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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : C09B 61/00

11 N´ umero de publicaci´on:

2 162 221

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˜ ESPANA

C09B 5/24 A61K 7/13 C07D 221/18 C07D 209/58

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 97402988.6 kFecha de presentaci´on: 10.12.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 848 041 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 17.06.1998

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Precursor de colorante obtenido de plantas del g´ enero Medicago, su preparaci´ on y su

aplicaci´ on para la obtenci´ on de productos colorantes.

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73 Titular/es: L’OREAL

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72 Inventor/es: Belcour-Castro, B´ eatrice;

30 Prioridad: 11.12.1996 FR 96 15212

14, Rue Royale 75008 Paris, FR

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

ES 2 162 221 T3

16.12.2001

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.12.2001

Aviso:

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Hussler, Georges y Bonnet, Anne

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74 Agente: Curell Su˜ nol, Marcelino

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 162 221 T3 DESCRIPCION Precursor de colorante obtenido de plantas de g´enero Medicago, su preparaci´ on y su aplicaci´ on para la obtenci´on de productos colorantes. 5

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La invenci´on tiene por objeto un precursor de colorante que puede obtenerse a partir de c´elulas de una planta del g´enero Medicago, as´ı como al procedimiento de preparaci´ on de dicho precursor de colorante y su aplicaci´on para la obtenci´ on de productos colorantes, por reacci´ on con una quinona. Se conocen numerosos productos colorantes derivados de quinona, as´ı como su aplicaci´on en particular para el te˜ nido de las fibras kerat´ınicas; ver por ejemplo la solicitud de patente EP-A-0560683 y los documentos citados en dicha solicitud de patente. El documento JP-06 040 884, del que ha sido publicado un resumen por la base de datos WPI/DERWENT, AN 94-089261 (1994) describe unos extractos de plantas del g´enero Medicago utilizables como ingredientes cosm´eticos de efecto blanqueante. Se ha descubierto ahora que unas c´elulas de plantas del g´enero Medicago, cultivadas in vitro en presencia de lactosa como sustrato carbonado, contienen unos metabolitos capaces de reaccionar con unas quinonas dando unos productos colorantes, y que estos metabolitos est´ an ausentes cuando se utiliza la glucosa como sustrato carbonado. Son estos metabolitos que constituyen los precursores de colorantes de la invenci´ on. Se ha descubierto que estos precursores de colorantes est´an tambi´en presentes en las plantas del g´enero Medicago cultivadas en el suelo o en condiciones hidrop´onicas, pero a una concentraci´ on muy baja. La invenci´on tiene por tanto por objeto una composici´ on que contiene por lo menos un precursor de colorante, caracterizada porque dicho precursor de colorante es un producto, que existe en estado natural en las c´elulas de una planta del g´enero Medicago, capaz de reaccionar en soluci´on acuosa con 1,4-naftoquinona dando por lo menos un producto colorante, y est´ a presente en dicha composici´ on en estado por lo menos parcialmente purificado. La expresi´on “en estado por lo menos parcialmente purificado” significa aqu´ı que, con respecto a su estado natural (planta o c´elulas frescas o desecadas), el precursor de colorante, en la composici´on de la invenci´on, ha sido concentrado y/o ha sido liberado de por lo menos una parte de los otros constituyentes de la planta, y en particular de los constituyentes que tienen una masa molecular superior a 3500. En las composiciones de la invenci´on, el precursor de colorante est´a generalmente presente a una concentraci´on superior a la concentraci´ on de dicho precursor en dicha planta o en dichas c´elulas en estado desecado. Se considera que una planta est´a en estado desecado cuando su contenido de agua es inferior a 10 % en peso.

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La invenci´on se refiere en particular a una composici´on en la cual dicho precursor est´a presente a una concentraci´ on por lo menos igual a la de dicho precursor en una dispersi´ on acuosa que contiene, por litro de dispersi´ on, 1 gramo (y en particular 2 gramos), de materia seca, de un triturado de c´elulas de dicha planta, habiendo sido las c´elulas de dicho triturado cultivadas in vitro en un medio que contiene u ´ nicamente lactosa como fuente de carbono.

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Los precursores de colorantes que son unos constituyentes de la composici´on de la invenci´ on est´an presentes en particular en las plantas, y en las c´elulas cultivadas in vitro (por ejemplo en las condiciones indicadas anteriormente), de las especies siguientes: Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago intermedia, Medicago media, Medicago var´ıa y Medicago versicolor.

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El cultivo in vitro de dichas plantas puede efectuarse a partir de un fragmento (por ejemplo un fragmento de hoja o de cotiled´ on).

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Los medios de cultivo que convienen para el cultivo in vitro de c´elulas vegetales son actualmente bien conocidos. Estos medios de cultivo contienen en particular unas fuentes de nitr´ ogeno, unas fuentes de carbono, unos microelementos, as´ı como unas vitaminas a baja concentraci´on. Los medios de cultivo actuales derivan en particular de las bases te´oricas definidas por MURASHIGE y SKOOG cuando tiene lugar la puesta a punto del medio de cultivo que lleva el nombre de estos autores. Para los microele2

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mentos, se utilizan generalmente los propuestos por Heller: manganeso, zinc, boro, cobre, yodo, n´ıquel, aluminio, as´ı como el molibdeno, el hierro y el cobalto. Como fuente de carbono, se utilizan generalmente unos az´ ucares, en particular la sacarosa y la glucosa, pero para obtener los precursores de colorantes de la invenci´on, conviene reemplazar por lo menos parcialmente estos az´ ucares por otras fuentes de carbono, en particular la lactosa. La determinaci´ on de las fuentes de carbono que convienen puede efectuarse por simples experiencias de rutina buscando la presencia, en las c´elulas cultivadas, de un precursor de colorante tal como el definido en la presente solicitud. Entre las vitaminas que favorecen el crecimiento de las c´elulas en cultivo, se citar´an en particular la tiamina, y tambi´en el a´cido nicot´ınico y la piridoxina. Se pueden a˜ nadir tambi´en pantotenato de calcio, biotina y mesoinositol.

