UNIVERSIDAD DEL TURABO

COMUNIDADES MICROBIANAS PRESENTES EN LA HOJARASCA A DIFERENTES ESTADOS DE DESCOMPOSICIÓN CON O SIN LA ABERTURA DEL DOSEL Y LA DEPOSICIÓN DEL DETRITO

Por María L. Ortiz Hernández B.S., Ciencias Naturales, Universidad de Puerto Rico en Río Piedras

TESIS

Escuela de Ciencias y Tecnología Universidad del Turabo Requisito parcial para el grado de Maestría en Ciencias Ambientales Con Especialidad en Manejo Ambiental

Gurabo, Puerto Rico mayo, 2008

ii

© Copyright 2008 María L. Ortiz Hernández. All Rights Reserved.

Dedicatoria Dedico este trabajo de investigación primeramente a DIOS y a mi mayor tesoro: mi familia. Porque siempre han estado a mi lado apoyándome en los momentos o situaciones que me hacían flaquear. Jean Carlos, Carlos Javier y Karla Michelle ustedes son mi fuente de motivación e inspiración para cada día seguir superándome. Carlos, amado esposo, gracias por escoger estar a mi lado y por brindarme el espacio y la fuerza que me han permitido culminar este gran reto. A mis padres, Rogelio y Monserrate, porque me enseñaron que en la vida hay que luchar con empeño para lograr nuestros sueños. A mi nieto Adrián Alexander y a mi futura nieta Ariana Michelle, gracias por brindarle ternura y energía a mi vida. Este logro se lo dedico, especialmente, a todos ustedes.

iii

Agradecimiento Siempre he pensado que Dios pone en nuestro camino a personas que de una forma u otra han de impactar nuestras vidas. Durante esta investigación hubo muchas personas que colaboraron conmigo. En primer lugar, quiero agradecer de manera muy especial a la Profesora Sharon Cantrell la confianza que tuvo en mí al escogerme para realizar esta investigación. Usted ha sido mi guía y asesora, la persona que ha estado durante estos años brindándome su apoyo y conocimiento para que hoy pueda culminar con este gran reto. Gracias por su paciencia y dedicación. También quiero agradecer de manera especial el asesoramiento, las recomendaciones y el apoyo del Profesor José Pérez y la Dra. Deborah J. Logde. Mi agradecimiento especial al “Luquillo Long Term Ecological Research” por proporcionarnos la asistencia técnica y al “Institute for Tropical Ecology Study” por proveernos las facilidades y los recursos económicos que nos permitieron llevar a cabo este estudio. Agradezco a Francisco Rivera, Zulma Ortiz, Claribel Báez, Albany Agues Marchetti y a Carlos Cruz la ayuda que me brindaron en las tareas realizadas en el laboratorio. Gracias por su ayuda incondicional. Finalmente, agradezco a mis familiares, amistades y a todos aquellos que dieron de su conocimiento, tiempo, y dedicación para que esta investigación se realizara. Gracias por su apoyo.

iv

Tabla de contenido página Lista de Tablas .................................................................................................................. vii Lista de Figuras ................................................................................................................viii Tabla de Apéndices ............................................................................................................ xi Abstract ............................................................................................................................. xii Resumen ...........................................................................................................................xiii Capítulo Uno Introducción.................................................................................................. 1 Justificación............................................................................................................. 1 Metas y Objetivos.................................................................................................... 3 Hipótesis.................................................................................................................. 4 Capítulo Dos Revisión de Literatura................................................................................... 8 Capítulo Tres Metodología................................................................................................ 22 Descripción del lugar de estudio ........................................................................... 22 Diseño experimental.............................................................................................. 24 Procedimiento para la colección y manejo de muestras........................................ 28 Extracción de ADN ............................................................................................... 28 Amplificación del ADN ........................................................................................ 28 Comparar estructura y estimar diversidad............................................................. 29

v

página Análisis estadísticos .............................................................................................. 29 Capítulo Cuatro Resultados .............................................................................................. 30 Resultados de la investigación .............................................................................. 30 Capítulo Cinco Discusión.................................................................................................. 76 Literatura Citada................................................................................................................ 81 Apéndices .......................................................................................................................... 85

vi

Lista de Tablas página Tabla 4.01. Muestras colectadas durante los intervalos de muestreo.............................. 31 Tabla 4.02. Amplificación de ADN ................................................................................ 32 Tabla 4.03. Promedio del ADN total (µg/ml) en los Bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca ............................................................................................ 34 Tabla 4.04. Promedio del ADN total (µg/ml) en los Bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojas verdes .................................................................................................. 36 Tabla 4.05. Resultados del análisis estadístico “Two-Way ANOVA” del ADN (µg/ml) versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca ..................................................................... 40 Tabla 4.06. Relación entre el número de filotipos de hongos y el número de filotipos de bacterias versus el % de humedad de acuerdo al tratamiento aplicado en la cohorte de hojarasca fresca ................................ 46 Tabla 4.07. Resultados del análisis estadístico “ANOVA” al aplicar la técnica TRFLP en hongos versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca............................................................ 50 Tabla 4.08. Resultados del análisis estadístico “ANOVA” al aplicar la técnica TRFLP en bacterias versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca............................................................ 51 Tabla 4.09. Por ciento (%) de masa remanente en los Bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca .......................................................................... 52

vii

Lista de Figuras página Figura 3.01.

Mapa del área este de Puerto Rico ............................................................ 23

Figura 3.02.

Mapa topográfico del área de estudio en la Estación El Verde................. 24

Figura 3.03.

Mapa del área de estudio en el Bosque Experimental de Luquillo, Estación El Verde...................................................................................... 25

Figura 3.04.

Diagrama de la canasta de descomposición .............................................. 26

Figura 3.05.

Remoción de la canasta de descomposición en el intervalo de las 31 semanas ................................................................................................ 27

Figura 4.01.

Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) en la hojarasca fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado .............................. 38

Figura 4.02.

Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) en las hojas verdes de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado ............................. 39

Figura 4.03.

Diversidad de bacterias y hongos encontrada en la cohorte de hojarasca fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP................................................................................. 43

Figura 4.04.

Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento poda del dosel sin adición del detrito en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas ..................................................................................................... 44

Figura 4.05.

Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento control en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas............................................. 44

Figura 4.06.

Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento no poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas ................................................................................................ 45

Figura 4.07.

Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas ................................................................................................ 45

viii

Figura 4.08.

Razón del número de filotipos de hongos entre el número de filotipos de bacterias versus el por ciento de humedad encontrada en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.......... 47

Figura 4.09.

Diversidad de bacterias y hongos encontrada en la cohorte de hojas verdes de acuerdo al tiempo y tratamiento aplicado y basados en el TRFLP....................................................................................................... 49

Figura 4.10.

ADN total extraído de 0.3 g de la hojarasca fresca en las 17, 31 y 55 semanas y el por ciento de masa remanente......................................... 53

Figura 4.11.

Cladograma del TRFLP del “pool” de las muestras que dieron positivo al PCR mostrando la estructura de la comunidad de bacterias y hongos presentes en las diferentes cohortes de hojas y en los tratamientos aplicados..................................................................... 56

Figura 4.12.

Perfil de TRFLP de muestras de bacterias de la hojarasca fresca en el bloque (A) a las que se les aplicó el tratamiento control a través del tiempo.................................................................................................. 58

Figura 4.13.

Perfil de TRFLP de muestras de hongos de la hojarasca fresca en el bloque (A) a las que se les aplicó el tratamiento control a través del tiempo........................................................................................................ 59

Figura 4.14.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas .............................................................. 62

Figura 4.15.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas .............................................................. 63

Figura 4.16.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas .............................................................. 64

Figura 4.17.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas .............................................................. 65

ix

Figura 4.18.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas ................................................................... 67

Figura 4.19.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas ................................................................... 68

Figura 4.20.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas ................................................................... 70

Figura 4.21.

Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas ................................................................... 71

Figura 4.22.

Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el intervalo de las 55 semanas ........... 73

Figura 4.23.

Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicaron distintos tratamiento en el intervalo de las 55 semanas ............................ 74

x

Lista de Apéndices página Apéndice Uno.

....................................................................................................... 85

Apéndice 1.01.

Protocolo para extracción de ADN ............................................... 86

Apéndice 1.02.

Dilución de iniciadores oligonucleótidos...................................... 88

Apéndice 1.03.

Protocolo de precipitación para productos de secuenciación........ 89

Apéndice Dos.

Resultados ..................................................................................... 91

Apéndice 2.01.

Resultados de la amplificación del ADN mediante la técnica de reacción de la cadena de polimerasa (PCR) utilizando la enzima de restricción Red Taq ................................. 91

Apéndice 2.02.

Resultados obtenidos en las muestras de hojarasca fresca colectadas en los Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y la diversidad de microorganismos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo......................... 96

Apéndice 2.03.

Resultados obtenidos en las muestras de hojas verdes colectadas en los Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y la diversidad de microorganismos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo......................... 98

xi

Abstract

María L. Ortiz Hernández (Master of Science, Environmental Science) Leaf litter microbial communities at different stages of decomposition with and without canopy opening and debris deposition (May 2008) Abstract of Master’s Thesis at the Universidad del Turabo M.S. thesis supervised by Dr. Sharon Cantrell No. of the pages in the text 99

Hurricanes are common disturbances affecting forest ecosystems in the Caribbean. Our objective was to determine the relative abundance and diversity of microorganisms in leaf litter at different stages of decomposition, and the influence of canopy opening and debris addition or removal. The study was conducted in the tabonuco forest (subtropical moist) at El Yunque Rain Forest, Puerto Rico. Three blocks with four treatment plots were established. TRFLP profiles of the 16S rDNA digested with MnlI and fungal ITS digested with HaeIII showed that the microbial communities at 17, 31 and 55 weeks were highly divergent among treatments. Ratio of fungal to bacterial phylotypes increased for close canopy with debris addition. Leaf mass loss was slowest in the treatment with canopy trimming and debris removal. Microbial community changes through time can be related to microclimate and the availability of labile compounds. Fungi appeared to control the succession of microorganisms in decomposing leaves.

xii

Resumen

Los huracanes son disturbios comunes que afectan los ecosistemas de bosques en el Caribe. El objetivo de nuestro estudio fue determinar la abundancia relativa y la diversidad de microorganismos en la hojarasca a diferentes estados de descomposición, y el efecto de la poda del dosel y la adición o remoción del detrito. El estudio fue realizado en bosque tabonuco (subtropical húmedo) en el bosque lluvioso El Yunque en Puerto Rico. Se establecieron tres bloques divididos en cuatro parcelas con cuatro tratamientos distintos. El TRFLP de la región 16S rADN digerida con la enzima MnlI y la región ITS digerida con la enzima HaeIII mostró que las comunidades microbianas a las 17, 31 y 55 semanas fueron altamente divergentes a través de los tratamientos. La razón del número de filotipos de hongos versus los de bacterias fue mayor en el tratamiento de no poda más adición del detrito. La pérdida de masa en la hojarasca fresca fue más lenta en el tratamiento de poda del dosel sin adición de detrito. Los cambios de las comunidades microbianas a través del tiempo pudieron ser relacionados al microclima y a la disponibilidad de compuestos lábiles. Los hongos aparentan controlar la sucesión de microorganismos al descomponer la hojarasca.

xiii

.

xiv

Capítulo Uno Introducción

Justificación Los disturbios atmosféricos que afectan los bosques del Caribe son causados principalmente por los huracanes. Éstos se originan en la costa occidental de África y una vez llegan al Caribe provocan cambios profundos en la fauna, la flora, la geografía, el suelo y en diversos aspectos generales del lugar. En trabajos realizados en Puerto Rico se ha sugerido que los disturbios naturales, como los huracanes, tienen un efecto significativo en la estructuración de los bosques tropicales, particularmente en la distribución de árboles, la diversidad de especies y la biomasa (Weaver, 1986; Lugo y Rivera-Battle, 1987). Durante los huracanes Hugo (1989) y Georges (1998), se crearon aberturas en el dosel del bosque de El Yunque y se produjo un aumento en la cantidad de hojarasca y madera acumulada en el suelo (Lodge et al, 1991; Ostertag et al, 2003). De acuerdo a los estudios realizados por Lodge et al, (1991), el Huracán Hugo depositó 1 kg/m2 de hojarasca en el suelo del bosque. En un periodo de dos años, la diversidad funcional de comunidades microbianas (Willig et al, 1996) y la supervivencia de los hongos (Lodge and Cantrell, 1995) fue afectada por el aumento en detrito, luz, humedad y nutrientes. En estudios realizados por Quishui y Zak (1995), se relaciona el tamaño de la abertura del dosel en bosques subtropicales y la descomposición de la hojarasca. En su trabajo se establece que los factores de temperatura, humedad y la radiación solar son factores que median las actividades y la estructura de las comunidades microbianas. Por otra parte en

1

2 estudios realizados por Cornejo, Varela y Wright (1994), se utiliza el método de irrigación para manipular el agua en el terreno durante la época de sequía y poder examinar el efecto de ésta sobre la razón de descomposición, la liberación de nutrientes, las bacterias y los hongos. Utilizaron series de diluciones para cuantificar la densidad de bacterias y hongos. En su estudio encontraron que las concentraciones de nutrientes en las fracciones recalcitrantes de la hojarasca mostraban una declinación rápida en el primer mes seguida por la bioacumulación o cambios no significativos en los siguientes cuatro meses. El conteo de bacterias mostró la tendencia a disminuir de valores altos en enero, febrero y marzo a valores bajos en abril y mayo, cuando la hojarasca era irrigada. Esta disminución fue correlacionada con la pérdida de masa y probablemente reflejaba una variedad de cambios en la calidad del sustrato durante la descomposición. Por el contrario, en la parcela control, el conteo de hongos fue mayor cuando las condiciones eran más secas durante febrero y marzo y declinaba con la leve lluvia de abril y las fuertes lluvias de mayo. Estas observaciones confirmaron que las condiciones secas favorecían la actividad de los hongos (Cornejo et al, 1994). No obstante, aún tiene que ser determinado el papel que desempeñan las interacciones de las comunidades microbianas presentes en la sucesión de la descomposición de la hojarasca sobre el suelo. El valor de este estudio estribaba en que se pudiera determinar como la deposición de la hojarasca verde y la abertura del dosel en el bosque afectaban las comunidades de microorganismos (hongos y bacterias) presentes en la hojarasca. El objetivo se alcanzó mediante la aplicación de “Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism” (TRFLP) utilizando el gen para la subunidad ribosomal pequeña en bacterias (16S rADN) y la región interna que se transcribe en hongos (ITS, por sus siglas

3 en inglés), independientemente. Esta técnica es considerada una herramienta poderosa y rápida para estimar la diversidad y estructura de comunidades microbianas complejas. Meta y Objetivos La meta del estudio fue determinar cómo la deposición de la hojarasca verde y la abertura del dosel en el bosque afectaban independientemente o en conjunto las comunidades microbianas (hongos y bacterias) presentes en la hojarasca. En otras palabras, se pretendía caracterizar y medir los cambios en la sucesión microbiana en la hojarasca simulando las condiciones que surgen con el paso de un huracán. Las aberturas en el dosel del bosque y la deposición del detrito ocurren normalmente en conjunto como resultado de los daños causados por los huracanes, pero en este estudio se utilizó un diseño factorial 2 x 2 para separar estos efectos. El estudio se realizó en tres áreas del Bosque Experimental de Luquillo en las cuales se recrearon los efectos de un huracán podando de manera sistemática el dosel para luego redistribuir la vegetación acumulada en distintas áreas. El cambio en las comunidades se analizó estableciendo distintas condiciones y simulando el movimiento de fuentes orgánicas, como hojas y ramas, durante el paso de un huracán. Con este estudio se pretendía medir los cambios en la estructura microbiana en respuesta a los diferentes tratamientos y sus efectos relativos en los organismos presentes en la sucesión de descomposición del material orgánico. Se tuvo como finalidad relacionar la información a nivel molecular con la actividad a escala ecológica. Los objetivos de este estudio son:


Analizar la composición y estructura de las comunidades microbianas en la hojarasca por medio de TRFLP.

