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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

C12N 5/10 (2006.01) C07K 16/36 (2006.01) C07K 16/46 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) C12N 15/13 (2006.01) A61P 7/00 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 283 308

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00949329 .7

86 Fecha de presentación : 13.07.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1194528

87 Fecha de publicación de la solicitud: 10.04.2002

54 Título: Anticuerpo monoclonal para el factor VIII, que incluso cuando está presente en exceso molar inactiva

el factor VIII solo en parte y método para producir dicho anticuerpo. 30 Prioridad: 14.07.1999 US 143891 P

14.07.1999 GB 9916450

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.11.2007

73 Titular/es: D. Collen Research Foundation vzw

Onderwijs en Navorsing Campus Gasthuisberg K.U. Leuven Herestraat 49 3000 Leuven, BE 72 Inventor/es: Jacquemin, Marc, G. y

Saint-Remy, Jean-Marie, R.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Aragonés Forner, Rafael Ángel

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01.11.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 283 308 T3 DESCRIPCIÓN Anticuerpo monoclonal para el factor VIII, que incluso cuando está presente en exceso molar inactiva el factor VIII solo en parte y método para producir dicho anticuerpo. 5

Campo de la presente invención

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La presente invención se refiere a nuevas estirpes celulares y a ligandos, particularmente anticuerpos monoclonales humanos y/o humanizados, así como a fragmentos tales como Fab, Fab’, F(ab’)2 , scFv, dominios variables simples, regiones que determinan la complementariedad, derivados, homólogos y combinaciones de los mismos, que se pueden obtener a partir de dichas estirpes celulares. Se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos ligandos y a métodos de prevención y de tratamiento de trastornos en la coagulación y a los procesos patológicos trombóticos resultantes en seres humanos mediante la administración de dichos ligandos a pacientes que necesitan los mismos. Se refiere también a métodos de obtención de anticuerpos específicos de mamíferos.

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Antecedentes de la presente invención

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La formación de coágulos sanguíneos no únicamente limita las hemorragias en el caso de las heridas (hemostasis), sino que puede provocar daños orgánicos graves y la muerte en el contexto de trastornos ateroescleróticos a causa de la oclusión de una arteria o vena importante. La trombosis es, por lo tanto, la formación de coágulos sanguíneos en el momento y en el lugar inapropiado. Implica una sucesión de reacciones bioquímicas complejas y reguladas que tienen lugar entre las proteínas de la sangre en circulación (factores de coagulación), las células sanguíneas (en particular los trombocitos) y los elementos de la pared de un vaso lesionado. Los tratamientos anticoagulantes y antitrombóticos pretenden inhibir la formación de coágulos sanguíneos a fin de evitar dichas consecuencias peligrosas, tales como el infarto de miocardio, los accidentes cardiovasculares, la pérdida de un miembro debido a una arteriopatía periférica o a una embolia pulmonar. Debido a la importancia de dichas enfermedades, resulta bastante sorprendente que los tratamientos antitrombóticos se hayan basado en unos pocos fármacos desde hace varios años, particularmente la aspirina para inhibir la actividad de los trombocitos, la heparina, que inhibe indirectamente los factores de coagulación IX, X y II (trombina), y la warfarina oral que inhibe los factores que dependen de la vitamina K (VII, IX, X, II y la proteína C). Más recientemente, las heparinas de bajo peso molecular (factores de inhibición X y II en diversos grados) se han convertido en anticoagulantes preferidos, principalmente debido a su facilidad de aplicación (una inyección subcutánea diaria sin necesidad de monitorización). A medida que aumentan los conocimientos sobre los procesos implicados en la trombosis, se ha desarrollado un número cada vez mayor de inhibidores específicos de los factores de coagulación. Sin embargo, hasta la fecha no se ha podido obtener con ellos una mayor proporción eficacia/seguridad. Los inhibidores directos de la trombina, en particular, se han relacionado con unos mayores trastornos hemorrágicos en ensayos clínicos extensos. La aspirina proporciona también un efecto protector contra la trombosis. Provoca un defecto funcional duradero en los trombocitos, detectable clínicamente como una prolongación de la duración de la hemorragia, debido a la inhibición de la actividad de la cicloxigenasa del enzima de los trombocitos humanos prostaglandina H-sintasa (PGHS-1) con dosis tan reducidas como de 30 a 75 mg. Debido a que los efectos secundarios gastrointestinales de la aspirina se manifiestan como dependientes de la dosis, y en la prevención secundaria, el tratamiento con aspirina se recomienda para un período indefinido, existen razones prácticas para elegir la menor dosis eficaz. Además, se ha especulado con el hecho de que una dosis baja (30 mg diarios) resulta más antitrombótica pero los intentos de identificación de la dosis óptima han producido unos resultados contradictorios. Se ha afirmado que la dosis de aspirina necesaria para inhibir completamente la agregación de trombóticos puede resultar superior en los pacientes con un trastorno cerebrovascular que en pacientes sanos y puede variar periódicamente en el mismo paciente. Sin embargo, la aspirina en cualquier dosificación de 30 mg o superior reduce el riesgo de cualquier episodio vascular importante como máximo en un 20%, lo que deja mucho lugar para mejorar. Además, el papel inhibidor de la aspirina puede conducir a la prevención de la trombosis y de las hemorragias excesivas. El equilibrio entre los dos casos depende fundamentalmente del riesgo absoluto de trombosis frente al de hemorragia por parte del paciente.

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En los pacientes que presentan un infarto de miocardio agudo, la reducción del tamaño del infarto, la conservación de las funciones ventriculares y la disminución de la mortalidad se ha demostrado con diversos agentes trombolíticos. Sin embargo, dichos agentes presentan unas limitaciones significativas, comprendiendo la necesidad de unas dosificaciones terapéuticas elevadas, una especificidad limitada de la fibrina y una tendencia significativa relacionada con las hemorragias. El activador del t-plasminógeno (t-PA) recombinante restaura completamente la permeabilidad solamente en la mitad de los pacientes, mientras que la estreptocinasa alcanza dicho objetivo en una proporción inferior a un tercio. Además, se produce la reoclusión tras el tratamiento trombolítico en un 5 a un 10% de los casos durante la estancia hospitalaria y en hasta un 30% durante el primer año según Verheugt et al., en J. Am. Coll. Cardiol. (1996) 27: 618-627. Por lo tanto, numerosos estudios han examinado los efectos de los tratamientos auxiliares antitrombóticos en pacientes con infarto de miocardio agudo. A título de ejemplo, la patente US nº 5.589.173 da a conocer un métodos para disolver y evitar que se vuelvan a formar trombos ocluyentes que comprende la administración de un antagonista proteico de un factor tisular, que puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, además de un agente trombolítico. 2

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Se ha demostrado previamente que los anticuerpos monoclonales resultan de valor terapéutico como agentes antitrombóticos. El primer fármaco autorizado fue el Abciximab (ReoProTM ), un fragmento Fab humanizado de un anticuerpo monoclonal murino (7E3) contra los receptores de la GP IIbIIIa de los trombocitos. Los anticuerpos murinos presentan unas características que pueden limitar enormemente su utilización en el tratamiento de seres humanos. En el caso de las xenoproteínas, pueden provocar la respuesta contra la inmunoglobulina mediante la formación de anticuerpos antimurinos humanos (HAMA, por sus siglas en inglés), tal como se describe en Jaffers et al., Transplantation (1986) 41:572. La necesidad de volver a administrar en los tratamientos de tromboembolias incrementa la probabilidad de dichas reacciones inmunitarias. A pesar de que la utilización de anticuerpos monoclonales humanos contrarresta dicha limitación, resulta difícil generar grandes cantidades de dichos anticuerpos mediante técnicas convencionales de hibridomas. Se han utilizado, por lo tanto, las técnicas de recombinación para construir anticuerpos “humanizados” que conserven la elevada afinidad de enlace de los anticuerpos monoclonales murinos pero que presenten una inmunogenicidad reducida en los seres humanos. En particular, se han propuesto anticuerpos quiméricos en los que la región variable (V) de un anticuerpo no humano se combina con la región constante (C) de un anticuerpo humano. A título de ejemplo, el fragmento murino Fc se eliminó del 7E3 y se sustituyó por la región constante Fab de la inmunoglobulina G humana para formar la quimera conocida como c7 E3 Fab o abciximab. Los métodos de obtención de dichas inmunoglobulinas quiméricas se describen en detalle en la patente US nº 5.770.198.

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La sinergia potencial entre la inhibición de los GP IIb/IIIa mediante el anticuerpo monoclonal 7 E3 Fab y el tratamiento trombolítico fue analizado por Kleiman et al., en J. Am. Coll. Cardiol. (1993) 22: 381-389. Las hemorragias importantes resultaron frecuentes en dicho estudio. Por lo tanto, las hemorragias potencialmente mortales constituyen una cuestión principal en dicha combinación de potentes compuestos antitrombóticos.

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En un intento reciente de reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos murinos, se trasplantó a un anticuerpo humano únicamente la región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), es decir, regiones de hipervariabilidad de las regiones V, en vez del dominio V entero. Dichos anticuerpos humanizados se conocen como anticuerpos con la CDR injertada. Se construyó satisfactoriamente uno de dichos anticuerpos con la CDR injertada contra el antígeno relativamente simple del nitrofenilacetilo, sin embargo, la construcción de anticuerpos con la CDR injertada que reconozcan antígenos más complejos ha producido anticuerpos que presentan una actividad de enlace significativamente inferior a los anticuerpos naturales no humanos. En muchos casos se demostró que la simple introducción de CDRs no humanas en un anticuerpo humano resulta insuficiente para conservar totalmente la actividad de enlace. A pesar de que se requiere un modelo informático elaborado de un anticuerpo murino de interés a fin de identificar los aminoácidos críticos a considerar en el diseño de un anticuerpo humanizado y se han propuesto pautas teóricas para dicho diseño, en todos los casos el procedimiento se ha de adaptar y optimizar para el anticuerpo no humano particular de interés.

