Universidad Veracruzana Facultad de Ingeniería y Ciencias Químicas Programa educativo: Ingeniería Química

Lipasas contenidas en las semillas de Ricinus communis utilizadas como biocatalizador en la transestirificación de triacilglicèridos

Tesis

Que para acreditar la Experiencia Educativa Experiencia Recepcional

Presenta: Maribel Martínez Lara

Asesor: Dr. Ricardo Tovar Miranda

Xalapa; Veracruz, Junio 2013

A mis padres, por su amor, constante apoyo, dedicación y esfuerzo, que hicieron posible el logro de mi formación profesional …

II

AGRADECIMIENTOS  Al Dr. Ricardo Tovar Miranda por su apoyo y don de enseñanza, por su ejemplo de

tenacidad y testimonio, por su tiempo, dedicación y

confianza hacia este proyecto.

 Al

Dr.

Raúl

Cortés,

Director

del

Instituto

de

Investigaciones

Multidisciplinarias (IIM) por sus palabras, confianza en mi persona para realizar esta investigación, por su apoyo moral y económico.

 A mis sinodales, por su tiempo e interés para con mi trabajo.  A mis compañeros del laboratorio de química orgánica establecido en el Instituto de Ciencias Básicas por la convivencia, la enseñanza y el soporte que me dieron para llevar a cabo este paso en mi vida.

III

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Química Orgánica del Instituto de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana, bajo la dirección del Dr. Ricardo Tovar Miranda, además de contar con el apoyo del Instituto de Investigaciones Multidisciplinarias de la Universidad Veracruzana bajo la dirección del Dr. Raúl Cortés García.

IV

Resumen Lipasas contenidas en las semillas de Ricinus communis utilizadas como biocatalizador en la transestirificación de triacilglicèridos. En la actualidad se habla, se investiga y se realizan proyectos para obtener energías renovables como los biocombustibles; debido a la rapidez con la que se están agotando los combustibles fósiles. La transesterificación de triacilglicèridos es una opción factible para generar biocombustible; en el presente trabajo se evaluó la transesterificación de los ácidos grasos presentes en triacilglicèridos de grasa de pollo, aceite usado y aceite puro con etanol, utilizando como biocatalizador las lipasas contenidas en las semillas de Ricinus communis; se ajustaron variables de la reacción como: disolventes, temperatura, tiempo de reacción y cantidad de enzima, con el fin de encontrar las condiciones en las cueles la transesterificación fue completa.

V

ÍNDICE AGRADECIMIENTOS ....................................................................................... III ÍNDICE .............................................................................................................. VI Resumen ............................................................................................................ V 1. Introducción .................................................................................................... 1 2. Antecedentes ................................................................................................. 2 2.1 Ricinus communis ..................................................................................... 2 2.1.1 Variedades ......................................................................................... 4 2.2 Enzimas .................................................................................................... 4 2.2.1 Enzimas y efectos catalíticos............................................................... 5 2.2.2 Actividad enzimática ............................................................................ 6 2.2.3 Aplicaciones industriales de las enzimas ............................................ 6 2.2.4 Hidrólisis enzimática ............................................................................ 7 2.3 Lipasas ..................................................................................................... 7 2.3.1 Mecanismo catalítico de las lipasas ................................................... 7 2.4 Triacilglicèridos ......................................................................................... 8 2.5 Reacción de Transesterificación ............................................................... 9 2.5.1 Variables en la transesterificación de triacilglicèridos.......................... 9 3. Planteamiento del Problema ........................................................................ 10 4. Justificación .................................................................................................. 11 5. Hipótesis....................................................................................................... 12 6. Objetivos ...................................................................................................... 13 6.1 Objetivo Generales ................................................................................. 13 6.2 Objetivos específicos .............................................................................. 13 7. Metodología.................................................................................................. 14 7.1 Recolección, lavado y extracción de aceite de la semilla ..................... 15 7.2 Reacción de Hidrólisis con lipasas.......................................................... 17 7.3 Activación de la enzima .......................................................................... 17 7.4 Reacción de Transesterificación ............................................................. 18 8. Resultados y Discusión ................................................................................ 19 8.1 Recolección de semillas y Extracción de aceite ..................................... 19 8.2 Reacción de Hidrólisis ............................................................................ 20 VI

8.3 Activación de la enzima .......................................................................... 20 8.4 Resultados de reacción de transesterificación ........................................ 20 9. Conclusiones ................................................................................................ 28 10. Anexo ......................................................................................................... 30 11. Bibliografía ................................................................................................. 31

