soluciones químicas). Los medios de cultivo se esterilizan en la AUTOCLAVE, el cual hace uso del calor húmedo. La autoclave es un aparato que permite elevar la presión y la temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullición del agua. Normalmente, se lleva la presión a 1 atmósfera (por encima de la ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126ºC, manteniéndolo en estas condiciones durante 20 minutos. Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas. etc.) se esteriliza con calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato más empleado (se somete a temperaturas de 140-180º C durante 2h-3h). En el caso de objetos metálicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilización, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaución de enfriarlos antes de su uso. 2) Que el inóculo no se contamine, modifique o destruya: Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente. 3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Esto se resuelve con el uso de cabinas estériles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente.

2. COMPETECIAS Durante y al término de la práctica el alumno: Identificará, y realizará algunas de las principales técnicas de esterilización de materiales de laboratorio de microbiología así como la preparación de diferentes medios de cultivo y las técnicas realizables de siembra simple de colonias bacterianas para poder identificar crecimiento microbiano en su desarrollo profesional .

3. PROCEDIMIENTO LABORATORIO EQUIPO NECESARIO Mechero bunsen o Fisher Matraz Erlenmeyer Tubos de ensayo Pipetas de 5 y 10 ml Cajas de Petri Autoclave Asas de siembra Perilla de succión Balanza granataria Parrilla con agitador magnético Guantes para manejo de materiales calientes Espátula

ALUMNO MATERIAL DE APOYO Gasas estériles Algodón Cinta Masking Tape Papel estraza Papel aluminio

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología Estufa de incubación Gradilla REACTIVOS 1 Medio de cultivo Luria Bertani (LB) 2 Medio de cultivo agar McConkey 3 Agar nutritivo 4.- Agua destilada 5.- Benzal

a) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA METODOLOGÍA

1. Preparación de material para esterilización Pipetas. Lave perfectamente el material, en la boquilla de la pipeta se coloca un tapón de 1.5 cm de largo, de tal forma que el aire pase libremente a través del algodón; flamear el algodón que sale de la boquilla y envolver cada pipeta con papel en la forma indicada en la figura 1, evitando así el contacto con el medio externo después de haber sido esterilizados, pero que sea de fácil y rápido acceso para su utilización. Marcar con una flecha que indique el extremo de la boquilla y anotar el volumen de la pipeta, así como el tipo de división y medida.

Figura 1. Preparación de pipetas para su esterilización. Cajas de Petri. Envolver con papel las cajas de Petri en forma individual o por grupo como se muestra en la figura 2, invertir el paquete de tal forma que las cajas queden con la tapa hacia abajo, fijar las puntas con cinta masking. Rotular (grupo, equipo y fecha).

Figura 2. Preparación de cajas Petri para su esterilización.

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología Matraces.- La boca de un matraz Erlenmeyer se cubre con un tapón de algodón y gasa y sobre este se coloca una cubierta de papel o aluminio (figura 3). Los matraces que contienen medios de cultivo y soluciones se rotulan indiciando contenido, fecha de preparación y nombre de quien lo preparo. Para esta práctica colocar solamente 100 ml agua.

Figura 3. Preparación de matraces Erlenmeyer para su esterilización. Tubos de ensayo.- Llenar el tubo hasta una tercera parte de su volumen total. La boca del tubo se cubre con un tapón de algodón y gasa y sobre él se coloca una cubierta de papel o aluminio, de igual forma que en los matraces Erlenmeyer. Unir los tubos con cinta masking y colocarlos en la lata de aluminio. Instrucciones generales para el manejo de la autoclave.