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El medio de cultivo puede tambi´en contener unos a´cidos aminados, unos extractos prote´ınicos, unos a´cidos org´ anicos, etc. Se pueden tambi´en a˜ nadir al medio de cultivo unos reguladores de crecimiento tales como el ´acido naftalenac´etico (ANA), la kinetina (6-furfurilaminopurina), etc. 15

Las composiciones de precursor de colorante de la invenci´on son en particular unas soluciones (es decir pr´ acticamente exentas de productos s´olidos no disueltos) o unos productos s´ olidos que pueden obtenerse por ejemplo partiendo de dichas soluciones por evaporaci´ on del o de los solventes. Los residuos s´olidos obtenidos por evaporaci´on del solvente (en particular agua, alcanol inferior y sus mezclas) son pr´ acticamente totalmente solubles en dicho solvente.

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La invenci´on tiene tambi´en por objeto un procedimiento de preparaci´ on de una composici´ on tal como la definida anteriormente.

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Este procedimiento est´ a esencialmente caracterizado porque se trituran unas plantas o partes de plantas del g´enero Medicago, o unas c´elulas de una planta del g´enero Medicago que provienen de un cultivo in vitro, y porque se separa y recoge, seg´ un los procedimientos de fraccionado usuales, una fracci´ on del triturado obtenido, siendo dicha fracci´ on una fracci´ on por lo menos parcialmente purificada exenta de constituyentes de masa molecular superior a 3500. Para separar dicha fracci´ on por lo menos parcialmente purificada, se puede operar por ejemplo seg´ un uno por lo menos de los procedimientos siguientes:

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- se procede a una filtraci´ on y se recoge el filtrado, - se procede a una decantaci´ on o a una centrifugaci´ on, y se recoge una fracci´ on que contiene el sobrenadante, 35

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- o se procede a una extracci´on con un solvente. El solvente apropiado para la extracci´ on puede ser determinado por simples experiencias de rutina. Se puede utilizar en particular el agua o un alcanol inferior (por ejemplo el metanol o el etanol). Se puede a continuaci´on evaporar el solvente para obtener una composici´ on en forma de extracto seco: se trata un triturado, un extracto, un filtrado o un sobrenadante as´ı obtenido de manera que se eliminen los constituyentes de masa molecular superior a 3500, y en particular superior a 1500. Seg´ un un modo de realizaci´ on particular del procedimiento de preparaci´ on de la composici´on de precursor de colorante, se cultivan in vitro unas c´elulas de una planta del g´enero Medicago, en un medio que contiene una fuente de carbono apropiada, por ejemplo lactosa, se tritura la biomasa formada, y se separa y se recoge, como anteriormente, una fracci´on de dicho triturado que contiene el precursor de colorante en estado por lo menos parcialmente purificado. Es posible efectuar el cultivo en un medio que contiene u ´ nicamente lactosa como fuente de carbono. El cultivo in vitro puede efectuarse a la luz, pero se efect´ ua preferentemente en la oscuridad. Se opera en medio no agitado o, preferentemente, en medio agitado. La temperatura de cultivo puede variar por ejemplo de 20 a 30◦ C. Se recoge la biomasa al cabo de un tiempo de cultivo suficiente, que depende en particular del volumen del fermentador utilizado. Se puede proceder tambi´en, a intervalos regulares, a unas extracciones de una parte de la biomasa en caso de cultivo continuo. En cada caso, el tiempo de cultivo o los intervalos entre dos extracciones pueden ser determinados por experiencias de rutina. En vista a una utilizaci´ on de las composiciones de la invenci´ on, el procedimiento de preparaci´ on de estas composiciones comprende por tanto una etapa de triturado de la biomasa (plantas, partes de plantas o c´elulas de cultivos in vitro) seg´ un los procedimientos usuales. Se puede a continuaci´on purificar por lo menos parcialmente la composici´ on eliminando todos o parte de los constituyentes distintos de los precursores de colorantes, como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, se puede filtrar el triturado sobre 3

ES 2 162 221 T3 cualquier filtro apropiado, comprendido sobre un filtro que retiene los productos de dimensi´on superior a 0,2 µm aproximadamente.

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Se puede purificar a´ un m´ as la composici´on de la invenci´ on (filtrado, sobrenadante o extracto) por paso a trav´es de una membrana de ultrafiltraci´ on o de di´ alisis capaz de retener a los constituyentes de masa molecular superior a un umbral predeterminado, por ejemplo superior a 3500, o superior a 1500 o a 1000. En cada uno de estos casos, los precursores de colorantes se encuentran en el filtrado o el dializado.

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Los precursores de colorante de la invenci´on son retenidos por las membranas que tienen un umbral de corte de 500 daltons. Su masa molecular est´ a por tanto comprendida entre 500 y 1000 daltons.