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Índice de Figuras Figura 1. Planta de Ricinus comunnis ..................................................................... 2 Figura 2. Molécula de triglicérido ............................................................................. 8 Figura 3. Reacción de Transesterificación ............................................................. 9 Figura 4. Frutos verdes y secos ............................................................................ 15 Figura 5. Frutos seco............................................................................................. 15 Figura 6. Semillas fuera del fruto seco .................................................................. 15 Figura 7. Semillas con cáscara y su almendra ...................................................... 16 Figura 8. Semilla entera y pulverizada sin aceite .................................................. 16 Figura 9. Almendra de la semilla ........................................................................... 19 Figura 10. Aceite extraído ..................................................................................... 19 Figura 11. Espectro de RMN de 1H a 300 MHz del triacilglicérido en CDCl 3 ......... 22 Figura 12. Espectro de RMN de 1H a 300 MHz del triacilglicérido transesterificado preparado con etanol en CDCL3 ................................................ 23 Figura 13. Espectro de RMN de1H a 300 MHz del biodiesel con etanol y aceite usado en CDCl3 .................................................................................................... 25 Figura 14. Espectro de RMN de1H a 300 MHz del biodiesel con etanol y aceite puro en CDCl3 ...................................................................................................... 26 Figura 15. Espectro de RMN de1H a 300 MHz del biodiesel con etanol y grasa de pollo en CDCl3 ................................................................................................. 27

VIII

Índice de Tablas

Tabla 1. Composición (% peso) de la semilla de higuerilla ..................................... 3 Tabla 2. Cantidades por reactivo en las reacciones .............................................. 18 Tabla 3. Reacciones de Transesterificación .......................................................... 21 Tabla 5. Comparación de reacciones sin o con disolvente hexano ....................... 24 Tabla 6. Ácidos grasos de Aceite de pepita de uva (Borges) ................................ 30 Tabla 7. Aceite de soya usado en cocina (Nutrioli) ............................................... 30 Tabla 8. Grasa de pollo ......................................................................................... 30

IX

1. Introducción Hoy en día al analizar el impacto ocasionado en el medio ambiente por el uso de hidrocarburos y

combustibles fósiles, surge la necesidad de buscar

alternativas energéticas sostenibles a largo plazo. La relevancia de emplear tecnologías y fuentes alternativas de recursos y energía radica en la contemplación de dos aspectos: minimización del impacto ambiental y capacidad de renovación (Diaz et al., 2003). Entre dichas alternativas energéticas se encuentra el biodiesel, el cual es obtenido mediante la reacción de transesterificación de aceites vegetales o grasas animales; esta reacción consiste en transformar triglicéridos en alquilésteres en presencia de un alcohol de bajo peso molecular y un catalizador, obteniéndose glicerol como co-producto. La transesterificación puede ser efectuada a partir de tres metodologías. La primera es la transesterificación del aceite, empleando una base como catalizador. Ésta metodología es ampliamente usada debido a que tiene un alto rendimiento y representa un proceso de conversión directa. El segundo método es la transesterificación del aceite empleando un ácido como catalizador. La tercera opción es la conversión de los ácidos grasos del aceite en ésteres utilizando enzimas como catalizadores. (National Biodiesel Board, 2002).

El uso de biocatalizadores o enzimas en la producción de biocombustible ofrece ventajas adicionales a los catalizadores heterogéneos de naturaleza química, las enzimas son mucho más selectivas, biodegradables y menos tóxicas. (Hernández, P.N.B; J.R.A. Santamaría, et al. 2009)

Este trabajo presenta los resultados de actividad catalítica de las lipasas presentes en Ricinus communis en la reacción de transesterificación de triacilglicèridos que componen los aceites vegetales utilizados como aquellos que se encuentran disponibles para consumo humano en tiendas de autoservicio, así como los que constituyen la grasa de pollo y su posible uso en la elaboración de biodiesel.

1

2. Antecedentes 2.1 Ricinus communis Ricinus communis comúnmente llamado ricino, higuera del infierno, higuera infernal, catapucia mayor, higuerilla, árbol del demonio.

Morfología y Taxonomía

Reino:

Plantae

División:

Magnoliophyta

Clase:

Magnoliopsida

Orden:

Malpighiales

Familia:

Euphorbiacea

Género:

Ricinus

Especie: comunnis

Figura 1. Planta de Ricinus Comunnis

(Atlas de las Plantas Alóctonas Invasoras, 2004).