4


Determinar si hay alguna diferencia significativa entre los tratamientos y diferentes niveles de descomposición de la hojarasca.




Determinar la diversidad de bacterias y hongos presentes en la sucesión en la hojarasca.

Hipótesis Ho: La deposición de materia orgánica y las aberturas en el dosel mantendrán invariable la diversidad de microorganismos en la hojarasca a diferentes estados de descomposición. Ha: La deposición de materia orgánica y las aberturas en el dosel cambiarán la diversidad relativa de microorganismos en la hojarasca a diferentes estados de descomposición. En trabajos realizados en el Bosque Experimental de Luquillo se ha encontrado, que la formación de aberturas en el dosel del bosque han causado cambios en la composición de comunidades de basidiomicetos en hojarasca, y a la misma vez, una disminución en la abundancia de especies (Hedger, 1985; Lodge and Cantrell, 1995). Por otro lado, Quishui y Zak (1995), encontraron que estas aberturas en el dosel afectan drásticamente la tasa de descomposición del lugar al reducir las actividades microbianas debido a los cambios en temperatura e irradiación de luz solar que ocurren en el suelo. El “Long Term Ecological Research” (LTER) auspiciado por la Fundación Nacional para la ciencias en su propuesta número 3 propuso estudiar los efectos de un huracán en las comunidades de organismos sobre el suelo del bosque. A estos fines, se seleccionaron tres áreas o bloques de estudios, las cuales estuvieron divididas en cuatro parcelas cada una y estas parcelas se dividieron en cinco subparcelas. En estas áreas se

5 simularon los diferentes efectos de un huracán. Dos de las cuatro parcelas fueron sometidas a una poda del dosel (corte de ramas por arboristas profesionales). En una de estas parcelas, se removió toda la hojarasca y las ramas verdes, y éstas se distribuyeron en otra parcela (donde no hubo poda del dosel). Al podar el dosel y redistribuir la biomasa, se crearon cambios en el microclima y estructura del bosque. Durante un año se tomaron muestras de la hojarasca para extraer el ADN y determinar los cambios, mediante indicadores genéticos, en la sucesión de las comunidades de microorganismos presentes durante la descomposición en la hojarasca después de un disturbio natural. Con el propósito de determinar como estos cambios afectan los microorganismos describiremos a continuación los distintos tratamientos. Descripción de los tratamientos: 1. Abertura del dosel y adición del detrito Este tratamiento simulará cambios en el microclima causados por la abertura en el dosel y la adición de materia orgánica. La tasa de descomposición de la hojarasca presente en las canastas aumentará debido al incremento relativo en la humedad de la capa de hojarasca protegida y al movimiento de nutrientes de las hojas verdes. Los cambios en humedad, profundidad de la hojarasca y la alta concentración de nutrientes en las hojas verdes podrán interactuar e influenciar la tasa de descomposición en la capa de la hojarasca presente sobre el suelo, además de la hojarasca verde. Por tanto, la diversidad de microorganismos en la hojarasca no cambiará inmediatamente después que el dosel sea podado. Eventualmente habrá una disminución en la diversidad relativa debido a la abertura de dosel y los cambios microclimáticos asociados (altas temperaturas y radiación de luz) que afectarán el desarrollo y las actividades microbianas en la

6 sucesión de descomposición de la hojarasca. Una vez que la abertura de dosel se cierre y las condiciones microclimáticas se reestablezcan aumentará la diversidad de microorganismos. 2. Abertura del dosel y remoción del detrito Esto simulará los cambios en el microclima (aberturas) creados por el huracán sin la incorporación de cambios en la redistribución de biomasa. El incorporar material orgánico es un factor importante para el desarrollo microbiano dentro de un ecosistema. Por ende, si se retira esta fuente orgánica, se disminuye el desarrollo de los microorganismos, particularmente los hongos. En este tratamiento se observará una diversidad reducida en el número de microorganismos inmediatamente después que el dosel del bosque se ha podado y se retire el material orgánico ya que habrá una disminución en la sucesión de descomposición de la hojarasca. Eventualmente, la diversidad de microorganismos comenzará a reestablecerse una vez la abertura del dosel se cierre y se reestablezcan las condiciones climáticas dentro del bosque. 3. Dosel cerrado y adición del detrito Esto simuló los cambios en la redistribución de biomasa creados por el huracán sin la asociación de los cambios del microclima. Se esperará que la hojarasca existente en las canastas tenga un aumento en la tasa de descomposición debido al aumento en la profundidad de la hojarasca y el ambiente favorable. Este tratamiento podrá tener la tasa más rápida de pérdida de hojarasca presente sobre el suelo. Las condiciones climáticas invariables y la entrada de biomasa dentro del bosque mantendrán sin cambios la diversidad de microorganismos. Inmediatamente luego del tratamiento habrá un marcado y rápido aumento en la diversidad de los microorganismos ocasionado por el incremento

7 de biomasa en la descomposición de la hojarasca sobre el suelo. La diversidad de microorganismos podrá mantenerse sin cambios. 4. Control. Dosel cerrado y no adición del detrito Esto mantendrá las condiciones del bosque sin cambios Se esperará que este tratamiento tenga el segundo o tercer lugar más alto en la tasa de descomposición. La diversidad de microorganismos en la hojarasca de las canastas no cambiará. Las condiciones invariables del bosque mantendrán la composición, la estructura y la diversidad microbiana.

Capítulo Dos Revisión de Literatura

El suelo es un recurso natural dinámico necesario para sustentar cualquier ecosistema terrestre. La calidad de éste puede afectar la sustentabilidad y productividad de uso de la tierra y, al mismo tiempo, esta calidad puede ser influenciada fuertemente por procesos microbiológicos tales como el reciclaje y la capacidad de nutrientes entre otros. La biomasa microbiana del suelo y de la hojarasca en los bosques tropicales está compuesta de eubacterias, arqueobacterias, hongos, actinomicetos, algas, protozoarios y algunos nemátodos. Esto constituye un cuarto de la biomasa total del planeta. Es por esta razón que la biomasa microbiana contribuye al mantenimiento de la fertilidad y calidad del suelo tanto en el ecosistema terrestre natural como en el ecosistema terrestre manipulado. De acuerdo a los estudios realizados por Willig et al, (1996), el uso que se le da al suelo afecta la estructura del ecosistema, éste incluye características tales como composición química, profundidad, disponibilidad de agua y concentración de materia orgánica. Aunque todos estos factores se pueden relacionar, no se ha podido determinar cuál de éstos es más importante en la estructura de la comunidad microbiana debido a la falta de manipulaciones en la experimentación. La biomasa microbiana es parte de la materia orgánica del suelo y de la hojarasca que se encuentra sobre éste y tiene una función importante en el desarrollo y funcionamiento de ecosistemas terrestres. La materia orgánica del suelo es una mezcla compleja de materia viva, muerta y descompuesta, en adición a los compuestos inorgánicos. El componente vivo comprende

8

9 alrededor de un 4% del carbono orgánico total del suelo y es subdividido en tres componentes: raíces de plantas (5-10%), macroorganismos (15-30%) y microorganismos (60-80%). Por otro lado el componente no vivo de la materia orgánica del suelo se puede dividir en materia macroorgánica (residuos de plantas en diferentes estados de descomposición), y humus incluyendo sustancias no húmicas (carbohidratos, lípidos, ácidos orgánicos, pigmentos y proteínas) y sustancia húmicas (ácido húmico y ácido fúlvico) (Theng et al, 1989). En la naturaleza los microorganismos viven en comunidades. Estas comunidades desempeñan un papel importante en la biosfera, principalmente reciclando elementos biológicos importantes (Vestal y White, 1989). Todos los ciclos bioquímicos esenciales como los de carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y azufre están mediados por comunidades de microorganismos. Por ende, si se entiende la función que tienen los microorganismos en el ambiente natural, se facilitará el distinguir cuáles organismos están presentes. Es sumamente importante entender el papel de estos microorganismos en el ecosistema. Los microorganismos controlan muchos de los procesos esenciales para el mantenimiento y supervivencia de los bosques tropicales. Lodge et al, (1996) presenta las dinámicas de la diversidad microbiana y el funcionamiento de los bosques. En adición, se mencionan los atributos funcionales de los microorganismos y se identifican los procesos que son sensibles a la pérdida de la diversidad, de manera especial, aquellos relacionados con disturbios o cambios ambientales en los bosques tropicales. En ese trabajo, los autores reconocen que existen pocas publicaciones que presenten cómo los microorganismos pueden influenciar los ecosistemas en los bosques tropicales. Esto ocurre ya que las publicaciones que más abundan están asociadas a la caracterización de

10 microorganismos que se relacionan a procesos en ecosistemas tropicales, pero el estudio de cómo la diversidad afecta el funcionamiento de los ecosistemas es prácticamente limitado. Se ha intentado determinar la función de ciertos microorganismos, como bacterias y hongos, en las comunidades microbianas naturales por medio de cultivos selectivos enriquecidos (Vestal y White, 1989). Por ejemplo, se puede seleccionar un medio con una sola fuente de carbono y luego mezclar el medio con la muestra de suelo o sedimento, se esperará que sólo aquellos microorganismos que puedan degradar la fuente de carbono añadida puedan crecer. De esta manera, dichos organismos serán seleccionados y enriquecidos produciendo una fuente de biomasa medible. Los microorganismos serán cultivados para obtener colonias puras. Este método ha sido utilizado para demostrar el papel de los microorganismos en el reciclaje de la materia en la naturaleza (Vestal y White, 1989). La cadena alimentaria subterránea del suelo difiere en varias maneras de la cadena superior de éste, pero quizás, una de las diferencias más importantes está en su función. Se ha señalado que las cadenas subterráneas del suelo son responsables de la mayor parte de la descomposición y el reciclaje de nutrientes en los ecosistemas, mientras las cadenas superiores son responsables de la productividad, como por ejemplo la entrada de carbono (Gange et al, 2002). Esta diferencia ocurre ya que la cadena subterránea es dominada por componentes microbianos. Gange et al, (2002) llegó a la conclusión que en la sucesión temprana los insectos que se alimentan de raíces y los hongos AM (micorrizales arbusculares) miembros de la cadena alimentaria del suelo afectan la estructura de las plantas de la comunidad. Ocurren varias interacciones entre ellos, el efecto de los

11 insectos es más grande cuando los hongos están presentes, pero el efecto de los hongos es mayor cuando los insectos están ausentes. Los insectos que se alimentan de raíces aceleran el proceso de sucesión, mientras los hongos micorrizales arbusculares la retrasan. Por otra parte, en su trabajo LaMontagne et al, (2003) compararon comunidades bacterianas del suelo a través de dos transectos verticales desde la superficie hasta cuatro metros de profundidad utilizando la técnica de polimorfismos en longitud de fragmentos terminales de restricción (TRFLP) para amplicones de genes 16S rARN para determinar cómo se diferenciaban las comunidades bacterianas en la superficie y las capas subterráneas. Los hallazgos revelaron que el ADN extraído de la muestras del suelo de los dos transectos disminuyó exponencialmente desde la superficie hasta cuatro metros de profundidad. La riqueza, adquirida por el número de picos obtenidos después de la digestión con las enzimas HhaI, MspI, RsaI, o HaeIII, y la diversidad, obtenida por los índices de diversidad Shannon, fueron menores en las muestras más profundas. La disminución en diversidad en la profundidad es consistente con la teoría de energía de las especies, la cual predice una diversidad relativa menor en los horizontes de materia orgánica más profundos. El patrón de uso del sustrato indica que el cultivo de microorganismos difiere entre los horizontes A (capa del suelo en la que se encuentra el humus, materia orgánica descomponiéndose y la actividad microbiana) y el horizonte O (capa superior del suelo en el que se encuentra la hojarasca) en los suelos del bosque. Este cambio en las poblaciones coincide con la disminución en el carbono del suelo, la biomasa microbiana total y la actividad que se produce a medida que aumenta la profundidad. En adición, LaMontagne et al, (2003) mencionan en su trabajo que las comunidades bacterianas en la superficie cambian con la disponibilidad de nutrientes y

12 que hay diferencias causadas por la profundidad y las estaciones del año. Existen varios ejemplos de cómo la alteración en la productividad de la planta (usualmente por defoliación) afecta la estructura de la cadena alimentaria del suelo (Mikola et al, 2001). Estos experimentos mostraron que las interacciones son complejas a medida que algunos componentes de la biota del suelo, como los nemátodos microbívoros, son afectados por algunas combinaciones particulares de especies de plantas defoliadas. Mientras tanto para otros (hongos), no es importante la identidad de la especie de planta, pero si la cantidad del follaje que fue removido (Gange et al, 2002). Los trabajos de Mikola et al, 2001 sugieren que la intensidad de la defoliación puede afectar grandemente la cadena alimentaria del suelo. En ese trabajo se concluyó que los datos microbianos obtenidos implicaban que el efecto de la intensidad de la defoliación en la estructura de la cadena alimentaria del suelo podría depender de la duración de la defoliación y, por consiguiente, es probable que sea más dinámico que constante en la naturaleza. En trabajos realizados en Puerto Rico, se ha sugerido que los disturbios naturales, como los huracanes, tienen un efecto significativo en la estructuración de los bosques tropicales. Esto ocurre en relación a los aspectos de distribución de árboles, diversidad de especies y la biomasa del lugar (Weaver, 1986; Lugo y Rivera-Battle, 1987). Según Lodge et al, (1996), en los bosques tropicales existen grupos funcionales sensitivos que realizan funciones básicas en los procesos de los ecosistemas. La función de la masa microbiana en la materia orgánica sobre el suelo y en el mantenimiento de nitrógeno puede ser significante, particularmente en ecosistemas perturbados o que se están regenerando (Arunachalam et al, 1996). Gran parte de estos microorganismos llevan a cabo interacciones mutualistas con otros organismos, como, las bacterias fijadoras de

