UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA BIOL 3405: LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA I. TÍTULO Dilución II. OBJETIVOS  Repasar el concepto de dilución en serie  Aplicar el concepto de dilución como técnica semi-cuantitativa III. INTRODUCCIÓN Los métodos de dilución que vamos a practicar se utilizan en muchos procedimientos inmunológicos, serológicos, y bacteriológicos. Análisis de suero (serología) Serología es el estudio del suero; estudio de anticuerpos en el suero. Determinar la presencia y concentración de anticuerpos en sangre es crucial en un individuo para:    

Estudios de autoinmunidad Necesidad vacunas de refuerzo Efectividad de una vacuna Si se tiene o tuvo recientemente infección (hepatitis, mononucleosis)

En ambos casos, para lograr un análisis adecuado se requiere la dilución sucesiva de la muestra. Las diluciones mas comunes son las que reducen la concentración por un factor de dos o por un factor de 10 (two-fold or ten-fold serial dilutions). A la detección de anticuerpos específicos se le llama seroconversión. La Seroconversión es el desarrollo (en el suero sanguíneo) de anticuerpos específicos para un antígeno como resultado de infección o inmunización. Para determinar la seroconversión de un paciente se analizan muestras de sangre obtenidas durante la enfermedad y durante la convalescencia para detectar los anticuerpos. Si se obtiene mayor cantidad de anticuerpos en la última muestra, es evidencia de que la persona fue infectada por ese organismo (antígeno). Antes de que ocurra seroconversión, la sangre es seronegativa. Luego que se detectan anticuerpos para un antígeno particular, la sangre es seropositiva. El término 1

seroconversión se utiliza mucho para referirse a la detección de anticuerpos anti-VIH. Seroconvertido, se referiría en este caso, ser VIH positivo. Cuando se quiere determinar la concentración de anticuerpos en suero, se preparan diluciones del suero con cantidad de antígeno constante y la dilución mayor a la cual todavía hay reacción es la medida o el título (titer). En otras palabras el título de anticuerpos en la dilución mas alta a la cual todavía se observa una reacción positiva. El título ayuda entre otras cosas a determinar si una vacuna fue efectiva y si hay necesidad de un refuerzo.

Dilución Para diluir muestras se utiliza una solución (diluyente) inerte, o sea, que no reaccione con la muestra ni con los reactivos a utilizar en el análisis. Un diluyente comúnmente utilizado es la solución salina al 0.85%. El proceso de dilución se lleva a cabo pasando la muestra por volúmenes fijos del diluyente.

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Para determinar la dilución realizada hay que considerar el volumen que se añade y el volumen total que se genera al añadir la muestra; al igual que la condición en que se encuentra la muestra. Ej: Al tubo #1 se añade 1 mL de muestra. Esa muestra no está diluida todavía. El mL se añade a 9 mL de diluente, generando así un volumen total de 10 mL. Entonces en ese tubo se tiene 1 mL de muestra en un total de 10 mL, lo cual representa una dilución de 1:10. Si se toma 1 mL del tubo #1 (donde ya la muestra está diluida por un factor de 1:10) y se añade a un tubo (tubo #2) que contiene 9 mL de diluente, se tiene entonces 1 mL de muestra que estaba diluida 1:10 en un total de 10 mL. En ese caso se multiplican los

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factores de dilución (1:10 de la muestra que se tomó del tubo #1 x 1:10 que es la dilución que se realizó en el tubo #2 = 1:10 x 1:10 = 1:100) De esa manera se calcula la dilución en cada tubo. Como en este caso es una dilución seriada en factor de diez, siempre se va a multiplicar la dilución que tiene la muestra por la dilución 1:10. Video: Para dilución 1:10 ver: “ten fold serial dilution youtube” Video: Para dilución 1:2 ver: “http://www.youtube.com/watch?v=j-sWADCEgEY” IV. MATERIALES Agua destilada Pipetas de 1 mL y 10 mL Micropipetas 10-100-1000 μL Puntas para micropipetas Tubos de ensayo (regulares y pequeños) Vasos (beakers) Solución de azul de metileno al 1% Gradillas Solución salina 0.85% Sangre Solución de SDS (sodium dodecyl sulfate) al 0.5% Vortex Tubos de centrífuga (15 mL) Azul de metileno 1% Hemocitómetro Microtubos Cultivo de Bacillus de 24 hrs. Contador de colonias Placas Petri TSA V. PROCEDIMIENTO A. Dilución factor de diez (ten-fold) 1. Coloque 5 tubos de ensayo en una gradilla y rotule de la siguiente manera: Tubo 1: [1:10] Tubo 2: [1:100] Tubo 3: [1:1,000] Tubo 4: [1:10,000] Tubo 5: [1:100,000]

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2. 3. 4. 5. 6. 7.