Es una planta arbustiva de 1 a 5 m de altura, con los tallos huecos, ramificados y de color verde o rojizo. Las hojas están partidas de 5 a 8 segmentos, en forma de estrella, con los nervios de color rojizo, sus bordes tienen dientecillos de tamaño irregular. Sus flores se encuentran en racimos, y los frutos son cápsulas espinosas que contienen 3 semillas grandes, lisas algo aplanadas y jaspeadas. (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana,2009).

Es originaria de África tropical y habita en climas cálido, semicálido y templado, desde el nivel del mar hasta los 3000 msnm. Planta en ocasiones cultivada, crece en terrenos de cultivo abandonados, a orillas de caminos, ríos y riachuelos, está asociada a bosques tropicales caducifolio; subcaducifolio; y perennifolio; bosque espinoso, matorral xerófilo y bosques mesófilo de montaña, de encino y de pino (Martínez. M. et al. 1996).

2

Las semillas son muy tóxicas, por la presencia de una albúmina llamada ricina, ya que basta la ingestión de tan solo 0,03 g (unos 25 g de semillas); masticadas o tragadas, producen un cuadro de intensa gastroenteritis con deshidratación; puede dañar gravemente el hígado y el riñón e incluso producir la muerte; contiene grasas hasta un 70%, de los cuales el 68% es un glicérido del ácido ricinoleico; proteínas hasta un 20%, ricina, enzimas, con presencia de lipasa; vitamina E. El aceite de ricino, obtenido por prensado de las semillas y calentado para destruir la ricina, es uno de los purgantes más conocidos, debiéndose su acción al ácido ricinoleico; tiene el inconveniente de su desagradable sabor. En la actualidad encuentra aplicaciones en la industria de pinturas y barnices, así como para la fabricación de lubricantes y líquidos para frenos. (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009)

Tabla 1. Composición (% peso) de la semilla de higuerilla (Romero, L. F, 2003)

Componente Composición Aceite

65

Fibra Leñosa

10.00

Agua

7.09

Ricina

1.91

Proteína

20.00

3

2.1.1 Variedades

Ricinus communis Mayor: Es la variedad más común. Su aceite es el más Indicado para uso industrial. Ricinus communis Minor. Ricinus communis Sanguineus. Ricinus communis Viridis. Ricinus communis Inermis. Ricinus communis Zanzibairiensis: No tiene ningún valor industrial (CONABIO, 1999).

2.2 Enzimas Los catalizadores de la vida son las enzimas. La mayoría de las reacciones del metabolismo celular

requieren ser catalizadas por estas, por lo que en

sistemas biológicos se les da el título de biocatalizadores, son notables dispositivos moleculares que determinan los patrones de la química de las transformaciones, también permiten mediar la transformación de una forma de energía en otra. Lo más llamativo y característico de las enzimas son su poder catalítico y su especialidad, debido a su composición química lo aminoácidos que las forman se unen covalentemente mediante un enlace peptídico formado entre el átomo de carbono del carboxilo de un aminoácido y el átomo de nitrógeno del grupo α-amino del siguiente. De acuerdo con la naturaleza del grupo R, los aminoácidos pueden ser polares o no polares y su distribución a lo largo de la proteína determina su comportamiento y sitio de acción, lo que en catálisis tiene lugar en un sitio determinado de la enzima llamado sitio activo. (Berg, Tymoczkoet al. 2007)

4

Las

enzimas

conocidas

son

proteínas,

estas

macromoléculas

son

catalizadores altamente efectivos para su gran diversidad de reacciones químicas, debido a su capacidad de unirse específicamente a una gama muy amplia de moléculas. Al utilizar

el repertorio completo de las fuerzas

intermoleculares, las enzimas atraen sustratos con la orientación óptima, para que se lleven a cabo las interacciones y por último el enlace químico. (Berg,et al.2003)

2.2.1 Enzimas y efectos catalíticos Las enzimas aceleran las reacciones por factores de hasta un millón o más (Radzicka and Wolfenden 1995). De hecho, la mayoría de las reacciones biológicas no podrían llevarse a cabo en ausencia de enzimas, son especificas en las reacciones que catalizan y en la elección de los reactivos lo cuales son llamados sustratos. Una enzima normalmente cataliza una reacción química o un conjunto de reacciones relacionadas. Las reacciones laterales que conducen a la formación de subproducto son raras en las reacciones catalizadas por enzimas, en contraste con las no catalizadas (Berg, et al. 2003).