13 nitrógeno en los nódulos de las plantas y los que actúan con artrópodos y las micorrizas. Como gran parte de estos organismos tienen su propio nicho ecológico, se hace difícil que puedan sustituir la existencia de otros. Es razonable pensar que algunos procesos en los bosques tropicales asociados a estos microorganismos y a sus interacciones sean sensitivos a disturbios debido a que las actividades y los grupos funcionales de éstos están delimitados a ambientes restringidos y son sensibles a cambios. El tamaño de una abertura producida en el dosel de un bosque después de un evento climatológico, como un huracán, es determinante en las actividades de la descomposición de la hojarasca. En estudios realizados por Quishui y Zak (1995), se relaciona el tamaño de la abertura del dosel en bosques subtropicales y la descomposición de la hojarasca. En su trabajo se establece que la temperatura, la humedad y la radiación solar son factores que median las actividades y la estructura de las comunidades microbianas. Por ejemplo, las aberturas de gran tamaño provocarán aumento en la entrada de la radiación solar, esto a su vez causará que aumente la evaporación y disminuya rápidamente la humedad de la hojarasca. Por otro lado, según Vestal y White (1989), cuando se habla del estado metabólico de las comunidades microbianas se tiene que mencionar que éstas pueden vivir bajo condiciones de estrés metabólico o crecimiento desigual cuando los factores de humedad, pH, luz, nutrientes inorgánicos, materia orgánica disponible y temperatura no son adecuados. Existen muchas células eucariotas y bacterianas que almacenan moléculas intracelulares durante los períodos de estrés metabólicos. El análisis de estos compuestos almacenados puede ser usado como indicador de la salud metabólica de la comunidad. Los cambios en estos compuestos pueden ser seguidos durante la manipulación ambiental para estudiar los efectos de los cambios en el metabolismo de la comunidad. De acuerdo

14 a trabajos realizados por Liu et al, (1997), la caracterización de la diversidad microbiana utilizando la técnica TRFLP demostraron que esta metodología provee un análisis rápido para conocer diversidad microbiana y los cambios en la estructura microbiana de la comunidad que ocurre a escalas temporales y espaciales o que ocurren en respuesta a perturbaciones ambientales. En las últimas décadas se han utilizado medios selectivos enriquecidos con una o varias fuentes de energía para estudiar la estructura de una comunidad microbiana natural. El aislamiento y la identificación de colonias, en adición a la utilización de técnicas básicas, como la técnica de tinción, observaciones morfológicas y pruebas bioquímicas, son acercamientos taxonómicos numéricos. Éstos presentan gran dificultad, consumen mucho tiempo, son costosos y solamente muestran la presencia de microorganismos que pueden ser cultivados en el medio seleccionado. El cultivo de microorganismos de muestras naturales puede indicar la presencia de microorganismos, pero no revela cuando los microorganismos biodegradan un compuesto particular bajo condiciones ambientales. En adición, muchas comunidades microbianas relacionadas a un sustrato no pueden ser cuantitativamente removidas y contabilizadas. Con el propósito de solucionar estos problemas se han desarrollando diversas técnicas para medir la biomasa, la estructura, el estatus metabólico y la actividad de una comunidad microbiana bajo condiciones in situ, tratando de revelar de forma más precisa el papel funcional de dicha comunidad en la naturaleza. Una de estas técnicas es el uso de análisis de lípidos. El análisis de lípidos se utiliza para el estudio de la biomasa, la estructura de la comunidad, el estatus metabólico y la actividad de las comunidades microbianas naturales y, en adición, es una técnica relativamente sensitiva y cuantitativa

15 que permite un mayor conteo de los microorganismos naturalmente presentes. Al usar esta metodología se pueden estudiar los cambios, a través del tiempo, en las poblaciones microbianas producidos por las perturbaciones físicas o químicas en el ambiente (Vestal y White, 1989). El análisis de lípidos descrito por Vestal y White en el 1989 involucra la extracción de lípidos de una muestra con solventes orgánicos seguido por el análisis de ciertas fracciones del material extraído. La extracción y el análisis deben ser directos. En el área de estudio o en el laboratorio, la muestra debe ser expuesta a una mezcla de fase sencilla de cloroformo, metanol y agua en una razón inicial de 1:2:0.8. Cuando estos solventes son añadidos, los lípidos se disuelven instantáneamente y el metabolismo de los lípidos se detiene. Esta técnica provee una visión de los lípidos al momento de la extracción de éstos. Después de un corto período de haberse hecho la extracción se añade agua y cloroformo al sistema con el propósito de separar las fases cambiando la polaridad de la mezcla. La fracción total de los lípidos puede ser encontrada en la fase más baja del cloroformo y las proteínas de mayor polaridad, los ácidos nucleicos, las paredes de las células y otros componentes permanecen en la fase metano-agua superior o en la interfase cloroformo-agua. La fase orgánica (contenido de lípidos) puede ser fraccionada en fosfolípidos para el análisis de la estructura de la comunidad y la biomasa. El residuo en la interfase puede ser usado para medir bacterias gram negativa, gram positiva y la biomasa eubacteriana total. Actualmente se ha desarrollado un método más simple con el objetivo de extraer los ácidos grasos directamente del suelo. MIDI (Microbial ID) es un protocolo diseñado para extraer los ácidos grasos de cultivos de bacterias puros, aunque de acuerdo a Sasser (1990), éste se ha utilizado en la extracción de ácidos grasos del suelo. En ambas

16 metodologías los ácidos grasos pasan por una metilación que dará lugar a la formación de los ácidos grasos metilados (“Fatty Acid Methyl Ester” o FAME por sus siglas en inglés). Éstos serán analizados en un cromatógrafo de gas. Según Cavigelli et al, 1995, el valor del análisis de los ácidos grasos metilados (FAME) surge del hecho de que hay un gran número de diferentes clases de ácidos grasos en los lípidos de los microorganismos y esa diversidad de organismos provee diferentes combinaciones de éstos. Este trabajo fue realizado por medio de un acercamiento in situ de la distribución espacial de las comunidades microbianas del suelo y es parte del esfuerzo que se realiza para mejorar el entendimiento de los patrones, las causas, y las consecuencias de la diversidad microbiana en el suelo. Los perfiles de los ácidos grasos metilados fueron usados en el experimento por su habilidad única de caracterizar rápidamente toda la comunidad y por su costo relativamente bajo. En su trabajo se mostró que la interpretación de los perfiles de todo el suelo de la comunidad puede ser difícil porque muchos ácidos grasos son comunes en diferentes organismos y porque en las muestras del ambiente hay cientos de ácidos grasos diferentes. Al determinar la biomasa de una comunidad microbiana se provee un estimado de la cantidad de los microorganismos activos en un ambiente particular y la capacidad para transformaciones metabólicas en ese ambiente. La masa viable de una comunidad microbiana es determinada midiendo los componentes celulares que son comunes a todas las células de la microbiota y que se degradan rápidamente con la muerte de la célula. Una manera de medir la biomasa es a través de la extracción y análisis de los componentes de los fosfolípidos. Todas las células contienen en sus membranas fosfolípidos, los cuales no son almacenados, pero si transformados rápidamente durante

17 el metabolismo. La totalidad de los lípidos serán extraídos como se mencionó anteriormente. La biomasa de ciertos organismos de una comunidad microbiana puede ser estimada por la extracción de compuestos que son únicos en esos organismos, por ejemplo, la eubacteria en una muestra puede ser estimada midiendo la cantidad de ácido murámico. Éste puede ser extraído de la interfase residual de una extracción típica de lípidos y luego será purificada y analizada usando la cromatografía de gas. Un dato sobre este método es que el ácido murámico varía dramáticamente en las células de las bacterias gram positiva y gram negativa, al igual que en las cianobacterias. En el caso de los hongos, la biomasa de éstos puede ser estimada por medio del contenido de ergosterol (Buchan et al, 2003). Por otro lado, cuando se habla de la estructura de la comunidad se hace notar que la diversidad en la estructura de las comunidades microbianas presentes en el ambiente determinará cuando se llevarán a cabo ciertas transformaciones. Para estudiar la estructura de la comunidad microbiana es importante discriminar entre diferentes tipos de microorganismos. El análisis del contenido de los patrones PLFA (Análisis de ácidos grasos fosfolipídicos) proveerá significado a los resultados obtenidos. Muchas células tienen en sus membranas fosfolípidos que contienen ácidos grasos metilados. El análisis cuantitativo y cualitativo de la fracción de fosfolípidos para ácidos grasos puede revelar la presencia y abundancia de ciertos tipos de microorganismos bajo condiciones naturales. De esta manera proveerá un patrón de los microorganismos presentes en un momento en particular. La presencia de ciertos ácidos grasos de fosfolípidos podría servir de marcadores para ciertos tipos de microorganismos (Vestal y Wise, 1989) pero no puede determinar con certeza las especies.

18 Para el 1985 se reportó el desarrollo de una nueva técnica conocida como reacción en cadena de polimerasa (PCR por siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) por Kary Mullis y asociados, la cual amplió grandemente el poder de la investigación con el ADN recombinante e inclusive reemplazo algunos de los métodos que existían anteriormente (Bridge et al, 1998). Uno de los requisitos para muchas de las técnicas de ADN recombinante es la disponibilidad de grandes cantidades de un segmento específico de ADN. El PCR permite la amplificación directa de segmentos de ADN específicos sin clonación y puede utilizarse en fragmentos de ADN que estén presentes en cantidades muy pequeñas. Este método se basa en la amplificación de un segmento de ADN utilizando una polimerasa de ADN y cebadores oligonucleótidos que hibridizan con la cadena complementaria la secuencia a amplificar. En la investigación de Fierer et al, (2005), se describe un método cuantitativo de PCR para estimar la abundancia relativa de grupos taxonómicos de bacterias y hongos en el suelo. Los cebadores oligonucleótidos fueron probados para especificidad y el método fue aplicado a tres distintos suelos. Los resultados demostraron que la técnica provee un índice rápido y sólido de la estructura microbiana de la comunidad. El PCR comienza con ADN de cadena doble que contiene la secuencia que será amplificada y sitios complementarios para el par de iniciadores. Los iniciadores por lo general son de 20 nucleótidos de longitud y son hechos sintéticamente. El PCR se puede resumir en un ciclo de tres etapas fundamentales: (1) la cadena doble del ADN que se quiere amplificar se denaturaliza en cadenas sencillas calentando a 94-95°C por un tiempo aproximado de 5 minutos; (2) la solución se enfría y los iniciadores se hibridan al ADN de cadena sencilla a 37-65°C, se utilizan dos iniciadores distintos ya que cada uno

19 tiene la secuencia complementaria a una de las dos cadenas del ADN y se alinea con sus extremos 3’ encarados debido a que se hibridan a cadenas opuestas; (3) a la mezcla de la reacción se le añade una ADN polimerasa resistente al calor a 70-75°C, la cual se extiende en dirección 5’–3’ utilizando como modelo el ADN de la cadena sencilla unido al iniciador teniendo como producto una molécula de ADN de doble cadena con los cebadores incorporados en el producto final. Cada grupo de tres pasos se denomina ciclo. El proceso es automático, rápido y se realiza en un aparato de ciclos termales programado para realizar un número predeterminado de ciclos en un tiempo y temperatura dada. En el PCR, la cantidad del nuevo ADN generado aumenta geométricamente, comenzando con una molécula de ADN, en el primer ciclo se producen dos moléculas de ADN, en el segundo cuatro moléculas, en el tercero 8 moléculas y así sucesivamente (Russell, 2006; Klug & Cummings, 1999). En su libro Bridge et al, (1998), expone los principios y las aplicaciones de la técnica de PCR en una variedad de áreas diversas de la micología. Entre estas se encuentran genética de los hongos, ecología microbiana, patología de las plantas, micología medicinal y biotecnología de hongos. En conclusión, el PCR es una de las herramientas más abarcadoras en el estudio del campo de la microbiología. Por otra parte en su libro Osborn & Smith (2005), describen la técnica conocida como el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos terminales de restricción (TRFLP) del gen 16S rADN, también conocido como el análisis de restricción de rADN amplificado (ARDRA). Este análisis es conocido porque permite la fácil comparación del rADN de bacterias aisladas o bibliotecas de clones. Los productos de PCR son obtenidos usando los iniciadores cebadores universales 16S rADN y el producto es digerido con enzimas de restricción. Los productos del PCR 16S rADN de diferentes bacterias,

20 proveyéndoles el mismo iniciador, podrían mostrar sólo una variación limitada en la longitud. Sin embargo, los sitios de restricción se pueden encontrar en posiciones diferentes dentro de la secuencia 16S rADN de diferentes bacterias y de aquí se adhiere el producto del PCR en dos o más fragmentos de diferente longitud. El factor discriminante es la localización de los sitios de restricción dentro del 16S rADN, con secuencia específica y por lo tanto, potencialmente, un taxón específico. En investigaciones realizadas por Liu et al, (1997), se trabajó con la técnica de PCR en donde uno de los dos iniciadores usados era fluorescentemente marcado en el Terminal 5’ y fue usado para amplificar una región seleccionada del 16S rADN del ADN total de la comunidad. El producto de PCR fue digerido con enzimas de restricción y el fragmento de restricción terminal marcado fluorescentemente fue medido con precisión utilizando un analizador genético automático. Un análisis simulado de computadoras para polimorfismos de longitud de fragmentos terminales de restricción para 1,002 secuencias eubacterianas mostraron que con una selección adecuada de los iniciadores del PCR y de la enzima de restricción, 686 secuencias podrían ser amplificadas por PCR y clasificadas en 233 fragmentos de longitud de restricción terminal o ribotipos (Liu et al, 1997). Utilizando TRFLP, se fue capaz de distinguir todas las cadenas bacterianas en un modelo de comunidad bacteriana y el patrón fue consistente con la predicción. Los resultados demostraron que el TRFLP es una herramienta poderosa para determinar la diversidad de comunidades bacterianas complejas y para la comparación rápida de la estructura de la comunidad y la diversidad de diferentes ecosistemas.

21 En conclusión, seremos capaces de predecir el desarrollo de comunidades y manejar efectivamente los procesos que se dan en ellas, cuando comencemos a entender la complejidad de las interacciones bióticas en el suelo y en la hojarasca y la manera en que éstas afectan las comunidades de plantas. Podemos mencionar que el conocimiento detallado de los procesos ecológicos y las interrelaciones entre ellos, a escalas específicas de tiempo y espacio, es integral para el manejo de los ecosistemas. Se han desarrollado procedimientos analíticos sensitivos para el estudio cuantitativo de las comunidades naturales de microorganismos in situ. Aunque estos métodos no contestan todas las preguntas experimentales concernientes a las comunidades microbianas naturales, éstos proveen un conjunto de herramientas necesarias para estudiar los microorganismos ya que pueden proveer información cuantitativa del estatus y del papel de los componentes más importantes del ecosistema.

