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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 220 157

21 Número de solicitud: 200102265

51 Int. Cl. : A01H 1/08

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ESPAÑA

A01H 7/00

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SOLICITUD DE PATENTE

22 Fecha de presentación: 14.03.2003

71 Solicitante/s: KOZO NIWA

4-4, Asahimachi Tosashimizu-shi, Kochi, JP 43 Fecha de publicación de la solicitud: 01.12.2004

72 Inventor/es: Niwa, Kozo y

Yoshinori, Sasaki

43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud:

74 Agente: Roeb Díaz-Álvarez, María

01.12.2004

54 Título: Bosque plantado por el hombre, método para plantar árboles y método para cultivar plantas.

57 Resumen:

ES 2 220 157 A1

Grupo de plantas, método para plantar árboles y método para cultivar plantas. Inhibición de los daños a los bosques causados por rayos ultravioleta. Esto se realiza mediante la selección por cochicina de tipo triploides o tetraploides de cromosomas y mediante la repoblación para formar un grupo de plantas resistente a los rayos ultravioleta creando un bosque artificial.

Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

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ES 2 220 157 A1 DESCRIPCIÓN Bosque plantado por el hombre, método para plantar árboles y método para cultivar plantas. 5

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a una técnica de cultivo de plantas, tal como el cultivo de árboles, y más específicamente a una técnica de cultivo selectivo de árboles jóvenes o similares que es resistente a los rayos ultravioleta con objeto de obtener una vegetación, tal como la de un bosque, fiablemente resistente a los rayos ultravioleta.

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Últimamente, el problema de los rayos ultravioleta sobre la tierra es objeto de debate. Se debe especialmente al hecho de que en los últimos tiempos se está destruyendo el ozono de la estratosfera que rodea a la tierra, con lo cual los rayos ultravioleta llegan a la tierra desde el exterior y ejercen su mala influencia sobre la biología terrestre. 15

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Por ejemplo, en lo referente al cuerpo humano, se informa sobre el incremento de afecciones asociadas a los rayos ultravioleta, y se confirma que el aumento de casos de cáncer de la piel se debe a un incremento de la radiación proveniente de los rayos ultravioleta. Por lo tanto, se estima que el daño derivado de los rayos ultravioleta da lugar a la presencia de oxígeno activo. Niwa, uno de los presentes inventores, ha estudiado sus propiedades farmacológicas y bioquímicas de diversas afecciones causadas por el oxígeno activo a través de varios años. Resumen de la invención

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Los daños reales derivados de los rayos ultravioleta convencionales han sido estudiados principalmente, y como tópico primordial, en relación con sus efectos sobre el cuerpo humano. Por otra parte, los presentes inventores han llegado a la conclusión de que los rayos ultravioleta también han provocado un considerable daño a los bosques. Se ha determinado que el mayor daño a los bosques proviene de la lluvia ácida. Por ejemplo, en el distrito de Schwarzwald, Alemania, se ha emitido un informe sobre los considerables daños provocados en una extensa zona en la que gran número de árboles perecieron a causa de la lluvia ácida. Los óxidos acídicos, tales como los óxidos con contenido de azufre derivados de la combustión industrial, se disuelven en las gotas de lluvia para convertirse en lluvia ácida. La investigación sobre estos efectos fue repetida en varias ocasiones por los presentes inventores, que visitaron el bosque dañado y obtuvieron unos extensos resultados. Los presente inventores observaron los daños del bosque en el curso de varias visitas realizadas a diversos lugares del mismo, en diferentes distritos. Después de una detallada investigación de las condiciones observadas, los presentes investigadores determinaron que posiblemente existen otros factores, además de la lluvia ácida, fuertemente relacionados con los fenómenos anormales de los árboles marchitos encontrados en el bosque. Tales daños podrían deberse a los rayos ultravioleta, identificados como el factor principal relacionado con el daño al bosque. No existen muchos estudios anteriores sobre los efectos dañinos de los rayos ultravioleta sobre los bosques. Como resultado de los efectos observados por los presentes inventores en relación con los rayos ultravioleta, es necesario tomar medidas prácticas urgentes destinadas a inhibir tales daños a los bosques. Debido a la pérdida de ozono de la atmósfera y al aumento de la radiación ultravioleta a escala mundial, deben adoptarse medidas urgentes para inhibir el daño provocado por los rayos ultravioleta, centrándose en los diversos factores que provocan tales daños. Si no se aplican medidas al respecto, los bosques de todo el mundo se marchitarán a causa de los rayos ultravioleta, y se prevé su desaparición a escala mundial. El objeto de la presente invención es prevenir el daño a los bosques provocados por los rayos ultravioleta. Los bosques plantados por el hombre según la presente invención se caracterizan por el cultivo de plantas de semilla dotadas de poliploides (tasusei, en japonés). El número de cromosomas de las plantas de semilla es triploide o tetraploide. Las plantas son de coníferas. Tales plantas de coníferas se seleccionan del grupo que incluye al cedro y al ciprés japoneses. El mayor número de cromosomas de las semillas se obtiene a través de reproducción y mutación. El método de cultivo de árboles de la presente invención se caracteriza porque comprende los pasos de seleccionar plantas de semilla con cromosomas poliploides y luego plantarlas. El número de cromosomas de las plantas debe ser triploide o tetraploide. Las plantas son de coníferas. Tales plantas de coníferas son de Cryptomeria japonica D. Don y Chamaecyparis obtusa Endl. El mayor número de cromosomas de las semillas se obtiene a través de reproducción y mutación. El método de cultivo de plantas de la presente invención se caracteriza porque comprende los pasos de formar una vegetación artificial considerablemente resistente a los rayos ultravioleta en comparación con la vegetación constituida por plantas triploide - mediante el cultivo selectivo de plantas cuyo número de cromosomas supere el número básico e intrínseco de la especie. En esta memoria descriptiva, “poliploide” (tasusei, en japonés) define aquellas especies con tres veces más de juegos de cromosomas - es decir, el número de cromosomas fundamentales multiplicado por tres. Además, deberá 2