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La invenci´on tiene tambi´en por objeto un procedimiento de obtenci´ on de un producto colorante, caracterizado porque se hace reaccionar una quinona con una composici´ on de precursor de colorante tal como la definida anteriormente y que, si se desea, se a´ısla y/o purifica un producto colorante salido de esta reacci´on.

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La selecci´on de las quinonas que convienen puede realizarse por simples experiencias de rutina haciendo reaccionar la quinona considerada con una composici´ on que contiene el precursor de colorante definido anteriormente. En efecto, la reacci´ on conduce a la aparici´ on de una coloraci´ on o una modificaci´on de la coloraci´ on, la quinona es utilizable en el procedimiento de un producto colorante seg´ un la invenci´on. Seg´ un un modo de realizaci´ on particular, la quinona puede elegirse en particular entre las 1,4benzoquinonas eventualmente sustituidas en una por lo menos de las posiciones 2 y 3, las 1,4naftoquinonas eventualmente sustituidas en una por lo menos de las posiciones 5,6,7 y 8, y la difenoquinona. Entre las 1,4-benzoquinonas eventualmente sustituidas, se citar´ an en particular las que responden a la f´ ormula (I)

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en la cual R y R’ representan independientemente -H, hidroxi, alquilo con C1 -C4 , alcoxi con C1 -C4 , sulfonilo, o un grupo heteroc´ıclico o arilo, eventualmente sustituido. El grupo heteroc´ıclico es por ejemplo un grupo furanilo, piranilo, o indolilo eventualmente sustituido, en particular sustituido por un grupo alquilo o alcoxi con C1 -C4 . El grupo arilo es por ejemplo un grupo fenilo eventualmente sustituido, en particular sustituido por lo menos por un alquilo o alcoxi con C1 -C4 . Entre las 1,4-naftoquinonas eventualmente sustituidas, se citar´ an en particular las que responden a la f´ ormula (II)

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en la cual los sustituyentes R1 a R4 est´an definidos, independientemente, como R y R’ anteriores.

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ES 2 162 221 T3 Las quinonas de f´ormulas (I) y (II) son conocidas o pueden prepararse seg´ un procedimientos conocidos. Algunas quinonas utilizables, comprendidos unos compuestos de f´ ormula (I) y (II), se describen por ejemplo en los documentos EP-376776 y “Dictionary of Natural Products on CD-ROM”, CHAPMAN & HALL (London) 1996. 5

Se puede utilizar en particular una quinona elegida entra la 1,4 - benzoquinona, la 2 - metil - 1,4 benzoquinona, la 2 - (4 - metil - 2 - furanil) - 1,4 - benzoquinona, la 2 - hidroxi - 1,4 - benzoquinona, la 2 - fenil - 1,4 - benzoquinona, la 1,4 - naftoquinona, la 5 - hidroxi - 1,4 - naftoquinona, la 5 - hidroxi - 7 - metil - 1,4 - naftoquinona, la 6 - metil - 1,4 - naftoquinona y la 5,8 - dihidroxi - 1,4 - naftoquinona. 10

Se pueden utilizar tambi´en otros derivados de quinona tales como la geogenina (o pleurotina) y la juglorina.

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La reacci´on del precursor del colorante con una quinona se efect´ ua preferentemente en soluci´on en un solvente apropiado tal como por ejemplo un alcohol o una mezcla de agua y de alcohol. El alcohol puede ser en particular un alcohol inferior tal como el metanol. Por ejemplo, se a˜ nade la quinona en forma de una soluci´ on en un alcohol con una soluci´ on acuosa que contiene el precursor de colorante. La reacci´on puede efectuarse a una temperatura de 20 a 100◦ C aproximadamente y en particular de 30 a 80◦C aproximadamente.

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Los precursores de colorantes de la invenci´on pueden estar presentes en las plantas enteras cultivadas en el suelo o en cultivo hidrop´onico. As´ı, en el caso de Medicago sativa, el filtrado obtenido despu´es de paso sobre membrana de porosidad 0,2 µm de un triturado de planta entera proporciona unos precursores de colorantes semejantes a los presentes en las c´elulas cultivadas in vitro en presencia de lactosa, como ha demostrado por ejemplo el an´ alisis por HPLC de dicho filtrado. Sin embargo, en la planta entera, estos precursores de colorantes est´an muy a menudo s´ olo presentes a bajas concentraciones, generalmente varios centenares de veces m´as bajas que las concentraciones obtenidas en las c´elulas de la misma planta cultivada in vitro en presencia de lactosa como u ´ nica fuente de carbono. Las composiciones de la invenci´on, tales como las definidas anteriormente, son en particular las que contienen los precursores de colorantes a una concentraci´ on por lo menos igual a la de dichos precursores en una dispersi´ on acuosa que contiene, por litro de dispersi´ on, 1 g (y en particular 2 g) en materia seca de un triturado de c´elulas de la planta considerada, habiendo sido las c´elulas de dicho triturado cultivadas en un medio que contiene u ´ nicamente lactosa como fuente de carbono. Las concentraciones m´ınimas as´ı definidas, que pueden ser muy f´ acilmente alcanzadas utilizando como materia prima unas c´elulas cultivadas in vitro en presencia de una fuente de carbono tal como por ejemplo lactosa, son netamente superiores a las que pueden ser alcanzadas en una dispersi´ on acuosa de un triturado de la planta entera. La invenci´on tiene tambi´en por objeto un producto colorante caracterizado porque es susceptible de ser obtenido por el procedimiento que acaba de ser descrito.