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El factor tisular (TF, por sus siglas en inglés), al ser una glucoproteína de membrana que actúa como receptor de los factores VII y VIIa y, por lo tanto, iniciar dicha vía extrínseca, se ha investigado como objetivo en los tratamientos anticoagulantes. Además de dicho papel, se ha implicado el TF en patologías tales como los trastornos vasculares o los choques sépticos causados por gramnegativos. Un estudio que intentaba caracterizar el potencial anticoagulante de los anticuerpos monoclonales murinos demostró que la función del TF por parte de la mayor parte de los anticuerpos monoclonales examinados dependía de la disociación del complejo TF/VIIa que se forma rápidamente cuando el TF entra en contacto con el plasma. Un anticuerpo monoclonal, el TF8-5G9, pudo inhibir el complejo TF/VIIa sin disociarlo, proporcionando de este modo un efecto anticoagulante inmediato en el plasma, tal como se da a conocer en el documento WO 96/40.921. Los factores de coagulación seleccionados presentan tanto una variación del peso molecular medio (comprendido aproximadamente entre 45.000 y 160.000) y una concentración plasmática normal relativamente elevada (por lo menos 0,01 micromol/l). Un tema de interés persistente relativo a todos los agentes antitrombóticos disponibles es el riesgo de sobredosis y, por lo tanto, de hemorragias excesivas y potencialmente mortales. La mayor parte de los agentes antitrombóticos actuales, por lo tanto, implican la realización de un seguimiento minucioso del paciente.

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Por lo tanto, existe la necesidad de unos compuestos eficaces en el tratamiento de los trastornos de coagulación, con los que no se pueda producir una sobredosis, que no requieran realizar un seguimiento minucioso del paciente y que no presenten problemas con las hemorragias. En el caso de un agente terapéutico basado en anticuerpos, el compuesto ideal sería un anticuerpo humano con una eficacia total como anticoagulante que no provoque inmunogenicidad. 60

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El factor VIII es una proteína que proporciona una importante actividad como cofactor y es uno de los factores de la coagulación con un peso molecular bastante elevado (265.000) y una concentración plasmática muy baja (0,0007 micromol/litro). Con 2.332 aminoácidos, el factor VIII constituye una de las cadenas polipeptídicas más largas conocidas y se sintetiza en el hígado, en el bazo y en la placenta. Se ha demostrado que su gen comprende 186.000 nucleótidos. El factor VIII circula como una proteína plasmática inactiva. Los factores V y VIII son proteínas homólogas que comparten una configuración estructural común con unos dominios A triplicados y unos dominios C duplicados, y 3

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unos dominios B estructuralmente divergentes que conectan los dominios A2 y A3. El factor VIII circula en una pluralidad de especies fragmentadas de un complejo unidas fuertemente con el factor de Von Willebrand con una concentración de 1 nmol/l. La activación del factor VIII se produce mediante la separación de los dominios A1 y A2, produciéndose la molécula inestable heterotrimérica factor VIIIa. El factor VIIIa se enlaza fuertemente a las membranas que comprenden fosfolípidos acídicos. El factor VIII comprende una zona de enlace con fosfolípidos en el dominio C2, entre los aminoácidos 2302 y 2332, según Arai et al. en J. Clin. Invest. (1989) 83: 1978. En la misma región del factor VIII se encuentra asimismo una zona de enlace con el factor Von Willebrand que actúa junto con los aminoácidos 1645 a 1689 en el dominio A3 según Shima et al., en Throm. Haemost. (1993) 69: 240 y en J. Biol. Chem. (1994) 269: 11601.

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Los anticuerpos policlonales que inhiben la actividad como cofactor del factor VIII se han clasificado como inhibidores del tipo I o del tipo II en función de su capacidad para inhibir el factor VIII completamente (tipo I) o únicamente parcialmente (tipo II). Según Gawryl et al., en Blood (1982) 60: 1103-9, se considera la inactivación reducida del factor VIII mediante anticuerpos humanos del tipo II debido a un efecto estérico del factor Von Willebrand. No se mencionan los anticuerpos monoclonales y, hasta la fecha, no se ha hecho uso terapéutico alguno de dichos inhibidores del tipo II. Biggs et al., en Br. J. Haematol. (1972) 23: 137, proporcionaron previamente la interpretación, a partir de los datos obtenidos al utilizar anticuerpos policlonales humanos, de que la pauta de inhibición del tipo II se podría relacionar con una baja afinidad. B. Ly et al., en Scandinavian Journal of Haematology (1982), 28: 132-140 dan a conocer anticuerpos policlonales contra el factor VIII que muy frecuentemente pertenecen a la clase de las IgG tanto en hemofílicos que desarrollan aloanticuerpos como en pacientes más infrecuentes que presentan autoanticuerpos contra su propio factor VIII. Dichos anticuerpos policlonales inhiben parcialmente la actividad del factor VIII tal como los anticuerpos descritos en Biggs et al. (1972) y en Hoyer et al. (1982). Dicho documento de nuevo deja sin mencionar si los anticuerpos monoclonales pueden reproducir la pauta de inactivación del factor VIII que presentan los anticuerpos policlonales de los pacientes. De nuevo, no se mencionan los anticuerpos monoclonales. Las solicitudes de patente europea EP-A-123.945, EP-A-152.746 y EP-A-432.134 todas descubren anticuerpos monoclonales producidos a partir de estirpes celulares de hibridomas y que presentan una pauta de reactividad específica con fragmentos polipeptídicos del factor VIIIc. Se dice que dichos anticuerpos monoclonales resultan útiles en la detección de la presencia del factor VIIIc y polipéptidos relacionados en el plasma mediante técnicas de inmunoanálisis, pero no se sugiere uso terapéutico potencial alguno en dichos documentos. J. Battle et al., en Annals of Hematology (1997) 75: 111-115, da a conocer un aloanticuerpo policlonal obtenido a partir de un paciente que presentaba la enfermedad de Von Willebrand en un estado grave que presenta, de un modo similar a un anticuerpo policlonal de conejo contra el factor de Von Willebrand, una actividad inhibidora del factor VIII plasmático. Dichos anticuerpos policlonales antifactor VIII inhiben, por lo tanto, el factor VIII siguiendo una pauta similar a los anticuerpos antifactor VIII del tipo II encontrados en pacientes con hemofilia A (Gawryl et al., en Blood (1982) 60: 1103-9). Sin embargo, en dicho aloanticuerpo humano no se detectaron anticuerpos contra el factor VIII, lo que sugiere que se trata de una inhibición no específica.

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J. Ingerslev et al., en Clínica Chimica Acta (1988) 174: 65-82 da a conocer una serie de anticuerpos monoclonales murinos contra el factor de Von Willebrand humano: dos de los mismos, que pertenecen al isotipo de la inmunoglobulina IgG1, presentan una inhibición extremadamente baja (1,3 BU/mg de inmunoglobulina) del factor VIII tal como se ilustra en la tabla I de dicho documento. En comparación, el anticuerpo monoclonal humano BO2C11, obtenido del paciente de hemofilia A con el inhibidor, presenta una actividad específica de 7.000 BU/mg de proteína (Jacquemin et al., en Blood, (1998) 92: 496-506). Ello indica que la administración de anticuerpos tal como describió Ingerslev a un animal o a un ser humano no afecta a la actividad del factor VIII, excepto en el caso de que se encuentre presente una cantidad extremadamente elevada de anticuerpos (cientos de mg/mi) en el plasma. Los autores no dan a conocer si cuando se utilizan dichos anticuerpos en una gran cantidad presentan una actividad inhibidora como el inhibidor policlonal del factor VIII humano del tipo I o del tipo II (es decir, inactivación parcial), tal como se describe en Gawryl et al., en Blood (1982) 60: 1103-9. Maraganore et al., en Circulation (1992) 86: 413, demostró que un péptido artificial de 12 aminoácidos, que corresponde a los residuos 1675 a 1686 del factor VIII, inhibe la separación por parte de la trombina de la cadena pesada requerida en la activación de la actividad procoagulante del factor VIII y asimismo de la cadena ligera requerida para disociar el factor VIII del factor de Von Willebrand y que la sulfatación de la tirosina de dicho péptido su reconocimiento por parte del factor VIII. J. Clin. Invest. (1988) 82: 206-211 describe la obtención de un modelo animal para la hemofilia A mediante la venoclisis del anticuerpo antifactor VIII humano en conejos. Según el documento WO 95/01570, los anticuerpos contra la cadena ligera del factor VIIIc humano o porcino se produjeron en un primer animal y posteriormente se provocó una hemofilia temporal en un segundo animal mediante el anticuerpo monoespecífico obtenido. La patente US nº 5.804.159 da a conocer también la provocación de un trastorno temporal en la coagulación en un mamífero mediante la preparación de un anticuerpo antiplasma que actúa contra varios factores de coagulación, por ejemplo, una preparación que comprende anticuerpos contra el factor de Von Willebrand y el factor VIII humanos, o contra el complejo factor VIII/Von Willebrand, o contra procoagulantes, anticoagulantes, factores que intervienen en la estructura del coágulo, factores fibrinolíticos, y fosfolípidos. 4