Capítulo Tres Metodología

Descripción del Lugar de Estudio El Bosque Experimental de Luquillo está ubicado en la parte noreste de Puerto Rico y comprende cuatro zonas de vida que resultan de los cambios en elevación, clima y características de suelo (Willig, 1996). El estudio se realizó en el bosque de tabonuco (Dacryodes excelsa) en la estación El Verde, la cual está localizada en una de las zonas de vida clasificada como bosque subtropical montano bajo húmedo (Figura 3.01). La temperatura promedio mensual es de 21˚C en enero a 25˚C en septiembre (Brown et al, 1983). La precipitación anual es poco cambiante (375.95 ± 79.47 cm) con valores bajos entre enero y abril (19.57 ± 23.71 cm) y valores altos (35.01 ± 45.99 cm) en los semanas restantes (Brown et al, 1983).

Diseño Experimental En esta área el “Luquillo Long Term Ecological Research” (Luq–LTER) estableció tres bloques (60 x 60 m) seleccionados de acuerdo a su similitud en pendiente, características de suelo, composición de especies y cobertura del dosel (Figura 3.02). Los bloques fueron divididos en cuatro parcelas (20 x 20 m), (Figura 3.03), sometidas a cuatro tratamientos (ver sección anterior).

22

23

El Yunque

Figura 3.01. Mapa del área este de Puerto Rico (Cortesía de la Junta de Planificación de Puerto Rico, 1996).

24

Bloque A 186

Bloque C

Estación del Verde

Bloque B

Figura 3.02. Mapa topográfico del área de estudio en la Estación de El Verde (Cortesía del Servicio Geológico de Estados Unidos, 1977).

25

N

#

#

# # ##

#

#

Bloque Block AA 340-360m 340-360m

#

W facing

## # # # ## ## ## #

# # #

##### # ## # ### ## ##

# # # ## # ## # # #### # ## #

### #

# # ## # # ##

## ##

## ##

#

Block C B Bloque 450-470m 450-470m W-NW facing

#

# # # # # # # ## # # # # # # # # ##

Block B Bloque C 450-470m 450-470m NW facing

Figura 3.03. Mapa del área de estudio en el Bosque Experimental de Luquillo, Estación El Verde mostrando los tres bloques y las parcelas por bloque (Cortesía de “Luquillo-Long Term Ecological Research”, 1998).

En cada parcela se seleccionaron cinco subparcelas y en cada una se colocaron seis canastas en donde se recolectó la hojarasca estudiada (Figura 3.04). Las canastas plásticas (35 x 25 cm) estuvieron descubiertas y su fondo fue reemplazado con una maya de nilón. Se cubrió el fondo de las canastas con una porción de la hojarasca sobre el suelo existente en cada subparcela. Luego se colocó una tela plástica de 1 mm en cada canasta para separar la hojarasca sobre el suelo de la capa de hojarasca fresca que se encontraba en el lugar. Nuevamente se colocó otra tela plástica para separar la capa de hojarasca

26 fresca de la capa de hojas verde. Es importante recordar que solo se añadió la capa de hojas verdes a la canasta en aquellos tratamientos donde hubo adición de detrito. Se colocó otra tela plástica en cada canasta para separar las hojas nuevas que van cayendo durante cada intervalo del muestreo, como se muestra en la Figura 3.05. Sin embargo, el tratamiento donde el dosel es podado y la biomasa es removida sólo tuvo canastas en cuatro de las cinco subparcelas de descomposición de hojarasca, en los bloque B y C.

Hojarasca de 44 a 55 semanas semanas semanas Hojarasca Nueva Hojarasca de 31 a 44 semanas Hojarasca de 17 a 31 semanas Hojarasca de 7 a 17 semanas Hojarasca caída de 0 a 7 semanas Hojas verdes Hojarasca Fresca Hojarasca sobre el suelo

Figura 3.04. Diagrama de la canasta de descomposición

27 Una canasta fue removida de cada subparcela durante los siguientes intervalos de tiempo 7, 17, 31, 44 y 55 semanas. En cada intervalo de muestreo se hizo una combinación de las muestras recolectadas de la misma cohorte que se encontraban en las cinco subparcelas para tener una muestra más representativa de la parcela. El experimento comenzó entre el 1 y el 10 de julio de 2005 y se extendió por un año.

Figura 3.05. Foto donde se ilustran las canastas de descomposición y la remoción de una de las canastas en el intervalo de las 31 semanas.

28 Procedimiento para la Colección y Manejo de la Muestra Las cinco muestras de cada parcela se mezclaron para tener una muestra representativa de ésta. Las muestras fueron colocadas en bolsas estériles y se transportaron en neveras portátiles para luego ser almacenadas en un refrigerador a -20˚C para evitar cambios en composición (Shutter and Dick, 2000). Las muestras se obtuvieron durante los meses de agosto, octubre, enero, abril y julio comenzando en el 2005 y terminando en el 2006. Extracción de ADN El ADN se extrajo directamente de la hojarasca utilizando “UltraClean Soil DNA Isolation Kit” (MoBio Laboratorios, Solana Beach, CA). Se tomó 0.3g de cada muestra y se siguió el protocolo indicado por el manufacturero para la extracción de ADN (Apéndice 2.01). Amplificación del ADN Se utilizó “Polymerase Chain Reaction” (PCR) con el propósito de amplificar segmentos específicos del ADN seleccionado. Se hizo un estimado de la concentración de ADN de acuerdo a la intensidad de la banda en el gel. La amplificación fue hecha utilizando la enzima “Red Taq DNA Polymerase” (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), los marcadores moleculares 16S rARN y la región interna que se transcribe (ITS) y los iniciadores oligonucleótidos que se utilizaron para las bacterias fueron el 27F-FAM y el 1525R, mientras que para los hongos se utilizaron el ITS1-FAM y el ITS4 (Apéndice 2.02).

29 Comparar Estructura de la Comunidad y Estimar Diversidad Para comparar la estructura y estimar la diversidad de las comunidades microbianas en estudio se utilizó la técnica TRFLP. Se utilizó esta técnica ya que es sensitiva e informativa para describir comunidades microbianas. Una vez obtenido el amplicón, se realizó la digestión de éste con enzimas de restricción específicas, las cuales cortarían el ADN en lugares característicos. En nuestro caso, las enzimas de restricción utilizadas fueron MnlI para bacterias y HaeIII para hongos. La digestión procedió a 37ºC por 2 horas. Cada producto de digestión se precipitó con alcohol para ser procesados en el Analizador Genético Automático ABI 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA; Apéndice 2.03). Se utilizó el estándar “Liz 500 size standard” (Applied Biosystem, Warrinton, UK). Análisis Estadístico Con los resultados obtenidos se preparó una matriz de 0 y 1, donde 0 representaba la ausencia de un filotipo y 1 la presencia del filotipo. Para comparar las comunidades se construyeron árboles filogenéticos utilizando PAUP 4.1b10 (Swofford, 2003). De esta manera se determinaron las diferencias entre las comunidades microbianas en la hojarasca en cada tratamiento y la temporada de muestreo. En adición, se realizó el análisis estadístico “Two-way ANOVA” del ADN y del número de picos obtenidos al aplicar la técnica de TRFLP para determinar si surgieron diferencias significativas en las comunidades de hongos y bacterias a través del tiempo y el tratamiento aplicado utilizando el programa MINI TAB (Versión 14). Para construir las gráficas en las que se presentan los resultados de nuestro estudio se utilizó el programa Microsoft Office Excel 2003.

Capítulo Cuatro Resultados

Introducción La meta del estudio fue determinar cómo la deposición de la hojarasca verde y la abertura del dosel en el bosque afectaban independientemente o en conjunto las comunidades microbianas (hongos y bacterias) presentes en la hojarasca. En otras palabras, se pretendía caracterizar y medir los cambios en la sucesión microbiana en la hojarasca luego del paso de un huracán. Con este propósito aplicamos cuatros tratamientos distintos a nuestras áreas de estudio (ver capítulo tres) y en base a dichos tratamientos se aplicaron diversas técnicas de análisis que nos permitieron obtener resultados de los muestreos realizados en los distintos intervalos de tiempo. Colección de Muestras Se recolectaron un total de 135 muestras. El desglose del número de muestras resultantes de acuerdo a los intervalos de tiempo establecidos en nuestro diseño experimental está contenido en la Tabla 4.01. A partir de las 31 semanas se observa una reducción en el número de muestras colectadas ya que se estuvo trabajando, exclusivamente, con las muestras de hojarasca fresca y las de hojas verdes.

30

31 Tabla 4.01. Muestras colectadas durante los diferentes tiempos de colección.

Tiempo de muestreo (semanas)

Número de muestras colectadas

7

17

31

44

55

39

42

18

18

18

Amplificación del ADN Al utilizar la técnica de PCR con el propósito de amplificar segmentos específicos del ADN seleccionado, se comenzó diluyendo 2 µl de la muestra pura del ADN en 18 µl de agua deionizada estéril. La amplificación del ADN fue lograda en 60 muestras (de un total de 78) a diversas concentraciones del ADN para bacterias, y en 68 muestras para hongos (Tabla 4.02). Se infiere la presencia de sustancias inhibidoras en algunas de las muestras a las que no se le pudo amplificar el ADN ya que se mezcló una cantidad de ADN de muestras que fueron positivas a PCR con muestras que habían dado negativo y el resultado fue negativo. No pudimos determinar que sustancia estaba inhibiendo la reacción en cadena de la polimerasa en dichas muestras. Los datos de la amplificación del ADN de cada muestra individual se presentan en el Apéndice 2.01.

32

Tabla 4.02. Amplificación de ADN para hongos y bacterias.

Tiempo

Número de

Amplificación de 16S rADN

Amplificación de ITS

de

muestras

(Bacterias)

(Hongos)

muestreo

colectadas Negativas

Dilución de

Negativas

Dilución de

(semanas)

ADN1

ADN1

10-1

10-2

10-1

10-2

72

39

17

42

12

13

17

10

24

8

31

18

6

4

8

0

1

17

442

18

55

18

0

17

1

0

18

0

1

En relación al ADN genómico total extraído

2

No se realizó PCR a las muestras de las 7 y las 44 semanas.

Los resultados de la Tabla 4.02 reflejan que a las 31 semanas la concentración del ADN de hongos aumentó en las muestras. Esto lo podemos deducir ya que durante este período hubo que diluir el ADN extraído en 17 de las 18 muestras que se obtuvieron hasta una concentración de 10-2 (2µl de ADN diluido 10-1 en 18 µl de agua deionizada

33 estéril) para obtener resultados positivos al PCR. Por otra parte, tanto para hongos como para bacterias, la concentración del ADN disminuyó a las 55 semanas ya que para las muestras de hongos que dieron positiva al PCR, el 100% (18 de 18) se encontraban a una concentración de 10-1 (2µl de ADN extraído en 18 µl de agua deionizada estéril) y en el caso de las muestras para bacterias, el 94% (17 de 18) se encontraban en una dilución de 10-1. El Apéndice 2.01 presenta los resultados individuales de la amplificación del ADN de cada muestra de acuerdo al periodo de muestreo y a la dilución a la que se encontraba la muestra cuando resultó positivo al PCR utilizando la ADN polimerasa RedTaq. Estos datos fueron resumidos en la Tabla 4.02. Los resultados obtenidos al calcular el promedio del ADN total (µg/ml) en los bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en las cohortes de hojarasca fresca (Tabla 4.03) y las hojas verdes (Tabla 4.04) se utilizaron para construir las gráficas en las que se compara el promedio del ADN total (µg/ml) en la hojarasca fresca (Figura 4.01) y en las hojas verdes (Figura 4.02) de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado.

34 Tabla 4.03. Promedio del ADN total (µg/ml) en los bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca.

Tratamiento

Tiempo

Promedio ADN1

(semanas)

(µg/ml)

Desviación Estándar

Control

7

126.50

99.64

No poda + detrito

7

84.77

0.06

Poda + No adición

7

151.77

227.47

Poda + Detrito

7

111.87

66.40

Control

17

34.17

39.99

No poda + Detrito

17

29.47

27.20

Poda + No adición

17

87.30

13.02

Poda + Detrito

17

85.03

23.34

Control

31

60.37

66.39

No poda + Detrito

31

93.13

17.25

Poda + No adición

31

90.93

47.30

Poda + Detrito

31

64.13

47.86

Control

44

26.83

9.29

No poda + Detrito

44

30.27

4.27

Poda + No adición

44

36.63

27.00

Poda + Detrito

44

29.27

12.69

Control

55

17.53

77.42

No Poda + Detrito

55

27.60

22.68

35 Poda + No adición

55

22.27

31.29

Poda + Detrito

55

20.00

31.29

1

El promedio se calculó en base a los datos obtenidos al utilizar el biofotómetro para

obtener la concentración del ADN total (µg/ml) en cada muestra individual (Apéndice 2.02, página 96). Por ejemplo, para calcular el promedio del ADN (µg/ml) en el intervalo de 17 semanas en el tratamiento control en la hojarasca fresca se utilizaron los datos obtenidos en ese intervalo para los tres bloques. En el bloque A la concentración del ADN total fue de 8.10 (µg/ml), en el bloque B fue de 30.50 (µg/ml) y en el bloque C fue de 63.90 (µg/ml). Se suman estos tres datos y se dividen entre el número de bloques, que son tres, y obtenemos que el ADN promedio en el intervalo de las 17 semanas para el grupo control en la hojarasca fresca fue de 34.17 (µg/ml). Este proceso se utilizó para completar la Tabla 4.03 y la Tabla 4.04.

36 Tabla 4.04. Promedio del ADN (µg/ml) en los Bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojas verdes.

Tratamiento

Tiempo

Promedio ADN

Desviación

(semanas)

(µg/ml)

Estándar

Poda + Detrito

7

140.75

162.28

No poda + Detrito

7

290.43

201.62

Poda + Detrito

17

57.40

28.99

No poda + Detrito

17

49.23

30.28

Poda + Detrito

31

38.07

17.82

No poda + Detrito

31

52.77

1.59

Poda + Detrito

44

28.37

12.87

No poda + Detrito

44

27.07

10.15

Poda + Detrito

55

15.43

1.79

No poda + Detrito

55

22.30

5.59

37 La información presentada en la Figura 4.01 muestra que la concentración de ADN total en la hojarasca fresca disminuye a las 17 semanas, pero aumenta nuevamente en las 31 semanas, excepto en el tratamiento en el que hubo poda y adición del detrito, el cual continuó disminuyendo hasta las 55 semanas. Este dato correlaciona los resultados obtenidos en la Tabla 4.02 para la comunidad de hongos, con respecto al aumento en la concentración de ADN presente en las muestras a las 31 semanas, ya que se puede observar que durante este intervalo de tiempo la concentración del ADN total (µg/ml) en la hojarasca fresca aumenta en tres de los tratamientos. En el caso de la cohorte de hojas verdes la concentración del ADN total va disminuyendo a través del tiempo, excepto en el tratamiento de no poda y adición del detrito, el cual tuvo un ligero aumento en la concentración de ADN, pero luego continuó su trayectoria descendente. En los períodos de las 44 semanas y las 55 semanas el ADN total (µg/ml) disminuye en todos los tratamientos, tanto para la hojarasca fresca (Figura 4.01) como para las hojas verdes (Figura 4.02).