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Entre estos colorantes, se citar´ an en particular los compuestos A, B, C y D descritos a continuaci´ on en la parte experimental.

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Entre los precursores de colorantes contenidos en las composiciones de la invenci´on, se citar´ an por tanto en particular los que son capaces de reaccionar con la 1,4-naftoquinona dando uno por lo menos de dichos compuestos A, B, C y D. Los productos colorantes obtenidos seg´ un la invenci´ on son generalmente solubles en por lo menos un solvente usual, por ejemplo en unos alcoholes (en particular alcanoles inferiores como el metanol o el etanol), y en unas mezclas de agua y de un alcohol. Estos productos colorantes pueden ser utilizados en particular en unas composiciones colorantes tales como unas composiciones de te˜ nido de las fibras textiles, comprendida la lana; en unas composiciones de te˜ nido de los cabellos; en unas composiciones de lacas para u˜ nas, etc. Dichas composiciones forman parte de la invenci´on. Pueden tambi´en ser utilizados para dar una coloraci´ on distintiva a unas composiciones l´ıquidas tales como unas composiciones de limpieza o de mantenimiento de las superficies (suelos, paredes, cristales). Las composiciones de te˜ nido de la invenci´ on pueden prepararse seg´ un los procedimientos usuales. Por ejemplo, las composiciones de te˜ nido para cabellos, que contienen los productos colorantes obtenidos seg´ un la invenci´ on, comprenden por lo menos un solvente apropiado aceptable en cosmetolog´ıa, en particular el agua, los alcoholes inferiores (por ejemplo con C1 -C6 ), los alquilenglicoles (como el etilenglicol 5

ES 2 162 221 T3 o el propilenglicol), etc.

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Los productos colorantes obtenidos seg´ un la invenci´ on est´ an presentes, en las composiciones de te˜ nido para cabellos, a una concentraci´on comprendida generalmente entre 0,01 a 10 % en peso, y en particular de 0,05 a 5 % en peso, con respecto al peso total de la composici´on. Estas composiciones pueden tambi´en contener otros colorantes elegidos entre los colorantes directos usuales, as´ı como los ingredientes usualmente presentes en unas composiciones de este tipo, por ejemplo unos agentes tensioactivos, unos agentes espesantes, unos agentes dispersantes, unos agentes conservantes, unos agentes de hinchado de las fibras querat´ınicas, unos perfumes, etc.

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Las composiciones de te˜ nido de la invenci´ on pueden presentarse en particular en forma de lociones, de geles, de dispersiones, de emulsiones, de espumas o tambi´en en forma de composiciones acondicionadas para aerosoles. 15

Para te˜ nir los cabellos con unas composiciones de te˜ nido de la invenci´ on, se aplica la composici´on sobre los cabellos y se deja actuar, en el caso en que la composici´on est´a destinada a ser aclarada, durante un tiempo generalmente comprendido entre 5 y 60 minutos, y en particular entre 10 y 30 minutos, y despu´ es se aclaran los cabellos. En el caso en que la composici´on no est´ a destinada a ser aclarada, se aplica sobre los cabellos, y despu´es se pueden secar estos u ´ ltimos.

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Las composiciones de lacas para u˜ nas que contienen los productos colorantes obtenidos seg´ un la presente invenci´on se preparan de forma usual. Adem´ as de un producto colorante obtenido seg´ un la invenci´on, las mismas contienen generalmente, en un solvente o una mezcla de solventes apropiada (en particular unos alcoholes tales como los alcanoles inferiores o el alcohol benz´ılico, sus acetatos, o tambi´en la acetona o unos glicoles), un pol´ımero film´ ogeno (en particular nitrocelulosa, etilcelulosa, etc), un plastificante (por ejemplo ftalato de butilo) que aumenta en particular la flexibilidad de la pel´ıcula de laca depositada, y eventualmente otros colorantes o pigmentos, y unas resinas que permiten obtener una laca brillante que tiene una buena adherencia.

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Las composiciones de te˜ nido de la invenci´ on pueden ser tambi´en utilizadas en unos procedimientos de te˜ nido de fibras textiles, por ejemplo la lana, por impregnaci´on o inmersi´ on de fibras textiles o de tejidos, con una soluci´ on o dispersi´on de productos colorantes obtenidos seg´ un la invenci´ on, eventualmente en presencia de un agente mordiente, seg´ un unos procedimientos conocidos.

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La invenci´on se refiere tambi´en a un kit (estuche) que permite preparar una composici´ on colorante. Dicho kit comprende, en unos contenedores separados cuyos contenidos son mezclados en el momento del empleo, por lo menos un precursor de colorante y por lo menos una quinona, presentando dicho precursor las caracter´ısticas siguientes:

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- existe en estado natural en las c´elulas de una planta del g´enero Medicago, - es capaz de reaccionar con dicha quinona dando por lo menos un producto colorante.