1. Comprobar que el nivel de agua sea adecuado, de acuerdo al indicador del equipo. 2. Colocar en su interior el material para esterilizar. 3. Cerrar y atornillar la tapa, apretando las tuercas por parejas diametralmente opuestas de forma que la tapa se acople perfectamente. 4. Abrir la válvula de vapor y accionar la fuente de calor. 5. Una vez que salga el vapor por la válvula de seguridad, esperar al menos 5 minutos para permitir que todo el aire del interior sea expulsado, posteriormente cerrar la válvula. 6. Vigilar el manómetro y la válvula de seguridad, al alcanzar la presión deseada disminuir la intensidad de calentamiento para mantener constante las condiciones requeridas. 7. Al finalizar el tiempo de esterilización apagar la fuente de calor y esperar a que descienda a cero para abrir la válvula de seguridad y permitir que el vapor remanente salga libremente. 8. Abrir la tapa y sacar el material.

NOTA Es importante no manipular los materiales estériles con las manos húmedas, ni colocarlos sobre superficies mojadas.

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2.- PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria según el volumen requerido. 2.- Colocar el medio en un matraz Erlenmeyer que contenga el agua destilada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad. 3.- Realizar la esterilización requerida del medio de cultivo a las condiciones que se establecen a 121•C durante 20-30 minutos 4.- Envasar en cajas de Petri, Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un área de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de 15 ml. A 20 ml De Agar por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente 5.- Agar en tubos, se esterilizará el Agar directamente en ellos a 121•C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20 a 30 • sobre una varilla de vidrio.

3.- SIEMBRA DE MICROORGANISMOS Una vez que las placas y los tubos de ensayo están solidificados trabajar frente a la flama como se indica la figura. a) Esterilizar a la flama el asa de siembra. b) Tomar una pequeña muestra con el asa de siembra del cultivo a inocular. c) Realizar la apertura de la caja de Petri con una mano mientras con la otra sostener el asa y realizar una siembra con movimientos suaves en zigzag. d) En tubos de ensayo se realiza el procedimiento de manera similar a la siembra en placa. e) Se deja en estufa de cultivo aproximadamente 72 horas y se observan resultados

NOTA no abrir ningún medio de cultivo, y para desecharlos, realizar esterilización de estos en las condiciones similares a lo previamente descrito

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4. . RESULTADOS

5. . ANÁLISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

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CUESTIONARIO

1. Defina los siguientes términos: Desinfectante, germicida, microbiostático, antiséptico. ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 2. Explicar por qué utilizamos papel Kraft para envolver material para esterilizar. ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 3. ¿Por qué se esteriliza a 121 oC durante 15 minutos en autoclave? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 4. ¿Por qué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el material? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 5. ¿Qué finalidad tiene el empacado antes de la esterilización? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 6. ¿Puede ser utilizado otro tipo de papel que el de estraza? ¿Por qué? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología 7. ¿Qué finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los extremos de las pipetas y de los Matraces Erlenmeyer? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ______________________________________________________

6. REFERENCIAS REFERENCIAS.

1. Breach, M.R. Esterilización, métodos de control. El manual Moderno, S.A. México. 2. Harley, J., Prescott, L. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw−Hill . 5th Edition. EUA. 3. Jhonson, T.R. and Case, C.L. Laboratory experiments in microbiology. 4th edition. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California. 4. Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª edición. Prentice Hall. USA.

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FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO CARRERA LICENCIATURA GASTRONOMIA

PLAN DE CLAVE ESTUDIO ASIGNATURA EN

PRÁCTICA No.

LABORATORIO DE

2

NOMBRE PRÁCTICA

Nombre del alumno: Nombre del profesor:

DE

NOMBRE DE ASIGNATURA Microbiología e higiene

MICROBIOLOGÍA LA

TINCIÓN DIFERENCIAL GRAM Fecha: Grupo:

LA

DURACIÓN (Minutos) 80 DE

Cuatrimestre: Turno:

Objetivo. Conocer y realizar los procesos de tinción diferencial de Gram para la identificación general de bacterias Gram positivas y Gram negativas. 1. FUNDAMENTO El imperceptible tamaño de las bacterias y otros microorganismos así como la dificultad para observarlas en detalle con el microscopio óptico por causa de la falta de contraste que existe entre estos (debido a que son usualmente transparente en el medio que les rodea); hizo que se crearan métodos para poder apreciarlas, siendo los métodos más sencillos el de fijación y tinción, iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, los que permitieron a los microbiólogos distinguir muchas características estructurales normalmente vistas, así el uso de colorantes, es el medio más simple de aumentar el contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir entre distintos tipos de células o para apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, etc. Existen numerosos colorantes, y en su mayoría son compuestos orgánicos naturales que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Los colorantes que se utilizan usualmente son moléculas que se combinan con intensidad con los componentes celulares como son los ácidos nucleicos y los polisacáridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina). La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio de microbiología. Su aplicación práctica es innegable sobre todo en el trabajo microscópico de rutina; las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos) se basan precisamente en la tinción de GRAM* La capacidad de las células para captar la coloración Gram solo es aplicable de manera adecuada en bacterias; como puede advertirse en las células de vegetales y animales superiores, que no conservan uno de los colorantes de los que está compuesta la técnica; los hongos microscópicos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios tienden a retener el colorante. El fundamento de la técnica se hace con base en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, es debido a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

2. COMPETENCIAS Durante y al término de la práctica el alumno: Realizará la técnica diferencial de Tinción de Gram para Identificar de manera cualitativa los principales tipos de bacterias que son Gram positivas y Gram negativas, asociando este conocimiento a su desarrollo profesional en el manejo de aspectos microbiológicos y sanitarios.

LABORATORIO EQUIPO NECESARIO Portaobjetos. Mechero Bunsen. Asa de siembra. Cubetas de tinción o similar. Asa de siembra Microscopio óptico Mechero de Bunsen o Fisher Aceite de inmersión

ALUMNO MATERIAL DE APOYO Medios de cultivo bacteriano obtenidos en la práctica anterior Gasas

REACTIVOS Cristal violeta, Lugol Alcohol-Acetona (1:1) Safranina Agua destilada a) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA METODOLOGÍA

TÉCNICA DE LA TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM 1) Preparación y fijación de frotis: • Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta coger un poco de muestra • Colocar la muestra en una lámina portaobjetos. • Con el asa realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto un espiral en la parte media la lámina. • Flamear con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente pare ser colocado sobre el dorso de la mano.

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2) Proceso de tinción. Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teñir la misma con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 grados Enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo. Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto más. NOTA El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido azul. Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación en el microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión 3. . RESULTADOS

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4. . ANÁLISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

a) Define los siguientes términos. 1.- Colorante____________________________________________________________ 2. Mordente ___________________________________________________________ 3. Tinción diferencial ______________________________________________ 4. Tinción simple ______________________________________________ 5. Peptidoglicano ______________________________________________ 6. Ácido teicoico ______________________________________________ 7. Espacio periplásmico ______________________________________________ 8. Porinas ___________________________________________________________ 9. Membrana celular _____________________________________________________ 10. Lipopolisacárido __________________________________________________

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b) Haz un diagrama de flujo sobre el proceso de la tinción de Gram, indicando la función de cada sustancia empleada. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ __________________________________________________________________ c) Haz un dibujo de las paredes celulares de una bacteria Gram positiva y una Gram negativa señalando las principales estructuras en ellasPreguntas ¿Cuáles son los diferentes métodos para coliformes totales? Para el conteo de coliformes totales se tienen tres métodos principalmente. El primero se basa en la técnica del número más probable (NMP), utilizando caldo Lauril Sulfato Triptosa seguido de la confirmación de los tubos positivos de formación de gas en caldo Lactosa Bilis Verde Brillante. La incubación es a 35 ºC. El segundo método emplea únicamente el caldo McConkey. La incubación es a 37 ºC. El tercer método usa el caldo Lactosa Bilis Verde Brillante a 35 – 37 ºC, seguido de confirmación en agar Bilis Rojo-Violeta o en agar Endo. Leer más: http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totalesfecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml#ixzz2WFfGZ84j .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 5. REFERENCIAS Jawetz E., et al. “Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg”. Editorial Manual Moderno, 19a Ed. México 2008; 702-703. Murray PR, et al. “Microbiología Médica”. Editorial Elsevier Mosby. 6a Ed. España 2009: 158159. Caldas A. L., “Guía de Microbiología y Parasitología básico clínica”. Disponible en: http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos010/DptoMedInt/Tencion_de_gram.pdf.