Los biocatalizadores como enzimas tienen la ventaja de ser más selectivos, biodegradables, menos tóxicos y permiten utilizar condiciones de reacción más suaves. Pueden utilizarse como células enteras (intracelulares) por ejemplo bacterias y levaduras o en forma de enzima aislada (extracelulares). El primer caso es más económico, ya que se evitan los costos asociados a las etapas de extracción y purificación de las enzimas, pero en las reacciones se pierde la selectividad y se pueden formar subproductos catalizados por otras enzimas presentes. En cualquiera de los dos casos, lo más recomendable es usar las enzimas inmovilizadas

o con un soporte

considerablemente su durabilidad con respecto

que permita aumentar al uso de la enzima

solubilizada. (Hernández, P. N. B., J. R. A. Santamaría, et al. 2009).

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2.2.2 Actividad enzimática La actividad enzimática es la capacidad de una enzima para catalizar una reacción química, es estrictamente dependiente de su estructura molecular y de la existencia del sitio activo, que está compuesto por un reducido número de aminoácidos cerca de la estructura

tridimensional de las proteínas, por lo

general lejos de la estructura primaria.(Eijsink, V.G.H; S. Gaseidnes, et al. 2005).

2.2.3 Aplicaciones industriales de las enzimas Las aplicaciones de las enzimas florecieron después de la Segunda Guerra Mundial, asociadas al desarrollo de la microbiología industrial y la ingeniería bioquímica. La ingeniería genética y herramientas de ingeniería de proteínas han sido los principales contribuyentes a la ampliación de el espectro de enzimas utilizadas en las últimas dos décadas, se estima que no menos del 50% de las enzimas comercializadas en la actualidad provienen de la manipulación genética en organismos mediante técnicas de ingeniería genética y de proteínas. Las aplicaciones de las enzimas en la síntesis orgánica representan una desafiante área para el desarrollo de la tecnología de enzimas (Illanes, A. 2008). Las enzimas son utilizadas en procesos como la elaboración de cerveza (Vanderhaegen, Neven et al. 2006), productos lácteos (Tucker and Woods, 1995), productos cárnicos (Aehele, 2007), industria de las grasas y oleoquímicas (Hasan, F., A. A. Shah, et al. 2006), la producción de polímeros biodegradables ( Linko, Y. Y., M. Lamsa, et al, 1998), el mejoramiento del sabor y la calidad de los alimentos (Gupta, R., P. Rathi, et al.2003), tratamiento de agua residuales (Dharmsthiti, S. and B. Kuhasuntisuk, 1998) y producción de biodisel ( Rivera, Villanueva, et al. 2009, Iso, Chen, et al. 2001; Van Gerpen 2005; Domínguez de María, Sinisterra, et al. 2006).

6

2.2.4 Hidrólisis enzimática Se entiende por hidrólisis enzimática aquella que se produce mediante un grupo de enzimas llamadas hidrolasas. Estas enzimas ejercen un efecto catalítico hidrolizante, es decir, producen la ruptura de enlaces por agua según:

(J.C.López. Enzimología. Ed. Científico-Médica).

2.3 Lipasas Las lipasas son enzimas usadas en los organismos para degradar las grasa de los alimentos de manera que se puedan absorber, por ello son utilizadas en catálisis de triacilglicèridos (Nelson,Flogia et al. 1996 ). La literatura revela que las lipasas son de origen; microbiano y se derivan de Asperguillus nige, Bacillus thermoleo, Candida rugosa, Pseudoma cepacia, entre otras; origen animal que se obtienen del páncreas (Nelson,Flogia et al. 1996); y vegetal encontradas en el látex de papaya, semillas de avena y ricino (Akoh,C.C.,S.W.Chang, et al.2007).

2.3.1 Mecanismo catalítico de las lipasas Para entender el mecanismo catalítico se deben considerar las estructuras tridimensionales de los complejos entre las lipasas y triglicéridos en el mecanismo catalítico en la transesterificación de triglicéridos. El sitio activo de las lipasas consiste en una tríada catalítica Ser-His-Asp/Glu, esta tríada catalítica es similar a la observada en las serina - proteasas. En este aspecto, se han planteado mecanismos para la hidrólisis de los enlaces éster siguiendo el mecanismo de las serina - proteasas. Dijkstra, et al. 1999).

7

(Jaeger, K., B.

2.4 Triacilglicèridos Los aceites y grasas están constituidos principalmente por triacilglicèridos, que son moléculas resultantes de la esterificación de la glicerina con tres moléculas de ácidos grasos. Los triacilglicèridos (conocidos popularmente como triglicéridos) pueden ser mixtos, según sean los grupos sustituyentes unidos a la molécula de glicerina. La composición de un aceite o grasa se puede expresar en función de sus triacilglicèridos o de su perfil de ácidos grasos. (Hernández, P.N.B; J.R.A. Santamaría, et al. 2009).