ES 2 220 157 A1 tenerse presente que el haploide o diploide que normalmente se observa en las plantas no se incluye en el alcance definido por el citado poliploide. Descripción de las realizaciones preferentes 5

A continuación se describen varios ejemplos y detalles de las realizaciones.

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Las plantas de semilla empleadas en los bosques plantados por el hombre, el método para plantar árboles y el método para cultivar plantas de la presente invención incluyen aspectos de resistencia a los rayos ultravioleta (en lo sucesivo, “resistencia a UV”. La forestación, en el caso de los bosques plantados por el hombre, se realiza empleando plantas de semilla con esta propiedad de resistencia a los rayos ultravioleta. Una vez seleccionadas las plantas de semilla que poseen dicha propiedad de resistencia a UV, se adopta una norma de selección de cromosomas poliploides (tasusei) adquiridos por dichas plantas. El término poliploide empleado en el presente documento define a las plantas de semilla con número de cromosomas superior a diploide.

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Este estudio ha sido propuesto, por vez primera, por los presentes inventores. Los árboles con cromosomas poliploides poseen una resistencia contra los rayos ultravioleta superior a la normalmente observada en árboles triploides. En los bosques plantados por el hombre formados por las citadas plantas de semilla resistentes a UV, se observa una evidente inhibición de los daños provocados por los rayos ultravioleta en árboles con cromosomas triploides. Los fenómenos anormales se refieren a efectos tales como árboles que se marchitan de pie, hojas peremnes que se secan y hojas caducas que caen a destiempo. Se estima que estos fenómenos anormales, producidos por los rayos ultravioleta, pueden ser inhibidos.

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A continuación se describen detalladamente varios tipos de árboles y varios ejemplos de la eficacia de la invención. Ejemplo

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En el ejemplo, se recogieron hojas de las plantas descritas en los apartados (1) a (3) que a continuación se incluyen, sometiéndolas a experimentos de resistencia a los rayos ultravioleta (resistencia W). (1) Arroz (Oryza sativa)

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Se emplearon hojas de Oryza sativa para fines comparativos de las muestras. El Oryza sativa es una planta monocotiledónea bien conocida por su resistencia a los rayos ultravioleta. Las muestras de hojas de Oryza Sativa utilizadas en el experimento se obtuvieron en la ciudad de Tosashimizu, prefectura de Kochi, en Shokoku, Japón. Las hojas de Oryza Sativa, provenientes de cinco zonas diferentes de la ciudad de Tosashimizu, fueron sometidas a medición de la actividad enzimática mediante el procedimiento descrito más adelante.

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(2) Osmunda (Osmunda japonica Thunb)

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Para el experimento, se recogieron hojas de Osmunda japonica Thunb que crecen espontáneamente en Tosashimizu, Japón. Se sabe que la Osmunda japonica Thunb, un helecho, es una plata cuya evolución es anterior a la de otras plantas. Muchos informes señalan que la Osmunda japonica Thunb se adapta a las condiciones ambientales gracias a que han adquirido la poliploidia multiplicador de cromosomas de la especie. (3) Gimnosperma, tal como pino negro, etc.

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Siendo una planta sensible a los rayos ultravioleta, las hojas de la gimnosperma se incluyeron en el experimento. Las tablas 1 a 4 de este ejemplo incluyen el árbol kuromatsu (cuyo nombre en latín es Pinus Thunbergii Parl), el árbol sugi (cuyo nombre en latín es Cryptomeria japonica D. Don) y el árbol hinoki (cuyo nombre en latín Chamaecyparis obtusa Endl.), los cuales crecen espontáneamente en las montañas de Japón y cuyas hojas se emplearon para el experimento. Dichas muestras de hojas de pino negro, cedro y ciprés se obtuvieron de los sitios reflejados en las tablas 1 a 4.

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El pino negro (en lo sucesivo denominado “pino negro de control”) sensible a los rayos UV comunes y el pino negro resistente a los rayos UV (en lo sucesivo denominado “pino negro resistente a UV”), descritos separadamente en la tabla 1, fueron sometidos a ensayos de actividad SOD y actividad GSH-Px, y a pruebas para determinar su nivel de peróxido lipídico. 60

Además, y según se refleja en las tablas 5 y 6, se realizaron mediciones de especies triploides y especies tetraploides derivadas de cruces y mutaciones. 65

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ES 2 220 157 A1 TABLA 1

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Comparación de niveles de peróxido lipídico y de actividades SOD y glutatión peroxidasa (GSH-Px) entre pinos negros japoneses (Pinus Thunbergii Parl.) resistente a UV y pinos negros japoneses (Pinus Thunbergii Parl.) sensibles a UV

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* P < 0,01 entre pinos negros resistentes y sensibles a UV 45

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ES 2 220 157 A1 TABLA 2 Comparación de niveles de peróxido lipídico y de actividades SOD y GSH-Px en ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.) triploides 5

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ES 2 220 157 A1 TABLA 3 Comparación de niveles de peróxido lipídico y de actividades SOD y GSH-Px en unidades adicionales de ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.) 5

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+ P < 0,001 entre tetraploides de unidades de control de ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.) y diploides o triploides de ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.), y entre tetraploides de unidades de control de ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.) y diploides o triploides de unidades de control de ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.).