38

H o ja r a s c a f r e s c a ( 7 s e m a n a s ) 160 120

A D N to t a l (µ g /m l)

80 40

1

0

D e t r ito

0

1

0

Poda

H o ja r a s c a f r e s c a (1 7 s e m a n a s ) 160 120

A D N to ta l (µ g /m l)

80 40

1

0

D e t r it o

0 1

0

Poda H o ja r a s c a f r e s c a ( 3 1 s e m a n a s ) 160 120

A D N t o ta l ( µ g /m l)

80 40 0

1

D e t r it o

0 1

0

Poda H o ja r a s c a f r e s c a ( 4 4 s e m a n a s ) 160 120

A D N to ta l ( µ g /m l)

80 40

1

0

D e t r ito

0 1

0

Poda H o j a r a s c a f r e s c a (5 5 s e m a n a s ) 160 120

A D N to ta l ( µ g /m l)

80 40

1

0

0 1

D e t r ito

0

Poda

Figura 4.01 Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) en la hojarasca fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado. O = no poda o no adición de detrito, 1 = poda o adición de detrito.

39

300 250 200 ADN total (µg/ml)

Poda + Detrito

150

No poda + Detrito

100 50 0 7

17

31

Tratamiento 44

55

Tiempo (semanas)

Figura 4.02. Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) en las hojas verdes de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado.

40 Tabla 4.05. Resultados del análisis estadístico “Two Way ANOVA” del ADN (µg/ml) versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca.

P Recurso

Hojas verdes

P Hojarasca fresca

Tratamiento

0.623

0.247

Tiempo (meses)

0.020

0.001

Interacción

0.577

0.265

Los resultados del análisis estadístico ANOVA muestran que hubo una diferencia significativa en la concentración de ADN total (µg/ml) versus el tiempo que se tomó la muestra, tanto en la hojas verdes (P=0.020) como en la hojarasca fresca (P=0.001). Esta diferencia significativa no fue observada en el ADN total (µg/ml) versus el tratamiento aplicado en ambos cohortes (Tabla 4.05). Los resultados del análisis estadístico ANOVA confirman los resultados obtenidos al calcular el ADN total y al realizar el PCR en relación a que la concentración de ADN total cambió a través del tiempo.

41 Comparación de la Estructura de la Comunidad y Estimar Diversidad De acuerdo al TRFLP de la región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI, el número de filotipos en las comunidades bacterianas de la hojarasca fresca en el tratamiento en que hubo poda y adición del detrito disminuyó durante el período de las 31 semanas, pero posteriormente aumentó a las 55 semanas (Figura 4.03.A-C). Por otra parte, considerando el TRFLP de la región ITS de hongos con la enzima de restricción HaeIII, se pudo observar que el número de filotipos en las comunidades de hongos se mantuvo muy similar en las 17 y 31 semanas, pero disminuyó a las 55 semanas para el mismo tratamiento (Figura 4.03.D-F). Si comparamos la composición de las comunidades de bacterias y hongos presentes en la hojarasca fresca en el intervalo de las 31 semanas, podemos observar que el número de filotipos de las comunidades de hongos fue mayor en todos los tratamientos. Este marcado aumento en el número de filotipos en las comunidades de hongos corrobora el aumento que hubo en el ADN total (µg/ml) que se encontró a las 31 semanas (Figura 4.01) y los encontrados en la amplificación del ADN para hongos (Tabla 4.02). En el tratamiento donde hubo poda, sin adición del detrito, el número de filotipos en las comunidades bacterianas fue disminuyendo desde las 17 semanas a las 31 semanas y en las 55 semanas no se obtuvo resultado alguno. Este resultado pudo ser causado por la falta de incorporar una fuente de material orgánico que promoviera el desarrollo de microorganismos y por el aumento en la radiación solar. En el caso de las comunidades de hongos se encontró que el número de filotipos en éstas se mantuvo bastante uniforme en los tratamientos aplicados entre las 17 y 31 semanas, ocurriendo una disminución en el

42 intervalo de las 55 semanas. En el caso de las comunidades de hongos, el tratamiento que presentó una mayor disminución en el número de filotipos a través del tiempo fue el de poda y adición del detrito. La Figura 4.04 muestra una relación o tendencia directa entre el número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos cuando se aplicó el tratamiento de poda del dosel sin adición del detrito en la hojarasca fresca durante los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas (R2=0.8304). La relación muestra una tendencia en la que si los hongos disminuían, las bacterias también lo hacían. En la Figura 4.05 no se pudo observar una relación o tendencia entre el número de filotipos de bacterias versus los de hongos cuando se aplicó el tratamiento control durante los mismos intervalos de tiempo (R2=0.3271). La Figura 4.06 muestra que al aplicar el tratamiento de no poda del dosel más adición del detrito se pudo observar una relación directa entre el número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas (R2=0.7272). La relación muestra una tendencia en la cual cuando los hongos disminuían, las bacterias también lo hacían. En el caso del tratamiento de poda del dosel más adición del detrito (Figura 4.07) se pudo observar una relación inversa entre el número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en la hojarasca fresca durante los mismos intervalos de tiempo (R2=0.9159). La relación mostró una tendencia en la cual al aumentar los hongos disminuían las bacterias o por el contrario, cuando disminuían los hongos las bacterias aumentaban.

43

A

D

Hojarasca fresca (17 semanas) 100 80 Número de 60 filotipos de 40 bacterias 20 0

100 80 Número de 60 filotipos de 40 hongos 20 0

1 Detrito

0 1

0

E

80 60 40 20 0

1 Detrito

0 0

F

1 0 1

Poda

0

Detrito

0

Poda

Hojarasca fresca (55 semanas) 100 80 Número de 60 filotipos de 40 bacterias 20 0

1 0 1

Poda C

Hojarasca fresca (31 semanas) 100 80 Número de 60 filotipos de 40 hongos 20 0

100

1

Detrito

0

Poda

Hojarasca fresca (31 semanas)

Número de filotipos de bacterias

1 0 1

Poda

B A

Hojarasca fresca (17 semanas)

Detrito

Hojarasca fresca (55 semanas) 100 80 0 Número de 60 42.5 filotipos de 40 44 hongos 20 0

1 0 1

Detrito

0

Poda

Figura 4.03. Número de filotipos de bacterias (A-C) encontrada en la cohorte de hojarasca fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de la región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI. Número de filotipos de hongos (D-F) encontrada en la cohorte de hojarasca fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de la región ITS de hongos con la enzima de restricción HaeIII. O = no poda o no adición de detrito, 1 = poda o adición de detrito.

Número de filotipos de hongos

44

70 60 17 S

50

31 S

55 S

40 30

y = 0.2385x + 38.211 R2 = 0.8304

20 10 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Número de filotipos de bacterias

Figura 4.04. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento poda del dosel sin adición del detrito en la hojarasca fresca

Número de filotipos de hongos

en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.

70 60

31 S

50 55 S

40 17 S

30

y = 0.7092x + 15.061 R2 = 0.3271

20 10 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Número de filotipos de bacterias

Figura 4.05. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento control en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.

Número de filotipos de hongos

45

70 17 S

31 S

60 50 55 S

40 30

y = 1.6646x - 10.139 R2 = 0.7272

20 10 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Número de filotipos de bacterias

Figura 4.06. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento de no poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca

Número de filotipos de hongos

fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.

70 31 S

60 50

17 S

40

55 S

30

y = -0.6391x + 72.882 R2 = 0.9159

20 10 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Número de filotipos de bacterias

Figura 4.07. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en el tratamiento de poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.

46 Tabla 4.06. Datos utilizados para determinar la relación entre la razón del número de picos de hongos y el número de picos de bacterias versus el por ciento de humedad de acuerdo al tratamiento aplicado en la cohorte de hojarasca fresca.

Tratamiento

Número de filotipos de hongos

Número de filotipos

Razón1 % de humedad

de bacterias

Control

38

34

1.12

69.70

Control

59

48

1.22

81.20

Control

42

50

0.85

83.30

No poda + detrito

63

45

1.40

77.86

No poda + detrito

59

38

1.55

82.43

No poda + detrito

44

35

1.26

82.93

Poda - detrito

49

40

1.24

56.07

Poda - detrito

41

22

1.86

74.68

Poda - detrito

39

0

0

73.62

Poda + detrito

49

46

1.08

73.00

Poda + detrito

57

21

2.70

79.06

Poda + detrito

27

68

0.40

78.30

1

La razón se obtuvo al dividir el número de filotipos de hongos versus el de bacterias.

47

R azón del núm ero de filotipos de hongos entre el núm ero de filotipos de bacterias

3 2.5 Tratamiento Poda - detrito Poda + detrito No poda + detrito Control

2 1.5 1 0.5 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% de humedad

Figura 4.08. Razón del número de filotipos de hongos entre el número de filotipos de bacterias versus el por ciento de humedad encontrada en la hojarasca fresca de acuerdo al tratamiento aplicado en los intervalo de las 17, 31 y 55 semanas.

Los datos presentados en la Tabla 4.06 fueron utilizados para determinar la relación entre la razón del número de picos de hongos y el número de picos de bacterias versus el por ciento de humedad de acuerdo al tratamiento aplicado en la cohorte de hojarasca fresca mostrada en la Figura 4.08. De esta figura se puede concluir que al aumentar el por ciento de humedad se promovió el desarrollo de hongos, especialmente en el tratamiento de no poda más adición del detrito.

48 Los resultados obtenidos del TRFLP de la región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI en las hojas verdes mostraron que en el tratamiento de no poda más adición del detrito hubo un mayor número de filotipos a medida que transcurrió el tiempo (Figura 4.09.A). En el caso del tratamiento en el que hubo poda y adición del detrito se pudo observar una leve disminución en el número de filotipos de bacterias en el intervalo de las 31 semanas, seguida de un aumento de éstos en el intervalo de las 55 semanas. En la Figura 4.09.B se muestra que en el tratamiento de no poda más detrito el número de filotipos de hongos fue mayor en el periodo de las 17 y 31 semanas y que en las 55 semanas éstos disminuyeron. En el caso del tratamiento de poda más detrito, se observó un ligero aumento en el número de filotipos en la comunidad de hongos a las 31 semanas, seguido por una leve disminución en el intervalo de las 55 semanas. (Resultados basados en el TRFLP de la región ITS de hongos con la enzima de restricción HaeIII). Hay que señalar que cuando se compara el número de filotipos bacterianos versus el número de filotipos de hongos se observa una tendencia inversa en el comportamiento de éstos. El número de filotipos en las bacterias aumenta a través del tiempo, pero en el caso de los hongos, el número de filotipos disminuye a través del tiempo. Este resultado es más evidente en el tratamiento de no poda más detrito. Una vez los hongos actúan degradando el sustrato (compuestos recalcitrantes) las bacterias aumentan ya que tienen los nutrientes necesarios para colonizar el sustrato (compuestos lábiles). Este resultado es observado en las hojarasca fresca, Figura 4.03 y en las hojas verdes, Figura 4.09.

49

A

100 80

Número de filotipos de bacterias

60 40

Poda + Detrito No poda + Detrito

20 0 17

31

55

Tiempo (semanas)

B

100 80

Número de filotipos de hongos

60 40

Poda + Detrito No poda + detrito

20 0 17

31

55

Tiempo (semanas)

Figura 4.09. A representa el número de filotipos de bacterias encontrados en la cohorte de hojas verdes de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de la región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI. B representa el número de filotipos de hongos encontrados en la cohorte de hojas verdes de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de la región ITS de hongos con la enzima de restricción HaeIII.

50 Tabla 4.07. Resultados del análisis estadístico “Two-Way ANOVA” del número de picos obtenidos al aplicar la técnica TRFLP en hongos versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca.

P Recurso

Hojas verdes

P Hojarasca fresca

Tratamiento

0.114

0.916

Tiempo (semanas)

0.025

0.054

Interacción

0.073

0.917

Los resultados del análisis estadístico ANOVA (Tabla 4.07) muestran que hubo una diferencia significativa en el número de filotipos de hongos versus el tiempo de muestreo en las hojas verdes (P=0.025) y en la hojarasca fresca (P=0.054). Por otra parte, el análisis mostró que no hubo una diferencia significativa en el número de filotipos de hongos versus el tratamiento aplicado, tanto en las hojas verdes (P=0.114), como en la hojarasca fresca (P=0.916). En el caso de las comunidades de bacterias, los resultados obtenidos del análisis estadístico ANOVA muestran que no hubo diferencias significativas en el número de filotipos de bacterias versus el tiempo y el tratamiento aplicado, tanto en las hojas verdes, como en la hojarasca fresca (Tabla 4.08).

51 Tabla 4.08. Resultados del análisis estadístico “Two Way ANOVA” del número de picos obtenidos al aplicar la técnica TRFLP en bacterias versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca.

Recurso

P

P

Hojas verdes

Hojarasca fresca

Tratamiento

0.233

0.508

Tiempo (semanas)

0.299

0.973

Interacción

0.601

0.567

52 Tabla 4.09. Por ciento (%) de masa remanente en los Bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca.

Tratamiento

Tiempo

% de Masa Remanente

(semanas)

Desviación Estándar

Control

17

59.00

5.67

No poda + Detrito

17

57.20

7.46

Poda + No adición

17

61.30

8.64

Poda + Detrito

17

62.30

7.43

Control

31

46.97

1.59

No poda + Detrito

31

43.47

5.27

Poda + No adición

31

49.60

4.65

Poda + Detrito

31

49.30

3.89

Control

55

35.00

1.16

No poda + Detrito

55

34.00

2.42

Poda + No adición

55

45.30

4.28

Poda + Detrito

55

25.90

5.11

53

Hojarasca fresca (17 semanas)

A 100 80 ADN total 60 (µg/ml) 40 20 0

D

Hojarasca fresca (17 semanas) 60

% de masa remanente 1

Detrito

0 1

50 40 30 20 1

0

Hojarasca fresca (31 semanas) 100 80 ADN total 60 (µg/ml) 40 20 0

E % de masa remanente

1

Detrito

0 1

Hojarasca fresca (31 semanas) 60 50 40 30 20

1

0

Detrito

0 1

0

Poda

Poda

C

Detrito

0

Poda

Poda

B

1 0

Hojarasca fresca (55 semanas) 100 80 ADN total 60 (µg/ml) 40 20 0

F

Hojarasca fresca (55 semanas) 60

% de masa remanente 1 0 1

Poda

Detrito

50 40 30 20

1 0 1

0

Detrito

0

Poda

Figura 4.10. A-C representa el ADN total extraído de 0.3 g de hojarasca fresca en las 17, 31 y 55 semanas. D-F representa el por ciento de masa remanente en la hojarasca fresca en las 17, 31 y 55 semanas. O = no poda o no adición de detrito, 1 = poda o adición de detrito.