Figura 2. Molécula de triglicérido

8

2.5 Reacción de Transesterificación Reacción entre un triacilglicérido (compuesto por una molécula de glicerol esterificada por tres moléculas de ácidos grasos), contenido en el aceite vegetal o grasa animal y un alcohol ligero (metanol o etanol), obteniéndose como productos glicerina y ésteres derivados de los tres ácidos grasos (Speigth G.J, 2008).

Figura 3. Reacción de Transesterificación

2.5.1 Variables en la transesterificación de triacilglicèridos Las principales variables que influyen en el rendimiento, conversión y cinética de la reacción son la calidad de la materia prima, el tipo y la cantidad del catalizador, el alcohol, la relación molar alcohol/aceite y las condiciones de reacción como temperatura, presión y agitación (Freedman, Prydeet al. 1984; Akoh, Chang et al 2007). Al incrementar la temperatura el rendimiento aumenta y el tiempo de reacción se reduce, se recomienda que la temperatura no exceda el punto de ebullición del alcohol porque se evapora y forma burbujas que limitan la reacción en las interfaces alcohol-aceite-biodiesel (Meher, VidyaSagar et al. 2006). Además en la catálisis enzimática las altas temperaturas degradan las enzimas.

9

3. Planteamiento del Problema La transesterificación de triacilglicèridos constituye una alternativa viable para la obtención de energía limpia, ecológica y económica. (Haas, M. J; A. J. McAloon, et al. 2006). Para ello, una opción prometedora

es encontrar

alternativas en las materias primas usadas. La catálisis enzimática se ha explorado recientemente con buenos resultados (Al-ZuhairS; 2005). Estos procesos son generalmente más limpios y ecológicos, las enzimas utilizadas son lipasas obtenidas de hongos y bacterias, el costo de estas enzimas es elevado debido a que su proceso de obtención y purificación es caro. Se sabe que las semillas de Ricinus communis contienen lipasas, pero se desconoce si estas lipasas sirven como catalizador en la reacción de transesterificación de grasa animal y aceite vegetal como desecho para la producción de un bioenergético.

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4. Justificación Las lipasas por su amplio poder catalítico son utilizadas en muchas reacciones orgánicas, entre las que se encuentran la hidrolisis, esterificación y transesterificación. Estas reacciones usualmente se dan con alto grado de selectividad, haciendo de las lipasas un importante grupo de biocatalizadores en la química orgánica. Además, las lipasas también presentan otras características especiales entre las cuales, una de mucha importancia es la estabilidad en solventes orgánicos. El uso de derivados de aceites vegetales como combustibles alternativos ha tomado un amplio interés debido al aumento en los precios del petróleo y a los problemas ambientales que ocasiona la combustión de combustibles fósiles. Ricinus communis es localizada de forma silvestre, es decir, que crece sin necesidad de un cuidado especializado y en cantidades abundantes en distintas regiones del país. Dentro de la misma, se encuentra una elevada cantidad de semillas, las cuales además de la enzima contienen, una gran cantidad de aceite que puede ser empleado en distintos procesos de manera sustentable.

El uso de un biocatalizador natural como es la lipasa, presente en las semillas, de Ricinus communis, se cree que puede sustituir a los catalizadores convencionales, esto resulta una alternativa importante. El costo de producción se reduce, además de ser un proceso sustentable ya que la Higuerilla es un producto natural y renovable, al mismo tiempo el uso de grasa animal, aceite vegetal como desecho, de escaso valor comercial y contaminante del ambiente, todo ello se aprovecharía para generar biocombustibles de forma renovable.

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5. Hipótesis Las lipasas contenidas en la Higuerilla (Ricinus communis) son capaces de catalizar la reacción de transesterificación de los triglicéridos contenidos en la grasa animal y aceite vegetal de desecho.

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6. Objetivos

6.1.

Objetivo General

 Demostrar que las lipasas contenidas en las semillas de Ricinus comunnis funcionan como biocatalizadores en la transesterificación de triacilglicèridos.

6.2 Objetivos específicos  Determinar condiciones físicas y químicas de reacción para obtener un mejor rendimiento.  Proponer una metodología alterna para la producción de biodiesel utilizando un catalizador natural.  Lograr una transesterificación completa de los ácidos grasos contenidos en los triacilglicèridos usados en cada reacción.

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7. Metodología El material utilizado fue perfectamente lavado y llevado a una estufa de secado a 52°C (solo cristalería).