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ES 2 220 157 A1 TABLA 4 Comparación de niveles de peróxido lipídico y de actividades SOD y GSH-Px en unidades de control de cedro japonés (Cryptomería japónica D. Don), hojas de arroz (Oryza Sativa) y osmunda (Osmunda japónica Thunb) 5

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± < 0,0001 entre tetraploides y triploides de unidades de control de cedro japonés (Cryptomería japónica D. Don.) 60

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§ P < 0,00001 entre tetraploides y triploides de unidades de control de cedro japonés (Cryptomería japónica D. Don.). Según se indica en la tabla 1, los Pinus Thunbergii Parl. resistentes a los rayos ultravioleta (resistentes a W) se compararon con los Pinus Thunbergii Parl. sensibles a los rayos ultravioleta (unidades de control) en relación con la actividad SOD, la actividad de glutatión peroxidasa (GSH-Px) y los niveles de peróxido lipídico. En la tabla 2, los triploides de Chamaecyparis obtusa Endl. se compararon con los triploides de Chamaecyparis obtusa Endl. en relación con los niveles de peróxido lipídico, la actividad SOD y la actividad GSH-Px. 7

ES 2 220 157 A1 En la tabla 3, los diploides, triploides y tetraploides de unidades de control de Chamaecyparis obtusa Endl. se compararon en relación con la actividad SOD individual, la actividad GSH-Px y los niveles de peróxido lipídico. 5

En la tabla 4 se comparó la actividad SOD, la actividad GSH-Px y los niveles de peróxido lipídico de los diploides, triploides y tetraploides de unidades de control de Cryptomería japónica D. Don, hojas de Oryza Sativa y Osmunda japónica Thunb. La comparación entre la tabla 4 y las tablas 5 y 6 se describe más adelante.

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Los extractos de las hojas de diploide, triploide y tetraploide de Cryptomería japónica D. Don y Chamaecyparis obtusa Endl. se comparan en las tablas 5 y 6, según se describe más adelante. En la tabla 5, columna de muestras de control, la marca empleada para describir el tamaño de la muestra de 0,6 gr/ml se denomina “x1”, la de 0,3 gr/ml se denomina “x2”, la de 6,0 gr/ml se denomina “x10”. La tabla 6 incluye información sobre las hojas de Oryza Sativa, para fines comparativos.

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Se ensayó la actividad enzimática individual y el nivel de peróxido lipídico de las plantas descritas en los apartados (1) a (3). Los elementos de ensayo empleados en la medición de la actividad enzimática consistieron en la actividad SOD, la actividad de glutatión peroxidasa (GSH-Px) y la actividad catalasa. Los resultados obtenidos se incluyen en las tablas 1 a 4. Las cantidades aparecen en forma de ± SD. Por el contrario, fue totalmente imposible detectar la actividad catalasa de plantas que no fueran Oryza Sativa, por lo que sus resultados no figuran en las tablas 1 a 4. En relación con el análisis cuantitativo del nivel de peróxido lipídico, el nivel en cuestión se midió empleando el método de reacción TBA, que consiste en convertir el ácido docohexanoico en una sustancia reactiva al TBA. Los homogenados de las hojas de las plantas individuales anteriormente descritas, empleados como muestras, se prepararon de la forma siguiente. Las hojas recogidas se pulverizaron en un molino. Los homogenados de las hojas de las plantas individuales anteriormente descritas se emplearon como muestras. El procedimiento de preparación de dichos homogenados de hoja es el siguiente. El polvo se suspende en una solución de etanol al 95% para el ensayo de formación de peróxido lipídico o en una solución fisiológica salina para cualquier otro ensayo que no sea de formación de peróxido lipídico. En ambos casos, la concentración es de 60 mg/ml. La solución en suspensión se somete a sonicación (15 W, durante 15 segundos).

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Después de la sonicación, la solución se centrifuga a 1.300 g, según se muestra en la figura 1. Una vez realizada la centrifugación, los sobrenadantes se dividen en dos partes. Una parte se emplea en la preparación de muestras para determinar el nivel de peróxido lipídico. La otra se pasa a través de un filtro de 45µ. Una parte de este filtrado se utiliza como muestra para el ensayo de actividad SOD, y el resto como muestras para los ensayos de actividad catalasa y GSH-Px. Análisis cuantitativo de SOD

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La mezcla anteriormente indicada se agrega a 0,2 ml de la mezcla de ensayo que contiene xantina-xantina oxidasa para producir O2 -. La cantidad resultante de O2 - está determinada por la cantidad de reducción de ferricitocromo c (tipo III) obtenida por absorbancia óptica a 550 nm, medida con un espectrofotómetro (Beckman). La cantidad de SOD contenida en la muestra se define como la cantidad de reducción obtenida al reducir citocromo c al 50%. Una unidad de SOD se expresa en unidades/mg de proteína. En este análisis, la muestra misma no sólo inhibe la reacción sobre el citocromo c sin la mediación del O2 -, sino que reduce directamente una pequeña cantidad de citocromo c. Empleando estos factores, se calculó la cantidad real de COD por medio de la siguiente fórmula: unidad = {a-(b-c)}/(a/2)

