UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS ZONA XALAPA
PROGRAMA EDUCATIVO INGENIERIA AMBIENTAL
TRATAMIENTO DEL SUERO DE QUESERIA CON CÉLULAS DE Kluyveromyces lactis INMOVILIZADA Y Saccharomyces cerevisiae
TESIS QUE PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA EDUCATIVA DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL
PRESENTA DULCE DANITZA GARZÓN GARCÍA
DIRECTOR DRA. CARMEN BULBARELA SAMPIERI
CO-DIRECTOR DR. MICLOTH LÓPEZ DEL CASTILLO LOZANO
Xalapa, Ver., Diciembre 2013
Dedicatorias A Dios, por permitirme un día mas vida y la conclusión de esta meta. A mis padres, Porque gracias a su apoyo y consejos, he llegado a realizar una de mis grandes metas lo cual constituye la herencia más valiosa que pudiera recibir. A mis hermanos y hermana, con quienes comparto mis logros y deseos de superacion. A la familia Carrera Vázquez, por la confianza depositada en mí y mi familia. A mi abuelita, tíos, tías y primos de quienes siempre recibí palabras de aliento. A mis abuelitos y tíos que siempre me demostraron su cariño y que desde donde se encuentran sigo recibiendo sus bendiciones. A mis amigas: Angy, Are, Carito y Diana, hermanas de destino, quienes siempre me brindaron su cariño y compañia.
A todas las personas, que tuvieron algún gesto de interés y que me regalaron palabras de aliento.
Agradecimientos A la Dra. Carmen y Dr. Micloth por tomarse el tiempo para guiar y corregir este trabajo, les agradezco profundamente su apoyo e interés, por compartirme sus conocimientos y experiencia. A la Dra. Lorena de Medina, por su apoyo y consideraciones. A la Dra. Yolanda,
a quien le profeso una gran admiración y
agradezco profundamente su apoyo brindado, para la realización del trabajo experimental de este proyecto. A la Dra. Tere Leal y mis compañeros Dora y Jesús, sin los que hubiera sido imposible realizar determinaciones que forman parte medular de este trabajo. A mis compañeros del cuerpo académico: Ray, Ruben y Lugardo por su apoyo y tiempo brindado y en especial a Jenny, gran compañera y amiga. A Vicky y demás compañeros del laboratorio 34 con los que las obligaciones se hacían mas amena.
“El peligro radica en que nuestro poder para dañar o destruir el medio ambiente, o al prójimo, aumenta a mucha mayor velocidad que nuestra sabiduría en el uso de ese poder”. Stephen Hawking
Índice Página Índice de figuras ........................................................................................................................ iii Índice de tablas .......................................................................................................................... iii RESUMEN ................................................................................................................................... v SUMMARY .................................................................................................................................vii Introducción ................................................................................................................................. 1 Capítulo 1. Antecedentes .......................................................................................................... 3 1.1 Planteamiento del problema .............................................................................................. 5 1.2
Justificación ..................................................................................................................... 6
1.3
Hipótesis .......................................................................................................................... 7
1.4
Objetivos .......................................................................................................................... 7 Objetivo general .......................................................................................................... 7
1.4.1 1.4.2
Objetivos específicos ............................................................................................. 7
Capitulo 2. Marco teórico .......................................................................................................... 8 2.1
Leche ................................................................................................................................ 8
2.2
Queso ............................................................................................................................... 9
2.3
Suero de quesería ........................................................................................................ 11
2.3.1
Componentes nutricionales ................................................................................ 12
2.3.2
Suero de quesería y su impacto ambiental ...................................................... 14
2.3.3
Aprovechamiento del suero de quesería .......................................................... 15
2.4
Levaduras ...................................................................................................................... 16
2.4.1
Condiciones para el crecimiento de las levaduras .......................................... 17
2.4.2
Ciclo de crecimiento de las levaduras ............................................................... 18
2.4.3
Saccharomyces cerevisiae ................................................................................. 19
2.4.4
Kluyveromyces lactis........................................................................................ 20
2.5
Inmovilización de células ............................................................................................. 20
2.5.1
Inmovilización por atrapamiento......................................................................... 21
2.5.2
Usos de la inmovilización .................................................................................... 22
2.5.3
Producción de metabolitos con células inmovilizadas .................................... 23
Capitulo 3. Materiales y métodos........................................................................................... 24 3.1
Muestreo y caracterización del suero de quesería ............................................. 24
i
3.2
Cepas utilizadas ....................................................................................................... 25
3.3
Técnicas microbiológicas ........................................................................................ 25
3.4
Inmovilización celular ............................................................................................... 26
3.5
Fermentación ............................................................................................................ 26
Capitulo 4. Resultados y discusión ........................................................................................ 30 4.1
Muestreo y caracterización de suero de quesería .............................................. 30
4.2
Análisis fisicoquímico ............................................................................................... 30
4.3
Crecimiento de K. lactis 837 y S. cerevisiae en suero de quesería ................. 31
4.4
Efecto de la fermentación sobre la DQO y SST .................................................. 33
4.5
Determinación de cinética para consumo de lactosa ......................................... 34
Conclusiones y recomendaciones ......................................................................................... 36 Bibliografía ................................................................................................................................. 37 Anexo A: Cartel presentado en el “3er Foro Ambiental UPIBI 2013”, en la modalidad de trabajos libres ............................................................................................................................ 43 Anexo B: Metodología para la determinación de la DQO .................................................. 44 Anexo C: Metodología para la determinación de solidos suspendidos totales .............. 55
ii
Índice de figuras Página Figura 1. Diagrama general de la elaboración del queso ................................. 11 Figura 2. Estructura de la lactosa ..................................................................... 13 Figura 3. Esquema general para la valorización del suero de quesería. .......... 15 Figura 4. Curva de crecimiento de las levaduras ............................................. 19 Figura 5. Comportamiento del crecimiento de células libres de S. cerevisiae y células inmovilizadas de K. lactis 837 inmovilizada en cultivo mixto en suero de queso desproteinizado en función del tiempo. ................................................. 32 Figura 6. Comportamiento entre el consumo de lactosa y la disminución del pH del cultivo mixto de S. cerevisiae y K. lactis 837 en medio SR desproteinizado ......................................................................................................................... 33 Figura 7. Comportamiento entre el consumo de lactosa y la disminución del pH del cultivo mixto de SC y KL837 en medio SR desproteinizado ....................... 34
Índice de tablas Página Tabla 1. Características físicas y químicas promedio de la leche fresca ........... 8 Tabla 2. Composición general de la leche, en porcentajes. ............................... 9 Tabla 3. Composición promedio del suero de quesería ................................... 12 Tabla 4. Fermentación de azúcares de S. cerevisiae....................................... 19 Tabla 5. Fermentación de azucares de K. lactis............................................... 20 Tabla 6. Procedencia de las muestras de sueros de quesería analizados ....... 30 Tabla 7. Caracterización de los distintos tipos de suero obtenidos en diferentes queserías.......................................................................................................... 31
iii
Parte de este trabajo fue presentado en la modalidad de trabajos libres en el 3er Foro Ambiental celebrado del 18 al 20 de septiembre en la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología UPIBI-IPN, México, D.F. (Anexo A)
iv
RESUMEN El suero de queso, generado en la producción de queso el cual al ser descargado en cuerpos de agua y suelo sin un tratamiento previo ocasiona un desequilibrio ambiental a estos sistemas, atribuido a las altas concentraciones de demanda química de oxígeno (DQO) y sólidos suspendidos totales (SST), por lo cual es necesario valorizar este residuo en aplicaciones que sean factibles tecnológica y económicamente para ser empleadas en queserías artesanales como las establecidas en la zona centro del Estado de Veracruz en los municipios de Coatepec, Jilotepec, Xico, Naolinco y Acajete. En este trabajo se evaluó la eficiencia del tratamiento de suero de quesería con un cultivo mixto de Kluyveromyces lactis inmovilizado en una matriz de alginato y Saccharomyces cerevisiae en suspensión para la reducción de la DQO y SST principalmente. Primeramente se caracterizó fisicoquímicamente el suero de quesería obtenido de diferentes microempresas productoras de queso de la región de Xalapa, observando que existen pocas diferencias fisicoquímicas de dicho producto de los diferentes productores. Posteriormente se realizó la fermentación del suero de quesería dulce por ser aquel que presentaba la mayor cantidad de lactosa. Para lo cual se realizó primeramente la inmovilización de la cepa de K. lactis por ser aquella que era capaz de degradar la lactosa. Posteriormente fue puesto en un cultivo mixto con células libres de S. cerevisiae. Y se determinaron los siguientes parámetros: disminución del pH, consumo de lactosa, crecimiento celular, DQO y SST en el medio de fermentación. Los resultados determinan un crecimiento de 1.24X1010±1.23X1010 UFC/g para S. cerevisiae en comparación con el presentado por K. lactis 837 (2.87x108±2.8X108 UFC/g) inmovilizado en perlas de alginato de calcio. En cuanto a los parámetros de eficiencia para el tratamiento del suero de quesería se obtuvieron los siguientes resultados: en el consumo de lactosa se observó una disminución del 76%, así como una reducción de un 35% de la DQO y un 83% de SST después de 168 h de cultivo. Por lo tanto se demuestra la posibilidad de aplicar este proceso fermentativo para el tratamiento del suero
v
de quesería y la posibilidad de la obtención de un metabolito que pueda ser de interés comercial. Palabras claves: Suero de queso, Inmovilización celular, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae. DQO.