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Sin embargo, ninguno de los compuestos de anticuerpos mencionados anteriormente que implica el factor VIII se ha descrito con un objetivo terapéutico. De hecho existe un cierto prejuicio entre los expertos en la materia contra la investigación de los anticuerpos antifactor VIII en los tratamientos antitrombóticos debido a que se presupone que, debido a que una deficiencia en el factor VIII constituye la causa de la hemofilia A, dichos anticuerpos podrían provocar una situación de hemorragia. El documento WO 97/26010 da a conocer unos anticuerpos monoclonales que presentan una actividad neutralizante autolimitadora contra un factor de coagulación que resulta útil en composiciones farmacéuticas para trastornos trombóticos. La actividad neutralizante autolimitadora en dicho documento se define como la actividad de un anticuerpo que se enlaza con un factor de coagulación humano y que inhibe la trombosis de tal modo que se produce una modulación limitada de la coagulación. La modulación limitada de la coagulación a su vez se define como un incremento en el período de coagulación determinado como la prolongación de la duración de la tromboplastina parcial activada (aPTT, por sus sigas en inglés) durante la que el plasma continúa siendo coagulable con la aPTT alcanzando un valor máximo, preferentemente comprendido entre 35 y 100 segundos a pesar de las concentraciones crecientes del anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, la aPTT se utiliza como criterio primario en el estudio de la eficacia en relación con el inconveniente de las hemorragias de los agentes antitrombóticos. Más particularmente, dicho documento demuestra que un policlonal de oveja contra el factor VIII (SAF8C-IG, adquirido en Affinity Biologicals) provoca una prolongación autolimitadora de la aPTT (la aPTT aumentó hasta un máximo aproximadamente de 65 segundos). Hemos demostrado, sin embargo, que el SAF8C-IG inhibe completamente la actividad del factor VIII humano (véase la Figura 10), es decir, es un inhibidor del tipo I en la clasificación de Gawryl et al., en Blood (1982) 60: 1103-9. Ello demuestra que un incremento limitado en el período de coagulación hasta un determinado valor máximo no se encuentra necesariamente correlacionado con la inactivación parcial de un factor de coagulación, y aún menos con un descenso del riesgo de hemorragia. Por ejemplo, resulta muy conocido que los pacientes con un déficit completo de factores de coagulación presentan una prolongación limitada de la aPTT, habitualmente comprendida entre 60 y 100 segundos, pero no obstante se exponen a un riesgo considerable de hemorragia (Hathaway et al., en Am. J. Clin. Pathol. (1979) 71: 22-25, y Hoffmann et al., en Thromb. Haemostas. (1978) 39: 640-645). Por el contrario, resulta muy conocido que una aPTT prolongada no proporciona un parámetro válido de la reducción del riesgo de trombosis. Particularmente, la deficiencia en el factor XII, otro factor de coagulación de las rutas de coagulación intrínsecas produce una prolongación de la aPTT de hasta 6 veces (Hathaway et al., en Am. J. Clin. Pathol. (1979) 71: 22-25, y Hoffmann et al., en Thromb. Haemostas. (1978) 39: 640-645). Sin embargo, un número significativo de pacientes que presentan dicha deficiencia ha sufrido infartos de miocardio o tromboembolias, demostrando la falta de protección ante los trastornos trombóticos en los pacientes deficientes en el factor XII, a pesar de la prolongación importante de la aPTT (McPherson R. A., Am. J. Clin. Pathol. (1977) 68: 420, y Glueck H. I. et al., en Ann. Intern. Med. (1966) 64:390). Jacquemin et al., en Blood (1998) 92: 496-506 se refieren al anticuerpo monoclonal humano IgG4 específico del factor VIII (BO2C11) producido por una estirpe celular obtenida a partir del repertorio de linfocitos B de memoria de un paciente con hemofilia A con inhibidores. Se supone que el BO2C11 reconoce el dominio C2 del factor VIII y que inhibe su enlace tanto con el factor de Von Willebrand como con los fosfolípidos. Se supone que inhibe completamente la actividad procoagulante del factor VIII natural y activado con una actividad de 7000 unidades Bethesda/mg. Los presentes inventores han demostrado, además, que el BO2C11, a pesar de que inhibe totalmente la actividad del factor VIII humano, proporciona una prolongación aproximadamente de 110 segundos del período de coagulación tal como se determina mediante la aPTT, lo que demuestra de nuevo que un incremento en el período de coagulación hasta un cierto valor máximo no se encuentra necesariamente correlacionado con la inactivación parcial de un factor de coagulación. Dicha reducción de los niveles del factor VIII expondrá el paciente a unos riesgos graves de hemorragia, tal como en el caso de los pacientes con hemofilia A grave (Levine P. H., en Ann. NY Acad. Sci. (1975) 240: 201; Gilbert M. S. Mount Sinaí J. Med. (1977) 44: 339).

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Sumario de la presente invención

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La presente invención se refiere a nuevos ligandos, particularmente nuevos anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, a fragmentos, derivados y homólogos de los mismos tal como se especifica en las reivindicaciones adjuntas, que se enlazan con el factor VIII o un complejo del mismo; a una nueva estirpe celular a partir de la que se pueden obtener dichos anticuerpos monoclonales; y a nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden dichos ligandos. El objetivo principal de la presente descripción es, por lo tanto, proporcionar un tratamiento antitrombótico eficaz y seguro que reduzca el riesgo de hemorragia en los mamíferos, más particularmente en los seres humanos. Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar unas composiciones terapéuticas que proporcionen un tratamiento antitrombótico eficaz que reduzca el riesgo de hemorragia en los mamíferos, más particularmente en los seres humanos.

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Otro objetivo adicional de la presente descripción es proporcionar un tratamiento antitrombótico y unos compuestos terapéuticos antitrombóticos que resulten más seguros de utilizar que los tratamientos y composiciones conocidos previamente. 5

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Un aspecto de la presente invención se refiere a seleccionar el factor VIII o un complejo del mismo, utilizando ligandos específicos. Dichos ligandos, al ser anticuerpos monoclonales, proporcionan una concentración estable terapéuticamente útil al inhibir únicamente parcialmente la función del factor seleccionado de modo que permanece una actividad residual del factor incluso cuando se utiliza el ligando en un excedente molar. Se puede realizar una curva del efecto inhibidor de un ligando según la presente invención con respecto a un determinado factor seleccionado en relación con la concentración de dicho ligando y se puede determinar la concentración en la que todavía existe una mínima actividad residual del factor que es por lo menos del 1%, preferentemente por lo menos del 2%. La actividad residual del factor a una concentración de cinco veces dicha concentración no ha de resultar sustancialmente distinta de la actividad residual en el punto mínimo. La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales de alta afinidad, tanto humanos como humanizados, así como fragmentos, derivados y homólogos de cualquiera de los mismos, que presentan la capacidad de inactivar únicamente parcialmente el factor VIII o un complejo del mismo, incluso con un excedente molar del ligando, evitando, por lo tanto, el riesgo de sobredosis y las complicaciones hemorrágicas resultantes. Otro aspecto adicional de la presente invención es proporcionar una nueva estirpe celular que produzca el anticuerpo monoclonal humano respectivo.

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La presente invención comprende también secuencias de polinucleótidos que codifican los anticuerpos mencionados anteriormente o fragmentos de los mismos. Se podrá apreciar que existe una pluralidad de secuencias de nucleótidos que caen dentro del alcance de la presente invención como resultado de la redundancia del código genético. La presente invención comprende también secuencias complementarias que corresponden a anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, mencionados anteriormente. En particular, la presente descripción comprende sondas construidas a partir de anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, mencionados anteriormente o a partir de polinucleótidos o a partir de las secuencias complementarias mencionadas anteriormente La presente descripción proporciona, además, un métodos de atenuación de la coagulación en seres humanos, que comprende la administración de un anticuerpo monoclonal, tanto humano como humanizado, un fragmento, un derivado o un homólogo del mismo, que puede inactivar únicamente parcialmente el factor VIII o un complejo del mismo en un paciente que necesita dicha atenuación incluso cuando dicho ligando se encuentra en un excedente molar. Da a conocer, además, un métodos de tratamiento o prevención de una patología trombótica en mamíferos, particularmente en seres humanos, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un ligando, particularmente un anticuerpo monoclonal, tanto humano como humanizado, un fragmento, un derivado o un homólogo del mismo, que puede inactivar únicamente parcialmente, incluso cuando dicho ligando se encuentra en un excedente molar, el factor VIII o un complejo que comprende el factor VIII, a un mamífero que necesita dicho tratamiento o prevención. En una forma de realización preferida, la patología trombótica se puede seleccionar, por ejemplo, de entre la coagulación intravascular, la trombosis arterial, la reestenosis arterial, la trombosis venosa y la arterioesclerosis. Otra forma de realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, que presenta la capacidad de enlazarse a una zona del factor VIII o de un complejo que comprende el factor VIII, para inactivar únicamente parcialmente dicho factor o complejo que comprende el factor incluso cuando el ligando se encuentra en un excedente molar, mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho ligando es un anticuerpo monoclonal de alta afinidad contra el factor VIII o contra el complejo factor VIII factor de Von Willebrand, tanto humano como humanizado, o híbrido, o un fragmento, derivado u homólogo del mismo. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender opcionalmente, además, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico.