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en donde: a = absorbancia obtenida por la adición sólo de xantina oxidasa. 55

b = absorbancia obtenida por los homogenados de las hojas en presencia de xantina oxidasa. c = absorbancia obtenida por la adición sólo de los homogenados de las hojas antes de la adición de xantina oxidasa. 60

Ensayo de actividad catalasa

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La actividad catalasa se determinó sobre la base de la velocidad de reducción del peróxido de hidrógeno (H2 O2 ). La velocidad de reducción se midió durante 12 a 30 segundos, en presencia de muestras de homogenados de las hojas, empleándose un espectrofotómetro a 240 nm. La actividad se expresa por medio de la siguiente fórmula: 8

ES 2 220 157 A1 K = (2,3 / 18) X log (A1/A2)

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A1 = Absorbancia medida durante 12 segundos a 240 nm en mezcla de ensayo con un volumen total de 3,1 ml, consistente en 10 mmol/L de H2 O2 en una solución de 3 ml de 50 mmol/L de solución tampón de fosfato de potasio y 0,1 ml de homogenado de las hojas. A2 = Absorbancia medida durante 30 segundos a 240 nm en la citada mezcla de ensayo.

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En este ensayo, el substrato de peróxido de hidrógeno fue sustituido por perborato sódico debido a la posibilidad de que el peróxido de hidrógeno provocara inestabilidad. En este caso, una solución de 0,002 a 0,05 ml de muestra de las hojas se suspendió en 2,8 ml de solución tampón (pH 7,4) de fosfato potásico de 0,5 mol/L, manteniéndose la mezcla en preincubación a 30ºC durante 5 minutos. A continuación, se agregó una solución de 0,2 N de perborato sódico a la mezcla preincubada, iniciándose la reacción. Se registró información durante 2-3 minutos, a 220 nm. Ensayo de actividad GSH-Px Para la medición del GSH-Px se utilizó el método de Lawrence y Burk, de conexión con la oxidación de NADPH de gutatión reductasa. La potencia de oxidación de NADPH se midió a 37ºC, empleándose un espectrofotómetro con una longitud de onda de 340 nm.

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La mezcla del ensayo consistió en 50 mmmol/L de solución tampón de fosfato potásico (pH 7,0), 1 mmol/L de ácido etilendiaminotetraacético, 1 mmol/L de NaN3 , 0,2 mmol/L de glutatión, 2 unidades de glutatión reductasa, y 1,5 mmol/L de solución hidroperóxido de cumeno 10 mmol/L de terc-butilperoxido. 25

A esta mezcla se le agregó homogenado de las hojas, obteniéndose un volumen de solución de 1,0 ml. La actividad enzimática medida por medio de este método equivale a la cantidad de NADPH oxidada por minuto. La actividad se representa en unidades/mg de proteína, según el método de Lowry. Ensayo de peróxido lipídico

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El ácido graso poliinsaturado 4,7,10,13,16, 19-docosahexanoico se diluyó 200 veces en etanol al 94%. Al tubo de ensayo que contenía este substrato se le añadieron diversas concentraciones de homogenados antes de someterlo a radiación ultravioleta. En el experimento se ensayaron homogenados con concentraciones de 0,6, 3,0 y 6,0 mg/ml. Después de la radiación, la solución fue analizada por medio de fluorospectrometría para medir la cantidad existente de TBA (ácido tiobarbitúrico). Se establecieron unas longitudes de onda a 515 nm para excitación y 553 nm para emisión en un fluoroespectrofotómetro Hitachi F-2000. Los resultados aparecen con la indicación media ± S.E. La cantidad de substancia de TBA se adoptó como medida de peróxido lipídico. Además, se realizó un análisis de diferencia significativa mediante un test t Student. El resultado del test t demuestra la significativa diferencia entre los dos grupos. Identificación de los números básicos de los cromosomas

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Los ploides de los árboles anteriormente citados se determinaron a través de análisis citológico de células de puntas de raíces o análisis por citometría de flujo de células de hojas. El debate sobre las tablas 1 a 6 se realizó de la forma siguiente. Según se aprecia en las tablas 1 a 4, las hojas de Oryza Sativa y Osmunda japónica Thunb (ref. tabla 4) reflejaron una actividad SOD aparentemente más elevada que las de las plantas gimnospermas, tales como los Pinus Thunbergii Parl., el Cryptomería japónica D. Don y el Chamaecyparis obtusa Endl. Destaca el GHS-Px de las hojas de Oryza Sativa, que reflejó una elevada actividad de 1384 unidades/g, y el SOD, cuya gran actividad llegó a 2941 unidades/g. Según se aprecia en la tabla 4, la actividad SOD de las hojas de Oryza Sativa es superior a la de los árboles individuales sometidos a ensayo (salvo el Cryptomería japónica D. Don, que es una planta tetraploide). En algunos casos, la mayor actividad SOD equivale a 100 veces la actividad de los árboles comunes sometidos a ensayo. En la tabla 4, las hojas de Osmunda japónica Thunb reflejan una elevada actividad, alcanzando 1394 unidades/g.