54 En investigaciones realizadas por la Dra. Jean Lodge en la misma área de estudio, ésta encontró que el por ciento de masa remanente en la hojarasca fresca fue muy uniforme en todos los tratamientos en el intervalo de las 17 semanas (Lodge, datos no publicados) (Tabla 4.09). Al comenzar nuestra investigación la Dra. Lodge buscó la masa de las capas de hojarasca sobre el suelo, la de la hojarasca fresca y la de las hojas verdes (en los tratamientos que hubo adición de detrito) que fueron colocadas en todas las canasta como se explica en la Figura 3.04. El por ciento de masa remanente se calculó luego de haber retirado los 2 gramos que fueron utilizados para realizar el análisis microbiano. Después de haber retirado los 2 gramos de cada muestra se procedió a buscar la masa de éstas con el propósito de calcular el por ciento de masa remanente. Finalmente, el por ciento de masa remanente se calculó utilizando los datos que se obtuvieron al comenzar la investigación para la masa de cada muestra y los que se obtuvieron después de cada muestreo. Si comparamos estos resultados con los obtenidos al calcular la concentración de ADN total en nuestra investigación en el intervalo de las 17 semanas veremos que la concentración de ADN total disminuyó drásticamente en los tratamientos donde no hubo poda. En el intervalo de las 31 semanas el por ciento de masa remanente disminuyó, pero se mantuvo uniforme entre los tratamientos (Figura 4.10). Por otra parte, en relación a la concentración de ADN total durante este intervalo de tiempo, se pudo observar un marcado aumento en la concentración de ADN en los tratamientos donde no hubo poda y una reducción en la concentración de ADN en el tratamiento en donde hubo poda y adición del detrito. Durante las 55 semanas el por ciento de masa remanente se mantuvo muy similar al de las 31 semanas en el tratamiento en el cual hubo poda y no adición del detrito. En el resto de los tratamientos hubo una marcada reducción

55 en el por ciento de masa remanente, en especial, en el tratamiento en el cual hubo poda y adición del detrito. En relación a la concentración de ADN total en el intervalo de las 55 semanas, se pudo observar una reducción drástica de ésta en todos los tratamientos. En términos de la estructura de las comunidades microbianas presentes en nuestras áreas de estudio, los resultados presentados en el cladograma (Figura 4.11) indican que en la estructura de la comunidad de bacterias, hay un aparente agrupamiento de éstas basado en el tratamiento donde hubo poda del dosel o donde no hubo poda y por el tiempo. Este resultado se puede observar en los clados señalados con las letras A, B y C cuando se agruparon en base al tratamiento y D para las que se agruparon en base al tiempo (Figura 4.11.A). Por otro lado, en la estructura de la comunidad de los hongos se observa que éstos se agruparon de acuerdo a los tratamientos en los cuales hubo adición o no adición del detrito, por el tipo de cohorte de hojas y por el tiempo. Este dato se observa en los clados señalados con las letras E, F y G cuando se agruparon en base a los tratamientos e I para los que se agruparon en base al tiempo (Figura 4.11. B).

56

HN 17 s

HF 17

s

HF 31

s

HF 55

s

HF 31

s

HF 55

s

F

HV 55 s

A

HV 17 s

E

HF 55 s HV 31 s HV 55 s HF 17 s

s HF 17

HF 17 s HV 17 s

s

HF 17 s

B

HN 17 s

HF 31 s

HF 55 s

HN 17 s

s

HN 17 s

HF 55 s HF 31 s

G

HF 55 s

HV 17 s

C

I

s HN 17 s

HV 31 s

s HN 17 s

HF 31 s

s HF 17

HV 31s

HF 17 s HV 55

HV 55

HF 31

s

HF 55 s

s

s

HF 31 s

s

HV 17 s

D

H

HV 31 s HF 31

s

HF 31

HN 17 s

s s

B

A Control

No poda + detrito

Poda + detrito

Poda + no detrito

Figura 4.11. Cladograma del TRFLP de las combinaciones de las muestras que dieron positivo al PCR mostrando la estructura de la comunidad de bacterias (A) y hongos (B) presentes en diferentes cohortes de hojas y en los tratamientos. Las siglas HF señalan la hojarasca fresca; HN señala la hojarasca nueva y HV representa las hojas verdes. La letra S representa la unidad de tiempo en semana.

57 A partir de la selección de varias muestras a las que se les aplicó la técnica de TRFLP, se obtuvo el mapa genético de los distintos filotipos que las conformaban. La Figura 4.12 muestra el número de filotipos presentes en la comunidad bacteriana cuando se aplica el tratamiento control en la cohorte de hojarasca fresca. La composición de la comunidad bacteriana se observa diferente y cambia a partir de las 17 semanas, pero no se observa una diferencia significativa entre las comunidades en los intervalos de las 31 y 55 semanas. Este dato puede ser señalado con el filotipo marcado con la letra A, el cual surge en el intervalo de las 31 semanas y perdura hasta las 55 semanas, pero no se encuentra en la comunidad de bacterias presente a las 17 semanas. En el caso de la comunidad de hongos para la misma cohorte y tratamiento se encontró que hubo una diferencia significativa en la riqueza de filotipos que se obtuvieron. La composición de la comunidad de hongos cambia a través del tiempo, este dato se puede corroborar al observar la Figura 4.13. En el intervalo de las 31 semanas no se observan filotipos que estuvieran presentes a las 17 semanas, por ejemplo, los filotipos señalados con las letras A y B. Por otra parte, en las 31 semanas surgen filotipos que no estaban presentes en las 17 semanas, como los filotipos señalados con las letras C, D y E. En el intervalo de las 55 semanas se observan filotipos que no estaban presentes en las 17 y 31 semanas, por ejemplo, los filotipos señalados con las letras F y G. Es importante recordar que en el tratamiento control no hubo poda ni adición de detrito, pero a pesar de este hecho la composición de las comunidades de bacterias y de hongos cambiaron a través del tiempo. Este dato nos muestra que hubo un efecto de temporalidad en los resultados obtenidos que pudo haber surgido por la disponibilidad de nutrientes en cada intervalo de muestreo.

58

17 semanas

U n i d a d e s

31 semanas

d e f l u o r e s c e n c i a

A

55 semanas

A

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.12. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento control a través del tiempo (17, 31 y 55 semanas). La letra A representa filotipo que se repite en la comunidad de bacterias a las 17 y 55 semanas. Las letras pb representan los pares de bases.

59

17 semanas

U n i d a d e 31 semanas s d e f l u o r e s c e n c i a

A

B

C

D

E

55 semanas

F

G

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.13. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento control a través del tiempo (17, 31 y 55 semanas). Las letras A, B, C, D, E, F y G representan filotipos presentes en la comunidad de hongos a través del tiempo.

60 Si comparamos los resultados presentados en la Figura 4.12 con los que se muestran en la Figura 4.13 podemos concluir que hubo una mayor variabilidad en la composición de la comunidad de hongos en la cohorte de hojarasca fresca versus la de bacterias a través del tiempo cuando se aplicó el tratamiento control. Estos resultados coinciden con los encontrados en la técnica de análisis ANOVA (Tablas 4.07 y Tabla 4.08). La Figura 4.14 muestra el perfil de TRFLP de las muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas. Se puede observar que aún dentro de la misma canasta la composición de la comunidad bacteriana cambia. Aunque cabe señalar que hay filotipos que se mantienen en todas las cohortes de la canasta, por ejemplo, el filotipo señalado con la letra A. Por otra parte, hay filotipos que se mantuvieron en algunas cohortes, pero no se mostraban en el resto de éstas. Por ejemplo, el filotipo señalado con la letra B se presenta en las cohortes de hojarasca sobre el suelo y la de hojas verdes, pero no se presenta en la hojarasca fresca y en las hojas nuevas. Si comparamos la composición de la comunidad bacteriana en el intervalo de las 17 semanas con la composición de esta misma comunidad en el intervalo de las 55 semanas (Figura 4.15) podremos observar como ésta cambia a través del tiempo. Hay que señalar que en esta figura hay filotipos que permanecen presentes en ambos cohortes, por ejemplo, el filotipo señalado con la letra A. En la Figura 4.15 se muestran únicamente las cohortes de hojarasca fresca y hojas verdes ya que se trabajó exclusivamente con estas cohortes a partir de las 31 semanas. Al observar la Figura 4.15 se puede constatar que los filotipos señalados con las letras A y B en la Figura 4.14 no

61 están presentes en ésta a pesar de que se encuentran en la misma canasta y se les aplicó el mismo tratamiento. Este resultado evidencia que la composición de la comunidad bacteriana presentó un cambio más pronunciado a través del tiempo versus el que ocurrió dentro de la misma canasta durante el mismo intervalo de tiempo. La Figura 4.16 muestra como la composición de la comunidad de hongos cambió en las diferentes cohortes que se encontraba dentro de la misma canasta del bloque A y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas. Se observa una gran variedad en los filotipos presentes en las distintas cohortes (por ejemplo, ver los filotipos contenidos en la figura señalada con la letra A), pero cabe señalar que en esta figura hay filotipos que se presentan en más de una cohorte, por ejemplo, los filotipos señalados con las letras B y C. Cuando se compara la composición de las comunidades de hongos en la cohorte de hojas verdes y hojas frescas en el intervalo de las 55 semanas con la de las 17 semanas se puede observar como la composición y la riqueza de los filotipos de esta comunidad cambia a través del tiempo (Figura 4.17). Se puede indicar que el cambio en la composición de la comunidad de hongos fue más pronunciada y evidente que en la de la comunidad de bacterias (Figura 4.14 y Figura 4.15).

62

U n i d a d e s

Hojas nuevas

d e

B

f l u o r e s c e n c i a

A

Hojas verdes

A

Hojarasca fresca

A

Hojarasca sobre el suelo

B

A

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.14. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas.

63

U n i d a d e s

Hojas verdes

A

d e f l u o r e s c e n c i a

Hojarasca fresca

A

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.15. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.

64

U Hojas nuevas n i d a d e Hojas verdes s B

d e f l u o r e s c e n c i a

A Hojarasca fresca

C

Hojarasca sobre el suelo

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.16. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas. La letra A representa un filotipo señalado.

65

U Hojas verdes n i d a d e s

A

d e f l u o r e s c e n c i a

Hojarasca fresca A

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.17. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.

66 En las Figuras 4.18 y 4.19 se continua observando el mismo patrón en relación a los cambios que ocurrieron en la composición de la comunidad bacteriana en los intervalos de las 17 y 55 semanas cuando se trabajó con las muestras de las distintas cohortes dentro de una misma canasta, pero en este caso se aplicó el tratamiento de poda más adición del detrito. En el caso de la comunidad de bacterias se observa como cambia la composición de ésta en las distintas cohortes. Por ejemplo, los filotipos delimitados por la figura señalada con la letra A muestran como varia la composición de la comunidad cuando pasamos al intervalo de las 55 semanas. En el intervalo de las 55 semanas (Figura 4.19) no se observan los filotipos que estaban presentes en la Figura 4.18. Nuevamente se muestra un efecto de temporalidad ya que aún dentro de la misma canasta se pudo observar como la composición de la comunidad bacteriana cambia a través del tiempo. En la Figura 4.20 se observa una disminución drástica en el número de filotipos en la cohorte de hojarasca sobre el suelo cuando se aplica el tratamiento de poda más adición del detrito en el intervalo de las 17 semanas. Se muestra una diferencia significativa en la composición de la comunidad de hongos en la hojarasca sobre el suelo versus la cohorte de hojarasca fresca y la de hojas nuevas. A pesar de este hecho, se encontraron filotipos comunes en la cohorte de hojarasca sobre el suelo y la de hojarasca fresca, por ejemplo, el filotipo señalado con la letra A. La composición de la comunidad de hongos en la cohorte de hojarasca fresca y la cohorte de hojas nuevas presenta un mayor número y riqueza de filotipos. Por ejemplo, los filotipos señalados con las letras B y C. En la Figura 4.21 se observa como la composición de la comunidad de hongos presente en la Figura 4.20 en el intervalo de las 17 semanas cambió en el intervalo de las 55 semanas.

67

Hojas nuevas

U n i d a d e s

Hojarasca fresca

d e A

f l u o r e s c e n c i a

Hojarasca sobre el suelo

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.18. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas.

68

Hojas verdes

U n i d a d e s

A

d e f l u o r e s c e n c i a

Hojarasca fresca

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.19. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.

69 Para poder comparar la composición de la comunidad de hongos en ambas figuras tenemos que referirnos a la cohorte de hojarasca fresca. En base a este hecho podemos decir que surgieron cambios en la composición de la comunidad de hongos en la hojarasca fresca a través del tiempo ya que en el intervalo de las 55 semanas surgieron filotipos que no estuvieron presente en las 17 semanas. Por ejemplo, los filotipos contenido en las figuras señaladas con las letras A y D. Por otra parte, hay que indicar que los filotipos señalados en el perfil de la hojarasca fresca con las letras B y C en el intervalo de las 17 semanas (Figura 4.20) continúan presentándose en el intervalo de las 55 semanas, no solo en la hojarasca fresca, sino que también se presentan en las hojas verdes. Esto nos puede indicar que parte de la comunidad de hongos originales se está restableciendo en el intervalo de un año o que éstos han logrado adaptarse y subsistir a través del tiempo. La Figura 4.22 presenta muestras de la cohorte de hojarasca fresca y del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el intervalo de las 55 semanas. Hay que señalar la presencia de un mayor número de filotipos en aquellos tratamiento en donde no hubo poda versus los tratamientos en que sí hubo poda. Podríamos inferir que la composición de la comunidad de bacterias no se restablece completamente de los efectos de un huracán o que ésta cambia en un período de 55 semanas, aunque estén dentro del mismo bloque. En el caso de la composición de la comunidad de hongos para el mismo tratamiento e intervalo de tiempo, se observó una disminución en el número de filotipos presentes en todos los tratamientos dentro del mismo bloque (Figura 4.23).

70

Hojas nuevas

U n i d a d e s d e

C

B

Hojarasca fresca C

f l u o r e s c e n c i a

B A

Hojarasca sobre el suelo

A

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.20. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas.

71

Hojas verdes

U n i d a d e s

C

B

d e f l u o r e s c e n c i a

Hojarasca fresca C

B D A

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.21. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.