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FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO CARRERA LICENCIATURA GASTRONOMIA

PLAN DE CLAVE ESTUDIO ASIGNATURA EN

PRÁCTICA No.

LABORATORIO DE

2

NOMBRE PRÁCTICA

Nombre del alumno: Nombre del profesor:

DE

NOMBRE DE ASIGNATURA Microbiología e higiene

MICROBIOLOGÍA LA

IDENTIFICACION CUALITATIVA COLIFORMES LECHE Fecha: Grupo:

LA

DURACIÓN (Minutos) 80 DE EN

Cuatrimestre: Turno:

Objetivo. Conocer y realizar los procesos de tinción diferencial de Gram para la identificación general de bacterias Gram positivas y Gram negativas. 6. FUNDAMENTO Los cauces de agua natural tales como ríos, lagos y arroyos, contienen suficientes nutrientes para soportar el crecimiento de varios organismos, que entran en el abastecimiento de agua de diferentes formas. En sitios congestionados, por ejemplo, los suministros de agua se contaminan por residuos domésticos e industriales. Como potencial portador de microorganismos patógenos, el agua puede poner en peligro la salud. El agua potable se obtiene de diferentes fuentes, como pozos, ríos y aguas superficiales. Diversas impurezas, desde ramas de árboles hasta microorganismos invisibles, pueden estar presentes en estas aguas y necesitan ser eliminadas antes de que el agua sea suministrada al público. Para ello, es necesario analizar el agua y garantizar la seguridad de ésta para ser consumida. Un muestreo adecuado resulta esencial para proporcionar muestras representativas para el laboratorio a cargo de la realización de los ensayos. Las características del muestreo dependen del objetivo perseguido con el mismo así como de la naturaleza de la muestra. Los microorganismos son organismos vivos. Además, cuando se encuentran en el agua no forman una solución perfecta, sino una suspensión con un grado de variabilidad que le es inherente. La presencia y el nivel de contaminación fecal constituye un factor importante en la evaluación de la calidad de una masa de agua y del riesgo de infección que representa para la salud humana. El análisis de muestras de agua para detectar la presencia de Escherichia coli, que normalmente habita en el tracto intestinal de hombres y otros animales de sangre caliente, proporciona una indicación de este tipo de contaminación. Otros indicadores de la contaminación fecal son los enterococcos. Este tipo de microorganismos son especialmente importantes cuando la contaminación se produjo hace tiempo y las bacterias coliformes menos resistentes, incluyendo Escherichia coli, pueden haber muerto cuando se realiza el análisis.

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología Pseudomonas aeruginosa es un organismo oportunista patógeno para el hombre que es capaz de crecer en el agua con concentraciones de nutrientes muy bajas. Es conveniente que las aguas minerales naturales, las aguas de manantial, las aguas embotelladas comercializadas y las aguas destinadas al consumo humano estén exentas de Pseudomonas aeruginosa. Algunas veces, por razones de salud pública, puede investigarse la presencia de Pseudomonas en otros tipos de aguas, entre las que se incluyen las aguas de piscina

7. COMPETENCIAS Durante y al término de la práctica el alumno: El alumno se familiarizará con los métodos de recuento, especialmente con el de Número Más Probable (NMP ) que le permitan detectar bacterias coliformes totales y fecales en leche, considerando si las muestras obtenidas son aptas para el consumo humano..