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En cuanto a las plantas gimnospermas sometidas a ensayo, y según se aprecia en la tabla 1 (P0,05). Esto podría indicar que no existe una relación con las enzimas GSH-Px resistentes a los rayos ultravioleta. 15

TABLA 5 Comparación de la actividad SOD y del efecto de peroxidación lipídica del extracto de hojas entre árboles japoneses 2X, 3X y 4X 20

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∗ x1 significa 0,6 gr/ml como unidad, y la columna “muestra añadida” indica el múltiplo de la unidad 10

ES 2 220 157 A1 TABLA 6 Comparación de la actividad SOD y del efecto de peroxidación lipídica del extracto de hojas entre árboles japoneses 2X, 3X y 4X 5

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∗ x1 significa 0,6 gr/ml como unidad, y la columna “muestra añadida” indica el múltiplo de la unidad

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La formación de peróxido lipídico aumentó con una baja concentración del homogenato (por ejemplo, 0,6 mg/mi). Una elevada concentración de homogenato inhibe la formación de peróxido lipídico. Esto se muestra claramente en las tablas 5 y 6.

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Según se aprecia en las tablas 5 y 6, la comparación entre las muestras de árboles tetraploides indica claramente que las muestras con una elevada actividad SOD presentan un fuerte efecto de inhibición en presencia de muestras de baja concentración. Esto podría sugerir que la actividad SOD juega un papel a la hora de inhibir la formación de peróxido lipídico como elemento citotóxico. Esto significa que, a mayor actividad SOD, mayor inhibición de formación de peróxido lipídico.

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Por ejemplo, las muestras de Cryptomería japónica D. Don Nº S-26, -30, -32, -34, -36 y -38 de la tabla 5 y las muestras de Chamaecyparis obtusa Endl. Nº H-6, -9, -10 y -11 de la tabla 6 tienen una actividad SOD que supera las 1000 unidades/g. Entre estas muestras, nueve de ellas, las Nº S-26, -30, -32, -34 y H-6, -9, -10 reflejaron una menor formación de peróxido lipídico (según se indica en la columna x1 de la tabla 5) al añadírseles muestras con una concentración más baja que la de los controles. En el caso de la muestra de hoja de Oryza Sativa, la formación de peróxido lipídico se inhibió con independencia de la baja concentración (véase la columna x1 de la tabla 5) o de la alta concentración (véase la columna x10 de la tabla) de homogenatos. Por consiguiente, la actividad SOD resultó ser tan alta como la actividad GHS-Px y la actividad catalasa. Entre las muestras de hojas sometidas a ensayo, la hoja de Oryza Sativa reflejó el mayor nivel de formación de peróxido lipídico. En otras muestras, diferentes a las de las hojas de Oryza Sativa, no se detectó actividad catalasa alguna, por lo que estos datos no han sido recogidos en las tablas. Por el contrario, mientras mayor sea la actividad SOD, más fuertes serán los efectos de la antioxidación. El SOD juega un papel importante en la eliminación del oxígeno activo. Al considerar los factores relacionados con la formación del oxígeno activo, no se descarta la presencia de rayos ultravioleta. En años recientes, la destrucción de la capa de ozono ha generado un aumento de la radiación ultravioleta que llega a la tierra. Sobre la base de esta evidencia, se ha identificado un aparente incremento de los radicales de oxígeno. Al igual que los seres humanos, los árboles sufren los efectos de la exposición a rayos ultravioleta y elevadas concentraciones de radicales de oxígeno. No obstante, los resultados experimentales de los presentes inventores señalan que la actividad SOD es alta en árboles que poseen resistencia ultravioleta, por lo que se estima que este aspecto constituye una función destinada a su protección frente a los daños provenientes del medio ambiente con la utilización de agentes antioxidantes tales como el SOD que se encuentra en sus hojas. Hasta ahora no existía informe alguno relativo a la autoprotección de los árboles, por medio de sus propios agentes antioxidantes, frente al daño provocado por el medio ambiente. En esto consiste el descubrimiento de los presentes inventores.

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La capacidad antioxidante de los pinos resistentes a los rayos ultravioleta (en lo sucesivo denominados “resistentes a UV”) se comparó con la de los pinos comunes. Se obtuvieron informes sobre la inducción de la actividad GHS-Px en respuesta a los radicales de oxígeno. No obstante, los experimentos llevados a cabo por los presentes inventores no proporcionaron ningún resultado sobre aparentes cambios de actividad GHS-Px paralelamente a la actividad SOD.

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Respecto a la catalasa, existe un informe relacionado con la producción de catalasa inducida por los radicales de oxígeno de los árboles. Sin embargo, este experimento detectó catalasa sólo en las hojas de Oryza Sativa. Se piensa que el terpeno y otros elementos de los homogenatos inhiben la activación.

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Es un hecho ampliamente conocido que, al igual que las enzimas (tales como la superoxidasa), las sustancias de bajo peso molecular (tales como la vitamina C en su función de agente oxidante) juegan un papel importante en la vida de los árboles. En el experimento de esta invención no se estudió la función antioxidante de los compuestos de bajo peso molecular, aunque sí se estudió la actividad SOD. La conclusión fue que el SOD, una enzima fuertemente antioxidante, se produce en las hojas de los árboles para protegerlos contra los excesos de radicales de oxígeno. Como resultado del análisis anterior, y según han descubierto los presente inventores, al considerar la relación entre la actividad SOD y los cromosomas de las plantas, los árboles del tipo triploide y tetraploide, y particularmente del tipo tetraploide, reflejan una elevada actividad SOD. No se ha analizado la relación entre la actividad SOD y los ploides de árboles basada en los estudios de otros especialistas. De acuerdo con lo señalado anteriormente, los resultados obtenidos por los presentes inventores no han sido evaluados en absoluto.