La enzima utilizada previamente fue pulverizada en mortero, activada y conservada a 4°C hasta su uso. Las reacciones fueron seguidas por cromatografía en capa fina, utilizando una mezcla de 95:5 hexano/acetato de etilo como fase móvil y una solución de acido fosfomolìbdico al 10%, utilizada como revelador. Para la cromatografía en capa fina se utilizaron cromatofolios de la marca MEREK® silica gel 60. Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de protón (RMN 1H) fueron realizados en un equipo Varian modelo Mercury Plus a 300 MHz utilizando cloroformo deuterado (CDCl3) como disolvente y tetrametilsilano (TMS) como referencia interna.

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7.1.

Recolección, lavado y extracción de aceite de la semilla

La planta fue obtenida en la Ciudad de Xalapa Enríquez con dirección Doctor Castelazo Ayala, en el estado de Veracruz - Llave, México. Se inició la recolección de

semillas de R. comunnis con diferentes

características físicas, observando que los racimos secos son los que contienen la semilla madura que se utilizo en este trabajo.

Figura 4. Frutos verdes y secos

Figura 5. Frutos seco

Características: el fruto color verde es blando-carnoso con un gran porcentaje de agua, sus semillas son pequeñas de coloración blanca y frágiles; el fruto seco color café, contiene semillas de capa dura color café marmoleado, esta protege a la almendra (endosperma) blanca-carnosa con presencia de aceite donde se encuentra la enzima.

Figura 6. Semillas fuera del fruto seco

15

Figura 7. Semillas con cáscara y su almendra

Las semillas recolectadas se lavaron con agua destilada y se cortaron en pequeños pedazos y se llevaron a un matraz con acetona por 24 horas a temperatura ambiente con agitación manual para extraer el aceite. Transcurridas 24 h, la solución fue filtrada en un embudo Buchner al vacío. El filtrado se evaporó en rotavapor a 60°C para eliminar la acetona contenida. El aceite obtenido fue pesado para los cálculos de rendimiento. En el sólido recuperado en el papel filtro se encuentra la lipasa, la cual se dejó secar 24 horas a temperatura ambiente, una vez seca es pesado y conservado a 4°C hasta su uso.

Figura 8. Semilla entera y pulverizada sin aceite 16

7.2.

Reacción de Hidrólisis con lipasas

Para comprobar la actividad catalítica que realiza la enzima de forma natural en la hidrólisis de ésteres, especialmente de triacilglicèridos se preparó la reacción que se describe a continuación. Se montó un blanco que sirvió de referencia para seguir el avance de la reacción.  En un matraz bola se depositarón cuidadosamente 1 g de aceite, 0.6 ml de CH3-COOH 0.1N pH 4.7, 0.1 g de enzima; se agitaron manualmente por 3 minutos.  Se monto un baño de agua a 37 °C donde se colocaron las muestras por 24 h.  La reacción fue monitoreada por medio de cromatografía en capa fina por 5 h ya que se reportó que en este tiempo existe un avance de 80% en la reacción (Longenecker H.E. et al. 1935).  Una vez terminado el tiempo de reacción se agrego etanol al 95% caliente y se procedió a titular con NaOH 0.1 N usando fenolftaleína como indicador.

7.3 Activación de la enzima Se utilizó el método propuesto por MelekTüter para activar las lipasas en una solución buffer pH 4 (Tüter, M 1998). I.

Se prepara un la solución buffer pH 4 citrato-fosfato (KH2PO4 /C6H8O7) se conservo hasta su uso a 4°C.

II.

En un matraz Erlenmeyer, se pesó la enzima, se viertió la solución buffer y se conservó a 4°C por 4 horas.

III.

Terminado el tiempo de la reacción se filtró al

vacio para obtener la

enzima que se seco por 24 horas a temperatura ambiente.

17

7.4 Reacción de Transesterificación Con la enzima activada se realizaron las reacciones de transesterificación, que se llevaron a cabo en

matraces bola de 25 ml. Colocando en ellos

triacilglicèridos, alcohol, lipasas y disolvente en diferentes proporciones (Ver Tabla 2). Los triacilglicèridos utilizados en este estudio fueron grasa de pollo, aceite puro de pepita de uva (Borges) y aceite de soya usado (Nutrioli). Los disolventes: Hexano e Isooctano Las

condiciones

de

reacción

que

permanecieron

constantes

fueron:

temperatura de 37°C, agitación magnética de 320 rpm y tiempo de 24 y 48 h.

Tabla 2. Cantidades por reactivo en las reacciones

Reactivos

Peso / Volumen %

Triacilglicèridos ⃰

0.2g

Lipasas

20% 30% 40% 50%

Etanol

37.6 μL 50 μL 62 μL 1mL

Isooctano/Hexano

2 mL

⃰ Grasa de pollo, Aceite puro y Aceite usado.