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Otra forma de realización de la presente invención se refiere a métodos de selección de anticuerpos monoclonales específicos. Las técnicas convencionales de inmunización de animales tales como un ratón con una proteína tal como el factor VIII provocan una respuesta inmunitaria que puede implicar a diversos epítopos de la molécula del factor VIII. La presente invención proporciona unos métodos más selectivos de obtención de anticuerpos monoclonales específicos contra un epítopo de una proteína natural. En primer lugar, se proporciona (es decir, se selecciona) un mamífero no humano que presenta una versión funcional modificada por lo menos parcialmente de una proteína natural. Dicha modificación, que se encuentra en un dominio de la proteína, se puede deber a cualquier causa, por ejemplo raza o variedad, a defectos genéticos al nacer, a una enfermedad o por una interferencia humana, por ejemplo inmunotolerancia contra la versión funcionalmente modificada. A continuación se administra la proteína natural al donante mamífero no humano a fin de provocar una respuesta inmunitaria; en la presente etapa, resulta importante que se administre una cantidad suficiente de proteína natural (por ejemplo el factor VIII) hasta que se produce una respuesta inmunitaria. A continuación, en una etapa final del método, la selección de los linfocitos V del donante mamífero no humano permitirá mayores posibilidades de obtener anticuerpos monoclonales contra un epítopo de la región de la modificación, por ejemplo al seleccionar linfocitos B del donante que produzcan anticuerpos que inactiven la proteína natural únicamente parcialmente. El potencial anticoagulante del factor de inhibición VIII no se ha explorado hasta la fecha, posiblemente debido a las complicaciones muy conocidas que se producen en los pacientes de hemofilia A que carecen de la actividad del factor VIII completamente (hemofilia grave) o en gran parte (hemofilia moderada). La hemofilia A, sin embargo, no demuestra únicamente la importancia del factor VIII como cofactor limitante de la coagulación, sino también la relación existente entre la coagulación y el desarrollo de la aterosclerosis. Se descubrió que la aterosclerosis y sus complicaciones trombóticas resultaban significativamente más inusuales entre los pacientes con hemofilia A. El antagonizar la actividad del factor VIII en un nivel que permita una hemostasis suficiente como para evitar las hemorragia 6

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pero que proteja ante la formación de trombos intravasculares patológicos, por lo tanto constituye una promesa sustancial en relación con una anticoagulación segura en trastornos protrombóticos tales como la trombosis venosa profunda (DVT, por sus siglas en inglés), la embolia pulmonar (PE, por sus siglas en inglés), en tratamiento postoperatorios, en el embarazo, en arteriopatías coronarias (CAD, por sus siglas en inglés), enfermedades cerebrovasculares (CVD, por sus siglas en inglés), arteriopatías periféricas (PAD, por sus siglas en inglés) y en intervenciones vasculares. La presente invención se basa en la sorprendente determinación de nuevos ligandos, particularmente nuevos anticuerpos monoclonales humanos y humanizados, y fragmentos, derivados y homólogos de los mismos tal como se especifica en las reivindicaciones adjuntas. Ellos presentan un inesperado “efecto meseta”, es decir, se alcanza únicamente una inactivación parcial del factor VIII implicado en la hemostasis, en particular en la cascada de coagulación, tanto individualmente como en combinación, cualquiera que sea el excedente de ligando. Los ligandos se pueden enlazar con el factor VIII o con un complejo del factor VIII incapacitando únicamente parcialmente la función de una zona fisiológicamente funcional de dicho factor o complejo del factor. Dicho “efecto estable” hace que los ligandos resulten particularmente adecuados en el tratamiento de los trastornos de coagulación y las patologías trombóticas resultantes al mismo tiempo que se minimiza el riesgo de hemorragia, en comparación, particularmente, con los anticuerpos con una actividad neutralizante autolimitadora mencionados en el documento WO 97/26010. Se produce, por lo tanto, un claro contraste entre la actividad neutralizante autolimitadora de los anticuerpos contra los factores dé coagulación descritos en el documento WO 97/26010 y la inhibición estable clínicamente significativa que comprende la presente invención, en la que los anticuerpos antifactor VIII, tal como el KRIX-1, inhiben la actividad del factor VIII en no más del 85%. Resulta particularmente útil una propiedad de los ligandos según la presente invención para permitir alguna función fisiológica de la región afectada incluso cuando el ligando se encuentra en un excedente molar. Los ligandos son anticuerpos antifactor VIII o anticuerpos contra un complejo del factor VIII, en particular anticuerpos monoclonales humanos o híbridos humanos que se enlazan con el factor VIII o con un complejo del factor VIII e inhiben por lo menos parcialmente la actividad del factor VIII. Los datos indican que los inhibidores del tipo II reaccionan con unos determinantes antigénicos distintos que los anticuerpos del tipo I y que dichos determinantes se bloquean parcialmente en el complejo factor VIII/factor de Von Willebrand. A continuación se describirá la presente invención más detalladamente haciendo referencia a los siguientes dibujos. La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Breve descripción de los dibujos

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La Figura 1 presenta los resultados de producir anticuerpos monoclonales humanos obtenidos a partir de un paciente de hemofilia A, expresados en forma de anticuerpo IgG enlazándose con el factor VIII en una prueba ELISA. La Figura 2 ilustra la inhibición de la actividad del factor VIII mediante el anticuerpo monoclonal BO2C11.

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La Figura 3 ilustra la inhibición de la actividad del factor VIII mediante el anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular KRIX 1. La Figura 4 ilustra la inhibición del enlace del factor VIII activado en la fosfatidil-L-serina mediante el anticuerpo producido por la estirpe celular KRIX 1.

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La Figura 5 ilustra la influencia de determinados anticuerpos policlonales en la disociación del factor VIII activado del factor de Von Willebrand. 50

Las Figuras 6 y 8 ilustran las secuencias de aminoácidos (las líneas inferiores) y las secuencias de nucleótidos (las líneas superiores) de las regiones variables VH de las cadenas pesadas de los anticuerpos monoclonales BO2C11 y KRIX 1, respectivamente. Se ilustran también tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cada cadena, cada una de ellas siendo un ligando polipeptídico individual según una forma de realización particular de la presente invención.

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Las Figuras 7 y 9 ilustran las secuencias de aminoácidos (las líneas inferiores) y las secuencias de nucleótidos (la líneas superiores) de las regiones variables VL de las cadenas ligeras de los anticuerpos monoclonales BO2C11 y KRIX 1, respectivamente. Se ilustran también tres CDR de cada cadena, cada una dé ellas siendo un ligando polipeptídico individual según una forma de realización particular de la presente invención.

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La Figura 10 presenta un gráfico que ilustra la inhibición de la actividad del factor VIII mediante el anticuerpo SAF8C-Ig mencionado en el documento WO 97/26010. La Figura 11 ilustra la cinética de la inhibición del factor VIII mediante el KRIX-1.

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La Figura 12 ilustra la inhibición de la trombosis venosa en un modelo con hámsteres mediante el KRIX-1.

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ES 2 283 308 T3 Definiciones El termino “anticuerpo” se refiere a moléculas intactas así como a fragmentos de las mismas, tales como Fab, Fab’, F(ab’)2 , o Fv, que se pueden enlazar con un epítopo determinante de un factor relevante o dominio del factor. 5

“Anticuerpo humanizado”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a moléculas de anticuerpos en las que se han sustituido los aminoácidos de las regiones no antigénicas de enlace a fin de que se parezca mucho a un anticuerpo humano. 10

Un “anticuerpo humano rediseñado” o un “anticuerpo híbrido humano”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo humano en el que se han sustituido los aminoácidos de las regiones antigénicas de enlace con secuencias según la presente invención, por ejemplo con CDR u otras partes de regiones variables que se han obtenido del repertorio de anticuerpos humanos.

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El término “homología” u “homólogo”, tal como se utiliza en la presente memoria haciendo referencia a ligandos según la presente invención se refiere a una molécula que competirá con o inhibirá el enlace de uno de los ligandos según la presente invención con la región seleccionada. El enlace ha de ser específico, es decir, el enlace de la molécula alternativa ha de ser tan específico con la región como el ligando según la presente invención. Allí donde los ligandos según la presente invención comprenden secuencias de aminoácidos, el grado de homología ha de ser por lo menos del 80%, preferentemente del 90% y más preferentemente del 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el ligando relevante.

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Descripción detallada de la presente invención 25

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A continuación se describirá la presente invención haciendo referencia a determinadas formas de realización y a determinadas figuras pero la presente invención no se encuentra limitada por las mismas sino únicamente por las reivindicaciones. La presente memoria describe el concepto general de la obtención de una “inhibición estable” terapéuticamente útil al inactivar únicamente parcialmente un factor en hemostasis mediante la selección de determinados anticuerpos monoclonales, así como mediante la producción de dichos anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, o fragmentos, derivados u homólogos de los mismos, y utilizar los mismos en tratamientos antitrombóticos y en composiciones para tratamientos antitrombóticos. Dichos ligandos y composiciones presentan la propiedad ventajosa de que la inactivación del factor es únicamente parcial incluso cuando el ligando se encuentra en un excedente molar. Ello significa que incluso cuando se utilice el ligando en una cantidad de la que se espera que inactive completamente el factor seleccionado, la inactivación resulta todavía incompleta.