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Al considerar la relación de la actividad SOD con el poliploide de los cromosomas y el incremento del locus de la codificación de cromosomas SOD, se produce un incremento de la cantidad existente de SOD. Esta consideración puede ser afirmativa en lo referente, por ejemplo, a los seres humanos. Se ha determinado que el Síndrome de Down tiene tres cromosomas (trisómico) que contienen locus de Cu, Zn y SOD, lo que produce un incremento del 50% en la cantidad de SOD. A pesar del incremento de la actividad SOD detectada individualmente en árboles triploides y tetraploides a través de los experimentos llevados a cabo por los presentes inventores, no se ha confirmado una potenciación en sí del nivel de SOD. Esto significa que podría considerarse una dilucidación de otro tipo. No obstante, la conclusión es que no se ha detectado un incremento de las posiciones de los cromosomas SOD en las muestras individuales sometidas a ensayo. Se estima que las hojas de Oryza Sativa están dotadas de resistencia a los rayos ultravioleta, que su actividad SOD es mayor que la del Cryptomería japónica D. Don, el pino negro y las unidades de control de Chamaecyparis obtusa Endl., y que, además, presentan una gran actividad GHS-Px, superior a la de los citados árboles. Además, la catalasa, casi no detectada en estos árboles, sí reflejó un nivel detectable en las hojas de Oryza Sativa. Esto significa que, a través de la capacidad que proporciona la fuerte actividad enzimática que poseen los árboles 12

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en respuesta a los radicales de oxígeno y a los rayos ultravioleta del medio ambiente, las plantas monocotiledóneas pueden adquirir una elevada adaptabilidad para defenderse de los rayos ultravioleta del medio ambiente. Por ejemplo, los helechos son plantas más primitivas que las gimnospermas y las angiospermas. Es un hecho bien conocido que los helechos pueden lograr una gran adaptabilidad al multiplicar su número de cromosomas para convertirlo en poliploide. Recientemente, se ha observado también una mayor adaptabilidad de las bacterias frente a las perturbaciones medioambientales mediante la adquisición de funciones poliploides.

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Además, los experimentos anteriormente descritos demuestran que el Cryptomería japónica D. Don y el Chamaecyparis obtusa Endl., que poseen propiedades de resistencia a los rayos ultravioleta, tienen cromosomas triploides y tetraploides.

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Incluso las plantas gimnospermas sensibles a los rayos ultravioleta pueden aumentar su actividad SOD mediante la multiplicación de su juego de cromosomas con el fin de protegerse a sí mismas frente a los mayores tiempos de exposición a rayos ultravioleta y radicales de oxígeno. Aparentemente, esto significa que las especies tienen una considerable capacidad de adaptación.

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Por otra parte, cabe la posibilidad de que el pino negro resistente a los rayos ultravioleta aumente su SOD con el fin de protegerse a sí mismo sin que esto guarde relación con los cromosomas poliploides, a diferencia del pino negro común. Se estima también que el pino negro resistente a los rayos ultravioleta no adopta una actitud de multiplicación de sus cromosomas para transformarse en poliploide. Como norma general, se sabe que la mayor radiación UV-B (siendo B la región en que los rayos ultravioleta se distribuyen de 280 nm a 320 nm) no está relacionada a los daños por oxidación de cuerpos tales como los de las plantas. Por lo tanto, el caso del pino negro confirma esta hipótesis. Existen dos tipos de adquisición de poliploides de cromosomas por parte de las plantas: uno es por cruce natural o artificial y el otro es por mutación natural, tal como por cambio de ramaje o mutación por tratamiento con colquicina. En este caso concreto, la mutación se produce mediante el procedimiento de las colchicinas y mediante el uso de la mutación de las yemas. (a) Procedimiento de las colchicinas

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Las colchicinas son un tipo de alcaloides. La mutación se induce por medio de la introducción de las semillas de conífera en una solución acuosa de colchicinas (0,1% a 0,5%) de 1 a 3 días. 35

La mutación también se puede inducir por la adición del extremo en crecimiento de la yema apical de la planta a una solución acuosa de colchicinas, de modo que se pueda obtener la variante de tetraploide. Por ejemplo, para obtener la variante de tetraploide para plántulas de coníferas es preferible añadir una solución acuosa de colchicinas de 0,2% a 0,4%, 4 ó 5 veces, un día si y otro no. (b) Mediante la mutación cambio de rama (mutación de las yemas)

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La planta que tiene más cromosomas de los fundamentales presenta una mutación llamada “mutación cambio de rama” (mutación de las yemas). Esta mutación tiene lugar en la naturaleza, aunque es poco probable que se produzca. Por lo tanto, se usa esta mutación de la siguiente manera: el cromosoma tetraploide se obtiene por medio de investigación en un bosque que tiene resistencia a los rayos ultravioleta sin marchitarse, y seleccionando las plántulas que tengan cromosomas tetraploides. Este procedimiento se usa porque se conserva la principal característica, la cual está causada por la mutación, en los campos de la agricultura y la jardinería, como en el caso del té verde, la manzana, el plátano, el tulipán la orquídea, etc.