LABORATORIO EQUIPO NECESARIO Mechero bunsen o Fisher Matraz Erlenmeyer 500 ml Tubos de ensayo con rosca Pipetas de 5 y 10 ml Autoclave Perilla de succión Balanza granataria Parrilla con agitador magnético Guantes para manejo de materiales calientes Espátula Estufa de incubación Campanas de Durham Gradilla REACTIVOS Agar MacConkey Verde Brillante Bilis 2% Caldo Caldo Lauril Sulfato Agua peptonada *

ALUMNO MATERIAL DE APOYO Muestra de Leche pasteurizada Muestra de leche fresca de establo Cinta Masking Tape

a) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA METODOLOGÍA

1) Método para coliformes totales Se prepara el inoculo a sembrar colocando en un matraz Erlenmeyer una muestra de 3 ml de leche a analizar y 27 ml de agua peptonada a una dilución de hasta 10-3 sembrando dos, tres o cinco tubos por cada dilución, según sea el caso (Anexo 1) Colocar 1 ml de la muestra en tubos de ensayo bacteriológicos con caldo verde bilis brillante (Anexo 1) colocando la muestra en los tubos que sea necesario y con la presencia de campanas de Durham Colocar el mismo número de muestras testigo de Verde Bilis Brillante

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.

incubar a 35 ºC ± 1 por 24 h. Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). Ésta se observa en las campanas. Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h más. 2) Métodos para coliformes fecales: Prueba de Mackenzie. En esta se usa el caldo Verde Bilis Brillante más agua Peptonada. Se parte del caldo MacConkey, los tubos positivos de la prueba de coliformes totales se siembran en este caldo, si aquí vuelve a salir positivo se le realizan las dos pruebas siguientes:

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Sólo se tomará esta prueba como positiva si los dos tubos (caldo Brilla y caldo Peptonado) resultan positivos 8. . RESULTADOS

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9. . ANÁLISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

¿Cuáles son los diferentes métodos para coliformes totales? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ Para el conteo de coliformes totales se tienen tres métodos principalmente. .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ ¿Qué importancia tienen las levaduras en la industria lechera? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología ¿Cómo hay que preparar la muestra para el análisis de leche? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ¿Cuál es el uso del agua peptonada? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 10. REFERENCIAS L. ORTIZ, M. (2003) Material didáctico de Microbiología de Alimentos: Recuento de enterobacterias. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza. VARGAS, T. (2005) Calidad de la Leche: Visión de la Industria Láctea. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdf

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UNIVERSIDAD BANCARIA DE MÉXICO “Constancia, Unidad y Trabajo”

FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CARRERA LICENCIATURA GASTRONOMIA

PLAN DE CLAVE ESTUDIO ASIGNATURA EN

PRÁCTICA No.

LABORATORIO DE

4

NOMBRE PRÁCTICA

Nombre del alumno: Nombre del profesor:

DE

NOMBRE DE ASIGNATURA Microbiología e higiene

MICROBIOLOGÍA LA

LA

DURACIÓN (Minutos) 80

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO EN PESCADO Fecha: Cuatrimestre: Grupo: Turno:

Objetivo. Identificará las técnicas de análisis microbiológico para establecer el grado de contaminación o presencia de bacterias dañinas en diferentes alimentos marinos 1. FUNDAMENTO El deterioro de la carne de los peces es consecuencia de los microorganismos presentes en su habitad de desarrollo, y por alteraciones en su flora microbiana inicial, ocasionadas al momento de su captura y manipulación, produciendo la mala calidad que lo hace inadecuado para el consumo, problema que puede originar consecuencias como intoxicaciones y, en algunos casos la muerte, debido a las enfermedades transmitidas por alimentos en mal estado. Siendo los peces animales de uso masivo, por su alto contenido proteico, su producción es destinada en un 70% al consumo humano, y el resto a la fabricación de alimentos para animales y otros fines. La composición química de estos comestibles es un medio competente para el desarrollo de diversos microorganismos, cuya microflora puede ser modificada en el momento de su recolección y tratado a nivel comercial, dando como resultado la putrefacción del mismo ocasionada por la acción bacteriana, en la cual pueden estar involucrados patógenos responsables de intoxicaciones en humanos y animales, motivo por el cual se han desarrollado técnicas para efectuar análisis microbiológicos para determinar la inocuidad de los productos, y dictaminar si es apropiado para la alimentación del hombre y otras especies; a raíz de esto se han desarrollado una serie de normas a nivel mundial, que hacen referencia a los diferentes métodos para realizar análisis microbiológicos, utilizando entre estos el número del método más probable para identificar Coliformes, estos son un grupo de microorganismos que se caracterizan porque muchos de ellos son responsables de un gran número de enfermedades, pero que además al realizar el análisis de la flora microbiana indican si, en este caso el pescado está en buen o mal estado. Otra de las técnicas más empleadas para la cuantificación es el aislamiento y recuento en placas, cuyo

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología fin es determinar el grado de contaminación de una muestra y las condiciones que han favorecido o reducido la carga microbiana, altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos y suelen ser signo de inmediata alteración del producto. Tasas superiores entre 105 y 107 microorganismos por ml suelen ser signos de descomposición que hacen que el pescado pueda ser apropiado para el consumo. 2. COMPETENCIAS Durante y al término de la práctica el alumno: El alumno se familiarizará con los métodos de recuento, especialmente con el de Número Más Probable (NMP ) que le permitan detectar bacterias coliformes totales así como vibro cholerae y Staphilococcus aureus en alimentos y considerando si la muestra traída es apta para el consumo humano..

LABORATORIO EQUIPO NECESARIO Mechero bunsen o Fisher Matraz Erlenmeyer 500 ml Tubos de ensayo con rosca Pipetas de 5 y 10 ml Autoclave Perilla de succión Balanza granataria Parrilla con agitador magnético Guantes para manejo de materiales calientes Espátula Estufa de incubación Campanas de Durham Gradilla Espátula de Digralsky REACTIVOS Verde Brillante Bilis 2% Caldo Caldo Lauril Sulfato Agar ABP Agua peptonada *

ALUMNO MATERIAL DE APOYO Muestra de pescado fresco o refrigerado Cinta Masking Tape

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a) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA METODOLOGÍA

1) Método para coliformes totales Se prepara el inoculo a sembrar colocando en un matraz Erlenmeyer una muestra de 10 gr de pescado a analizar por 90 ml de agua peptonada quedando la dilución 10-1 (agua peptonada anexo 1). Se coloca una muestra de 1 ml en un tubo de ensayo que contiene 9 ml agua peptonada y se incuba a 37°C por espacio de 48 horas. A partir de la muestra 10-1 se toma 1 ml y se vierte en tubo de ensayo con verde bilis brillante (9 ml) incubando a 37°C por 48 horas colocando la muestra en los tubos que sea necesario y con la presencia de campanas de Durham. De la misma muestra se toma 0.1 ml y se siembra en placa con medio de cultivo ABP y agar F dejando que se incube por espacio de 48 horas a 37° C

.

incubar a 35 ºC ± 1 por 24 h. Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). Ésta se observa en las campanas. Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h. 3. . RESULTADOS

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4. . ANÁLISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

¿Por qué es importante el uso de medios selectivos para el análisis de pescados y mariscos? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ ¿Que función tiene el método ABP de cultivo?. .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _______________________________________________________________ ¿Qué importancia tienen los métodos predictivos de Vibro cholerae? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología ¿Cómo hay que preparar la muestra para el análisis de pescado ? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ¿Por qué se usa medio peptonado en porciones completas carnes? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 5. REFERENCIAS JAWETZ E., et al. “Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg”. Editorial Manual Moderno, 19a Ed. México 2008; 702-703. MURRAY PR, et al. “Microbiología Médica”. Editorial Elsevier Mosby. 6a Ed. España 2009: 158-159. CALDAS A. L., “Guía de Microbiología y Parasitología básico clínica”. Disponible en: http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos010/DptoMedInt/Tencion_de_gram.pdf.