72 Hay que señalar que aunque se observó una reducción en el número de filotipos presentes en la comunidad de hongos durante este intervalo de tiempo hubo filotipos que se encontraron en prácticamente todos los tratamientos, excepto en el tratamiento control. Este es el caso del filotipo señalado con la letra A. Si comparamos la composición de la comunidad de bacterias (Figura 4.22) con la de la comunidad de hongos (Figura 4.23) podríamos concluir que en el intervalo de las 55 semanas el número de filotipos presentes en todos los tratamientos fue mayor para la comunidad de bacterias, especialmente en los tratamientos donde no hubo poda. En resumen, podemos decir que los resultados de los distintos análisis microbianos mostraron, al aplicar los diferentes tratamientos en nuestra área de estudio, que hubo cambios en la sucesión microbiana a través del tiempo, especialmente en el caso de los hongos. Los resultados obtenidos del TRFLP para la región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI y el TRFLP de la región ITS de hongos con la enzima de restricción HaeIII corroboran lo anteriormente expuesto ya que cuando se aplicó el análisis estadístico ANOVA a estos resultados se encontró que hubo una diferencia significativa en el número de filotipos de hongos a través del tiempo. En el caso de las bacterias hubo cambios en el número de filotipos a través del tiempo, pero la diferencia no fue significativa. Otro aspecto importante fue que los electroferogramas mostraron que, en el caso de los hongos en la hojarasca fresca, hubo un mayor número de filotipos en los tratamientos donde no hubo poda o en los que hubo adición del detrito. En adición, se pudo observar que había variedad de filotipos en las cohortes que se encontraban dentro de una misma canasta del mismo bloque y durante el mismo intervalo de tiempo.

73

U n i d a d e s

Control

No poda + detrito

d e f l u o r e s c e n c i a

Poda - detrito

Poda + detrito

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.22. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el intervalo de las 55 semanas.

74

U n i d a d e s

Control

No poda + detrito

d e f l u o r e s c e n c i a

A

Poda - detrito

A

Poda + detrito

A

Longitud de fragmento terminal (pb)

Figura 4.23. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el intervalo de las 55 semanas.

75 En relación al número de filotipos obtenidos del TRFLP para la comunidad de hongos en la hojarasca fresca podemos decir que hubo un mayor número de filotipos de hongos en prácticamente todos los tratamientos en los intervalos de las 17 y 31 semanas. En términos de las hojas verdes se observó que hubo un mayor número de filotipos de bacterias en el tratamiento de no poda más detrito durante el intervalo de las 55 semanas, mientras que para los hongos el número de filotipos fue mayor en los intervalos de las 17 y 31 semanas. Este dato puede sugerirnos que en los hojas verdes la comunidad de bacterias empieza a recuperarse de los efectos de un disturbio en aproximadamente un año. Se observó una tendencia en la cual después que la comunidad de hongos actuaba descomponiendo la materia orgánica se podía observar un aumento en la comunidad de bacterias, es decir, cuando los hongos aumentaban las bacterias disminuían o por el contrario, cuando los hongos disminuían las bacterias aumentaban.

Capítulo Cinco Discusión

El estudio pretendía medir los cambios en la estructura microbiana en respuesta a los diferentes tratamientos y sus efectos relativos en los organismos presentes en la sucesión de descomposición del material orgánico. Los objetivos del estudio incluían analizar la composición y estructura de las comunidades microbianas en la hojarasca por medio de la técnica de TRFLP, determinar si hubo alguna diferencia significativa entre las áreas de estudio y diferentes niveles de descomposición de la hojarasca y determinar organismos presentes en la sucesión en la hojarasca. La actividad microbiana es responsable de una gran parte de la descomposición. Los diferentes grupos de descomponedores microbianos se han adaptado a degradar diversos tipos de recursos y, en adición, se han adaptado a diferentes condiciones ambientales, dirigiendo la sucesión de la comunidad microbiana al descomponer la hojarasca (Lodge, 1996). Los compuestos lábiles son degradados, en primer lugar, por las bacterias de crecimiento rápido y por los hongos azúcares, mientras que los recursos recalcitrantes (ej. lignina) pueden ser descompuestos más tarde, primeramente por hongos, especialmente por basidiomicetos de producción blanca que utilizan las bandas de las hifas para colonizar nuevos recursos y para importar nutrientes de su fuente de alimentos previa (Miller and Lodge, 1997). La degradación de la lignocelulosa por los hongos de producción blanca provee variedad en los recursos adicionales que son descompuestos por otros microbios, dirigiendo los nuevos cambios de la comunidad microbiana. Los disturbios que ocasionan la apertura del dosel y depositan el detrito,

76

77 tanto de actividades naturales (ej. huracanes) como antropogénicas (ej. esparcimiento) pueden afectar significativamente las comunidades de descomponedores microbianos y la tasa de descomposición, a través de sus efectos en el ambiente del suelo del bosque y la calidad de la hojarasca (Miller and Lodge, 1997). En términos de la concentración de ADN total se establece que no hubo una diferencia significativa de éste entre los bloques, tratamientos y cohortes de las hojas, pero si fue significativamente diferente a través del tiempo en la hojarasca fresca (P=0.001). En el tratamiento donde hubo poda y adición del detrito la concentración del ADN fue mayor en las 7 y 17 semanas si se compara con el resto de los intervalos de muestreo (Figura 4.01). La colonización de hongos basidiomicetos es promovida en la hojarasca fresca. La tasa de descomposición pudo aumentar debido al aumento relativo en la humedad de la capa de la hojarasca fresca cubierta y al movimiento de nutrientes de las hojas verdes que están sobre ellas. Los cambios en humedad, profundidad de la hojarasca y la alta concentración de nutrientes en las hojas verdes pudieron interactuar y de esta manera influenciar la tasa de descomposición en la capa de la hojarasca fresca presente en el suelo, además de las hojas verdes. La tasa de descomposición pudo ser más rápida en este tratamiento como muestra el bajo por ciento de masa remanente en el intervalo de las 55 semanas presentado en la Figura 4.10.F (Lodge, datos no publicados). El clímax de la comunidad microbiana es más rápido en este tratamiento, como muestra la disminución de ADN a las 31 semanas (Figura 4.10.B). Es el único tratamiento donde el ADN disminuye durante este intervalo de tiempo. La alta concentración de ADN en el tratamiento de poda sin adición del detrito pudo estar causada por la ausencia de hongos basidiomicetos. Cuando los hongos

78 basidiomicetos no están presentes en el sustrato, las bacterias y los hongos azúcares pueden colonizarlo. Por tanto, la alta concentración de ADN en este tratamiento pudo estar dirigida por estos microorganismos (Figura. 4.10.A). Este resultado está sustentado por el alto por ciento de masa remanente que se obtuvo a las 55 semanas en el tratamiento, mostrando que la descomposición fue más lenta en ausencia de hongos basidiomicetos (Figura 4.10.F) (Lodge, datos no publicados). La aceleración de la descomposición temprana en las hojas por algunos hongos basidiomicetos puede ser atribuida, en parte, a su capacidad de colonizar rápidamente el sustrato y a su capacidad de mover los nutrientes, las cuales les permiten convertir la biomasa en nuevos recursos cuando la incorporación de nutrientes es mínima (Lodge et al, 2008). Al no incorporar una fuente de material orgánico se disminuyó el desarrollo de los microorganismos, particularmente, los hongos. Por tal razón la hojarasca presente en el suelo se descompone más lentamente que en los otros tratamientos ya que la concentración de nutrientes declina rápidamente en la hojarasca existente debido a la pérdida de nutrientes de los microbios y al aumento de la radiación del sol. El tamaño de la abertura del dosel es determinante en las actividades de la descomposición de la hojarasca (Quishui and Zak, 1995). En este tratamiento se observó una disminución en el número de filotipos a través del tiempo ya que al realizarse la poda del dosel, y al retirar el detrito se disminuye la sucesión de descomposición de la hojarasca (Figura 4.03.A–C). Los resultados del análisis estadístico ANOVA confirmaron que no hubo una diferencia significativa en el número de filotipos en las comunidades de bacterias en la hojarasca fresca a través del tiempo.

79 El clímax de la comunidad microbiana es más lento en el tratamiento donde no se poda el dosel, pero la abundancia de microorganismos puede ser más alta cuando se añade el detrito, debido a que se propicia una alta conectividad de hongos (Lodge, trabajos no publicados). Este hecho es apoyado por la alta concentración de ADN en el tratamiento donde no hubo poda, pero si adición del detrito (Fig. 4.10.B). Los resultados del cladograma mostraron que la estructura de las comunidades de hongos y bacterias cambia a través del tiempo y el espacio. La poda del dosel y la adición del detrito pueden afectar la comunidad microbiana. Estos cambios y diferencias observadas entre los tratamientos y las cohortes de hojas, pudieron ser provocados principalmente por el tiempo de recolección de la muestra y por el lapso de tiempo que se tuvo que esperar para defoliar entre un bloque y otro. Además, se encontró que las muestras son altamente divergentes y no pudo ser observado un patrón definido en las comunidades debido a la diversidad de las comunidades de hongos y bacterias, y a la variabilidad entre los bloques. El efecto de la intensidad de la defoliación en la estructura de la cadena alimentaria sobre el suelo pudo depender de la duración de la defoliación provocando que el efecto sobre las comunidades microbianas sea más dinámico que constante (Mikola et al, 2001). Por tanto, pudimos probar que la hipótesis (Ha) en la que se señalaba que la deposición de la materia orgánica y las aberturas en el dosel cambiarían la diversidad de microorganismos en nuestra área de estudio es cierta. Esto es de esta manera, ya que los resultados obtenidos de los distintos análisis que se aplicaron a las muestras recolectadas corroboraron que la deposición de materia orgánica y las aberturas en el dosel cambiaron la diversidad relativa de microorganismos, en nuestro caso, hubo una diferencia significativa mayor en el número de filotipos en la comunidad

80 de hongos a través del tiempo, tanto en la hojarasca fresca, como en las hojas verdes. Podemos concluir que los cambios ocurridos a través del tiempo en las comunidades microbianas pueden ser relacionados a los cambios ocurridos en el microclima y a la disponibilidad de los compuestos lábiles. En adición, podemos concluir que los hongos aparentan controlar la sucesión de microorganismos al descomponer la hojarasca presente sobre el suelo. Por último, en muy pocos trabajos de investigación se ha aplicado la técnica de TRFLP al estudio de las comunidades microbianas en las hojas y en determinar como los cambios en el ambiente afectan su estructura y diversidad. En este estudio se logró aplicar, por primera vez, la técnica de TRFLP en la región del trópico, pero aún se necesitan realizar más investigaciones, ya que las enzimas de restricción que se utilizaron en el estudio nos dieron una resolución limitada. Es necesario evaluar otras enzimas para de esta manera poder determinar cual es más eficaz al momento de discriminar entre los efectos causados por los tratamientos y los causados por las cohortes de hojas. Es decir, utilizar otras enzimas de restricción que nos provean una mayor resolución de la estructura microbiana presente en la hojarasca.

Literatura Citada

Arunachalam A, Pandey HN. 2003 Ecosystem Restoration of Jhum Fallows in Northeast India: Microbial C and N Along Altitudinal and Successional Gradients. Restoration Ecology 11: 168-173. Arunachalam A, Maithani K, Pandey HN, Tripathi RS. 1996. The impact of disturbance on detrital dynamics and soil microbial biomass of Pinus Kesiya forest in northeast India. Forest Ecology and Mangement 88: 273-282. Bridge PD, Arora DK, Reddy CA, Elander RP. 1998. Applications of PCR I Mycology. CAB International: 1–20. Buchan A, Newell SY, Butler M, Biers EJ, Hollibaugh JT, Moran MA. 2003. Dynamics of Bacterial and Fungal Communities on Decaying Salt Marsh Grass. Applied and Environmental Microbiology 69: 6,676–6,687. Cavigelli MA, Robertson GP, Klug MJ. 1995. Fatty acid methyl ester (FAME) profiles as measure of soil microbial community structure. Plant Soil 170: 99-113. Chabrerie O, Laval K, Puget P, Desaire S, Alard D. 2003. Relationship between plant and soil microbial communities along a successional gradient in chalk grassland in north- western France. Applied Soil Ecology 24: 43-56. Cornejo FH, Varela A, Wright SJ. 1994. Tropical Forest Litter Decomposition under Seasonal Drought: Nutrient Release, Fungi and Bacteria. Oikos 70, No. 2: 183190.

81

82 Fierer N, Jackson JA, Vilgalys R, Jackson RB. 2005. Assessment of Soil Microbial Community Structure by Use of Taxon-Specific Quantitative PCR Assays. Applied and Environmental Microbiology 71, No. 7: 4117-4120. Gange AC, Brown V. 2002. Soil food web components affect plant community structure during early succession. Ecological Research 17: 217-227. Hedlund K. 2002. Soil microbial community structure in relation to vegetation management on former agricultural land. Soil Biology & Biochemistry 34: 12991307. Klug WS, Cummings MR. 1999. Conceptos de Genética. Prentice Hall. P. 475 – 477. LaMontagne MG, Schimel JP, Holden PA. 2003. Comparison of Subsurface and Surface Soil Bacterial Communities in Grassland as Assessed by Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms of PCR – Amplified 16S rRNA Genes. Microbial Ecology 46: 216–227. Liu WT, Marsh TL, Cheng H, Forney LJ. 1997. Characterization of Microbial Diversity by Determining Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms of Genes Encoding 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology 63 No. 11: 45164522. Lodge DJ, Cantrell SA. 1995. Fungal communities in wet tropical forests: variation in time and space. Canadian Journal of Botany Suppl.: S1391-S1398. Lodge DJ, Hawksworth Y, Richie BJ. 1996a. Microbial diversity and tropical forest functioning. Ecological Studies 122: 71-100.

83 Lodge DJ, McDowell WH, Macy J, Ward SK, Leisso R, Claudio-Campos K, Kühnert K. 2008. Distribution and Role of Mat-Forming Saprobic Basidiomycetes in a Tropical Forest. Brtish Mycological Society Symposia Series. Chapter 11: 195207. Lodge DJ, McDowell WH, McSwiney CP. 1994. The importance of nutrient pulses in tropical forest. TREE 9, No. 10: 384-387. Lodge DJ, Regan DP, Waide RB. 1996b. The Food Web of a Tropical Forest. Univ. of Chicago Press: 53-108. Lodge DJ, Scatena FN, Asbury CE, Sanchez MJ. 1991. Fine litterfall and related nutrient inputs resulting from Hurricane Hugo in Subtropical Wet and Lower Montane Rain Forests of Puerto Rico. Biotropica 23: 364-372. Lugo AE, Rivera CT. 1987. Leaf production, growth rate, and age of the palm Prestoea Montana in the Luquillo Experimental Forest, Puerto Rico. Journal of Tropical Ecology 3: 151-162. Mikola J, Yeates GW, Barker GM , Wardle DA, Bonner KI. 2001. Effects of defoliation intensity on soil food-web properties in an experimental grassland community. Oikos 92 Issue 2: 333, 11-17. Miller RM, Lodge DJ. 1997. Fungal responses to disturbance - Agriculture and Forestry. Pp. 65-84. In The Mycota, Vol. V. Environmental and Microbial Relationships. K. Esser, P.A. Lemke and D.T. Wicklow, Eds. Springer Verlag.