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La Osmunda japónica Thunb, un helecho similar a las plantas gimnospermas y angiospermas, ya ha adquirido la condición poliploide, al igual que muchos tipos de helecho. Es sabido que las plantas monocoltiledóneas, tales como el Oryza Sativa, poseen la misma resistencia contra los rayos ultravioleta que el Pinus Thumbergii Parl., el Cryptomería japónica D. Don y el Chamaecyparis obtusa Endl. Los experimentos llevados a cabo por los presentes inventores indican que las hojas tanto de Osmunda japónica Thunb como de Oryza Sativa reflejan una actividad SOD más fuerte que la de otros árboles. Las plantas gimnospermas, tales como el pino negro, el Cryptomería japónica D. Don y el Chamaecyparis obtusa Endl., demuestran su acción de respuesta al medio ambiente real a través de la multiplicación de sus cromosomas con genes SOD, como han podido comprobar los presentes inventores. Sobre la base de referencias en el campo de la agricultura y la jardinería, se observa que en muchos casos se producen mejoras en diversos tipos de vegetación -tales como plantas de té, manzanos, bananos, tulipanes y orquídeasmediante el empleo de poliploides. No obstante, en el caso del Cryptomería japónica D. Don y del Chamaecyparis obtusa Endl., es evidente que las especies poliploides no se desarrollan igual de bien que las especies comunes. Este valor de las especies poliploides ha pasado totalmente inadvertido por el sector de la industria forestal.

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En las unidades de control de Cryptomería japónica D. Don y Chamaecyparis obtusa Endl., los presente inventores han encontrado especies triploides naturales entre las especies estériles a través de investigación celular biológica. Los informes y resultados obtenidos por los presentes inventores revelan que sólo 41 clones de cedros japoneses y 2 clones 13

ES 2 220 157 A1 de unidades de control de Chamaecyparis obtusa Endl. corresponden a especies triploides. Cabe mencionar que las “unidades de control” muestran un buen ritmo de crecimiento. 5

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Los presentes inventores se han esforzado por cultivar las especies triploides empleando tecnología de cruce artificial. Esto se realizó mediante cruces entre especies triploides y tetraploides de Cryptomería japónica D. Don y Chamaecyparis obtusa Endl., respectivamente. Los presentes inventores han observado que las especies triploides artificiales obtenidas a través de cruce artificial se desarrollaron mejor que las especies diploides. Es decir, se confirmó el hecho de que se produce un mejor crecimiento de las especies triploides de cruce artificial que de las especies triploides comunes. Se deduce que es posible y beneficioso utilizar especies poliploides para cultivar Cryptomería japónica D. Don y Chamaecyparis obtusa Endl. El ensayo de peróxido lipídico refleja que el homogenato de las hojas de especies tetraploides con elevada actividad SOD aparentemente inhibe la formación de peróxido lipídico. Esta evidencia podría sugerir que los árboles se protegen a sí mismos frente al daño provocado por radicales de oxígeno introducidos por los rayos ultravioleta a través de la multiplicación de su número de cromosomas. Los cedros japoneses -con la salvedad del cedro tetraploide- que contienen una cantidad de resina comparativamente menor que la de otros árboles, reflejaron un bajo nivel de peróxido lipídico y una baja actividad SOD. Estos resultados se incluyen en las tablas 2 a 4. Debido a que el Cryptomería japónica D. Don contiene una reducida cantidad de resina, es evidente que la cantidad de peróxido lipídico que se forma será baja. Por consiguiente, para tratar una baja formación de próxido lipídico basta con una reducida actividad SOD. Es decir, se estima que el Cryptomería japónica D. Don no requiere una gran actividad SOD para el tratamiento de un bajo nivel de peróxido lipídico, ya que este cedro no produce una gran cantidad del citado peróxido lipídico. La investigación de los presentes inventores confirma que los árboles demuestran una excelente adaptabilidad frente al incremento del nivel dañino de los radicales de oxígeno resultante de la reciente aceleración del daño a la ozonosfera. Los helechos, que son plantas de una evolución más primitiva que las plantas gimnospermas y angiospermas, adquirieron la función poliploide con el fin de adaptarse a los inconvenientes de las alteraciones del medio ambiente a través de la multiplicación de su número de cromosomas. Además, en las plantas de hojas en forma de aguja, tales como el Cryptomería japónica D. Don y el Chamaecyparis obtusa Endl., se observa que sus semillas adquirieron la propiedad de resistencia a los rayos ultravioleta mediante la multiplicación de su número de cromosomas. Esto se aprecia en la comparación entre las especies resistentes y las especies no resistentes a los rayos ultravioleta. Se descubrió que especialmente los árboles triploides y tetraploides presentaban esta tendencia.

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Aunque algunas especies de cruce natural mostraban un crecimiento inadecuado o se volvían estériles, se confirma que las mismas podían lograr buenas características de crecimiento por medio de cruce artificial.

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Se descubrió que el medio para adquirir la propiedad de adaptabilidad del Cryptomería japónica D. Don y del Chamaecyparis obtusa Endl. consiste en multiplicar el juego cromosónico para convertirlo en poliploide. Se puede decir que esta producción de descendencia poliploide a través de cruce artificial constituye un método efectivo de protección de los árboles frente a la creciente tendencia de los radicales de oxígeno inducidos por los rayos ultravioleta. Esta invención no necesariamente se limita a los ejemplos anteriores, y otras realizaciones podrán incluirse dentro del ámbito de la misma siempre que no se aparten de su objeto.