vi
SUMMARY The cheese whey generated in the production of cheese which when discharged into water bodies and land without prior treatment causes an environmental imbalance these systems , attributed to high concentrations of chemical oxygen demand ( COD ) and suspended solids (TSS ) , which is necessary for valuing this residue in applications that are technologically and economically feasible to be used in cheese makers such as those in the central area of the state of Veracruz in the municipalities of Coatepec , Jilotepec , Xico , Naolinco and Acajete . This study evaluated the efficiency of treatment of cheese whey with a mixed culture of Kluyveromyces lactis immobilized in an alginate matrix and Saccharomyces cerevisiae in suspension for the reduction of COD and TSS mainly. First was characterized physicochemically serum obtained from different micro dairy producing cheese Xalapa region , noting that there are few such product physicochemical differences of the various producers. Later the fermentation of cheese whey to be those showing the greatest amount of lactose. For which it was first immobilizing the strain K. lactis to be one that was able to degrade lactose. Later he was put in a mixed culture with free cells S. cerevisiae. And the following parameters were determined: pH decrease , lactose consumption , cell growth, COD and TSS in the fermentation medium . The results determine 1.24X1010 growth ± 1.23X1010 UFC / g for S. cerevisiae compared presented by K. lactis 837 ( 2.87x108 ± 2.8X108 CFU / g ) immobilized in calcium alginate beads . Regarding efficiency parameters for the treatment of cheese whey yielded the following results in the consumption of lactose there was a decrease of 76% and a 35% reduction of COD, and 83 % TSS after 168 h of cultivation. Therefore demonstrates the applicability of this process of fermentation for the treatment of cheese whey and the possibility of obtaining a metabolite that can be of commercial interest. Keywords:
Cheese
whey,
cell
immobilized,
Saccharomyces cerevisiae, COD
vii
Kluyveromyces
lactis,
Introducción El suero de quesería es el líquido obtenido de la coagulación enzimática o química de la caseína de la leche. Aunque el volumen de suero generado depende del tipo de queso producido, se estima que en promedio por cada kilo de queso se generan de 8 a 9 litros de suero de quesería. Este, contiene principalmente lactosa (4.9-6.0%) y proteínas solubles (1.1-3.6%) que se traducen en una alta demanda química de oxígeno (DQO, 50-70 g/L) (Frigon et al., 2009; Prazeres et al., 2012). A pesar la riqueza nutricional este subproducto, en México alrededor de 470 mil toneladas son descargadas al drenaje y llegan a ríos y suelos, alterando las propiedades fisicoquímicas de estos ecosistemas (Valencia et al., 2009). Las queserías de pequeña y mediana escala presentan cada vez más problemas para el tratamiento de este desecho ya que no pueden permitirse altos costos de inversión en tecnologías de valorización del suero (como la recuperación de proteínas y lactosa del suero de quesería, secado por pulverización, etc.), siendo los tratamientos físico-químicos y/o biológicos una buena alternativa de tratamiento (Saddoud et al., 2006). Por ello, es necesario evaluar diversas opciones de tratamiento del suero producido por la industria quesera en las cuales se valorice los nutrimentos contenidos en este residuo y su uso en procesos fermentativos. Una opción es el uso de microrganismos de interés biotecnológico, con los cuales se pueden obtener metabolitos de interés industrial que junto con la tecnología de inmovilización celular se pueden aplicar a los procesos de bioconversión de suero de quesería puede mejorar la economía y el rendimiento de tales procesos. El presente trabajo busca aportar una alternativa de aprovechamiento del suero de queso dulce generado en queserías artesanales ubicadas en los municipios de Coatepec, Xico, Naolinco, Jilotepec y Acajete, en el marco de las actividades realizadas por el cuerpo académico de “Gestión agroindustrial y ambiental” de la Facultad de Ciencias Químicas.
1
En su primer capitulo se presentan los antecedentes y el planteamiento del problema, la justificación de realizar esta investigación, así como la hipótesis y objetivos bajo los cuales se desarrollo. El capitulo dos comprende conceptos específicos de los entes que intervienen en esta investigación, así para la industria quesera se da un acercamiento a través de su materia prima, la leche, y el proceso de producción del queso, el suero de queso que habrá de utilizarse como medio de fermentación se establece su composición promedio, impacto ambiental y opciones de aprovechamiento. Otro término que se abordan en este capítulo es una descripción de las características de las levaduras utilizadas en el proceso de estudio de este trabajo utilizadas para la realización del trabajo, las condiciones bajo las cuales crecen favorablemente, su ciclo de crecimiento. Del mismo modo se incluye también se especifican conceptos básicos de la inmovilización celular, sus usos y su importancia en la producción de metabolitos. Para el capitulo tres se enlistaran las técnicas utilizadas para la caracterización del suero, procedente de queserías artesanales de la zona centro del Estado de Veracruz, las cepas utilizadas y las técnicas microbiológicas utilizadas durante la investigación, la inmovilización de las levaduras y finalmente los parámetros a través de los cuales se dio seguimiento a la fermentación incluyendo la DQO y los solidos suspendidos totales. Los resultados de exponen en el capitulo cuatro, así como su discusión, lo cual nos servirá para establecer las conclusiones del presente trabajo y posibles recomendaciones.
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Capítulo 1. Antecedentes Las opciones de tratamiento del suero de quesería se han dado en procesos microbiológicos aerobios y anaerobios, en los cuales además de buscar la reducción de parámetros como la DQO como en la generación de productos de interés económico, Prazeres, et al. en 2012 realizaron una revisión a través de la cual consideran opciones de valorización del suero de queso con la premisa que los nutrientes contenidos en este pueden ser usado para la producción de biomasa y metabolitos de interés comercial a través de medio biotecnológicos. Con base en este último punto, los proyectos se enfocan principalmente en la utilización del suero para la elaboración de productos alimenticios, tales como bebidas, quesos, sustitutos de quesos y de productos edulcorados. Desde el punto de vista biotecnológico, existen diversas investigaciones a nivel mundial que se conducen hacia el aprovechamiento del suero de quesería con microrganismos, como la producción de alcohol y biomasa a partir de procesos fermentativos con levaduras como Kluyveromyces marxianus (Grba et al., 2002). El uso de cultivos mixtos, es ampliamente utilizado para producir etanol a partir de lactosa con microorganismos como S. cerevisiae pero que no son capaces de hidrolizar lactosa junto con microorganismos que si son hidrolizan la lactosa, ya que Magalhães et al., (2013) evaluaron la producción de etanol de suero de queso desproteinizado por un cultivo conjunto de K. marxianus y S. cerevisiae obteniendo una concentración de etanol de 16,02±0,11 g L -1. La inmovilización celular presenta ventajas biotecnológicas, permitiendo que exista una mayor densidad celular los biorreactores y hace posible la reutilización y el funcionamiento continuo de los mismos, lo que evita la necesidad de separar las células de los productos para un tratamiento posterior. Kosseva et al., (2009b) declaran que K. marxianus inmovilizado en una matriz de alginato brinda un alto porcentaje de conversión de lactosa a etanol (80-88%) en comparación a otros sistemas de células inmovilizadas. Guo et al., (2010) evaluaron la fermentación de una solución concentrada de suero de queso en polvo (10% de lactosa) con células libres o inmovilizadas de
3
K. marxianus en monocultivo o cultivo mixto con células libres o inmovilizadas de S. cerevisiae, observando el mayor rendimiento en la producción de etanol en el cultivo mixto y con células inmovilizadas. También en México se han propuesto alternativas de utilización del suero de queso, como el desarrollo de una bebida a partir de suero fermentado con Lactobacillus acidophilus inmovilizados en trozos de zapote mamey (Pouteria sapota) (Ortiz et al., 2009). La elaboración de quesos a partir de suero, la cual es factible en cuanto a los requerimientos nutricionales para una buena alimentación a un costo razonable, según lo concluye Lagunes-Rendón en 2012, otra de las alternativas de manejo de este residuo ha sido el buscar la reducción de la DQO, así Ocampo, et al. en 2001 evaluaron y compararon la eficiencia de la reducción de la DQO, obtenida e cultivo por lote y continuo con cultivo mixto de levaduras. En la Universidad Veracruzana se han realizado diversos proyectos enfocados a la utilización de este subproducto. Landa en 2013, realizó una valoración del proceso de producción de biomasa de S. cerevisiae en cultivo mixto con K. lactis, obteniendo 71.6 g/L de biomasa en base seca. Hernández (2013), utilizó el suero dulce de quesería para la elaboración de un producto tipo cajeta, con la finalidad de aprovechar el alto valor nutricional de este subproducto de la industria láctea.
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1.1 Planteamiento del problema El suero de quesería generado como desecho en las industrias queseras se caracteriza por el alto contenido de sólidos y carga orgánica elevada, además de generarse en gran volumen. Un pequeño porcentaje de este desecho puede ser vertido al suelo debido a los minerales que aún contiene, contribuyendo al enriquecimiento de este; sin embargo, cuando se descarga en cantidad irracional al suelo o ríos es perjudicial. Este desecho debe ser tratado previamente para que se pueda verter directamente a un cuerpo receptor. A pesar de la existencia de sistemas basados en el uso de microrganismos que degradan la materia orgánica presente, los cuales han sido ampliamente estudiados para el tratamiento de efluentes con carga orgánica alta, el suero de quesería sigue siendo descargado sin un tratamiento previo. La mayoría de las ocasiones dichos sistemas de tratamiento no son llevados a cabo por el desinterés derivado de alto costo de su implementación y mantenimiento. Municipios de la región centro de Veracruz se caracterizan por la producción de queso de manera artesanal, siendo necesaria la caracterización del suero generado, así como su valorización en busca de alternativas de uso o tratamiento para disminuir los problemas ambientales que este ocasiona.
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1.2 Justificación El suero de quesería, un desecho para la industria quesera, puede ser integrado a un proceso fermentativo como medida para su tratamiento. Si el efluente presenta cierto interés comercial promovería la instalación del sistema, evitando la descarga directa de este desecho. Algunos microrganismos tienen la capacidad para producir alcohol a partir de los azúcares aún presentes en el suero de quesería; por lo cual contribuyen a la disminución de la carga orgánica permitiendo la integración del efluente a otro sistema de tratamiento y que el producto de dicha fermentación pueda ser comercializado. S. cerevisiae es una levadura que metaboliza la glucosa en condiciones anaerobias produciendo etanol, sin embargo no es capaz de metabolizar la lactosa, el principal azúcar de la leche y que se encuentra en alto porcentaje en el suero de quesería. Por lo cual la realización de un cultivo en conjunto con K. lactis, la cual utiliza la lactosa para su crecimiento, se puede disminuir la carga orgánica y producir etanol. La oportunidad de comercialización del fermento obtenido, representaría al productor un ingreso adicional a su actividad principal.
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1.3 Hipótesis Es factible disminuir la carga orgánica del suero de quesería a través de un cultivo conjunto de cepas de levaduras seleccionadas.
1.4 Objetivos 1.4.1 Objetivo general Evaluar el tratamiento de suero de quesería mediante la fermentación en cultivo conjunto de Kluyveromyces lactis inmovilizada en una matriz de alginato de calcio y Saccharomyces cerevisiae suspendida.
1.4.2 Objetivos específicos
Analizar fisicoquímicamente el suero de quesería obtenido de una quesería artesanal.
Determinar las cinéticas de crecimiento, de consumo de lactosa durante la fermentación de suero de quesería.
Evaluar la disminución de la carga orgánica (DQO) y de sólidos suspendidos totales en el suero de quesería tras la fermentación.