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UNIVERSIDAD BANCARIA DE MÉXICO “Constancia, Unidad y Trabajo”

FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CARRERA LICENCIATURA GASTRONOMIA

PLAN DE CLAVE ESTUDIO ASIGNATURA EN

PRÁCTICA No.

LABORATORIO DE

5

NOMBRE PRÁCTICA

Nombre del alumno: Nombre del profesor:

DE

NOMBRE DE ASIGNATURA Microbiología e higiene

MICROBIOLOGÍA LA

LA

DURACIÓN (Minutos) 80

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO EN HORTALIZAS Fecha: Cuatrimestre: Grupo: Turno:

Objetivo. Conocerá y aplicará diferentes técnicas de análisis microbiológico para establecer el grado de contaminación o presencia de bacterias en hortalizas de consumo inmediato 1. FUNDAMENTO El método de dilución en placa se fundamenta en que cualquier célula viable inoculada en un medio de cultivo se multiplica y produce datos de fácil identificación, como la formación de colonias en placas de agar. Este método consiste en la preparación de una serie de diluciones de una muestra de suelo en un diluyente apropiado, esparciendo una alícuota de una dilución sobre la superficie de un medio de cultivo sólido e incubando la placa de agar bajo condiciones ambientales apropiadas. La dilución debe permitir generar colonias separadas, cada colonia puede proceder de una sola célula o de una agrupación (unidad viable), la cual se contará como una bacteria. Bajo este fundamento, estas placas pueden ser usadas no sólo para el conteo de poblaciones microbianas, sino también para el aislamiento de organismos. Un medio selectivo o no selectivo puede ser usado dependiendo de la naturaleza Vías de contaminación de la muestra Aire: vía de transporte de polvos (y microorganismos que se adhieren a estos) o esporas fúngicas. Suelo: Fuente de una gran flora microbiana que puede alcanzar la muestra Transporte: Las vías de transporte con las que la muestra entro en contacto desde la siembra hasta que llego al laboratorio. Contaminación por una incorrecta desinfección de los materiales y equipos de laboratorio En la determinación de diferentes muestras que pudieran estar contaminados se usan medios de cultivo que pueden llegar a considerarse semiselectivos como son:

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología Agar PCA: Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. También es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas. Agar EMB: Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Medio Sabouraud: Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras.

2. COMPETENCIAS Durante y al término de la práctica el alumno: El alumno se familiarizará con los métodos de recuento, especialmente con el de Número Más Probable (NMP ) que le permitan detectar bacterias coliformes totales así como vibro cholerae y Staphilococcus aureus en alimentos y considerando si la muestra traída es apta para el consumo humano..

LABORATORIO EQUIPO NECESARIO Mechero bunsen o Fisher Matraz Erlenmeyer 500 ml Tubos de ensayo con rosca Pipetas de 5 y 10 ml Autoclave Perilla de succión Balanza granataria Parrilla con agitador magnético Guantes para manejo de materiales calientes Espátula Estufa de incubación Campanas de Durham Gradilla Espátula de Digralsky REACTIVOS Verde Brillante Bilis 2% Caldo Agar PCA Agar EMB Agua peptonada *

ALUMNO MATERIAL DE APOYO Muestra de pescado fresco o refrigerado Cinta Masking Tape

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b) DESARROLLO DE LA PRÁCTICA METODOLOGÍA