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En el kit de la invenci´on, el precursor de colorante puede estar presente en soluci´ on en un solvente tal como los mencionados anteriormente para la reacci´on con la quinona. El precursor de colorante puede tambi´en estar presente en forma de extracto seco o de producto purificado. En este u ´ ltimo caso, el kit puede contener por lo menos dicho solvente en un contenedor separado, cuyo contenido es utilizado para disolver los reactivos (precursor de colorante y/o quinona) en el momento de la utilizaci´ on. As´ı mismo, la quinona puede estar presente en forma de producto puro o en forma de soluci´ on. Los ejemplos siguientes ilustran la invenci´on. Ejemplo 1

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Cultivo in vitro en la oscuridad en presencia de lactosa Se pone en cultivo en medio l´ıquido, en condiciones as´epticas, un fragmento de cotiled´on de alfalfa (variedad Europa). El medio de cultivo, que presenta la particularidad de contener lactosa como sustrato carbonado, tiene la composici´ on siguiente:

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Constituyentes

Concentraciones (mg.L−1)

KNO3 NH4 NO3 KH2 PO4 , H2 O MgSO4 , 7H2 O CaCl2 , 2H2 O MnSO4 , H2 O NiCl2 , 6H2 O AlCl3 , 6H2 O H3 BO3 ZnSO4 , 7H2 O CuSO4 , 5H2 O Kl FeSO4 , 7H2 O Na2 EDTA Pantotenato de calcio Mesoinositol ´ Acido nicot´ınico Piridoxina Tiamina Biotina Kinetina ´ Acido naftalenac´etico Lactosa

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1900,000 1650,000 170,000 370,000 440,000 0,076 0,030 0,050 1,000 1,000 0,030 0,010 27,800 37,300 1,000 100,000 1,000 1,000 1,000 0,010 0,100 0,100 30000,0

Este medio de cultivo es previamente esterilizado en autoclave durante 20 minutos a 115◦C. 35

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Para el mantenimiento del cultivo, se recolectan las c´elulas por filtraci´ on sobre una tela de Blutex de 50 µm y se inocula medio de cultivo virgen, en frascos de Erlenmeyer de 1 L que contienen 400 mL de on medio, con 20 g de biomasa recolectada. El cultivo es mantenido a 26◦ C al abrigo de la luz con agitaci´ de 100 rpm. El mantenimiento es semanal. Ejemplo 2 Extracci´ on y caracterizaci´ on del precursor de colorante: reacci´ on con la 1,4-naftoquinona a) Obtenci´ on del precursor de colorante en forma de una soluci´ on filtrada

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Unas c´elulas cultivadas como en el ejemplo 1 se recolectan al final de un ciclo de mantenimiento por filtraci´ on sobre tela de Blutex 50 µm. Se introducen 5 g de materia fresca as´ı recolectada en 15 cm3 de una soluci´ on tamponada de pH 6,5. La soluci´on tamp´ on se prepara de la forma siguiente: se prepara una soluci´ on A que contiene 27, on B que contiene 53,65 g de 8 g de NaH2 PO4 , 2H2 O en 1 L de agua ultrapura; se prepara una soluci´ on Na2 HPO4 , 7H2 O en 1 L de agua ultrapura; se mezclan 171,25 mL de soluci´on A con 78,75 ml de soluci´ B y 250 ml de agua ultrapura para obtener 500 mL de soluci´ on tamponada. La suspensi´on de c´elulas es triturada en un homogeneizador de Potter. La mezcla triturada es filtrada sobre filtro Whatmann de 2,7 µm, y despu´es el filtrado obtenido es filtrado sobre membrana Millipore 0,2 µm. Las operaciones de filtraci´on se efect´ uan a 4◦ C. b) Reacci´ on con la 1,4-naftoquinona

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naden 50 pL de una soluci´ on que contienen 12,5 g/L de 1,4A 5 cm3 del filtrado obtenido, se a˜ naftoquinona en metanol. Se deja la mezcla obtenida en incubaci´ on durante 90 minutos a 30◦ C.

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ES 2 162 221 T3 c) Extracci´ on del producto colorante

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Se a˜ nade a continuaci´on una soluci´ on acuosa de a´cido clorh´ıdrico 1N hasta pH 2,5 y se a˜ nade cloruro de metileno, a raz´ on de un volumen para un volumen de medio de reacci´ on. Se agita durante 1 hora con una barra magn´etica, se centrifuga durante 10 minutos a 10000 rpm. Se separan la fase org´ anica y la fase acuosa. Se a˜ nade a la fase acuosa acetato de etilo (1 volumen de acetato de etilo para un volumen de fase acuosa). Se agita durante 1 hora y despu´es se deja decantar y se separan las fases org´anica y acuosa.

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Las fases org´anicas se re´ unen y se secan sobre sulfato de sodio anhidro. Este u ´ltimo es a continuaci´on eliminado por filtraci´ on. Se evaporan a continuaci´ on los solventes a presi´on reducida a 50◦ C. Se obtiene un residuo seco. d) An´ alisis del extracto obtenido

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El residuo seco obtenido en la fase anterior, disuelto en una mezcla de metanol/cloruro de metileno 50:50 (en volumen), es analizado por CCM (cromatograf´ıa en capa delgada) de s´ılice. Se eluye con cloruro de metileno que contiene 1 % de metanol. Se observa la presencia de un producto A caracterizado por Rf = 0,88 y un producto B caracterizado por Rf = 0,85. R RP (proveedor: El extracto es tambi´en caracterizado por HPLC, con una columna HPLC Lichrosorb MERCK). El eluyente es una mezcla 60/40 (V/V) de acetonitrilo y de agua ultrapura acidificada hasta pH 3 con a´cido fosf´ orico.