7
Capitulo 2. Marco teórico 2.1
Leche
La legislación mexicana a través de la NOM-155-SCFI-2012, define leche como el producto destinado para consumo humano, proveniente de la secreción natural de las glándulas mamarias de especies domésticas y a la leche de consumo humano a aquella que debe ser sometida a tratamientos térmicos u otros procesos que garanticen la inocuidad del producto; además puede ser sometida
a
operaciones
tales
como
clarificación,
homogeneización,
estandarización u otras, siempre y cuando no contaminen al producto y cumpla con las especificaciones de su denominación. Según lo indica Martínez (2004) la leche y sus derivados son alimentos de gran valor nutricional, por lo que no pueden ser fácilmente desplazados ni sustituidos por otros productos en la dieta. Son especialmente ricos en proteínas y calcio de fácil asimilación, nutrientes muy importantes en las etapas de crecimiento y desarrollo, así como para el mantenimiento de la masa ósea y muscular. Las características promedio para la leche fresca, según Revilla (1996) se presentan en la tabla 1. Tabla 1. Características físicas y químicas promedio de la leche fresca Fuente: Revilla, 1996
Materia grasa, mínimo
3.50 %
Sólidos totales, mínimo
12.00 %
Acidez, expresada en acido láctico, máximo
0.18 %
Proteína (Nx6.38), mínimo
3.00%
Cenizas, máximo
0.80 %
Ensayo de reductasa, mínimo a. Leche para consumo directo
6.50 horas
b. Leche para ser pasteurizada
4.00 horas
Sedimento en 473 cm3 de leche
2.00 mg
Punto de congelación, abajo de
0.53 ºC
8
Mientras que los constituyentes de la leche se encuentran en tres estados físicos: solución o fase hídrica, suspensión micelar o suspensión de la caseína ligada a sales minerales, y emulsión de la materia grasa bajo forma globular, lo cual permite la división de los ingredientes en tres grandes grupos: Agua, Sólidos no grasos (SNG), y Grasa (G). Los sólidos no grasos son llamados también Sólidos del suero de la leche (SS), Sólidos del plasma (SP), Extracto seco desengrasado, (ESD) o Extracto seco magro (ESM). La suma de los SNG y grasa forma los Sólidos totales (ST) o extracto seco total (EST) (Revilla, 1996). Tabla 2. Composición general de la leche, en porcentajes.
Fuente: Revilla, 1996 Constituyente Variación% Promedio% Agua
70.00-90.50
87.00
Proteínas
2.70-4.80
3.50
Lactosa
3.50-6.00
4.90
Cenizas
0.65-0.90
0.80
La leche es un producto alimenticio que se consume en fresco y de la cual también se pueden obtener diversos alimentos: yogurt, mantequilla, crema y quesos. Estos últimos son productos con alto valor nutricional y comercial por lo cual gran parte de la producción láctea se dirige hacia la producción de este alimento. La producción anual nacional de leche para el 2012 es reportada por Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP), con información de las delegaciones de la SAGARPA en 10,880,870,000 de litros de los cuales Veracruz aporto 715,190,000 litros, siendo el 23% procedente del Distrito de Desarrollo Rural (DDRS) de Coatepec que contempla los municipios de Xalapa, Naolinco, Coatepec, entre otros.
2.2
Queso
El queso puede definirse como un alimento lácteo obtenido por la coagulación
9
enzimática de la leche con la subsecuente separación del suero. Esta definición cubre la mayoría de los tipos de quesos producidos en el mundo; sin embargo, algunos quesos por coagulación sino por precipitación acida, constituirían excepciones a esta definición general. La FAO define al queso como un producto fresco o maduro que se obtiene de por el drenado posterior a la coagulación de la leche, crema, leche parcial o totalmente descremada o combinación de estas; no obstante, esta definición excluye a los quesos obtenidos de suero (García, et al., 2005). Mientras que en la norma mexicana NMX-F-713-COFOCALEC-2005 denomina al queso como el producto elaborado con la cuajada de la leche de vaca o de otras especies animales, fluida o en polvo, adicionada o no de sólidos lácteos, crema y/o grasa butírica, mediante la coagulación de caseína con cuajo, gérmenes lácticos, enzimas apropiadas, ácidos orgánicos comestibles, y con o sin tratamiento ulterior por calentamiento, drenada, prensada o no, con o sin adición de fermentos de maduración, mohos específicos e ingredientes y aditivos comestibles autorizados. La proporción entre las proteínas del suero y la caseína debe ser igual o menos al de la leche, no debe contener grasa y proteínas de origen diferente al de la leche, ni almidones y féculas. Se conocen en todo el mundo más de dos mil nombres de quesos (Hernández, 2003). Sin embargo, los tipos básicos y realmente distintivos probablemente se concreten a algunas decenas, y los distintos nombres dados a los quesos en diferentes regiones obedecen a tamaños, formas y diferencias menos significativas en los procesos de elaboración. Esto hace muy difícil clasificar a los quesos, pero en principio pueden distinguirse algunas clases muy generales; como por ejemplo, maduros y frescos:
Queso fresco, el producto que no es sometido a un proceso de maduración, presenta un alto contenido de humedad (hasta 80% m/m), textura blanda, sabor suave, no presenta corteza, requiere refrigeración para su conservación y se consume preferentemente en los primeros veinte días a partir de su elaboración.
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Queso maduro, el producto que es sometido a un proceso de maduración contiene menos humedad que los que los quesos frescos (hasta 62% m/m), puede ser de pasta dura, semidura o blanda, con o sin corteza, puede o no requerir condiciones de refrigeración para su conservación y se consume generalmente después de un mínimo de treinta días de maduración (Consejo para el Fomento de la Calidad de la Leche y sus Derivados, A.C., 2005)
Aunque el proceso de la producción varía según el tipo de queso a producir, en la figura 1 se muestra el diagrama general de elaboración de queso.
Figura 1. Diagrama general de la elaboración del queso
Fuente: García, et al., 2005
2.3
Suero de quesería
La NOM-243-SSA1-2010 define al suero de quesería como líquido obtenido de la coagulación de la caseína de la leche, mediante la acción de enzimas coagulantes de origen animal, vegetal o microbiano, por la adición de ácidos orgánicos o minerales de grado alimentario; acidificación por intercambio iónico hasta alcanzar el punto isoeléctrico de la caseína.
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El suero de leche o suero de quesería es el líquido resultante de la coagulación de la leche durante la elaboración del queso. Se obtiene tras la separación de las caseínas y de la grasa, constituye aproximadamente 90% del volumen de la leche y contiene la mayor parte de los compuestos hidrosolubles de esta. Su composición varía dependiendo de las características de la leche y de las condiciones de elaboración del queso que se procede, en términos generales la composición que el suero contiene se enlista en la Tabla 3. Tabla 3. Composición promedio del suero de quesería Fuente: García et al., 2005
Componente
Porcentaje en volumen (%)
Lactosa
4.9
Cenizas
0.6
Grasa
0,3
Acido láctico
0,2
Agua
93,1
El suero de quesería, según su acidez, se divide en tres tipos:
Suero dulce con pH mayor a 5.8.
Suero medio acido con pH entre 5.8 y 5.0
Suero acido con pH menor a 5.0.
Esto depende del tipo de procesamiento que se realice a la leche para la obtención de los diferentes tipos de quesos. En México, se produce principalmente el suero dulce y medio acido (García, et al., 2005), debido a que se producen principalmente quesos blandos no madurados y quesos tipo “pasta filata” donde la coagulación de la cuajada requiere un pH de 5.2 (Van Hekken, 2003).
2.3.1 Componentes nutricionales El suero de queso contiene principalmente, en base seca, lactosa (70-75%) y proteínas solubles (10-15%) (Frigon et al., 2009).
12
Lactosa. La lactosa es el componente número uno del suero de leche después del agua. El contenido de este carbohidrato en la leche de vaca es entre 4.4 y 5.2 %, promediando 4.8 %. Este es un disacárido compuesto por una molécula de glucosa ligada a una de galactosa, se presenta su estructura en la figura 2.
Figura 2. Estructura de la lactosa Fuente: Berg et al., 2007
Rosa de Souza et al. (2010) consideran que la lactosa al ser el componente mayoritario en el suero de queso, su recuperación y utilización en procesos biotecnológicos es una opción económicamente viable, además de minimizar los problemas de contaminación. Si la caseína se elimina de la leche desnatada por algún método de precipitación, como la adición de ácidos minerales, queda en solución un grupo de proteínas que se denominan sero-proteínas o proteínas del suero de la quesería (Gčosta Bylund, 2003). Las principales proteínas que se encuentran en el suero son:
α- lactoalbumina. Esta proteína es considerada como la típica proteína del suero de leche. Se encuentra presente en la leche de todos los mamíferos y juega un papel importan en la síntesis de la lactosa en la ubre (Gčosta Bylund, 2003).
β-lactoglobulina. Esta proteína es exclusiva de los animales de pezuña hendida (ungulados) y es la proteína más abundante en el suero de leche procedente de vacas (Gčosta Bylund, 2003).
13
2.3.2 Suero de quesería y su impacto ambiental Desde el punto de vista ambiental, el suero de quesería es el residuo líquido producto de elaboración de cualquier tipo de queso. El volumen de suero generado depende del tipo de queso a producir, sin embargo, se estima que por cada kilo de queso se generan de 8 a 9 litros. El contenido de proteínas y lactosa se traduce en un alta demanda química de oxígeno (50-70 g/L) (Frigon et al., 2009) aunada a las altas concentraciones de sólidos suspendidos totales y cloruro de sodio representan un alto riesgo ambiental (Prazeres et al., 2013a), conduciendo a un alto consumo del oxígeno disuelto presente en los cuerpos de agua y representando grandes problemas en la carga orgánica de sistemas de tratamiento aguas residuales municipales. Gänzle et al., (2008) plantean que la creciente producción de queso en la segunda mitad del último siglo, estimula la necesidad de buscar nuevas alternativas para la utilización del suero, lo que significa predominantemente encontrar usos para la reutilización de los componentes del suero, proteínas y lactosa ya que a pesar de ser una fuente de carbono de bajo costo solo una pequeña porción es usada como materia prima para la conversión química, enzimática o microbiana de derivados como la lactasa y lactitol Como lo menciona Valencia et al., (2009) a pesar la riqueza nutricional del suero de queso, en México alrededor de 470 mil toneladas son descargadas al drenaje y llegando a ríos y suelos, alterando las propiedades fisicoquímicas de estos ecosistemas. El aporte salino y el bajo pH, disminuyen la calidad del agua de riego, para Prazeres et al., (2013b) la calidad de esta agua puede afectar gravemente al sistema suelo-agua y los recursos de la planta. Cuando las plantas sufren cualquier desequilibrio de uno o más nutrientes, su metabolismo experimenta perturbaciones, sin embargo es necesaria la caracterización físico-química de los tejidos de las plantas para determinar una deficiencia o exceso de nutrientes.
14
2.3.3 Aprovechamiento del suero de quesería Algunas de las principales opciones de manejo del suero proveniente de la industria quesera son:
Como alimento para ganado.
La recuperación de sus componentes (lactosa y proteínas).
Como aditivo en la industria.
Como medio de fermentación para la obtención de diversos productos biotecnológicos.