1) Método para coliformes totales Se prepara el inoculo a sembrar colocando en un matraz Erlenmeyer una muestra de 10 gr de la muestra triturada bajo condiciones de limpieza por 90 ml de agua peptonada quedando la dilución 10-1 (agua peptonada anexo 1). Se coloca una muestra de 1 ml en un tubo de ensayo que contiene 9 ml agua peptonada y se incuba a 37°C por espacio de 48 horas. A partir de la muestra 10-1 se toma 1 ml y se vierte en tubo de ensayo con verde bilis brillante (9 ml) incubando a 37°C por 48 horas colocando la muestra en los tubos que sea necesario y con la presencia de campanas de Durham. De la misma muestra se toma 0.1 ml y se siembra en placa con medio de cultivo PCA y agar EMB dejando que se incube por espacio de 48 horas a 37° C 3. . RESULTADOS

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4. . ANÁLISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son los principales contaminantes químicos en frutas y hortalizas? .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 2 Explique procesos patológicos transmisibles por los alimentos: Intoxicaciones e infecciones. .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 3. Explique técnicas de preservación de alimentos por radiación .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 4.Explique los indicadores de contaminación fecal en frutas y hortalizas .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 5. Busca algún proyecto o trabajo de investigación relacionable a productos vegetales y escribe brevemente su desarrollo .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 5. Explique los controles de calidad que se realizan durante la elaboración de productos vegetales con frutas y hortalizas .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 5. REFERENCIAS JAWETZ E., et al. “Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg”. Editorial Manual Moderno, 19a Ed. México 2008; 702-703. MURRAY PR, et al. “Microbiología Médica”. Editorial Elsevier Mosby. 6a Ed. España 2009: 158-159. CALDAS A. L., “Guía de Microbiología y Parasitología básico clínica”. Disponible en: http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos010/DptoMedInt/Tencion_de_gram.pdf.

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ANEXO 1 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO PREPARACION DE AGUA PEPTONADA 100 ml INGREDIENTES, CANTIDADES Peptona: 0,1g NaCl: 0,85 g Agua: 100 mL

PREPARACIÓN: Disolver los componentes en 100 mL de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones de 9,9, 9,0 y 0,9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 1 ml PREPARACION DE VERDE BILIS BRILLANTE A 1 lt En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas. Fórmula (en gramos por litro) Bilis de buey deshidratada Lactosa Peptona Verde brillante

Instrucciones

20.0 10.0 10.0 0.0133

Suspender 40 g del polvo deshidratado por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Preparar además, el medio a doble concentración. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. pH final: 7.2 ± 0.2

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Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. PREPARACION DE MACCONKEY AGAR A 1 lt .En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Fórmula (en gramos por litro) Peptona Pluripeptona Lactosa Mezcla de sales biliares Cloruro de sodio Agar Rojo neutro Cristal violeta

Instrucciones

17.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y 3.0 10.0 mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos 1.5 hasta disolver. Esterilizar en 5.0 13.5 autoclave a 121°C durante 15 0.03 minutos. 0.001 pH final: 7.1 ± 0.2

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Universidad Bancaria de México Manual Prácticas de Laboratorio de microbiología L. ORTIZ, M. (2003) Material didáctico de Microbiología de Alimentos: Recuento de enterobacterias. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza. VARGAS, T. (2005) Calidad de la Leche: Visión de la Industria Láctea. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdf JAWETZ E., et al. “Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg”. Editorial Manual Moderno, 19a Ed. México 2008; 702-703. MURRAY PR, et al. “Microbiología Médica”. Editorial Elsevier Mosby. 6a Ed. España 2009: 158-159. CALDAS A. L., “Guía de Microbiología y Parasitología básico clínica”. Disponible en: http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos010/DptoMedInt/Tencion_de_gram.pdf. BREACH, M.R. Esterilización, métodos de control. El manual Moderno, S.A. México HARLEY, J., PRESCOTT, L. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw−Hill . 5th Edition. EUA. JHONSON, T.R. and Case, C.L. Laboratory experiments in microbiology. 4th edition. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California. MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M. y PARKER, J. Biología de los microorganismos. 10ª edición. Prentice Hall. USA.

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