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La presente invención proporciona una estirpe celular particular que produce anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan con el factor VIII humano y más específicamente presentan la capacidad de inactivas la actividad como cofactor del factor VIII humano al interferir con la región de escisión proteolítica o del factor de Von Willebrand o realizar reacciones complejas o al provocar cambios conformacionales tridimensionales en el factor VIII, en particular seleccionando un dominio del factor VIII y reconociendo epítopos que se encuentran en dicho dominio. Un dominio preferido es el dominio C1 del factor VIII pero la presente invención no se limita al mismo. Se puede inhibir parcialmente asimismo una región del dominio C2 del factor VIII. La presente invención comprende también ligandos distintos a los anticuerpos policlonales, en particular anticuerpos monoclonales, que reducen el ritmo de separación del factor VIII del factor de Von Willebrand. Dichos anticuerpos monoclonales seleccionan específicamente el factor VIII cuando se enlazan con el factor de Von Willebrand y, por lo tanto, seleccionan un epítopo asociado al complejo del factor VIII y el factor de Von Willebrand. La presente invención proporciona también fragmentos de cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores tales como Fab, Fab’, F(ab’)2 , scFv, CDR, dominios variables simples así como derivados, homólogos y combinaciones de los mismos. Más particularmente, dichos anticuerpos monoclonales y fragmentos pueden seleccionar un dominio del factor VIII, en particular el dominio C1 del factor VIII. Asimismo, pueden inhibir parcialmente una región del dominio C2 del factor VIII. Pueden seleccionar también un epítopo asociado al complejo del factor de Von Willebrand y el factor VIII. Un aspecto de la presente descripción es, por lo tanto, proporcionar ligandos distintos de los anticuerpos policlonales que se enlazan a una primera región (por ejemplo en el dominio C1 del factor VIII) alejada de una segunda región funcional (por ejemplo la región del dominio C2 del factor VIII responsable del enlace con los fosfolípidos) de modo que la función de la segunda región se ve únicamente reducida parcialmente incluso cuando el ligando se encuentra en un excedente molar y terapéutico. La estirpe celular denominada KRIX 1 que produce los anticuerpos monoclonales según la presente invención se depositó en la BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University of Ghent [“Depósitos coordinados de microorganismos en Bélgica/Laboratorio de depósito de plásmidos de Biología Molecular, Universidad de Ghent”] K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, BE con el número de entrada LMBP 5089CB el 1 de julio de 1999. La presente descripción proporciona, además, unas estirpes celulares que producen anticuerpos monoclonales que presentan una reactividad sustancialmente similar a la de los anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de la estirpe celular depositada mencionada anteriormente, así como los anticuerpos monoclonales humanos que se pueden obtener a partir de dichas estirpes celulares adicionales. 8

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La presente invención proporciona, además, anticuerpos monoclonales humanos rediseñados o anticuerpos monoclonales híbridos humanos contra el factor VIII, que se enlazan con e inactivan únicamente parcialmente el factor VIII o un complejo que comprende el factor VIII y el factor de Von Willebrand que comprende únicamente elementos obtenidos del repertorio de anticuerpos humanos. Por anticuerpos monoclonales híbridos humanos se entiende un anticuerpo híbrido construido a partir de un anticuerpo humano y a partir de regiones variables según la presente invención. Tradicionalmente en la técnica, hasta la fecha únicamente ha resultado posible obtener anticuerpos contra el factor VIII obtenidos a partir de animales, por ejemplo ratones, o construir anticuerpos quiméricos a partir de anticuerpos humanos con partes variables obtenidas a partir de anticuerpos murinos. La presente memoria proporciona también ligandos, distintos de los anticuerpos policlonales, que presentan la capacidad de inactivar únicamente parcialmente un factor (o un complejo que comprende un factor) implicado en la hemostasis, en particular en la cascada de la coagulación sanguínea, preferentemente el factor VIII o un complejo que comprende el factor VIII, al enlazarse a una región de dicho factor o complejo, teniendo lugar dicha inactivación únicamente parcial cuando el ligando de la presente invención se encuentra en un excedente molar con respecto a dicho factor. La región a la que se enlaza el ligando puede encontrarse o no implicada directamente o sustancialmente en una interacción fisiológica de dicho factor o complejo. Por ejemplo, el ligando se puede enlazar con una región que se encuentra a una distancia predeterminada de una región fisiológicamente funcional de dicho factor. Por inactivación “estable” parcial en la presente memoria se entiende una inactivación como máximo del 98%, preferentemente una inactivación como máximo del 95%, tal como se puede determinar mediante un método de ensayo adecuado tal como por ejemplo un ensayo cromogénico disponible en Coatest® (Kabi Vitrum, Bruselas, Bélgica) o en Chromogenix AB, Mólndal (Suecia). El nivel de activación requerido puede depender de la función fisiológica del factor implicado en la hemostasis. Por otro lado, a fin de proporcionar una utilidad terapéutica, la inactivación del factor sanguíneo ha de ser por lo menos aproximadamente del 65%, preferentemente por lo menos aproximadamente del 70%, tal como se puede determinar mediante el mismo método de ensayo comentado anteriormente. Se puede apreciar que los ligandos según la presente invención actúan de un modo distinto del mecanismo atribuido convencionalmente a los anticuerpos del tipo II contra el factor VIII,. Un mecanismo convencional es el de competencia con otro factor, por ejemplo el factor de Von Willebrand. La cinética de un mecanismo de competencia significa que si una especie se encuentra en una concentración elevada en comparación con la otra (por ejemplo en un excedente molar), la inhibición es de hecho completa. En cambio, los ligandos de la presente invención alcanzan un nivel estable en la inactivación del factor relevante, que es sustancialmente independiente del excedente del ligando. El otro mecanismo convencional atribuido a los anticuerpos del tipo II es el de la baja afinidad: también en dicho caso, un excedente conducirá la reacción a una inhibición completa. Cuando el factor sanguíneo seleccionado es el factor VIII, lo ligandos de la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales humanos que se pueden obtener de la estirpe celular KRIX 1 depositada, siendo preferentemente de la clase IgG, y que presentan la capacidad de inactivar únicamente parcialmente la actividad como cofactor del factor VIII. Más específicamente la presente memoria se refiere, en una forma de realización preferida, a anticuerpos monoclonales humanos de dicho origen que pueden reconocer epítopos que se encuentran en el dominio C1 del factor VIII. A pesar de que los inventores no desean limitarse a una explicación o teoría simple, se cree que el enlace de dichos anticuerpos monoclonales humanos obstaculiza únicamente parcialmente el enlace del factor VIII activado con los fosfolípidos, una etapa necesaria para la expresión de la actividad como cofactor. La presente memoria proporciona, además, unos anticuerpos que presentan sustancialmente las mismas características descritas anteriormente y que se producen mediante la inmunización realizada a propósito en animales, preferentemente en ratones, por ejemplo inyectando el factor VIII humano en ratones y a continuación fusionando los linfocitos esplénicos con una estirpe celular de mieloma murino, seguido por la identificación y la clonación de los cultivos celulares que producen anticuerpos antifactor VIII. A continuación se humanizan los anticuerpos monoclonales producidos en animales, por ejemplo al asociar la región determinante de la complementariedad (“CDR”) del anticuerpo monoclonal no humano con regiones estructurales humanas - en particular la región C constante del gen humano - tal como describen Jones et al., en Nature (1986) 321: 522 o Riechmann en Nature (1988) 332: 323. La presente invención proporciona también fragmentos y derivados, en particular regiones determinantes de la complementariedad (“CDR”) de los anteriores anticuerpos monoclonales antifactor VIII así como homólogos de los mismos. Por ejemplo, la presente invención proporciona fragmentos de enlace con antígenos Fab, Fab’ y F(ab’)2 generados mediante la digestión proteolítica de dichos anticuerpos monoclonales utilizando procedimientos muy conocidos en la técnica, tales como los que describen Stanworth et al., en Handbook of Experimental Immunology (“Manual de inmunología experimental”) (1978), vol. 1 capítulo 8 (Blackwell Scientific Publications). Dichos fragmentos, que comprenden la zona de enlace del anticuerpo, han perdido un cierto número de propiedades del anticuerpo original, tales como la activación del complemento o la capacidad de enlazarse con receptores gamma Fc. La presente invención comprende asimismo fragmentos variables de cadena simple (scFv, por sus siglas en inglés), fragmentos de dominios variables simple de los anticuerpos y combinaciones de dichos fragmentos y los fragmentos mencionados anteriormente. La presente invención proporciona asimismo partes variables de cadena simple solubles o fijadas a la membrana de los anteriores anticuerpos monoclonales y un método para su obtención tal como sigue. Las secuencias de ADN de las partes variables de las cadenas humanas pesada y ligera se amplifican en reacciones separadas y se clonan. Una secuencia conectora de quince aminoácidos, por ejemplo (Gly4 ser)3 se introduce entre VH y VL mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de dos etapas, por ejemplo según Dieffenbach y 9

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Dveksler, “PCR Primer, a laboratory manual” (“Iniciadores de la PCR, manual de laboratorio”) (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, EE.UU. El fragmento resultante se introduce a continuación en un vector adecuado para la expresión de un fragmento variable de cadena simple (scFv) como un polipéptido soluble o expuesto en fagos. Ello se puede conseguir mediante métodos muy conocidos por los expertos en la materia, tal como describen Gillilánd et al., en Tissue Antigens (“Antígenos tisulares”) (1996) 47: 1-20. La presente invención comprende también un ligando que comprende péptidos representativos de regiones hipervariables de un anticuerpo monoclonal que se puede obtener por síntesis utilizando un biosistema sintetizador aplicado, por ejemplo un sintetizador de polipéptidos tal como el modelo 9050 disponible en Milligen (EE. UU.) o un modelo de una tecnología relacionada, que solo o junto con otras o similares regiones hipervariables ejercerá unas propiedades similares a las del anticuerpo original. La presente descripción proporciona, además, una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de trastornos de la hemostasis, en particular de la cascada de la coagulación y las patologías trombóticas resultantes en los seres humanos, que comprenden, como principio activo, un ligando distinto de un anticuerpo policlonal, preferentemente un anticuerpo monoclonal humano tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Más preferentemente dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano, o un fragmento, derivado u homólogo del mismo, que se puede obtener a partir de la estirpe celular KRIX 1 depositada en la Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms con el número de entrada LMBP 5089CB. El grado de homología con dicho anticuerpo monoclonal es por lo menos del 80%, preferentemente del 90% y más preferentemente del 95%, y la homología se considera particularmente preferentemente con respecto a las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo. Un ligando según la presente invención puede comprender también un polipéptido artificial con una potencia equivalente. La composición farmacéutica de la presente memoria ha de comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho ingrediente, tal como se indica de aquí en adelante en relación con el procedimiento de tratamiento o de prevención.