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Caudal: 1 cm3 por minuto. Se efect´ ua la detecci´on a 490 nm. Los productos A y B son caracterizados respectivamente por unos tiempos de retenci´on de 22,7 y de 13,8 minutos.

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El an´ alisis por CCM (eluyente: mezcla cloruro de metileno/metanol 98:2) del residuo seco obtenido en la fase anterior, en soluci´on en una mezcla cloruro de metileno-metanol (50:50), ha permitido aislar adem´as un compuesto C, de color violeta (Rf = 0,2). 35

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El an´ alisis por CCM (eluyente: mezcla cloruro de metileno/heptano 85:15) del residuo seco obtenido en la fase anterior, en soluci´on en una mezcla cloruro de metileno-metanol (50:50 en volumen), ha permitido tambi´en aislar un compuesto D, de color amarillo (Rf = 0,14). Los compuestos A, B, C y D han sido caracterizados por espectrometr´ıa de masa, en RMN1 H, en RMN13 C, en RMN2D1 H−13 C y 1 H-15 N. El conjunto de los datos anal´ıticos permite proponer las estructuras siguientes:

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El compuesto A es por tanto la 6,7,8,9 - tetrahidro - dinafto[2,3 - f:2’,3’ - h]quinolein - 5,10,11,16 - tetraona, el compuesto B es la dinafto[2,3 - e:2’,3’ - g]indolin - 5,9,14,15 - tetraona, el compuesto C es la 4b - hidroxi - 4b,4c,10a,10b,11,12,13 - heptahidro - 3 - aza - antra[1,4 - def]nafto[2’,3’ - p]crisen 5,10,14,19,20 - pentaona, y el compuesto D es la dinafto[2,3 - e:2’,3’ - g]indol - 5,14,15, - triona. En soluci´on en cloruro de metileno, los compuestos A, B y C tienen un color rojo y el compuesto D color amarillo. En otras experiencias, el filtrado obtenido en el ejemplo 2a) anterior ha sido tratado en autoclave on como anteriormente, no durante 30 minutos a 120◦ C. Despu´es de adici´on de naftoquinona e incubaci´ hay formaci´ on de los compuestos A y B. Por el contrario, un tratamiento del filtrado durante 30 minutos on de los productos A y B. a 80◦ C no impide la obtenci´ Cuando el filtrado obtenido como anteriormente es previamente tratado con una proteasa a una conon de los productos A y centraci´on final de 80 unidades durante 15 horas a 40◦ C, se observa la formaci´ B, en cantidad detectable, despu´es de reacci´on con la 1,4-naftoquinona en las condiciones ya descritas anteriormente. En otras experiencias, el filtrado obtenido en el ejemplo 2a) anterior ha sido dializado a trav´es de diferentes membranas que tienen unos umbrales de corte respectivos de 3500, 1000 y 500 daltons. En cada caso, la reacci´on con la 1,4-naftoquinona, seguida de la extracci´on, como se ha descrito anteriormente, se ha efectuado a la vez sobre el retenido y sobre el dializado, y se han analizado por CCM los productos obtenidos, buscando los productos A y B. Con las membranas que tienen un umbral de corte de 3500 y de 1000 daltons, los productos A y B son detectados en el producto obtenido por reacci´ on con el dializado. Con la membrana que tiene un umbral de corte de 500 daltons, los productos A y B se encuentran en el producto obtenido por reacci´ on con el retenido. Se puede por tanto concluir que los precursores de colorante, presentes en el filtrado, que reaccionan con la 1,4-naftoquinona, tienen una masa molecular comprendida entre 500 y 1000 daltons, y que la reacci´on con la 1,4-naftoquinona no es de naturaleza enzim´ atica. Ejemplo 3 on: comparaci´ on con unas c´elulas cultivadas en presencia de glucosa Cultivo in vitro bajo iluminaci´

60

Cuando el cultivo de las c´elulas de alfalfa, en el mismo medio que en el ejemplo 1, se realiza bajo iluminaci´ on (fotoperiodo de 16 horas), se obtiene tambi´en la formaci´ on de los productos A y B despu´es de reacci´on con la 1,4-naftoquinona como se describe en el ejemplo 2. 9

ES 2 162 221 T3

5

Se han efectuado diversos ensayos an´ alogos a los del ejemplo 2 sobre unos cultivos de Medicago sativa cultivados en el mismo medio que el descrito anteriormente, pero en presencia de glucosa como fuente de carbono en lugar de lactosa. No se han obtenido los productos A y B, en cantidad detectable, despu´es de reacci´on con la 1,4-naftoquinona. Ejemplo 4 Reacci´ on con la p-benzoquinona

10

Se opera de forma an´ aloga a la descrita en el ejemplo 2b), reemplazando la 1,4-naftoquinona por la p-benzoquinona. La mezcla de reacci´on obtenida tiene una coloraci´ on violeta. Ejemplo 5 15

Reacci´ on con la juglona Se opera de forma an´ aloga a la descrita en el ejemplo 2b), reemplazando la 1,4-naftoquinona por la 5-hidroxi 1,4-naftoquinona (juglona). Se obtiene una coloraci´ on marr´ on. 20

Ejemplo 6 Reacci´ on con la naftazarina 25

Se opera de forma an´ aloga a la descrita en el ejemplo 2b), reemplazando la 1,4-naftoquinona por la 5,8-dihidroxi 1,4-naftoquinona (naftazarina). Se obtiene una coloraci´ on rosa. Ejemplo 7

30

Estudio del poder tintoreo Los ensayos se han efectuado sobre unos lotes de cabellos que contienen 90 % de cabellos blancos naturales.