84 Moore JC, Berlow EL, Coleman DC, De Ruiter PC, Dong Q, Hastings A, Collins N, McCann KS, Melville K, Morim PJ, Nadelhoffer K, Rosemnd AD, Post DM, Sabo JL, Scow KM, Vanni MJ, Wall DH. 2004. Detritus, trophic dynamics and biodiversity. Ecology Letters 7: 584-600. Osborn AM, Smith CJ. 2005. Molecular Microbial Ecology. Taylor and Francis Group. P. 69 – 70. Ostertag R, Scatena FN, Silver WL. 2003. Forest Floor Decomposition Following Hurricane Litter Inputs in Several Puerto Rican Forests. Ecosystems 6: 261-273. Quishui Z, Zak JC. 1995. Effects of gap size on litter decomposition and microbial activity in subtropical forest. Ecology 78: 2196-2205. Thormann MN, Currah RS, Bayley SE. 2003. Succession of microfungal assemblages in decomposing peatland plants. Plant & Soil 250 Issue 2: 323-333. Vestal JR, White DC. 1989. Lipid Analysis in Microbial Ecology: Quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience 39: 535-541. Weaver PL. 1986. Hurricane damage and recovery in the montane forest of the Luquillo Mountain of Puerto Rico. Caribb. J. Sci. 22: 53-70. Willing MR, Moorehead DL, Cox SB, Zak JC. 1996. Functional diversity of soil bacterial communities in the tabonuco forest: the interaction of anthropogenic and natural disturbance. 28: 471-48.

85

Apéndices

86 Apéndice Uno

Apéndice 1.01. Protocolo alternativo para extraer ADN (UltraClean Soil DNA Isolation Kit, MoBio Laboratorios, Solana Beach, CA). Ponerse guantes todo el tiempo. 1. Añadir 0.25 g a 1.00 g de muestra del suelo a la solución ya preparada (2 ml Bead Solution Tubes). Enumerar cada solución. 2. Mover las soluciones. 3. Cotejar la solución S1, para verificar que no halla precipitado. Si hay precipitado se tendrá que calentar la solución a una temperatura de 60ºC, hasta que se disuelva el precipitado. 4. Añadir 60 µl de la solución S1 e invertirla varias veces o moverla brevemente. 5. Añadir 200 µl de la solución IRS (“Inhibitor Renoval Solution”), se requiere solo si el ADN será utilizado en PCR. 6. Asegurar los tubos horizontalmente utilizando el “Mo Bio Vortex Adapter’’ con cinta adhesiva. Mover a velocidad máxima por 10 minutos. 7. Centrifugar los tubos a 10,000 x g durante 30 segundos. 8. Transferir el sobrenadante a tubos microcentrifugados limpios. 9. Se espera tener alrededor de 400 µl a 450 µl de sobrenadante. 10. Añadir 250 µl de la solución S2 y moverla por 5 segundos. Colocarla en el congelador a 4ºC por 5 minutos. 11. Centrifugar los tubos a 10,000 x g.

87 12. Transferir el volumen completo de sobrenadante a un tubo de sobrenadante limpio. 13. Añadir 1.3 ml de la solución S3 al sobrenadante y moverlo por 5 minutos. 14. Colocar 700 ml en el filtro “Spin filter” y centrifugar por 1 minuto a 10,000 x g. Descartar el flujo. Repetir el proceso con el sobrenadante que falta. Se realizará un total de 3 tandas por cada muestra. 15. Añadir 300 µl de la solución S4 y centrifugar por 30 segundos a 10,00 x g. 16. Descartar el flujo. 17. Centrifugar nuevamente por 1 minuto. 18. Colocar cuidadosamente el filtro en un tubo nuevo. Se provee. 19. Añadir 50 µl de la solución S5 en el centro de la membrana del filtro. 20. Centrifugar por 30 segundos. 21. Desechar el filtro. El ADN en el tubo está listo para las aplicaciones. Se recomienda que se almacene el tubo con el ADN a una temperatura de -20ºC.

88 Apéndice 1.02. Dilución de iniciadores oligonucleótidos “primers” para bacterias 1525R

Ci = 100 pmol 20 µl “primer”

20pmol (100 µl) Vi =

=

20 µl “primer”

100pmol

80 µl ddH2O

27F (FAM)

Ci= 48.2 20 pmol (100 µl) Vi =

41.5 µl “primer” = 41.5 µl de “primer”

58.2 µl ddH2O

48.2 pmol Se aplicará el mismo procedimiento para diluir los iniciadores oligonucleótidos “primers” de hongos (ITS4 e ITS1).

89 Apéndice 1.03. Protocolo para Precipitación de Productos de Secuenciación Volumen inicial 20µl 1. Transferir todo el volumen de la digestión a un microtubo de 1.5 ml. 2. Preparar y añadir: a. 49 µl de agua deionizada estéril (ddH2O) b. 6 µl de 3M acetato de sodio (CH3COONa) c. 125 µl de etanol 95% (CH3CH2OH) 3. Mezclar bien (vortex) e incubar a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos (reposar). 4. Centrifugar a velocidad máxima por 20 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos en la misma orientación para localizar el “pellet”. 5. Utilizando una micropipeta, aspirar todo el sobrenadante con mucho cuidado y en la dirección opuesta a donde se supone que esté el “pellet”. 6. Añadir 250 µl de etanol 70% para lavar el “pellet”. 7. Centrifugar a velocidad máxima por 5 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos en la misma orientación. 8. Aspirar el sobrenadante con premura y mucho cuidado con una micropipeta. 9. Dejar secar las muestras en un bloque termal a 70oC por 15 minutos o dejarlo abierto de forma horizontal hasta evaporarse el alcohol residual. Si posee secado al vacío mejor. Puede secar en un horno de secado a 70o C. 10. Resuspender el “pellet” en Formamida (CH3NO) y en el marcador de peso molecular “Liz 500’’ (Applied Biosystem, Warrinton, UK). Utilizar 14.8 µl de Formamida + 0.2 µl

90 de “Liz marker” (por muestra). Luego, con una micropipeta, se transfieren todas las muestras al plato de secuenciar y se le coloca el septo (la tapa de goma gris). 11. El plato de secuenciar se coloca en el termociclador y se aplica el programa de desnaturalizar. Este método es aplicado para romper interacciones débiles como los puentes de hidrógeno que pueden formarse. 12. Cuando finalice el ciclo de desnaturalizar, colocar rápidamente el plato de secuenciar que contiene las muestras en un baño de agua fría para un cambio drástico de temperatura por 2 minutos. Luego secar el plato y colocar la base y la cubierta requerida para la secuenciación en el Analizador Genético.

91

Apéndice Dos

Apéndice 2.01. Resultados de la amplificación del ADN mediante la técnica de reacción de la polimerasa en cadena (PCR) utilizando la enzima Polimerasa de ADN Red Taq

ADN Descripción

Bacterias

Dilución

16s rADN

Hongos

Dilución

ITS

Período de muestreo: 17 semanas 40

A1 - Hojarasca nueva

-

N/A

-

N/A

41

A1 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

42

A1 - Hojarasca sobre suelo

+

10-1

+

10-2

43

A2 - Hojarasca nueva

+

10-2

+

10-1

44

A2 - Hojarasca fresca

-

N/A

-

N/A

45

A2 - Hojarasca sobre suelo

+

10-2

+

10-1

46

A3 - Hojas verdes

-

N/A

-

N/A

47

A3 - Hojarasca nueva

+

10-1

+

10-1

48

A3 – Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-1

49

A3 - Hojarasca sobre suelo

+

10-2

+

10-2

50

A4 - Hojas verdes

+

10-2

+

10-1

51

A4 - Hojarasca nueva

+

10-1

+

10-1

52

A4 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-1

53

A4 - Hojarasca sobre suelo

+

10-2

+

10-1

54

B1 - Hojarasca nueva

+

10-2

-

N/A

92 Apéndice 2.01., continuación. 55

B1 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-1

56

B1 - Hojarasca sobre suelo

+

10-2

+

10-1

57

B2 - Hojas verdes

+

10-1

+

10-1

58

B2 - Hojarasca nueva

-

N/A

+

10-1

59

B2 - Hojarasca fresca

+

10-2

-

N/A

60

B2 - Hojarasca sobre suelo

+

10-2

+

10-1

61

B3 - Hojas verdes

+

10-2

+

10-1

62

B3 – Hojarasca nueva

+

10-2

+

10-1

63

B3 – Hojarasca fresca

-

N/A

-

N/A

64

B3 - Hojarasca sobre suelo

+

10-1

-

N/A

65

B4 - Hojarasca nueva

-

N/A

+

10-1

66

B4 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

67

B4 - Hojarasca sobre suelo

+

10-1

N/A

N/A

68

C1 - Hojas verdes

-

N/A

+

10-1

69

C1 - Hojarasca nueva

-

N/A

+

10-1

70

C1 - Hojarasca fresca

-

N/A

-

N/A

71

C1 - Hojarasca sobre suelo

+

10-1

+

10-1

72

C2 - Hojas verdes

-

N/A

+

10-1

73

C2 - Hojarasca nueva

+

10-1

N/A

N/A

74

C2 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-2

75

C2 - Hojarasca sobre suelo

+

10-2

+

10-2

76

C3 - Hojarasca nueva

+

10-1

+

10-2

77

C3 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-1

93 Apéndice 2.01., continuación. 78

C3 - Hojarasca sobre suelo

+

10-1

+

10-1

79

C4 - Hojarasca nueva

-

N/A

+

10-2

80

C4 - Hojarasca fresca

-

N/A

+

10-2

81

C4 - Hojarasca sobre suelo

+

10-1

+

10-2

Período de muestreo: 31 semanas 82

A1 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-2

83

A2 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-2

84

A3 - Hojas verdes

-

N/A

+

10-1

85

A3 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-2

86

A4 - Hojas verdes

+

10-1

+

10-2

87

A4 - Hojarasca fresca

-

N/A

+

10-2

88

B1 – Hojarasca fresca

-

N/A

+

10-2

89

B2 – Hojas verdes

-

N/A

+

10-2

90

B2 - Hojarasca fresca

-

N/A

+

10-2

91

B3 - Hojas verdes

+

10-2

+

10-2

92

B3 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-2

93

B4 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-2

94

C1 - Hojas verdes

+

10-2

+

10-2

95

C1 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-2

96

C2 - Hojas verdes

+

10-2

+

10-2

97

C2 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-2

98

C3 - Hojarasca fresca

-

N/A

+

10-2

99

C4 - Hojarasca fresca

+

10-2

+

10-2

94 Apéndice 2.01., continuación. Período de muestreo: 55 semanas 118

A1 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

119

A2 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

120

A3 - Hojas verdes

+

10-1

+

10-1

121

A3 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

122

A4 - Hojas verdes

+

10-2

+

10-1

123

A4 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

124

B1 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

125

B2 - Hojas verdes

+

10-1

+

10-1

126

B2 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

127

B3 - Hojas verdes

+

10-1

+

10-1

128

B3 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

129

B4 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

130

C1 - Hojas verdes

+

10-1

+

10-1

131

C1 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

132

C2 - Hojas verdes

+

10-1

+

10-1

133

C2 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

134

C3 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

135

C4 - Hojarasca fresca

+

10-1

+

10-1

+ resultado positivo al PCR - resultado negativo al PCR N/A no aplica

95 10 -1 muestras positivas al PCR al tener 2µl de ADN extraído en 18 µl de agua deionizada estéril 10 -2 muestras positivas al PCR al tener 2µl de ADN diluido 10 -1 en 18 µl de agua deionizada estéril. Tratamientos:

A1, B1, C4 --- Control A2, B4, C3--- Poda sin adición de detrito A3, B2, C2 --- Poda más adición de detrito A4, B3, C1 --- No poda más adición de detrito

96 Apéndice 2.02. Resultados obtenidos en las muestras de hojarasca fresca colectadas en los Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y el número de filotipos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo.

Bloque

Tratamiento

TRFLP (16S rADN)

TRFLP (ITS)

Tiempo

ADN

Número de picos

Número de picos

(meses)

(µg/ml)

para bacterias

para hongos

A

control

17

8.1

34

34

A

control

31

80.3

48

66

A

control

55

14.4

50

29

A

No poda + Detrito

17

29.7

45

63

A

No poda + Detrito

31

141.3

N/A

34

A

No poda + Detrito

55

23.2

35

44

A

Poda + No adición

17

172.2

N/A

N/A

A

Poda + No adición

31

107.3

10

59

A

Poda + No adición

55

18.0

N/A

58

A

Poda + Detrito

17

52.5

41

23

A

Poda + Detrito

31

66.8

17

81

A

Poda + Detrito

55

14.2

45

68

B

control

17

30.5

N/A

N/A

B

control

31

55.5

N/A

51

B

control

55

22.4

N/A

56

B

No poda + Detrito

17

29.1

N/A

N/A

97

B

No poda + Detrito

31

65.1

33

54

B

No poda + Detrito

55

23.2

N/A

N/A

B

Poda + No adición

17

37.6

31

24

B

Poda + No adición

31

34

45

B

Poda + No adición

55

18.8

N/A

27

B

Poda + Detrito

17

109.7

N/A

N/A

B

Poda + Detrito

31

58.8

N/A

22

B

Poda + Detrito

55

15.2

N/A

31

C

control

17

63.9

N/A

42

C

control

31

45.3

15

64

C

control

55

15.8

N/A

N/A

C

No poda + Detrito

17

29.6

N/A

N/A

C

No poda + Detrito

31

73.0

43

89

C

No poda + Detrito

55

36.4

N/A

N/A

C

Poda + No adición

17

52.1

48

74

C

Poda + No adición

31

121.7

N/A

19

C

Poda + No adición

55

30.0

N/A

33

C

Poda + Detrito

17

92.9

50

75

C

Poda + Detrito

31

66.8

25

68

C

Poda + Detrito

55

30.6

94

N/A

43.8

98 Apéndice 2.03. Resultados obtenidos en las muestras de hojas verdes colectadas en los Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y el número de filotipos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo.

Bloque

Tratamiento

TRFLP (16S rADN)

TRFLP (ITS)

Tiempo

ADN1

Número de picos

Número de picos

(meses)

(µg/ml)

para bacterias

para hongos

A

Poda + Detrito

17

34.2

N/A

N/A

A

Poda + Detrito

31

28.9

N/A

72

A

Poda + Detrito

55

13.9

10

65

A

No poda + Detrito

17

34

23

80

A

No poda + Detrito

31

51.7

58

64

A

No poda + Detrito

55

28.7

31

N/A

B

Poda + Detrito

17

48.1

25

45

B

Poda + Detrito

31

26.7

N/A

17

B

Poda + Detrito

55

17.4

N/A

15

B

No poda + Detrito

17

84.1

N/A

66

B

No poda + Detrito

31

52

28

95

B

No poda + Detrito

55

18.4

N/A

29

C

Poda + Detrito

17

89.9

N/A

13

C

Poda + Detrito

31

58.6

13

62

C

Poda + Detrito

55

15

65

N/A

99 C

No poda + Detrito

17

29.6

N/A 69

C

No poda + Detrito

31

54.6

22

56

C

No poda + Detrito

55

19.8

96

N/A

1

Los resultados obtenidos al calcular la concentración de ADN total se obtuvieron de las

muestras que fueron colectadas de los bloques A, B y C utilizando el biofotómetro. Se utilizaron 6 µl del ADN extraído diluidos en 54 µl de agua esterilizada.