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La composición farmacéutica de la presente descripción puede comprender, además, particularmente en vista del denominado tratamiento antitrombótico auxiliar, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico. Dichos agentes trombolíticos, así como sus dosificaciones habituales en función del tipo al que pertenecen, resultan muy conocidos por los expertos en la materia. Entre los numerosos ejemplos de agentes trombolíticos que las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender, la siguiente lista no limitativa se puede citar particularmente: t-Pa, estreptocinasa, venombina A, TNK-tPA o estafilocinasa. Los excipientes farmacéuticos aptos para utilizar en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se describen por ejemplo en Remington’s Pharmaceutícal Sciences 16th ed. (“Ciencia farmacéutica de Remington, 16ª ed.”) (1980) y su formulación resulta muy conocida para los expertos en la materia. Comprenden todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibióticos y antifúngicos (por ejemplo fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (tales como glúcidos o cloruro sódico) y similares. Los ingredientes adicionales se pueden añadir a fin de controlar la duración de la acción del principio activo del anticuerpo monoclonal de la composición. De este modo se pueden conseguir composiciones de liberación controlada al seleccionar los excipientes poliméricos apropiados tales como por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, povidona, copolímeros de etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carmelosa, sulfato de protamina y similares. El ritmo de liberación de fármaco y la duración de la acción se puede controlar también al incorporar el principio activo del anticuerpo monoclonal en partículas, por ejemplo microcápsulas, de una sustancia polimérica tal como hidrogeles, ácido poliláctico, hidroximetilcelulosa, polimetacrilato de metilo y otros polímeros descritos anteriormente. Dichos métodos comprenden sistemas coloidales de administración de fármacos tales como liposomas, microsferas, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, etcétera. En función de la vía de administración, la composición farmacéutica que comprende el principio activo puede requerir recubrimientos protectores. La forma farmacéutica apta para utilizar en inyecciones comprende disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de la misma. Los excipientes habituales comprenden, por lo tanto, disoluciones acuosas amortiguadoras del pH, etanol, glicerina, propilenglicol, macrogol y mezclas de los mismos. La presente descripción proporciona también la utilización de un ligando, distinto de un anticuerpo policlonal (tal como se ha comentado anteriormente) como medicamento. Más preferentemente el medicamento utilizado en la presente invención constituye un medio de prevención y/o tratamiento de trastornos de la hemostasis, en particular, trastornos de la coagulación y otras patologías trombóticas de los mamíferos, preferentemente de los seres humanos. Se puede administrar dicho ligando a un paciente mediante cualquier medio conocido en la técnica, es decir, por vía oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraarterial, parenteral o mediante cateterismo. Según la presente invención, el ligando se puede utilizar también como medicamento junto o asociado a otro medicamento, por ejemplo un agente trombolítico tal como los descritos anteriormente haciendo referencia a las composiciones farmacéuticas. La presente descripción proporciona, por lo tanto, un método de tratamiento y/o prevención de la hemostasis, los trastornos de la coagulación y patologías trombótica’s así como un método de atenuación de la coagulación en mamíferos, preferentemente en un ser humano, que comprende la administración a un mamífero que necesita dicho tratamiento o prevención o atenuación de la coagulación una cantidad terapéuticamente eficaz de un ligando distinto de un anticuerpo policlonal tal como se ha descrito anteriormente. Preferentemente dicho ligando es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que se puede obtener a partir de la estirpe celular KRIX 1 depositada en la Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms con el número de entrada LMBP 5089CB o un fragmento de logando 10

ES 2 283 308 T3 antígeno Fab, Fab’ o F(ab’)2 , una región (CDR) de determinación complementaria, una parte variable de cadena simple (scFv) soluble o fijado a la membrana, un dominio variable simple o un derivado o combinación de cualquiera de dichos elementos. 5

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Una cantidad terapéuticamente eficaz tal como se utiliza en la presente memoria significa desde aproximadamente 1 microgramo hasta aproximadamente 10 miligramos por kilogramo de peso corporal, más preferentemente desde aproximadamente 10 microgramos hasta aproximadamente 1 miligramo por kilogramo de peso corporal del mamífero a tratar. Se podrá apreciar que, en vista del período de vida media prolongado de la mayor parte de los anticuerpos IgG humanos, los ligandos de la presente descripción que son anticuerpos monoclonales de dicha clase permiten una periodicidad de tratamiento que colabora en el bienestar del paciente. Entre formas de realización preferidas, como patologías trombóticas a prevenir o tratar, se pueden citar la coagulación intravascular, la trombosis arterial (que puede ser responsables de infartos de miocardio agudos de accidentes cardiovasculares), la reestenosis arterial, la trombosis venosa (que habitualmente se produce en venas periféricas como consecuencia de un trauma o inmovilización accidental o quirúrgica) o la arterioesclerosis. En un método de tratamiento más preferido, se proporciona al paciente una inyección intravenosa en embolada con una dosis determinada por la experiencia del médico en función de los criterios que determinan el cuadro clínico del paciente particular. El método de tratamiento y/o prevención según la presente descripción puede comprender, además, el tratamiento o prevención de las mismas patologías trombóticas al administrar al paciente, preferentemente mediante una administración secuencial, una cantidad terapéuticamente eficaz del agente trombolítico tal como se ha descrito anteriormente haciendo referencia a las composiciones farmacéuticas. Secuencial, tal como se utiliza en la presente descripción, significa que el ligando de la presente invención y el agente trombolítico conocido se administran al paciente secuencialmente y no simultáneamente.

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La presente invención proporciona, además, un método de obtención de anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de mamíferos no humanos, que comprende las etapas de: 30

a) seleccionar un mamífero no humano que presente una proteína funcional por lo menos parcialmente fisiológicamente activa, realizándose la modificación con respecto a una proteína natural y encontrándose en un dominio de la proteína; b) administrar la proteína natural a un mamífero no humano a fin de provocar una respuesta inmunitaria, y

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c) seleccionar linfocitos B del mamífero no humano que produzcan anticuerpos que inactiven únicamente parcialmente la proteína natural. Según el presente método, la práctica habitual comprende sacrificar los mamíferos no humanos y extraer su bazo a fin de realizar la etapa (c).

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La presente descripción proporciona adicionalmente un método de obtención de anticuerpos monoclonales a partir de la sangre de un ser humano que presenta una proteína funcional modificada y por lo menos parcialmente fisiológicamente activa, realizándose la modificación con respecto a una proteína natural y encontrándose en un dominio de la proteína, y a quién se administró la proteína natural, comprendiendo dicho método la etapa de seleccionar, a partir de la sangre del ser humano, linfocitos B que produzcan anticuerpos que inactiven únicamente parcialmente la proteína natural. La presente invención, en las formas de realización que describen los diversos aspectos mencionados anteriormente y definidos en las reivindicaciones adjuntas, presenta numerosas ventajas. La ventaja principal de la utilización terapéutica de los anticuerpos monoclonales de la presente invención es que el tratamiento resulta altamente específico en relación con la respuesta inmunitaria a considerar. En estados de hipercoagulación, la especificidad de los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención garantiza que la interacción en la ruta de la cascada de la coagulación se limite al factor reconocido por el anticuerpo. Más específicamente, la utilización de anticuerpos antifactor VIII que presentan las características preferidas mencionadas anteriormente supone una combinación única de ventajas relacionadas con la selección del factor VIII, las relacionadas con las características de la inhibición del factor VIII y las relacionadas con la utilización de anticuerpos: - La selección del factor VIII significa que al neutralizar la actividad como cofactor tal como la del factor VIII no supone riesgo alguno de inhibir completamente la actividad enzimática que el mismo potencia y, por lo tanto, representa una ventaja sobre otros métodos en los que se seleccionan directamente enzimas tales como el factor IX. - Las formas de realización de los inhibidores descritos anteriormente presentan en común que inhiben eficazmente pero únicamente parcialmente la actividad como cofactor del factor VIII, determinando una estabilidad terapéuticamente útil, incluso cuando el anticuerpo monoclonal de la presente invención se utiliza en un excedente superior a 100 veces. Los anticuerpos monoclonales según la presente invención alcanzan el efecto estable de la inactivación del factor VIII, permitiendo la aplicación de inyecciones intravenosas 11

ES 2 283 308 T3 en embolada, obteniéndose una protección antitrombótica rápida durante varias semanas sin la necesidad de realizar un seguimiento minucioso y sin el riesgo de sobredosis. 5

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- Los anticuerpos IgG humanos presentan un período de vida media prolongado de tres semanas (excepto en el caso de la IgG3 que es de una semana), proporcionando de este modo unos niveles plasmáticos muy estables del agente antitrombótico y permitiendo una reducción drástica de la frecuencia de administración. Además, la utilización de anticuerpos humanos o derivados supone un riesgo mínimo de producción de respuestas inmunitarias. La presente invención se describe más detalladamente a partir de los siguientes ejemplos que se proporcionan únicamente a título ilustrativo. Ejemplo 1

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Producción de anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de pacientes con hemofilia A

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Se producen los anticuerpos monoclonales humanos con la especificidad y características pretendidas mediante la transformación de linfocitos B obtenidos a partir de la sangre periférica de pacientes que padecen hemofilia A o hemofilia adquirida. El método de selección de los pacientes es una forma de realización de la presente invención. A fin de provocar una respuesta inmunitaria más específica, se buscan pacientes que presenten una función reducida de una proteína fisiológicamente activa, por ejemplo, el factor VIII. Por “reducida” se entiende que se encuentra disponible una cierta función residual pero que es inferior a la conocida para el tipo natural de la misma proteína. La comparación entre la autoproteína y la proteína natural ha de mostrar la diferencia entre las dos proteínas, preferentemente en una región o dominio que resulte de interés. La diferencia puede comprender la eliminación o la sustitución de uno o más aminoácidos con otros. A continuación se administra a los pacientes una cantidad suficiente de la proteína natural para provocar una respuesta inmunitaria. A continuación se extraen los linfocitos B de los pacientes y se seleccionan en función de la producción de anticuerpos que presentan las propiedades pretendidas. A pesar de que anteriormente se ha hecho referencia a “pacientes”, el método según la presente forma de realización se puede aplicar en líneas generales a los mamíferos. El procedimiento anterior conlleva una gran posibilidad de obtener anticuerpos que seleccionan el dominio que comprende el defecto.