35

Se han efectuado tambi´en unos ensayos sobre los mismos cabellos previamente sometidos a permaR (proveedor: L’OREAL). nente con la permanente DULCIA 1 El extracto obtenido en el ejemplo 2c) anterior se disuelve en etanol a 95 %.

40

Composici´ on 1: se a˜ nade a la soluci´on etan´ olica un volumen igual de agua a la que se ha a˜ nadido ´acido c´ıtrico hasta pH 4. Composici´ on 2: se a˜ nade a la soluci´on etan´ olica un volumen igual de agua a la que se ha a˜ nadido monoetanolamina hasta pH 10,5.

45

Se sumergen unas mechas de cabello de 1,2 g en la composici´on 1 ´o 2. Se deja actuar durante 30 minutos a 45◦ C, y despu´es se aclaran las mechas y se secan los cabellos. En todos los casos, se obtiene una coloraci´ on tabaco, m´ as marcada en los cabellos con permanente. 50

Ejemplo 8 Composici´ on de te˜ nido para cabellos 55

60

10

ES 2 162 221 T3 -

5

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15

Compuesto A Copol´ımero acetato de vinilo/´ acido crot´onico/polietilenglicol vendido bajo la denominaci´ on “Aristoflex A” por la Sociedad HOECHST Etanol Trietanolamina q.s.p. Agua q.s.p.

0,1 g

1,5 g 40 g pH = 7 100 g

Esta loci´ on se aplica sobre unos cabellos blancos. Los cabellos son entonces conformados y secados. Se colorean de rojo. Se obtienen unos resultados an´ alogos reemplazando el compuesto A por el compuesto B ´o C, o por una mezcla en cantidades iguales de los compuestos A, B y C. Ejemplo 9 Composici´ on de laca de u˜ nas

20

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30

35

Se prepara una composici´ on para coloraci´ on de las u˜ nas que tiene la composici´on siguiente ( % en peso): -

Tolueno Acetato de butilo Acetato de etilo Acetato de n-propilo Isopropanol Nitrocelulosa Ftalato de dibutilo Santolite Butiral polivin´ılico Acetil-tributil-citrato Filtro U.V. Colorante

21,97 10 10 10 25 9 2 3 5 3 0,5 0,53

Cuando el colorante es el compuesto A, B ´o C, se obtiene una laca de u˜ nas de color rosa-rojo. Con el compuesto D, el color de la laca es amarillo. 40

Ejemplo 10 Kit 45

La reacci´on de coloraci´ on puede efectuarse con la ayuda de un kit (estuche) compuesto por dos reactivos: - un reactivo A est´a constituido por un frasco de cristal de 10 ml que contiene 50 µl de una soluci´ on metan´ olica de 1,4-naftoquinona con 12,5 g/L,

50

55

- un reactivo B est´a constituido por un frasco de cristal de 5 mL que contiene 5mL de reactivo preparado como sigue: unas c´elulas de alfalfa (5 g) se trituran en un tamp´ on como se ha descrito en el ejemplo 1. El medio obtenido es filtrado en condiciones as´epticas sobre membrana Millipore de 0,2 µ. 5 mL de esta mezcla son transferidos de forma as´eptica a un frasco de cristal previamente esterilizado en autoclave, 120◦C, 30 minutos. Estos dos reactivos pueden por tanto conservarse as´ı a temperatura ambiente durante algunas semanas.

60

En el momento de la utilizaci´ on, el contenido del reactivo B es transferido al frasco que contiene el reactivo A. Este es entonces colocado al ba˜ no Mar´ıa para incubaci´ on durante 90 minutos a 30◦C, lo que conduce a la formaci´on de los colorantes buscados.

11

ES 2 162 221 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Procedimiento de preparaci´ on de una composici´ on que contiene un precursor de colorantes, caracterizado porque se trituran unas plantas o partes de plantas del g´enero Medicago, o unas c´elulas de una planta del g´enero Medicago que provienen de un cultivo in vitro, y porque se separa y se recoge seg´ un los procedimientos de fraccionamiento usuales una fracci´on por lo menos parcialmente purificada exenta de constituyentes de masa molecular superior a 3500, siendo dicha fracci´ on capaz de reaccionar en soluci´on acuosa con la 1,4-naftoquinona dando por lo menos un producto colorante.

10

2. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque para separar dicha fracci´on por lo menos parcialmente purificada, se opera seg´ un uno por lo menos de los procedimientos siguientes: - se procede a una filtraci´ on y se recoge el filtrado;

15

- se procede a una decantaci´ on o a una centrifugaci´ on y se recoge el sobrenadante; - se procede a una extracci´ on con un solvente y despu´es, si se desea, se evapora dicho solvente.

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25

3. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 2, caracterizado porque adem´ as, se trata un triturado, un extracto, un filtrado o un sobrenadante as´ı obtenido de forma que se eliminen los constituyentes de masa molecular superior a 1500. 4. Procedimiento seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se cultivan in vitro unas c´elulas de una planta del g´enero Medicago, en un medio que contiene una fuente de carbono apropiada, se tritura la biomasa formada, y se separa y se recoge dicha fracci´ on por lo menos parcialmente purificada. 5. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´on 4, caracterizado porque se efect´ ua dicho cultivo en un medio que contiene u ´ nicamente lactosa como fuente de carbono.