Actualmente, se ha incrementado el interés por la utilización de las proteínas y lactosa, ya sea por la aplicación de procesos de separación de membrana, como ultrafiltración, nanofiltración y ósmosis reversa para la obtención de estos componentes (Yorgun et al., 2008). Otro es el uso de los componentes del suero por medio de procesos fermentativos para la obtención de diversos productos de interés biotecnológico tales como: ácidos orgánicos o biopolímeros (enzimas, polyhidroxialcanatos, exopolisacáridos, etc.). En la figura 3 se muestra un esquema general para la valorización de este residuo.
Figura 3. Esquema general para la valorización del suero de quesería. Fuente: Modificada de Mollea et al.,2013 y Carvalho, 2013.
Alrededor del 50% del suero de queso producido en el mundo es tratado y transformado
en
diversos
productos 15
alimenticios,
de
los
cuales
aproximadamente el 45% se utiliza directamente en forma líquida, 30% en forma de suero de queso en polvo, 15% para la recuperación de lactosa y el resto como queso de suero concentrados de proteínas (Kosseva et al., 2009). La utilización de la lactosa presente en el suero de quesería para su conversión en etanol ha sido considerada tanto para la obtención de este importante producto como en una posible solución para disminuir la DQO (Guimarães et al., 2010). Otro ejemplo de la bioconversión de los nutrientes presentes en el suero es la fermentación en reactores de lecho empacado con un biofilm de Clostridium acetobutylicum, a través de la cual, se obtuvo butanol a una concentración de 4.93 g/L (Raganati et al., 2013) o más recientemente el uso de este residuo para que a través de cepas Enterobacter aerogenes y de Rhodopseudomonas se obtenga hidrogeno (Rai et al., 2013).
2.4
Levaduras
Las levaduras son hongos unicelulares, no filamentoso, con una morfología característica esférica u ovalada; ampliamente distribuidos en la naturaleza. La mayoría de las levaduras forman colonias de organismos unicelulares, que crecen a medida que aumenta el número de levaduras, este aumento suele ocurrir por gemación. En la gemación la célula parental forma una protuberancia o yema sobre su superficie externa. Esta yema se alarga y crece, mientras que el núcleo de la célula parental se divide; uno de los núcleos migra a la yema y la yema acaba finalmente por separarse
de la célula madre
(Santamaria et al., 1998). Las levaduras se dividen en dos grupos, según su capacidad de producir esporas (ascoesporas y basidosporas). Las cepas que forman esporas pertenecen al grupo de los Ascomicetos y basidiomicetos. Las que no producen esporas pero se reproducen principalmente por gemación pertenecen al grupo de los hongos imperfectos o “falsas levaduras”.
16
2.4.1 Condiciones para el crecimiento de las levaduras
Nutrientes: Las levaduras tienen las mismas necesidades de nutrientes que otros organismos vivos. como las bacterias, tienen un sistema intracelular y extracelular de enzimas capaces de descomponer grandes moléculas presentes en el sustrato hasta dejarlas con un tamaño manejable para el metabolismo de la célula.
Humedad: Como las bacterias, las levaduras necesitan tener acceso al agua para poder vivir, pero requieren menos cantidad de agua que las bacterias. algunas puede crecer en medios con muy baja humedad, la mayor parte de las levaduras crecen en un rango de actividad de agua de 0,912 a 0,876.
Acidez: Las levaduras pueden desarrollarse en medios con un pH oscilante entre 3 y 7.5. el óptimo es usualmente 4.5-5.0
Temperatura: Las levaduras no crecen normalmente a temperaturas por debajo del punto de congelación del agua o por encima de 47ºC. su temperatura óptima se encuentra normalmente entre 20 y 30 ºC, es decir son mesófilas. Las células en crecimiento mueren normalmente cuando se someten a temperaturas de 52 a 58 ºC durante 5 a 10 minutos, las esporas (ascoesporas) son más resistentes, pero mueren cuando se las expone a 60-62ºC durante pocos minutos.
Oxígeno: las levaduras tienen la capacidad de desarrollarse tanto en presencia como en ausencia de oxígeno atmosférico, ya que son anaerobias facultativas. En ausencia de oxígeno, las levaduras descomponen los azúcares en alcohol y agua, mientras que en condiciones aerobias descomponen el azúcar en dióxido de carbono y agua y presentan un mayor crecimiento (Gčosta Bylund, 2003).
17
2.4.2 Ciclo de crecimiento de las levaduras El ciclo de crecimiento de las levaduras, puede ser representado mediante una curva, figura 4 en la cual se aprecian las seis fases de desarrollo.
Fase de latencia: La población de levaduras no aumentan, pues no se produces multiplicaciones celulares, estando las levaduras adaptándose al medio fermentativo.
Fase
de
aceleración:
Las levaduras
empiezan
a
multiplicarse,
5
encontrándose una población de 10 células/ml. esta fase junto con la anterior transcurre en 24 horas, dependiendo de la temperatura y termina cuando el mosto se satura de dióxido de carbono.
Fase de crecimiento exponencial: La población de levaduras crece exponencialmente, coincidiendo el número de células totales con las vivas, sucediéndose un máximo de 4 a 5 generaciones de células.
Fase de ralentización del crecimiento: Corresponde a la última parte de la fase anterior, donde debido a los “factores limitantes” del medio fermentativo, la población de levaduras deja de crecer, alcanzándose un valor de 80 a 100 millones de células por ml. prácticamente la totalidad de las levaduras están vivas y por lo tanto activas.
Fase estacionaria. el crecimiento es nulo, las levaduras no se multiplican, permaneciendo la población estacionaria y activa por cierto tiempo.
Fase declive: Transcurre durante un tiempo 3 o 4 veces más largo que el de la fase de crecimiento. la población total de levaduras disminuye ligeramente, pero son las levaduras vivas las que sufren una importante reducción, debiendo estas de terminar de transformar los últimos azucares del mosto en condiciones cada vez más adversas. las células
18
mueren y por autolisis empiezan a excretar al medio las sustancias que contienen (Hidalgo, 2010).
Figura 4. Curva de crecimiento de las levaduras Fuente: Hidalgo, 2010
2.4.3 Saccharomyces cerevisiae Es una levadura, del grupo de los ascomicetos, en la naturaleza se encuentra sobre sustratos ricos en azúcares o en los exudados y savias dulces de algunas plantas. Dado su amplio uso en la producción de pan, vinos y cerveza, además de que posee un genoma pequeño, solamente unas cuantas veces mayor que el de Escherichia coli, constituye la levadura y el microorganismo eucarionte más estudiado (González y Valenzuela, 2002), En la tabla 4 se muestra la capacidad de fermentación de algunos azúcares por parte de S. cerevisiae. Tabla 4. Fermentación de azúcares de S. cerevisiae Fuente: Kurtzman et al., 2011
Carbohidrato
Capacidad fermentativa
Carbohidrato
Capacidad fermentativa
Glucosa
+
Rafinosa
+
Galactosa
+
Trehalosa
-
Lactosa
-
Melibiosa
-
Maltosa
+
Sucrosa
+
+: Fermentación positiva -: Fermentación negativa
19
2.4.4 Kluyveromyces lactis Kluyveromyces es una levadura ascomiceta, que crece después de tres días a 25 ºC, las células con elipsoidales de 2-6 x 2-8 µm, y ocasionalmente individualmente, en pares o en pequeñas cadenas, al crecer las cadenas son butirosas, brillantes, de color crema o rosado (Kurtzman et al., 2011). El hábitat natural de esta especie es variado, sin embargo muchas de las cepas han sido aisladas de derivados lácteos en los que su mayor fuente de carbono es la lactosa, donde a diferencia de S. cerevisiae presenta un buen crecimiento (Wésolowski-Louvel et al., 1996). K. lactis no se utiliza comúnmente para la producción de etanol, sin embargo es ampliamente utilizada en la producción de otros metabolitos, a través de la fermentación en suero de quesería debido a su capacidad para metabolizar la lactosa debido a que presenta un sistema enzimático formado por una permeasa y una hidrolasa: lactosa permeasa y β-galactosidasa. La lactosa permeasa es la responsable de excretar al medio de cultivo a la βgalactosidasa, esta se encarga de hidrolizar la lactosa liberando dos monosacáridos: glucosa y galactosa (Guimarães et al., 2010). En la tabla 5 se enlistan algunos azúcares y la fermentación por parte de K. lactis. Tabla 5. Fermentación de azucares de K. lactis Fuente: Kurtzman et al., 2011
Carbohidrato
Capacidad fermentativa
Glucosa
B
Maltosa
+
Lactosa
+
Rafinosa
+
+ Fermentación positiva -: Fermentación negativa b: Fermentación baja
2.5
Inmovilización de células
La inmovilización de células se refiere a células físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida en el espacio reteniendo sus funciones 20
fisiológicas intactas. Este confinamiento puede ser temporal o permanente, dependiendo del tipo de inmovilización, para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos procesos químicos y bioquímicos (Fajardo, 2011). La inmovilización celular tiene varias ventajas, ya que permite mayor densidad de células en los biorreactores, mejora la estabilidad, hace que la reutilización y el funcionamiento continuo sean posibles, y se opone a la necesidad de separar las células de los productos para un tratamiento posterior. La adsorción, el atrapamiento en gel y la unión covalente son los métodos de inmovilización más utilizados en procesos biológicos (Panesar et al., 2007). De acuerdo la forma en que se induce la inmovilización se puede clasificar en pasiva (por adsorción) o activa (por atrapamiento en geles de polímeros o ataque químico).
2.5.1 Inmovilización por atrapamiento El método de inmovilización por atrapamiento en geles de polímeros permite conseguir grandes concentraciones de biomasa con el uso de reactores fluidizados. Además se pueden inmovilizar en matrices independientes células que no podrían coexistir en contacto directo debido al efecto “killer” o la capacidad de algunas levaduras para inhibir el crecimiento de otras(Fajardo, 2011). El método de atrapamiento es el de mayor uso para la inmovilización de células enteras (Panesar et al., 2007), siendo una de las técnicas más atractivas para una variedad de aplicaciones, incluyendo la industria alimenticia, farmacia, biomedicina y tratamiento de residuos. La principal ventaja de esta técnica es la simplicidad por la cual las “esferas” se pueden obtener, en la cual se hace gotear un polímero con una suspensión de células a un medio que contiene iones conjugados; sin embargo, la principal limitación de esta técnica es la posible fuga de las células durante el funcionamiento continuo a largo plazo, además de los posibles problemas de difusión de nutrientes y productos a través de la matriz porosa y la pobre resistencia mecánica de los soportes sólidos (Fajardo, 2011).