18

8. Resultados y Discusión 8.1 Recolección de semillas y Extracción de aceite Se realizó la cuantificación de las semillas con cáscara y sin ella después de su recolección; ya que el peso obtenido de estas fue necesario para cuantificar el porcentaje del aceite contenido en las semillas, conociendo el peso del aceite extraído. 1 semilla: 0.237 g

76 semillas colectadas: 26.46 g

1 semilla sin cascara: 0.172 g

76 semillas: 11.779 g

Figura 9. Almendra de la semilla

Aceite extraído:

7.53 g

Figura 10. Aceite extraído

El aceite extraído de las semillas representó el 64% del peso total; el peso de las semillas secas sin aceite fue de 3.25 g que constituyó el 27%, esto quiere decir; que en todo el proceso para obtener la semilla sin aceite se perdió un 8% en peso de materia. 19

8.2 Reacción de Hidrólisis Se valoró cuantitativamente la hidrólisis por medio de una titulación, la cual reveló un rendimiento del 74% después de 24 h a 37°C Después de un tiempo de incubación, la reaccione fue puesta en un matraz Erlenmeyer de 50 ml con 95% de etanol caliente. Los ácidos grasos fueron titulados con 0.1 N de una solución alcalina (NaOH) usando fenolftaleína como indicador.

Cálculo del rendimiento de hidrolisis por titulación Porcentaje de Hidrolisis

=

cc. 0.1 N NaOH (muestra)  cc. 0.1N NaOH (blanco ) No. de saponifica ción (aceite )  No. de Acidos grasos libres

8.3 Activación de la enzima En la metodología que se usó para activar la enzima, se observó una pérdida del peso de la enzima en un 25%. El peso inicial fue 1.63 g de enzima en la solución buffer; transcurrió el tiempo de activación, se dejó secar. El peso de la enzima seca y activada fue de 1.22 g que representa el 75%.

8.4

Resultados de reacción de transesterificación

Se montó una reacción preliminar para comprobar la actividad biocatalítica de la enzima, la cual fue seguida por cromatografía en capa fina,

dando un

resultado positivo. Con este resultado se procedió a probar diferentes condiciones (relación

estequiometria lipasa-triacilglicérido,

disolventes

y

tiempo) hasta encontrar las más adecuadas. Se realizaron múltiples experimentos que fueron evaluados cualitativamente y con la interpretación de los resultados obtenidos se cuantificaron 12, los cuales presentaron un mayor avance de transesterificación y como producto se obtuvo biodiesel de la conversión de los triacilglicèridos. 20

Los experimentos del 1 al 7 y el número 12 son realizados con aceite de pepita de uva, en el

8 - 9

se utilizó aceite usado de soya y el 10 -11 fueron

experimentados con grasa de pollo. El peso de la enzima que fue empleado, se expresó en porcentaje, en relación al peso total de cada reacción. (Ver Tabla 4).

Tabla 3. Reacciones de Transesterificación

Experimento

Enzima (mg)

Etanol (μL)

Conversión ⃰ (%)

α

41.9 (20%)

37.7(9eq)

61c

α

68.9 (30%)

37.7(9eq)

70

α

91.8 (40%)

37.7(9eq)

82 c

11.48 (50%)

37.7(9eq)

88 c

α

41.9 (20%)

62.7(15eq)

66 c

α

68.9 (30%)

62.7(15eq)

67 c

11.48 (50%)

62.7(15eq)

85 c

β

11.48 (50%)

37.7(9eq)

91d

β

11.48 (50%)

1 ml

52e

10

β

11.48 (50%)

37.7(9eq)

60d

11β

11.48 (50%)

1ml

39e

β

11.48 (50%)

1ml

97

1 2 3

α

4 5 6

β

7 8 9

12

α

1

c

e

β

⃰ Calculado por RMN de H. Tiempo de 24h y 48 h. c

Disolvente (2 mL) Isooctano

d

e

Hexano Sin Disolvente.

El rendimiento de las reacciones se determinó mediante RMN de ¹H por integración de la región entre 4.0 – 4.5 ppm, debido a que en esta puede observarse de forma clara la diferencia entre las señales para triglicérido con las del éster etílico formado.

21

Figura 11. Espectro de RMN de 1H a 300 MHz del Triacilglicérido en CDCl3

22

Figura 12. Espectro de RMN de 1H a 300 MHz del triacilglicérido transesterificado preparado con etanol en CDCL3

La figura 12 muestra una de las señales, en la región de 4.05 – 4.3 ppm, esta representa el producto de la reacción de transesterificación, del triacilglicérido de la figura 11, demostrando así la actividad catalítica de la enzima, de los ácidos grasos con etanol.