30

35

6. Procedimiento seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque se efect´ ua dicho cultivo en la oscuridad. 7. Composici´ on, que contiene por lo menos un precursor de colorante, que puede obtenerse seg´ un el procedimiento seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 8. Composici´ on seg´ un la reivindicaci´ on 7, caracterizada porque se presenta en forma de una soluci´ on o en forma de un producto s´ olido soluble en un solvente elegido entre el agua, los alcanoles con C1 -C6 , el cloruro de metileno, y sus mezclas.

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55

9. Composici´ on seg´ un la reivindicaci´ on 7 o´ 8, caracterizada porque dicho precursor est´ a presente en dicha composici´ on a una concentraci´ on superior a la concentraci´ on de dicho precursor en dicha planta o en dichas c´elulas en estado de secado. 10. Composici´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque dicho precursor de colorante est´a presente en dicha composici´ on a una concentraci´ on por lo menos igual a la de dicho precursor en una dispersi´ on acuosa que contiene, por litro de dispersi´ on, 1 gramo, de materia seca, de un triturado de c´elulas de dicha planta, habiendo sido cultivadas las c´elulas de dicho triturado in vitro en un medio que contiene u ´ nicamente lactosa como fuente de carbono. 11. Composici´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque dicha planta se elige entre Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago intermedia, Medicago media, Medicago varia y Medicago versicolor. 12. Composici´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizada porque dicho precursor es capaz de reaccionar con la 1,4-naftoquinona dando uno por lo menos de los productos siguientes: - 6,7,8,9-tetrahidro-dinafto[2,3-f:2’,3’-h]quinolein 5,10,11,16-tetraona,

60

- dinafto[2,3-e:2’,3’-g]indolin-5,9,14,15-tetraona, - 4b-hidroxi-4b,4c,10a,10b,11,12,13-heptahidro-3-aza-antra[1,4-def]nafto[2’,3’-p]crisen-5,10,14,19,20pentaona, y 12

ES 2 162 221 T3 - dinafto[2,3-e:2’,3’-g]indol-5,14,15,-triona.

5

13. Procedimiento de obtenci´on de un producto colorante, caracterizado porque se hace reaccionar una quinona con una composici´on tal como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, y porque, si se desea, se a´ısla y/o purifica un producto colorante obtenido de esta reacci´ on.

10

14. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 13, caracterizado porque dicha quinona se elige entre las 1,4-benzoquinonas eventualmente sustituidas en una por lo menos de las posiciones 2 y 3, las 1,4-naftoquinonas eventualmente sustituidas en una por lo menos de las posiciones 5, 6, 7 y 8, y la difenoquinona. 15. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 14, caracterizado porque dicha quinona es una 1,4benzoquinona eventualmente sustituida de f´ ormula (I) o una 1,4-naftoquinona eventualmente sustituida de la f´ ormula (II)

15

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en la cuales los sustituyentes R, R’ y R1 a R4 representan independientemente -H, hidroxi, alquilo con C1 -C4 , alcoxi con C1 -C4 , sulfonilo, o un grupo heteroc´ıclico o arilo eventualmente sustituido. 30

35

16. Procedimiento seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque dicha quinona se elige entre la 1,4-benzoquinona, la 2-metil-1,4-benzoquinona, la 2-(4-metil-2-furanil)1,4-benzoquinona, la 2-hidroxi-1,4-benzoquinona, la 2-fenil-1,4-benzoquinona, la 1,4-naftoquinona, la 5-hidroxi-1,4-naftoquinona, la 5-hidroxi-7-metil-1,4-naftoquinona, la 6-metil-1,4-naftoquinona y la 5,8dihidroxi-1,4-naftoquinona. 17. Procedimiento seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque se efect´ ua dicha reacci´on en soluci´ on a una temperatura que puede ir de 20 a 100◦C aproximadamente.

40

18. Producto colorante caracterizado porque es susceptible de ser obtenido por el procedimiento seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17. 19. Producto colorante seg´ un la reivindicaci´ on 18, caracterizado porque se elige entre los siguientes:

45

- 6,7,8,9-tetrahidro-dinafto[2,3-f:2’,3’-h]quinolein 5,10,11,16-tetraona, - dinafto[2,3-e:2’,3’-g]indolin-5,9,14,15-tetraona, - 4b-hidroxi-4b,4c,10a,10b,11,12,13-heptahidro-3-aza-antra[1,4-def]nafto[2’,3’-p]crisen-5,10,14,19,20pentaona, y

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- dinafto[2,3-e:2’,3’-g]indol-5,14,15,-triona. 20. Kit que permite preparar una composici´ on colorante, comprendiendo dicho kit en unos contenedores separados cuyos contenidos son mezclados en el momento del empleo, por lo menos un precursor de colorante y por lo menos una quinona, presentando dicho precursor las caracter´ısticas siguientes: - es un producto que existe en estado natural en las c´elulas de una planta de g´enero Medicago, - es capaz de reaccionar con dicha quinona dando por lo menos un producto colorante.

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21. Kit seg´ un la reivindicaci´ on 20, caracterizado porque dicha planta se elige entre las mencionadas en la reivindicaci´on 11.

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ES 2 162 221 T3 22. Kit seg´ un la reivindicaci´ on 20 o´ 21, caracterizado porque dicha quinona se elige entre las mencionadas en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

5

23. Composici´ on colorante, caracterizada porque contiene un producto colorante tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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