21
Para mejorar el rendimiento las levaduras se inmovilizan por atrapamiento en diferentes matrices poliméricas como la de alginato de calcio, presentando ciertas ventajas como, eliminación de la inhibición causada por las altas concentraciones de sustrato y producto, protección contra la fuerza en cizalla y fricción dentro de los reactores y la posibilidad de reutilizar las células en varios ciclos sin necesidad de recuperarlas (Birol et al., 1998; Wen-Tao et al., 2005; Swain et al., 2007). Sin embargo, las células inmovilizadas pueden sufrir limitaciones en el suministro de nutrientes, razón por la cual, es necesario seleccionar una concentración apropiada del polímero de inmovilización para garantizar que las células no escapen de las perlas y así mismo, el sustrato y el producto puedan movilizarse satisfactoriamente a través de la red de alginato de calcio (Roca et al., 1996; Najafpour et al., 2004).
2.5.2 Usos de la inmovilización Dada la estabilidad que da al sistema, la facilidad de operación y los bajos costos de operación, las células inmovilizadas tienen múltiples aplicaciones, en enología, el uso de levaduras inmovilizadas en geles se ha podido observar comparación a células libres (Hidalgo, 2010).que productividad de la fermentación es hasta diez veces más activa en comparación a células libres. En el área ambiental la inmovilización se ha aplicado en el control de la contaminación, en el caso del tratamiento de petróleo crudo Se ha utilizado la inmovilización de células en el tratamiento de residuos. Zhen-Yu et al., (2012), determinaron que la degradación de petróleo crudo por microrganismos inmovilizados era significativamente mayor a la que se obtenía a través de microrganismos libre. La misma aseveración la tiene Tsekova et al., (2010), donde observaron una mayor sorción de iones de cobre (II) y cadmio (III) por parte de células de Aspergillus niger dispuestas en una matriz polimérica a diferencia de encontrarse en suspensión. La tecnología de células y enzimas inmovilizadas también ha sido aplicada a los procesos de bioconversión de suero de leche para mejorar la economía de tales procesos y ofreciendo muchas ventajas en la producción de biomasa y metabolitos, en el caso del etanol se ha usado para eliminar la inhibición 22
causada por la alta concentración de sustrato y producto, también para mejorar la productividad y el rendimiento de la producción de etanol (Kosseva et al., 2009).
2.5.3 Producción de metabolitos con células inmovilizadas Dada la posibilidad de inmovilizar cualquier célula o enzima y para cualquier procesos biológicos tanto aerobio como anaerobios son amplias las oportunidades de producción de metabolitos. Las tecnologías de inmovilización se han aplicado a la fermentación del etanol, demostrando que ofrece muchas ventajas tales como: alta densidad celular y la productividad volumétrica muy alta, la posibilidad de reutilización de los biocatalizadores, alta estabilidad del proceso (físico y biológico) durante períodos largos de fermentación, la mejora de la resistencia a la contaminación y la protección física y química de las células. La inmovilización de las células microbianas para la fermentación se ha desarrollado para eliminar la inhibición causada por la alta concentración de sustrato y producto, también para mejorar la productividad y el rendimiento de la producción de etanol, a su vez, incrementa la tolerancia de los microrganismos al etanol y reduce costos de producción de inóculo (Kossevaa et al., 2009a; Jiménez et al., 2011).
23
Capitulo 3. Materiales y métodos 3.1
Muestreo y caracterización del suero de quesería
La caracterización se realizo por duplicado en el mes de octubre de 2012 durante dos muestreos consecutivos (Lunes 8 y 15) en queserías localizadas en los municipios de a de Acatlán, Naolinco Jilotepec, Coatepec, Xico y en la localidad de La Joya municipio de
Acajete, se tomaron volúmenes de 1L
aproximadamente para cada uno de los tipos de suero, almacenándose a 4ºC para evitar su descomposición.
pH y acidez
El potencial de hidrogeno (pH) se midió por duplicado en la muestra homogenizada y a temperatura ambiente a través de su medición directa con un potenciómetro de marca HANNA, mientras que la acidez se determino a través del método de titulación de una muestra de suero de queso previamente homogenizado y a una temperatura de 25º C hidróxido de sodio valorado a 0,1M y fenolftaleína como indicador, expresada en porcentaje de acido láctico, haciendo uso de la siguiente fórmula: (E. 1) Donde: V=Volumen utilizado de NaOH N= Normalidad del NaOH M= Peso de la muestra mEQ= Miliquivalente del ácido láctico (0.009)
Humedad y cenizas
Se realizo la determinación de humedad en base a la NMX-F-083-1986, mientras que cenizas se efectúo en base a la NMX-F-066-S-1978 ambas con un tamaño de muestra de 1.5 g de suero de queso.
24
Lactosa, proteína y sólidos no grasos
Estos parámetros se evaluaron a través del equipo LactiCheck™ RapiRead Ultrasonic Milk Analyzer Model LC-02/RR, el cual se basa en la medición de los componentes por espectroscopia ultrasónica, con el cual es posible conocer estos parámetros en alrededor de 85 segundos.
3.2
Cepas utilizadas
Para el presente trabajo se utilizó una cepa de S. cerevisiae y la cepa de K. lactis 837, las cuales fueron donadas por el Dr. Micloth López del Castillo Lozano del Instituto de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana.
3.3
Técnicas microbiológicas Medios de cultivo utilizados
Para la activación de cepas se utilizó caldo papa-dextrosa, para lo cual se puso a hervir 200 g de papa blanca en 500 mL de agua destilada, posteriormente se le agregaron 20 g de glucosa y se llevó a 1000 mL. Se esterilizó a 121°C durante 15 min. Para la preparación de agar papa-dextrosa se añadió agar al 1.5%. El suero de quesería se pasteurizó a 63°C durante 30 min y posteriormente fue envasado en frascos estériles a 4°C hasta su utilización.
Determinación del porcentaje de viabilidad
Se determinó la concentración y viabilidad de una suspensión celular. Las células se tiñen con azul de metileno, aquellas que presentan daño en la membrana plasmática se tiñen de azul, así fue posible diferenciar entre células viables y no viables. Se preparó una disolución 1:2 con 10 μL del cultivo y azul de metileno. Se coloca una muestra de la disolución anterior en la cámara de Neubauer donde se cuenta el número de células viables, en cuatro cuadrantes, haciendo uso de la siguiente ecuación (E. 2), mediante la cual se calcula el porcentaje de viabilidad, se recomienda que el porcentaje de células viables
25
(incoloras) sea por arriba del 80% para que la inmovilización por extrusión se efectivo. (E. 2)
Activación de cepas
K. lactis 837 y S. cerevisiae se mantuvieron en agar papa dextrosa. Para su activación, con un asa bacteriológica se tomó una colonia de cada una de cepas y se inocularon por separado en 10 mL de caldo papa-dextrosa más 5% de suero de leche en polvo y se incubó a 30°C durante 24h.
3.4
Inmovilización celular
Para inmovilizar las células de K. lactis 837 se prosiguió de la siguiente manera: Se activó K. lactis 837 como se indicó anteriormente, después de 24h se evaluó su viabilidad, una vez alcanzando una viabilidad del 85%, se centrifugó obteniéndose 4g de biomasa celular. Esta biomasa celular se suspendió en una solución de alginato de sodio al 2% (p/v) a 35°C; hasta obtener una concentración celular de 100mg de peso seco de celular por mL de solución. La solución de alginato al 2% (p/v), se preparó en agua destilada, por lo cual el alginato se disolvió en agua a una temperatura cercana a 65ºC. La formación de las esferas se realizó haciendo pasar la suspensión de células/alginato de sodio una aguja hipodérmica mediante una bomba peristáltica para tener un tamaño de gota uniforme. Las gotas se hicieron caer en una solución de cloruro de calcio al 0.1M con agitación, para que gelificaran. La mezcla se mantuvo en la solución de CaCl2 24 h (etapa de curado), tras este periodo se enjuagaron con agua destilada y estéril, hasta su uso.
3.5
Fermentación
La fermentación se realizó con 25g de perlas que contienen células de K. lactis 837 y 1mL de inoculo de S. cerevisiae previamente activado en 250mL de suero de requesón pasteurizado. 26
Se tomaron muestras de 5mL del suero fermentado y 1g de perlas de alginato de sodio cada 12h hasta cumplir 168h (7 días), para medir los siguientes parámetros: lactosa, pH, DQO, SST, UFC/mL de S. cerevisiae y de K. lactis 837.
Lactosa
La cuantificación de azúcares (Lactosa) se llevo a cabo a través de la prueba del acido 1,3-Dinitrosalicilico, reactivo capaz de oxidar los azucares reductores dando como resultado una coloración directamente proporcional a la concentración de azucares la cual fue medida a 540 nm.
pH
La muestra tomada se centrifugo 5 min a 5000 rpm para eliminar la biomasa y se realizo la medición por duplicado de pH con un potenciómetro marca HANNA.
Demanda Química de Oxígeno (DQO)
La cuantificación de la DQO se hizo utilizando el método comúnmente a aplicado en el análisis de aguas residuales y residuales tratadas, así se tiene que los resultados de mg/l de DQO se definen como los mg de O 2 consumido por litro de muestra bajo las condiciones de este procedimiento. En el mismo, la muestra se calienta dos horas con un agente oxidante potente, dicromato de potasio. Los compuestos orgánicos oxidables reaccionan, reduciendo el ion de dicromato (Cr2O72) a un ion crómico verde (Cr3+). Cuando se utiliza el método colorimétrico o titulométrico de 0-150 mg/L, se determina la cantidad de Cr6+ remanente. Cuando se utiliza el método colorimétrico de 0-1500mg/L ó 0-15000 mg/L, se determina la cantidad de Cr3+ producido. El reactivo DQO también contiene iones de plata y de mercurio. La plata es un catalizador y el mercurio se utiliza para formar complejos de las interferencias de cloruro (Hach Company, 2000), (ANEXO B).
Sólidos suspendidos totales (SST)
La cuantificación de este parámetro se realizo en base a la metodología propuesta por Krawczyk et al., (1959) que en atención al tiempo que
27
normalmente se llevaba la de sólidos suspendidos totales, evaluaron el uso de un espectrofotómetro para su cuantificación, años después el método fue tomado por la compañía Hach e integrado a su espectrofotómetro modelo 5000 (ANEXO C).