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Los linfocitos B se transforman mediante la infección con el virus de Epstein-Barr y la activación de antígenos de superficie utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la materia. Los sobrenadantes celulares que comprenden los anticuerpos apropiados se identifican mediante un procedimiento de análisis específico tal como se describe posteriormente con más detalle.

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De este modo, se identifican los anticuerpos contra el factor VIII al hacer reaccionar el sobrenadante con placas de microvaloración de poliestireno recubiertas con el factor VIII o con complejos del factor VIII/factor de Von Willebrand. El enlace de los anticuerpos específicos se detecta mediante la adición de un reactivo de IgG no humano acoplado a un enzima. La adición de un sustrato enzimático que se convierte en un compuesto coloreado en presencia del enzima permite detectar los anticuerpos específicos. Dichos métodos conocidos como pruebas de inmunoabsorción enzimática (ELISA) resultan muy conocidos por los expertos en la materia y se describen en detalle, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology (“Protocolos actuales en inmunología”), capítulo 2, John Wiley & Sons (1994). Más específicamente en el presente caso, el enlace de los anticuerpos IgG antifactor VIII se detectó mediante la adición de un anticuerpo monoclonal murino marcado con peroxidasa de rábano específico del Fc gamma humano. La subclase IgG del anticuerpo antifactor VIII se detecto mediante una prueba ELISA, tal como se ilustra en la Figura 1. La inhibición de la actividad funcional del factor VIII se ensayó en un análisis de coagulación funcional del siguiente modo. Se incubó un volumen equivalente del sobrenadante de un cultivo celular y de una reserva de plasma normal durante 2 horas a 37ºC y se determinó a continuación la actividad residual del factor VIII. Aquellos anticuerpos que inhiben significativamente la actividad del factor VIII se destacan con un asterisco en la Figura 1. Los linfocitos B (tales como los BO2C11) que producen anticuerpos antifactor VIII y a continuación se hacen crecer y se clonan mediante disolución limitante tal como se describe, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology (véase supra). Los anticuerpos antifactor VIII que presentan la capacidad de inhibir la actividad procoagulante del factor VIII tal como se ha descrito anteriormente se identifican utilizando un equipo de ensayo cromogénico tal como el ensayo cromogénico del factor VIII de Dade, Düchingen, Alemania o el Coatest® disponible comercialmente en Kabi Vitrum (Bruselas, Bélgica) o el Chromogenix AB (Mölndal, Suecia). Se incubaron unos volúmenes equivalentes de anticuerpos BO2C11 y de una reserva de plasma normal durante 2 horas a 37ºC. Las concentraciones de BO2C11 antes de realizar la mezcla se ilustran en el eje X. La reducción de la actividad del factor VIII se determinó en un ensayo de coagulación y se expresó como porcentaje de la actividad obtenida en ausencia del anticuerpo (véase la Figura 2). La actividad residual tiende a cero asintóticamente (inhibición completa).

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Se seleccionaron anticuerpos que inhiben la función del factor VIII con una afinidad suficiente pero no inhiben completamente la actividad procoagulante del factor VIII, incluso cuando se utiliza un gran excedente de anticuerpo, en una forma de realización adicional de la presente invención. Un ejemplo representativo de dicho anticuerpo se ilustra 12

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en la Figura 3, en la que se incubaron volúmenes equivalentes de KRIX 1 y del factor VIII recombinante o de plasma normal durante 2 horas a 37ºC y siendo las concentraciones (expresadas en µg/ml) de KRIX 1 antes de mezclar con el plasma las indicadas, se determinó la actividad residual del factor VIII utilizando el ensayo cromogénico mencionado anteriormente. De un modo interesante, la Figura 3 muestra como aproximadamente el 60% de la inhibición del factor VIII a una concentración de 0,1 µg/ml y de un modo más interesante la inhibición asintótica de aproximadamente el 80% en el intervalo completo de concentraciones desde 0,5 hasta 300 µg/ml. Los anticuerpos seleccionados de este modo se producen a continuación en un cultivo masivo y se purifican mediante cromatografía de afinidad utilizando métodos que resultan muy conocidos por los expertos en la materia.

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Los detalles de una técnica de preparación no limitante son los siguientes. Se obtuvo el factor VIII recombinante humano (actividad específica 4000 UI/mg) de Hyland (Glendale, Ca) como material para uso exclusivo en laboratorio; el complejo obtenido a partir del plasma (pd, por sus siglas en inglés) del factor VIII - factor de Von Willebrand, purificado por cromatografía de intercambio de iones (actividad específica ±160 UI/mg de proteína; proporción p/p del factor de Von Willebrand en relación con el factor VIII de 15:1), y el complejo factor VIII purificado - factor de Von Willebrand reducido (proporción p/p del factor de Von Willebrand en relación con el factor VIII de 4800:1; lote 951016) se obtuvieron en la Cruz Roja Belga (Bruselas, Bélgica). Las muestras de sangre periférica se recogieron a partir de donantes que padecían hemofilia leve y con inhibidores. Se perpetuaron los monocitos de la sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) mediante la infección con EBV concomitante a la activación de los antígenos de superficie. Se realizó la detección sistemática de cuatrocientos ochenta estirpes celulares mediante la prueba ELISA en relación con la producción de anticuerpos contra el factor VIII. Por ejemplo, una estirpe celular, denominada KRIX 1, se clonó satisfactoriamente por disolución limitante. Se verificó la clonalidad mediante amplificación por RT-PCR de la secuencia de ARNm de las regiones V de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo: se obtuvo una secuencia simple a partir de 10 clones de los productos de PCR. Se obtuvieron los anticuerpos purificados mediante el paso del sobrenadante del cultivo celular de KRIX 1 en proteína-A sefarosa. Se realizó una prueba ELISA con la subclase IgG y se identificaron los anticuerpos específicos de cadena ligera del KRIX-1 como un IgG4k. Se purificaron los anticuerpos monoclonales humanos mediante la absorción en proteína A inmovilizada (Proteína A high-TRAP®; Pharmacia, Uppsala, Suecia). Los fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales se prepararon mediante digestión en papaína. Se diluyó un mg de un anticuerpo seleccionado en 500 µg/ml en una disolución amortiguadora de fosfato (40 mol/l de KH2 PO4 , 60 mM de Na2 HPO4 ·2H2 O, 0,15 M NaCl) que comprendían 50 mmol/l de L-cisteína (sigma), 1 mmol/l de ácido edético (Merck) y 10 microgramos de papaína (Sigma). Se incubó la mezcla durante 3 h a 37ºC mientras se sometía a agitación continua. Se detuvo la reacción mediante la adición de yodoacetamida hasta una concentración final de 75 mmol/l durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo digerido se dializó contra una disolución amortiguadora salina dé fosfato (140 mmol/l de NaCl, 67 mmol/l de KC1, 20 mol/l de Na2 HPO4 , 4,4 mmol/l KH2 PO4 , a un pH de 7,4). Los fragmentos de IgG y Fc sin digerir se eliminaron a continuación mediante el pase en proteína-A sefarina (Proteína A high-TRAP®; Pharmacia). A continuación se siguió purificando el fragmento Fab por cromatografía de filtración en gel en un Superdex 200 (Pharmacia). Se utilizaron métodos convencionales en la detección de los anticuerpos IgG antifactor VIII, la determinación de la subclase IgG y el análisis de la inhibición del enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand. En el caso del análisis de la inhibición del enlace del factor r. VIII a un anticuerpo seleccionado mediante Fab y a un anticuerpo nativo, se recubrieron unas placas de poliestireno Maxisorb (Nunc) durante 2 h con 50 µl del anticuerpo diluido en 5 µg/ml en una disolución amortiguadora de glicina (20 mmol/l de glicina, 34 mol/l NaCl, pH 9,2). Tras realizar el lavado, se mezclaron 50 µl del factor VIII marcado con biotina diluido hasta 1 µg/ml en tris-caseína (10 mol/l de tris-(hidroximetil)-aminoetano, a un pH de 7,3, que contenía 150 mol/l de NaCl y caseína al 0,5%) durante 1 h a 37ºC con 50 µl de IgG humana a diversas diluciones. Se añadió una alícuota de 50 µl de la mezcla a las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras realizar el lavado, se detectó el enlace del factor r. VIII biotinado mediante la adición secuencial de avidina-peroxidasa y OPD. El factor r. VIII (concentración final de 0,2 pg/ml) se incubó con el anticuerpo IgG humano a distintas concentraciones durante 2 h a 37ºC y se examinó la actividad residual del factor VIII mediante un análisis cromogénico (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Mölndal, Suecia o Kabi Vitrum, Bruselas, Bélgica). La inhibición de la actividad plasmática del factor VIII se determinó mediante el método Bethesda, en el que se utilizó como fuente de factor VIII una reserva de plasma normal depositada en una disolución amortiguadora de citrato trisódico. La actividad residual del factor VIII se determinó mediante un análisis cromogénico o mediante un análisis de coagulación de una etapa.