Transfiera 9 mL de agua destilada a cada uno de los tubos. Transfiera 1 mL de la solución de azul de metileno (1%) al tubo 1. Mezcle hasta obtener una solución homogénea. Transfiera 1mL del tubo 1 al tubo 2. Mezcle hasta obtener una solución homogénea. Repita la operación anterior hasta completar el último tubo (tubo 5) y remueva 1 mL (del último tubo). 8. Compare visualmente los cinco tubos y determine a qué dilución desaparece el color ¿A que dilución desaparece el color?____________________ Dibuje o tome foto de sus resultados. B. Dilución factor de diez (ten-fold) 1. Coloque 6 microtubos en una gradilla y rotule de la siguiente manera: Tubo 1: [1:10] Tubo 2: [1:100] Tubo 3: [1:1,000] Tubo 4: [1:10,000] Tubo 5: [1:100,000] Tubo 6: [1:1,000,000] 2. Transfiera 0.9 mL de solución salina a cada uno de los tubos. 3. Prepare stock de cultivo bacteriano (Bacillus) transfiriendo 10 ul de caldo. bacteriano en 9.99 ml de solución salina. 4. Transfiera 0.1 ml del “stock” al tubo 1. 5. Mezcle hasta obtener una solución homogénea. 6. Transfiera 0.1mL del tubo 1 al tubo 2. 7. Mezcle hasta obtener una solución homogénea. 8. Repita la operación anterior hasta completar el último tubo (tubo 6). 9. Transfiera 1 ml de cada tubo a una placa petri rotulada igual que los tubos. 10. Añada TSA tibio y mezcle cuidadosamente. 11. Deje enfriar el agar hasta que el agar este sólido. 12. Coloque las placas en una incubadora a 37 grados centígrados por 24/48 horas. 13. Cuente el número de bacterias en cada placa (solo aquellas < 500 cfu/ml). 14. Anote sus resultados en la tabla provista. 15. Grafique sus resultados siguiendo el ejemplo.

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Dilution

CFU/ml

0 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000 1:100,000 1:1,000,000

Ten-fold Dilution of Bacterial Culture 600 500

CFU/m l

400 CFU/ml

300 200 100 0 0

10

100

1000

10000

100000

1000000

Dilution Factor

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C. Dilución factor de dos (two-fold) 1. Coloque 10 tubos de ensayo pequeños en una gradilla y rotule del 1 al 10 como indica en la tabla a continuación: Número de tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dil ución Control positivo (SDS + eritrocitos) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Control negativo (Sol. Salina + eritrocitos)

2. 3. 4. 5. 6.

Añada 1 mL de solución salina a cada tubo del 2 al 10. Añada 1 ml de la solución de SDS (0.5%) al tubo 1 y al tubo 2. Mezcle suavemente. Transfiera 1 mL del tubo 2 al tubo 3. Mezcle suavemente el tubo 3. Transfiera 1 mL del tubo 3 al tubo 4 y así sucesivamente hasta el tubo 9. Mezcle suavemente. 7. Descarte 1 mL del tubo 9. 8. Prepare una solución de glóbulos rojos: a. Añada 0.25 mL de sangre a un tubo de centrífuga b. Añada 12.5 mL de solución salina al mismo tubo c. Mezcle suavemente hasta obtener una solución homogénea 9. Añada 1 mL de la solución de glóbulos rojos (preparada en número 8) a cada tubo (1 al 10). 10. Deje los tubos a temperatura ambiente por 5 min. 11. Determine la dilución mas alta en la cual ocurre hemólisis (solución roja sin turbidez). Dilución más alta (más diluido) en que ocurre hemólisis:______________ ¿Qué causó la hemólisis? Dibuje o tome foto de sus resultados.

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