UFC/mL
Para realizar el conteo de K. lactis 837 se pesó y transfirió 1g de perlas a un tubo de ensaye con 9 mL de buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7. (El tubo así preparado es la primera dilución, 10-1). Se agito mediante un vortex de cuando en cuando para agilizar su disolución. Una vez disueltas las perlas y habiendo homogenizado, se prepararon diluciones seriales por duplicado de 10-2 hasta 10-9 en tubos con 9 mL de solución de NaCl 0.85%. Se sembró 1 mL de cada dilución por el método de inclusión en agar Papa-dextrosa. Se mantuvieron las condiciones de cultivo de 30°C por 24h. Para obtener la cantidad de células se multiplico el número de UFC por la dilución correspondiente. Para el conteo de células de S. cerevisiae se inoculo por duplicado con 1mL de la dilución correspondiente del suero de quesería fermentado en cajas Petri en diluciones seriales como en el caso anterior y se añadió el medio PDA fundido a una temperatura inferior de 45°C homogeneizando perfectamente para una buena separación de células y se almacenaron a 30°C por 24h.
Determinación del orden de cinética de consumo de lactosa
Para obtener un modelo de cinética para el consumo de lactosa, se evaluaran los resultados obtenidos en base a lo siguiente: o Cinética de orden cero: (E. 3) que una vez integrando: (E. 4) o Cinética de primer orden: (E. 5) que una vez integrando y evaluando C=Co en t=0 se obtiene: 28
(E. 6)
o Cinética de segundo orden: (E. 7) que una vez integrando y evaluando C=Co en t=0 se obtiene: (E. 8)
29
Capitulo 4. Resultados y discusión Las pruebas fisicoquímicas del suero de quesería, así como el seguimiento de la fermentación se llevaron a cabo en las instalaciones de los laboratorios 3, 6 y 34 de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Veracruzana.
4.1
Muestreo y caracterización de suero de quesería
Se realizo el muestreo del suero de queso generado en queserías de los municipios de Acatlán, Naolinco Jilotepec, Coatepec, Xico y en la localidad de La Joya municipio de Acajete, localizados en la Zona Centro del Estado de Veracruz. En la tabla 6 se enlista la procedencia de cada muestra, así como el tipo de queso producido y de suero de queso. Tabla 6. Procedencia de las muestras de sueros de quesería analizados
Municipio de
Tipo de queso
Tipo de suero
Acatlán y Jilotepec
Queso ranchero
Dulce
Xico y Naolinco
Queso panela
Dulce
Xico, Naolinco y La Joya
Queso de hebra
Ácido
Coatepec
Requesón
Dulce
procedencia
4.2
Análisis fisicoquímico
Las pruebas fisicoquímicas se realizaron en los dos tipos de suero de queso (dulce y acido) y en el suero procedente de la producción de requesón, los resultados se presentan en la tabla 7. Como es reportado en la bibliografía, la diferencia entre el suero dulce y el acido se basa en los valores encontrados para pH y acidez, esto consecuencia del tipo de queso del que proceda el suero, en el resto de parámetros no se aprecia mayor diferencia y en el caso del suero de requesón solo se manifiesta una disminución en la cantidad de proteína presente, esto a consecuencia de la desproteinización tras la elaboración de este. 30
Tabla 7. Caracterización de los distintos tipos de suero obtenidos en diferentes queserías
Suero de
Determinación
Suero dulce
Suero ácido
pH
6.34 ± 0.42
4.77 ± 0.82
6.1 ± 0.01
Acidez
0.09 ± 0.03
0.33 ± 0.25
0.05 ± 0.01
Humedad (%)
93.89 ± 1.05
94.79 ± 0.32
95.15 ± 0.71
Proteína (%)
3.20 ± 0.98
2.54 ± 0.23
2.69 ± 0.28
Lactosa (%)
5.20 ± 1.42
4.10 ± 0.08
4.48 ± 0.11
Grasa (%)
0.54 ± 0.05
0.59 ± 0.04
0.18 ± 0.02
Sólidos no grasos (%)
6.10 ± 1.05
5.21 ± 0.32
4.85 ± 0.01
Cenizas (%)
1.18 ± 0.84
0.49 ± 0.16
0.96 ± 0.02
4.3
requesón
Crecimiento de K. lactis 837 y S. cerevisiae en suero de quesería
Se realizó el conteo celular de las cepas durante la cinética, en la cual se observó que el crecimiento de S. cerevisiae durante la fermentación inicio con un densidad celular de 4.4 x104 y para K. lactis 837 se obtuvo un conteo inicial de 1.8 x103 UFC/g. Ambas cepas alcanzaron la fase estacionaria de crecimiento a las 72h. S. cerevisiae presenta un mayor crecimiento (1.3x1010±4.9X109 UFC/g) en comparación al presentado por K. lactis 837 (4.0x108±2.8X108 UFC/g) (Figura 5) atribuyendo esto a la inmovilización (Garzón, 2008). En cultivos mixtos con K. lactis 837 inmovilizada en perlas de alginato, se observa una mejor fermentación del suero de quesería. Así, en la figura 6 se presenta el consumo de lactosa el cual fue del 76% de la lactosa inicial, pasando de 45.0±4.2 a 10.5±0.27 g/L, provocando una caída del pH de 6.5±0.5 a 4.0±0.7, debido a la producción de ácido láctico y etanol a partir de una heterofermentación de la lactosa. En un cultivo mixto de células libres de levaduras no es posible obtener una diferenciación en cuanto a la cantidad de UFC/g de cada una de las levaduras. Sin embargo, se sabe por estudios previos que las cepas de Saccharomyces, muestran un bajo crecimiento y un
31
consumo mínimo de lactosa en suero de quesería, ya que este género no tiene la capacidad de producir la enzima β-galactosidasa, la enzima responsable de
Unidades formadoras de colonia (UFC/g)
la hidrólisis de la lactosa en sus monómeros (Reyes, 2012).
Tiempo (h) Figura 5. Comportamiento del crecimiento de células libres de S. cerevisiae (-♦-) y células inmovilizadas de K. lactis 837 inmovilizada (-▲-) en cultivo mixto en suero de queso desproteinizado en función del tiempo.
32
50
8
45
7
40 6 5
30 25
4
20
pH
Lactosa (g/L)
35
3
15 2 10 1
5 0
0 0
24
48
72
96
120
144
168
Tiempo (h)
Figura 6. Comportamiento entre el consumo de lactosa (-■-) y la disminución del pH (-♦-) del cultivo mixto de S. cerevisiae y K. lactis 837 en medio SR desproteinizado.
4.4
Efecto de la fermentación sobre la DQO y SST
La DQO es un parámetro que nos proporciona una idea del grado de contaminación que puede ocasionar en el cuerpo receptor, en especial en los ríos y lagos donde un alta DQO será responsable de consumir el oxígeno disueltos en estos cuerpos de agua. Para la DQO se observó una reducción del 35% de su valor inicial, pasando de 81.1 a 53.1 g/L, mientras que para los sólidos suspendidos totales (SST) se presenta una disminución del 83% iniciando con un valor de 12.9 g/L y alcanzando al final de la fermentación con una concentración de 2.2 g/L. En tratamientos anaerobios de suero de leche (Saddoud et al., 2006) se alcanzó 79% de remoción de DQO, mientras que en cultivo mixto ternario de levaduras se alcanzó un 85% de remoción (Ocampo et al., 2001), en el caso de SST la bibliografía no reporta la disminución de este parámetro. 33
La DQO y SST residuales pueden atribuirse tanto a la fermentación incompleta de la lactosa y de las proteínas del suero de quesería como a la producción de algunos metabolitos propios de la fermentación (etanol, ácido láctico).
Figura 7. Comportamiento entre el consumo de lactosa y la disminución del pH del cultivo mixto de SC y KL837 en medio SR desproteinizado
4.5
Determinación de cinética para consumo de lactosa
Haciendo uso de las formulas anteriormente enlistadas se evaluó el mejor ajuste de los datos experimentales obtenidos tras la fermentación, observando que a través de la ecuación para la cinética de primer orden se obtiene una recta con mayor linealidad (Figura 8). Siendo la ecuación de esta recta:
34
4
ln(Co/C)
3.5
3 y = -0.0091x + 3.7191 2.5
2 0
50
100
150
Tiempo (h)
Figura 8. Grafica de cinética para el consumo de lactosa
35
200
Conclusiones y recomendaciones En este trabajo se caracterizo suero de quesería procedente de queserías artesanales, así como evaluar un proceso fermentativo como opción de tratamiento al suero de queso. La caracterización del suero de quesería permite que se propongan otras alternativas de tratamiento idóneas a las características promedio de los sueros evaluados. Mediante las condiciones de estudio fue posible disminuir la DQO del suero de quesería en un 35% y los SST al 83%. Sin embargo hace falta optimizar las condiciones de fermentación para obtener una mayor eficiencia en la remoción de DQO, así como incluir un tratamiento primario. La inmovilización de K. lactis 837 en una matriz de alginato permitió que S. cerevisiae creciera de manera favorable a pesar de no metabolizar lactosa (principal azúcar del suero de queso). La posibilidad de obtener etanol o el desarrollo de una bebida a partir del fermento se presenta como una opción de valorización del suero de quesería y la oportunidad económica para instalar este proceso en una quesería artesanal. Evaluar procesos fermentativos con la finalidad de conocer la capacidad de tratamiento al suero de quesería como una posibilidad de evitar su descarga irracional. La determinación de las cinéticas de consumo de lactosa, se presentan como el primer pasó al diseño del reactor que permita desarrollar esta alternativa a mayor escala.
36
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de levaduras IX Congreso nacional de
biotecnología y bioingeniería
Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería México Ortiz, L. Ponce Castillo, R. Paz Gamboa, E. Pérez Silva, A. Montero Lagunes, M. (2009)
Desarrollo de una bebida a partir de suero
fermentado con L. acidophylus Inmovilizados en trozos de zapote mamey
(pouteria
sapota).
Cartel.
XIII
Congreso
Nacional
de
Biotecnología y Bioingeniería. Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería. Panesar, P Kennedy. J.F Gandhi, D.N. Bunko, K. (2007). Bioutilisation of whey for lactic acid production. Food Chemistry. 105:1–14 Prazeres, A. R; Carvalho. F; Rivas. J. (2012). Cheese whey management: A review. J. Environ. Management. 110:48-68. Prazeres, A. R; Carvalho. F; Rivas. J. (2013a). Fenton-like application to pretreated
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40
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42
Anexo A: Cartel presentado en el “3er Foro Ambiental UPIBI 2013”, en la modalidad de trabajos libres
43
Anexo B: Metodología para la determinación de la DQO
Oxygen Demand, Chemical
DOC316.53.01099
USEPA1 Reactor Digestion Method2
Method 8000
0.7 to 40.03 mg/L COD (ULR); 3 to 150 mg/L COD (LR); 20 to 1500 mg/L COD (HR); 200 to 15,000 mg/L COD (HR Plus) Scope and application: For water and wastewater. Digestion is required. 1 2 3
Ranges 3 to 150 mg/L COD and 20 to 1500 mg/L COD are USEPA approved for wastewater analyses (Standard Method 5220 D), Federal Register, April 21, 1980, 45(78), 26811-26812. Jirka, A.M.; Carter, M.J., Analytical Chemistry, 1975, 47(8), 1397. The ULR is only available with spectrophotometers that can measure at a wavelength of 350 nm.