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Por ejemplo, además de los árboles con hojas de aguja anteriormente citados, tales como el Cryptomería japónica D. Don y el Chamaecyparis obtusa Endl., se puede considerar la adaptación de árboles de hoja ancha, tales como de hoja perenne y de hoja caduca. Por otro lado, a pesar de que los árboles han adquirido su resistencia a los rayos ultravioleta a través de la multiplicación de su número de cromosomas y a pesar de que los resultados de este experimento no se obtuvieron del Pinus Thumbergii Parl., evidentemente podrían existir ciertas especies de Pinus Thumbergii Parl. susceptibles de adquirir la resistencia a los rayos ultravioleta con la obtención de medios poliploides, ya que existen muchos tipos de pinos. Se estima que es posible seleccionar fuertes especies de plantas resistentes a los rayos ultravioleta a partir de los juegos de los cromosomas. Las plantas seleccionadas deben plantarse en áreas soleadas para que conserven su fuerte resistencia ecológica frente a los rayos ultravioleta. Aunque la anterior descripción se centra en las variedades triploides y tetraploides, los árboles poliploides, tales como los que presentan cromosomas pentaploides y hexaploides, pueden producir los mismos resultados.

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En los bosques plantados por el hombre según la presente invención, se inhiben considerablemente los daños tales como la muerte de árboles provocada por los rayos ultravioleta. Por consiguiente, si el grado de radiación ultravioleta de la tierra aumentara debido al aumento de la destrucción de la ozonosfera, se puede lograr la conservación de los 14

ES 2 220 157 A1 bosques plantados por el hombre a través de la presente invención. Empleando el método de plantar árboles de la presente invención, se pueden formar bosques plantados por el hombre dotados de resistencia a los rayos ultravioleta. 5

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ES 2 220 157 A1 REIVINDICACIONES

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1. Grupo de plantas formadas mediante el cultivo de plantas de semilla cuyos juegos de cromosomas son de tipo poliploide. 2. Grupo de plantas, según la reivindicación 1, en el que el número de cromosomas es poliploides, tal como triploides o tetraploides.

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3. Grupo de plantas, según la reivindicación 2, en el que las plantas de semilla son de coníferas. 4. Grupo de plantas, según la reivindicación 3, en el que las plantas de semilla de coníferas se seleccionan del grupo que incluye cedro japonés (en latín, Cryptomeria japonica D. Don) o ciprés japonés (en latín, Chamaecyparis obtusa Endl.).

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5. Grupo de plantas, según la reivindicación 4, en el que el número de cromosomas de las plantas de semilla se obtiene por aumento del número de cromosomas mediante cultivo de plantas que comprende el paso de formar artificialmente una vegetación considerablemente resistente a los rayos ultravioletas, así como una mutación que se produce mediante el procedimiento de las colchicinas y mediante su uso en la mutación de las yemas. 6. Grupo de plantas, según la reivindicación 1, en el que las plantas de semilla son de coníferas. 7. Grupo de plantas, según la reivindicación 1, en el que las plantas de semilla de coníferas son de cedro japonés (Cryptomeria japonica D. Don) o ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.).

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8. Método para plantar árboles, según reivindicaciones anteriores que comprende los pasos de seleccionar las plantas de semilla de tipo poliploides y plantarlas. 9. Método para plantar árboles, según la reivindicación 8, en el que el número de cromosomas de las plantas de semilla es poliploides, tal como triploides o tetraploides. 10. Método para plantar árboles, según la reivindicación 9, en el que las plantas de semilla son de coníferas.

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11. Método para plantar árboles, según la reivindicación 10, en el que las plantas de semilla de coníferas son de cedro japonés (Cryptomeria japonica D. Don) o ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.). 12. Método para plantar árboles, según la reivindicación 11, en el que el número de cromosomas de las plantas de semilla se obtiene por aumento del número de cromosomas mediante cultivo y mutación.

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13. Método para plantar árboles, según la reivindicación 8, en el que las plantas de semilla son de coníferas. 14. Método para plantar árboles, según la reivindicación 8, en el que las plantas de semilla de coníferas son de cedro japonés (Cryptomeria japonica D. Don) o ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa Endl.).

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15. Método de cultivo de plantas de acuerdo con las reivindicaciones anteriores que comprende el paso de formar artificialmente una vegetación considerablemente resistente a los rayos ultravioleta en comparación con la vegetación constituida por plantas triploides, mediante el cultivo selectivo de plantas cuyo número de cromosomas es superior al número básico de la especie.

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ES 2 220 157 A1

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11 ES 2 220 157

21 Nº de solicitud: 200102265

22 Fecha de presentación de la solicitud: 14.03.2003

32 Fecha de prioridad:

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 51

Int. Cl.7:

A01H 1/08, 7/00

DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

X

SU 668652 A (BURDAEVA) 25.06.1979, resumen, World Patent Index [en línea] Londres (Reino Unido): Derwent Publications Ltd. [recuperado el 29.10.2004]. Recuperado de: EPOQUE, La Haya (Países Bajos). DW 198009. Nº de acceso 1980-16073C.

1-3,5,6, 8-10,12, 13,15

X

JP 63-084429 A (OJI PAPER CO.) 15.04.1988, resumen, World Patent Index [en línea] Londres (Reino Unido): Derwent Publications Ltd. [recuperado el 29.10.2004]. Recuperado de: EPOQUE, La Haya (Países Bajos). DW 198821. Nº de acceso 1988-143353.

1,2

X

GB 2371808 A (KOZONIWA) 07.08.2002, todo el documento.

1-4,6,7

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica

O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado

5 para todas las reivindicaciones 

 para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe

Examinador

Página

29.10.2004

Fco. J. Haering Pérez

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