23

Se demostró la actividad biocatalítica de pruebas que se realizaron en presencia de dos disolventes: Isooctano y hexano. Posteriormente se decidió repetir las reacciones de transesterificación con los mejores resultados de RMN de 1H pero sin disolvente, con los diferentes triglicéridos ya experimentados con etanol. (Ver tabla 5).

Tabla 4. Reacciones sin o con disolvente.

Triacilglicérido

% Enzima

Transesterificación

Transesterificación

sin Disolvente %

con Hexano %

Aceite de pepita

50

97

85

Aceite usado

50

52

91

Grasa de pollo

50

39

60

La tabla anterior describe la catálisis enzimática de las lipasas con éxito; mostrando en los siguientes espectros, la mejor conversión de cada triacilglicérido a éster (biodiesel).

24

Figura 13. Espectro de RMN de1H a 300 MHz del biodiesel con etanol y aceite usado en CDCl3

25

Figura 14. Espectro de RMN de1H a 300 MHz del biodiesel con etanol y aceite puro en CDCl3

26

Figura 15. . Espectro de RMN de1H a 300 MHz del biodiesel con etanol y grasa de pollo en CDCl3

27

9. Conclusiones  Las enzimas contenidas en las semillas de Ricinus comunnis catalizaron la reacción de hidrólisis con rendimiento del 74%.  Las lipasas contenidas en las semillas de R. comunnis utilizadas en este estudio

presentaron

actividad

biocatalítica

en

la

reacción

de

transesterificación de triacilglicèridos y etanol, con y sin disolvente.

 Todos los lotes de las lipasas presentaron actividad biocatalítica.  Usando como disolventes Isooctano y Hexano los rendimientos de cada reacción fueron extraordinarias.  Las condiciones encontradas para la mejor conversión de triacilgliceridos a biodiesel fue con 50% de enzima y sin disolvente  Se estableció que las enzimas presentes en las semillas de R. communis transesterifican con etanol eficientemente los triacilglicèridos usados a 37°C.  Después de un año del corte de la semilla y extracción de aceite, las enzimas trabajaron satisfactoriamente en las reacciones, lo que indica que su vida útil es larga manteniéndola bajo las condiciones de almacenamiento adecuadas.  El producto de la transesterificación: biodiesel, fue un biocombustible económico, debido a que después de la extracción del aceite de ricino, se desecha el resto de la almendra contenida en la semilla, lugar donde se encuentra la enzima, lo que no implicaría un costo extra en la obtención de la lipasa; al mismo tiempo los triacilglicèridos usados son desechos del consumo humano que generalmente no tienen tratamiento, lo cual evitaría contaminación al medio ambiente. 28

 Por lo anteriormente descrito, se concluyó del

presente trabajo, fue

sustentable al 100%, debido a que: al no usar disolvente; se minimiza el impacto

ambiental,

evitando

la

contaminación

con

el

uso

de

triacilglicèridos consumidos; al ser desechados por el hombre y haber manejado materias primas que son productos de desecho se reduce el costo de producción.

29

10. Anexo

Composición de los ácidos grasos de los Triacilglicèridos

Tabla 5. Ácidos grasos de Aceite de semilla de uva (FAO/OMS, 1997). Ac. Grasos Saturados (Esteárico y Palmítico)

Peso 2.1g

Poliinsaturados (linóleico y linolénico)

7.5g , 1.0g

Peso Molecular 284.48g/mol 256.47g/mol 278.43g/mol

Monoinsaturados (Oleico )

3.4g

282g/mol

Tabla 6. Aceite de soya usado en cocina (FAO/OMS,1997 ). Porcentaje Saturados (Palmítico )

10.71%

Peso molecular 256.47g/mol

Monoinsaturados (oleico)

22.6%

282g/mol

Poliinsaturados (Linóleico)

63.15%

254.40g/mol

Ac. Grasos

Tabla 7. Grasa de pollo. (Hernández, P.N.B; J.R.A. Santamaría, et al. 2009) Ac. Grasos

Porcentaje

Peso Molecular

Saturados (Palmítico y Mirístico)

21.6%

256.47g/mol

1%

228,36 g/mol

44 %

282g/mol

5.4%

254.408g/mol

25%

254.40g/mol

Monosaturados (oleico y palmitoleico)

Poliinsaturados (Linóleico)

30

11. Bibliografía Al-Zuhair

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of

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by

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