Test preparation Instrument specific information The table in this section shows all of the instruments that have the program for this test. Table 1 shows adapter and light shield requirements for the instruments that use them. To use the table, select an instrument, then read across to find the corresponding information for this test. Table 1 Instrument-specific information for test tubes Instrument
Adapters
Light shield
DR 6000
—
—
DR 5000
—
—
DR 900
4846400
Cover supplied with the instrument
DR 3900
—
LZV849
DR 3800
—
LZV646
DR 2800
—
Before starting Install the instrument cap on the DR 900 cell holder before ZERO or READ is pushed. DR 3900, DR 3800, DR 2800 and DR 2700: Install the light shield in Cell Compartment #2 before this test is started. The reagent that is used in this test is corrosive and toxic. Use protection for eyes and skin and be prepared to flush any spills with running water. The reagents that are used in this test contain mercury. Collect the reacted samples for proper disposal. Review the Safety Data Sheets (MSDS/SDS) for the chemicals that are used and use any recommended personal protective equipment. Run one blank with each set of samples. Run all tests (the samples and the blank) with the same lot of vials. The lot number is on the container label. Refer to Blanks for colorimetric determination on page 4. Store unused (light sensitive) vials in a closed box. If the samples contain high concentrations of chloride, refer to the Alternate reagents section.
44
Dispose of reacted solutions according to local, state and federal regulations. Use the Safety Data Sheets for disposal information for unused reagents. Consult the environmental, health and safety staff for your facility and/or local regulatory agencies for further disposal information.
Oxygen Demand, Chemical, Dichromate Method (multi-range: 40.0, 150, 1500, 15,000 mg/L) 45
Description
Quantity
Beaker, 250-mL
1
Blender
1
COD Digestion Reagent vials
varies
DRB200 Reactor
1
Light shield or adapter (For information about sample cells, adapters or light shields, refer to Instrument specific information on page 1.)
1
Magnetic stirrer and stir bar
1
Opaque shipping container for storage of unused, light-sensitive reagent vials
varies
Pipet, TenSette, 0.1- to 1.0-mL, with pipet tips (for use with the 200–15,000 mg/L range)
1
Pipet, volumetric, 2.00-mL
2
Pipet filler safety bulb
1
Test tube rack
2
Refer to Consumables and replacement items on page 7 for reorder information.
Sample collection and storage • • • •
• •
Collect samples in clean glass bottles. Use plastic bottles only if they are known to be free of organic contamination. Test biologically active samples as soon as possible. Homogenize samples that contain solids to get a representative sample. To preserve samples for later analysis, adjust the sample pH to less than 2 with concentrated sulfuric acid (about 2 mL per liter). No acid addition is necessary if the sample is tested immediately. Keep the preserved samples at or below 6 °C (43 °F) for up to 28 days. Correct the test result for the dilution from the volume additions.
Reactor digestion procedure 1. Put 100 mL of sample in a blender. Blend for 30 seconds or until homogenized. For samples with large amounts of solids, increase the homogenization time. If the sample does not contain suspended solids, omit steps 1 and 2.
2. For the 200–15,000 mg/L range or to improve accuracy and reproducibility of the other ranges, pour the homogenized sample into a 250-mL beaker and gently stir with a magnetic stir plate.
3. Set the DRB200 Reactor power to on. Preheat to 150 °C. Refer to the DRB200 User Manual for selecting preprogrammed temperature applications.
4. Prepare the sample: Remove the cap from a vial for the selected range. Hold the vial at an angle of 45 degrees. Use a clean pipet to add 2.00 mL of sample to the vial. For 250–15,000 mg/L vials: Use a TenSette Pipet to add 0.20 mL of sample to the vial.
46
5. Prepare the blank: Remove the cap from a second vial for the selected range. Hold the vial at an angle of 45 degrees. Use a clean pipet to add 2.00 mL of deionized water to the vial.
6. Close the vials tightly. Rinse the vials with water and wipe with a clean paper towel.
7. Hold the vials by the cap, over a sink. Invert gently several times to mix. The vials get very hot during mixing.
8. Put the vials in the preheated DRB200 reactor. Close the lid.
10. Set the reactor power to off. Let the vials cool in the reactor for about 20 minutes. The vials should cool to 120 °C or less.
11. Invert each vial several times while it is still warm.
12. Put the vials in a tube rack to cool to room temperature.
For 250–15,000 mg/L vials: Use a TenSette Pipet to add 0.20 mL of deionized water to the vial.
9. Heat the vials for 2 hours.
Oxygen Demand, Chemical, Dichromate Method (multi-range: 40.0, 150, 1500, 15,000 mg/L) 47
Colorimetric procedure
Start
Zero
1. Start program 431 COD ULR, 430 COD LR or 435 COD HR. For information about sample cells, adapters or light shields, refer to Instrument specific information on page 1.
2. Clean the blank.
3. Insert the blank into the cell holder.
4. Push ZERO. The display shows 0 or 0.0 mg/L COD.
Note: Although the program name may vary between instruments, the program number does not change.
Read
5. Clean the prepared sample.
6. Insert the prepared sample into the cell holder.
7. Push READ. Results show in mg/L COD.
8. If using High Range Plus COD digestion reagent vials, multiply the result by 10. For the most accurate results with samples near 1500 or 15,000 mg/L COD, repeat the analysis with a diluted sample.
Blanks for colorimetric determination The blank vial can be used again and again for measurements that use the same lot of reagent vials. Measure the absorbance of the blank vial over time and prepare a new blank vial when the absorbance changes. 1. Put the instrument in the absorbance mode at the applicable wavelength. Refer to Table 3 on page 7. 2. Add 5 mL of deionized water into an empty vial. 3. Put the vial in the instrument and zero the instrument. 4. Put the blank vial that is used in the test procedure into the instrument and record the absorbance value.
48
Colorimetric procedure
5. Keep the blank vial in the dark. 6. Prepare a new blank when the absorbance has changed by approximately 0.01 absorbance units.
49 Method (multi-range: 40.0, 150, 1500, Oxygen Demand, Chemical, Dichromate 15,000 mg/L)
Colorimetric procedure
Interferences Chloride is the primary interference in this test procedure. Each COD vial contains mercuric sulfate that removes chloride interference to the level specified in Column 1 of Table 2. Dilute samples that have higher chloride concentrations to the level given in Column 2. Note: For best results, use the low range and ultra-low range vials for samples that have high chloride concentrations (near maximum concentration) and low COD concentrations.
If sample dilution causes the COD concentration to be too low for accurate measurements, add 0.50 g of mercuric sulfate (HgSO4) to each COD vial before the sample is added. The additional mercuric sulfate will increase the maximum chloride concentration to the level given in Column 3. Note: Bromide interference is not removed with mercuric sulfate.
Table 2 Chloride concentration limits in the sample Vial range
Column 1 (maximum mg/L Cl–)
Column 2 (mg/L Cl– for diluted samples)
Column 3 (maximum mg/L Cl– with mercuric sulfate)
ULR1 (0.7–40.0 mg/L)
2000
1000
N/A
LR (3–150 mg/L)
2000
1000
8000
HR (20–1500 mg/L)
2000
1000
4000
HR Plus (200–15,000 mg/L)
20,000
10,000
40,000
1
The ULR is only available for spectrophotometers that can measure at a wavelength of 350 nm.
Accuracy check Standard solution method Items to collect: • • • • •
1000 mg/L COD standard solution 100-mL volumetric flask, Class A Volumetric pipets, Class A and pipet filler Deionized water Potassium acid phthalate (KHP), dried overnight at 120 °C (HR Plus only)
0.7 to 40.0 mg/L ULR 1. Prepare a 30-mg/L COD standard solution as follows: a. Use a pipet to add 3.00 mL of the 1000 mg/L standard solution into a 100-mL volumetric flask. b. Dilute to the mark with deionized water. Mix well. 2. Use the test procedure to measure the concentration of the standard solution. 3. Compare the expected result to the actual result. Note: The factory calibration can be adjusted slightly with the standard adjust option so that the instrument shows the expected value of the standard solution. The adjusted calibration is then used for all test results. This adjustment can increase the test accuracy when there are slight variations in the reagents or instrument
Oxygen Demand, Chemical, Dichromate Method (multi-range: 40.0, 150, 1500, 15,00050mg/L)
Alternate reagents 3 to 150 mg/L LR 1. Prepare a 100-mg/L COD standard solution as follows: a. Use a pipet to add 10 mL of the 1000 mg/L standard solution into a 100-mL volumetric flask. b. Dilute to the mark with deionized water. Mix well. 2. Use the test procedure to measure the concentration of the standard solution. 3. Compare the expected result to the actual result. Note: The factory calibration can be adjusted slightly with the standard adjust option so that the instrument shows the expected value of the standard solution. The adjusted calibration is then used for all test results. This adjustment can increase the test accuracy when there are slight variations in the reagents or instruments.
20 to 1500 mg/L HR 1. Use the test procedure with a 300-mg/L, 800 mg/L or 1000 mg/L COD standard solution to measure the concentration of the standard solution. 2. Compare the expected result to the actual result. Note: The factory calibration can be adjusted slightly with the standard adjust option so that the instrument shows the expected value of the standard solution. The adjusted calibration is then used for all test results. This adjustment can increase the test accuracy when there are slight variations in the reagents or instruments.
200 to 15,000 mg/L HR Plus 1. Prepare a 10,000 mg/L COD standard solution as follows: a. Dissolve 8.500 g of dried KHP in 1000-mL of organic-free deionized water. 2. Use the test procedure to measure the concentration of the standard solution. 3. Compare the expected result to the actual result. Note: The factory calibration can be adjusted slightly with the standard adjust option so that the instrument shows the expected value of the standard solution. The adjusted calibration is then used for all test results. This adjustment can increase the test accuracy when there are slight variations in the reagents or instruments.
Mercury-free COD2 Reagents are available as a mercury-free alternative. These reagents are fully compatible with test procedures and stored programs in the instruments. Chloride and ammonia determinations are recommended for accurate results.
NOTICE COD2 reagents are not approved for USEPA reporting purposes. Because COD2 reagents do not contain mercury as a masking agent, they exhibit a positive interference from chloride. More information is available for use with specific applications.
Method performance The method performance data that follows was derived from laboratory tests that were measured on a spectrophotometer during ideal test conditions. Users may get different results under different test conditions. Program
Standard
Precision (95% Confidence Interval)
Sensitivity Concentration change per 0.010 Abs change
431 (ULR)
30 mg/L COD
28.8–31.2 mg/L COD
0.5 mg/L COD
430 (LR)
80 mg/L COD
77–83 mg/L COD
3 mg/L COD
435 (HR)
800 mg/L COD
785–815 mg/L COD
23 mg/L COD
7850–8150 mg/L COD
230 mg/L COD
435 (HR Plus) 8000 mg/L COD
Summary of method The results in mg/L COD are defined as the milligrams of O 2 consumed per liter of sample under the conditions of this procedure. The sample is heated for 2 hours with sulfuric acid and a strong oxidizing agent, potassium dichromate. Oxidizable organic
51
compounds react, reducing the dichromate ion (Cr 2O72–) to green chromic ion (Cr3+). When the 0.7–40.0 or the 3–150 mg/L colorimetric method is used, the amount of Cr6+ that remains is measured. When the 20–1500 mg/L or 200–15,000 mg/L colorimetric method is used, the amount of Cr3+ that is produced is measured. The COD reagent also contains silver and mercury ions. Silver is a catalyst, and mercury is used to complex chloride interferences. Test results are measured at the wavelengths that are specified in Table 3. Table 3 Range-specific test wavelengths Range in mg/L COD
Wavelength
0.7 to 40.0 mg/L
350 nm (for applicable instruments)
3 to 150 mg/L
420 nm
20 to 1500
620 nm (610 nm for colorimeters)
2000 to 15,000 mg/L
620 nm (610 nm for colorimeters)
Pollution prevention and waste management Reacted samples contain mercury, silver and chromium and must be disposed of as a hazardous waste. Dispose of reacted solutions according to local, state and federal regulations. Users in the United States can use the ez COD Recycling Service for disposal of COD vials. Refer to Consumables and replacement items on page 7.
Consumables and replacement items Required reagents Description
Quantity/test
Unit
Item no.
COD, Ultra Low Range, 0.7 to 40 mg/L
1-2 vials
25/pkg
2415825
COD, Low Range, 3 to 150 mg/L
1-2 vials
25/pkg
2125825
COD, High Range, 20 to 1500 mg/L
1-2 vials
25/pkg
2125925
COD, High Range Plus, 200 to 15,000 mg/L
1-2 vials
25/pkg
2415925
varies
4L
27256
Quantity/test
Unit
Item no.
COD2, Low Range, 0 to 150 mg/L COD
1-2 vials
25/pkg
2565025
COD2, High Range, 0 to 1500 mg/L COD
1-2 vials
25/pkg
2565125
COD2, High Range, 0 to 1500 mg/L COD
1-2 vials
150/pkg
2565115
COD2, High Range Plus, 0 to 15,000 mg/L COD
1-2 vials
25/pkg
2834325
COD Digestion Reagent Vials, 3 to 150 mg/L COD
1-2 vials
150/pkg
2125815
COD Digestion Reagent Vials, 200 to 1500 mg/L COD
1-2 vials
150/pkg
2125915
COD Digestion Reagent Vials, ULR 0.7-40.0 mg/L
1-2 vials
150/pkg
2415815
COD Digestion Reagent Vials, HR plus,200-25,000 mg/L
1-2 vials
150/pkg
2415915
Quantity/test
Unit
Item no.
1
each
2616100
1
each
2616102
Water, deionized
Alternate reagents and package sizes Description
Required apparatus Description Blender, 2-speed, 120 VAC OR Blender, 2-speed, 240 VAC
52
DRB200 Reactor, 110 V, 15 x 16 mm
1
each
LTV082.53.40001
DRB200 Reactor, 220 V, 15 x 16 mm
1
each
LTV082.52.40001
Pipet filler, safety bulb
1
each
1465100
Pipet, volumetric, Class A, 2.00-mL
1
each
1451536
Description
Unit
Item no.
Beaker, 250-mL
each
50046H
COD Standard Solution, 300-mg/L
200 mL
1218629
COD Standard Solution, 300-mg/L
500mL
1218649
COD Standard Solution, 800-mg/L
200 mL
2672629
COD Standard Solution, 1000-mg/L
200 mL
2253929
Oxygen Demand Standard (BOD, COD, TOC), 10-mL ampules
16/pkg
2833510
each
1970001
Pipet tips for TenSette Pipet 1970001
50/pkg
2185696
Pipet tips for TenSette Pipet 1970001
1000/pkg
2185628
Potassium Acid Phthalate, ACS
500 g
31534
Stir bar, octagonal
each
2095352
Stirrer, electromagnetic, 120 VAC, with electrode stand
each
4530001
Stirrer, electromagnetic, 230 VAC, with electrode stand
each
4530002
Test tube rack
each
1864100
70/pkg
2096900
Description
Unit
Item no.
Balance, analytical, 80 g x 0.1 mg 100-240 VAC
each
2936701
Flask, volumetric, Class A, 1000-mL
each
1457453
Flask, volumetric, Class A, 100-mL
each
1457442
Mercuric Sulfate
28 g
191520
Pipet, volumetric, Class A, 3-mL
each
1451503
Pipet, volumetric, Class A, 10-mL
each
1451538
OR
Recommended standards and apparatus
®
Pipet, TenSette , 0.1–1.0 mL
Wipes, disposable
Optional reagents and apparatus
Oxygen Demand, Chemical, Dichromate Method (multi-range: 40.0,500 150, Sulfuric Acid, ACS mL1500, 15,000 mg/L) Wastewater Influent Standard, Mixed Parameter, for NH3-N, NO3-N, PO4, COD, SO4, TOC
97949
500 mL
2833149
Description
Unit
Item no.
EZ COD™ Recycling Service with 5-gal bucket-mail back option (For US customers only. 20 and 55 gallon sizes are also available. )
each
2895405
EZ COD™ Recycling Service with 5-gal bucket- pick up option. (For US customers only. 20 and 55 gallon sizes are also available. )
each
2895405P
Consumables and replacement items (continued)
53
Finger cots Gloves, chemical resistant, size 9-9.5 Paper, for weighing, 100 x 100 mm Safety goggles, vented Wastewater, Effluent Inorganics, for NH3-N, NO3-N, PO4, COD, SO4, TOC 1
2/pkg
1464702
pair
24101041
500/pkg
1473885
each
2550700
500 mL
2833249
Other sizes available
FOR TECHNICAL ASSISTANCE, PRICE INFORMATION AND ORDERING: In the U.S.A. – Call toll-free 800-227-4224 Outside the U.S.A. – Contact the HACH office or distributor serving you. On the Worldwide Web – www.hach.com; E-mail –
[email protected] © Hach Company/Hach Lange GmbH, 1989–2013. All rights reserved. 04/2013, Edition
54
HACH COMPANY WORLD HEADQUARTERS Telephone: (970) 669-3050 FAX: (970) 669-2
Anexo C: Metodología suspendidos totales
para
la
determinación
Suspended Solids Photometric Method1
de
solidos
DOC316.53.01139
Method 8006
5 to 750 mg/L TSS Scope and application: For water and wastewater. 1
Adapted from Sewage and Industrial Wastes, 31, 1159 (1959).
Test preparation Instrument specific information The table in this section shows all of the instruments that have the program for this test. Table 1 shows sample cell and orientation requirements for reagent addition tests, such as powder pillow or bulk reagent tests. To use the table, select an instrument, then read across to find the corresponding information for this test. Table 1 Instrument-specific information for reagent addition Instrument
Sample cell orientation
Sample cell
DR 6000
The fill line is to the right.
2495402
DR 3800 DR 2800 DR 2700 DR 5000
The fill line is toward the user.
DR 3900 DR 900
The orientation mark is toward the user.
2401906
Before starting Install the instrument cap on the DR 900 cell holder before ZERO or READ is pushed. Do not use the Pour-Thru Cell or sipper module (for applicable instruments) with this test.
Items to collect Description
Quantity
Beaker, 600-mL, polypropylene
1
Blender
1
Cylinder, 500-mL polypropylene, graduated
1
Sample cells (For information about sample cells, adapters or light shields, refer to Instrument specific information on page 1.)
2
Refer to Consumables and replacement items on page 3 for reorder information.
Sample collection and storage • • •
Collect samples in clean glass or plastic bottles. To preserve samples for later analysis, keep the samples at or below 6 °C (43 °F) for up to 7 days. Let the sample temperature increase to room temperature before analysis.
Photometric procedure
Start
1. Start program 630 Suspended Solids. For information about sample cells, adapters or light shields, refer to Instrument specific information on page 1.
2. Blend 500 mL of sample in a blender at high speed for exactly two minutes.
3. Pour the blended sample into a 600-ml beaker.
4. Prepare the sample: Stir the sample and immediately pour 10 mL of the blended sample into a sample cell.
Note: Although the program name may vary between instruments, the program number does not change.
Zero
5. Prepare the blank: Fill a second sample cell with 10 mL of tap water or deionized water.
6. Clean the blank.
7. Insert the blank into the cell holder.
8. Push ZERO. The display shows 0 mg/L TSS.
Read
9. Swirl the prepared sample to remove any gas bubbles and uniformly suspend any residue.
10. Clean the prepared sample.
11. Insert the prepared sample into the cell holder.
12. Push READ. Results show in mg/L TSS.
2
Suspended Solids, Photometric Method (750 mg/L)
Interferences Samples that absorb strongly at the measurement wavelength, such as blue dyes, may give false, high-bias readings. A user-entered calibration is advised for these samples.
Accuracy check
Standard solution method Calibration for this test is based on the gravimetric technique with parallel sewage samples from a municipal sewage plant. For most samples, this calibration supplies satisfactory results. When higher accuracy is required, run parallel spectrophotometric and gravimetric determinations with portions of the same sample. Make the new calibration on the particular sample using a gravimetric technique as a basis.
Summary of method This method of determining total suspended solids (TSS) is a simple, direct measurement which does not require the filtration or ignition/weighing steps that gravimetric procedures do. The USEPA specifies the gravimetric method for solids determinations, while this method is often used for checking in-plant processes. The measurement wavelength is 810 nm for spectrophotometers or 610 nm for colorimeters.
Consumables and replacement items
Required apparatus
Description Beaker, 600-mL, polypropylene
Quantity/test 1
Unit each
Item no. 108052
Blender, 2-speed, 120 VAC
1
each
2616100
Blender, 2-speed, 240 VAC
1
each
2616102
Cylinder, graduated, 500-mL, polypropylene
1
each
108149
58
FOR TECHNICAL ASSISTANCE, PRICE INFORMATION AND ORDERING: In the U.S.A. – Call toll-free 800-227-4224 Outside the U.S.A. – Contact the HACH office or distributor serving you. On the Worldwide Web – www.hach.com; E-mail –
[email protected] © Hach Company/Hach Lange GmbH, 1989–2013. All rights reserved.
59
HACH COMPANY WORLD HEADQUARTERS Telephone: (970) 669-3050 FAX: (970) 669-2932
04/2013, Edition 8