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Ejemplo 2 Producción de anticuerpos monoclonales mediante inmunización en animales 65

Alternativamente, los anticuerpos monoclonales que presentan las mismas características descritas en el Ejemplo 1 se pueden producir con el objetivo de la inmunización en animales. De este modo, se inyectan ratones con el factor VIII en un aditivo de Freund. 13

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Los anticuerpos monoclonales antifactor VIII humano se obtienen a continuación mediante la fusión de linfocitos de bazo con una estirpe celular de mieloma murino. Los sobrenadantes del cultivo celular que producen anticuerpos antifactor VIII se identifican y se clonan mediante disolución limitante, utilizando métodos descritos en Current Protocols in Immunology (véase supra). La posterior selección de los inhibidores que presentan la capacidad pretendida de inhibición de la actividad procoagulante del factor VIII se realiza tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los anticuerpos monoclonales producidos en los ratones se humanizan a continuación. De este modo, las secuencias de las partes variables de las cadenas pesadas y ligera murinas se alinean con las regiones variables de la inmunoglobulina humana para identificar el anticuerpo humano con un mayor grado de homología en las regiones estructurales. El fragmento de ADN que codifica las regiones variables humanizadas se sintetiza a continuación mediante un método de inserción de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) basado en la PCR tal como se describe, por ejemplo, en Sato et al., Cancer Research (1993) 53: 851-6. La secuencia del producto final de la PCR de la parte variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado se digiere y se subclona antes del gen humano C gamma-1 en un primer plásmido de expresión. La región variable de la cadena ligera del constructo final se inserta en el gen C kappa en un segundo plásmido de expresión. A continuación se realiza la cotransfección de los dos constructos en un sistema de expresión con células COS. Ejemplo 3

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Caracterización de anticuerpos antifactor VIII Los anticuerpos monoclonales tanto de origen animal (Ejemplo 1) o animal (Ejemplo 2) se caracterizaron utilizando un sistema de ensayo mediante el que se analizó su capacidad de inhibición del enlace del factor VIII con los fosfolípidos. De este modo, se recubren placas de microvaloración de poliestireno con fosfatidil-L-serina. El factor VIII recombinante soluble a una concentración final de 2 µg/ml se mezcla durante 30 minutos a 37ºC con diversas concentraciones del anticuerpo a analizar. A continuación se activa rápidamente la mezcla con trombina y se añade a la placas recubiertas con fosfatidil-L-serina. A continuación se incubaron dichas placas durante 2 minutos a 21ºC y se detectó el factor VIII mediante la adición del dominio mAbF14A2 antifactor VIII Al durante dos minutos, seguido por una incubación de dos minutos con Fc gamma antimurino de cabra conjugado con HRP. Los resultados de dicho experimento se ilustran en la Figura 4 para el anticuerpo monoclonal producido a partir de la estirpe celular KRIX 1. En la figura se indica la media de enlace del factor VIII activado en ausencia (símbolos cerrados) o presencia (símbolos abiertos) del anticuerpo, así como la desviación típica de los triplicados. Los controles en ausencia del factor VII proporcionaron una DO 490 interior a 0,05. La Figura 4 demuestra claramente que el anticuerpo monoclonal producido a partir de la estirpe celular KRIX 1 inhibe significativamente el enlace del factor VIII con los fosfolípidos pero que realiza una inhibición incompleta incluso cuando se añade en un gran excedente. Para demostrar que en ausencia de plasma, el KRIX 1 no reconoce la cadena ligera del factor VIII mutado del donante, se sintetizaron unos fragmentos de ADN que codificaban las cadenas ligeras del factor VIII natural y mutada. Las proteínas correspondientes se expresaron en lisados de reticulocitos. El pliegue correcto de las cadenas ligeras naturales y mutadas se determinó mediante inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal humano BO2C11, que reconoce un epítopo conformacional en el extremo C de la cadena del factor VIII. Los experimentos de inmunoprecipitación indicaron que el BO2C11 se enlazó con las cadenas ligeras naturales y Arg2150His, mientras que el KRIX 1 capturó exclusivamente la cadena ligera natural. La exposición prolongada de geles de SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de sodiododecilsulfato) a la película autorradiografía no consiguió detectar enlace significativo alguno del KRIX 1 con la cadena ligera mutada. Los experimentos de control no mostraron enlace alguno con los reactivos del ensayo a excepción del factor VIII o fragmentos del factor VIII, y la incubación previa con el factor r. VIII soluble evitó el enlace con los fragmentos del factor VIII marcados con metionina, confirmando la especificidad de enlace. El KRIX 1 no reconoció el factor VIII en la inmunotransferencia de tipo Western indicando que el epítopo reconocido era conformacional. La posterior cartografía del epítopo se realizó, por lo tanto, con fragmentos del factor VIII producidos en lisados de reticulocitos. Los experimentos preliminares habían indicado que dicho enfoque resultaba eficaz en la síntesis de los dominios del factor VIII. El procedimiento de inmunoprecipitación utilizando los dominios del factor VIII marcado producidos en los lisados de reticulocitos se validó mediante la cartografía del epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal BO2C11. Se observó una concordancia completa entre el enlace con los fragmentos de eliminación C2 del factor VIII producidos en los lisados de reticulocitos y el enlace con los fragmentos recombinantes producidos en E. coli o en células COS. El KRIX 1 se enlazó con la cadena ligera en toda su longitud, a los fragmentos correspondientes a los dominios A3C1, C1C2 y al dominio aislado C1. En cambio, el KRIX 1 no se enlazó con los dominios C1 o C1C2 con la sustitución con Arg2150His, a pesar de que en un experimento de control, el dominio C1C2 Arg2150His se enlazó con el BO2C11 como su homólogo normal. Se realizó la búsqueda de otras mutaciones de la cadena ligera que pudiesen alterar el enlace del KRIX 1. Tal como se ilustra en la Tabla I, el KRIX 1 inhibió la actividad de todas las moléculas del factor VIII mutado analizadas hasta el momento, excepto aquellas que comprendían la mutación Arg2150His.

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ES 2 283 308 T3 TABLA I Inhibición de la actividad del factor VIII en el plasma de pacientes con hemofilia A leve 5

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Al utilizar el KRIX 1 como medicamento para inhibir parcialmente el factor VIII, las mutaciones moderadas del factor VIII no afectarán a la eficacia del tratamiento. El KRIX 1 inhibió el enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand de un modo dependiente de la dosis. La concentración de KRIX 1 requerida para alcanzar el 50% de inhibición (CI50 ) del enlace del factor VIII fue de 0,25 µg/ml y se obtuvo un valor superior al 95% de inhibición con 20 µg/ml de KRIX 1. Los fragmentos Fab del KRIX 1 inhibieron también el enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand. Sin embargo, en una base molar se requirió 15 veces más del fragmento Fab que del KRIX 1 natural para inhibir el 50% del enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand. Se realizaron unos experimentos adicionales para descartar que los fragmentos Fab del KRIX 1 contenían todavía el anticuerpo intacto o parcialmente digerido. La SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de sodiododecilsulfato) de los fragmentos Fab purificados por absorción con proteína-A y cromatografía de filtración en gel mostró una banda simple. La presencia de trazas de fragmentos de Fc gamma que continuasen enlazados a los fragmentos Fab se excluyó mediante una prueba ELISA. Unos pocillos con el factor VIII insolubilizado se incubaron con KRIX 1 natural o Fab. Se pudo detectar el enlace de tanto el KRIX 1 natural como del Fab mediante la adición de una IgG de cadena ligera antikappa marcada con peroxidasa. En cambio, la adición de una IgG gamma anti-Fc marcada con peroxidasa no reveló enlace específico alguno incluso cuando se incubaron en los pocillos 100 µg/ml de la preparación de Fab. En comparación, la adición de 0,1 µg/ml del anticuerpo natural dio lugar a un enlace significativo. En la prueba ELISA, se requirió una concentración 15 veces superior de Fab que de anticuerpo natural para inhibir el 50% del enlace del KRIX 1 biotinado con el factor VIII insolubilizado, indicando que el fragmento Fab del KRIX 1 presentaba una afinidad inferior hacia el factor VIII que el anticuerpo natural. Por consiguiente, el requisito de unas concentraciones superiores del fragmento Fab del KRIX 1 que del anticuerpo natural para inhibir el enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand se ha de atribuir a la afinidad reducida de los fragmentos Fab del KRIX 1 hacia el factor VIII. Para determinar si el KRIX 1 era representativo de los anticuerpos policlonales del donante, se realizó un ensayo competitivo. El enlace del KRIX 1 biotinado con el factor VIII insolubilizado se determinó en presencia de unas concentraciones crecientes de KRIX 1, IgG policlonal del donante e IgG policlonal de control. La IgG del donante inhibió el enlace del KRIX 1 con el factor VIII en función de la dosis. La concentración de KRIX 1 y de IgG del 15

ES 2 283 308 T3 donante que inhibía el 50% del enlace del KRIX 1 biotinado con el factor VIII resultó de 0,3 µg/ml y de 170 µg/ml, respectivamente, mientras que no se observó inhibición alguna con la IgG de control. Ejemplo 4 5

Producción de anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de pacientes con hemofilia A y que se enlazan con el complejo factor VIII - factor de Von Willebrand 10

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Alternativamente, los anticuerpos que reducen el ritmo de liberación del factor VIII del factor de Von Willebrand se identificaron del siguiente modo. Se recubrieron unas placas de microvaloración de poliestireno con un anticuerpo específico para el factor de Von Willebrand. Una disolución del factor VIII recombinante biotinado (0,5 µg/ml) formando un complejo con el factor de Von Willebrand (5 µg/ml) se mezcló con diversas concentraciones de IgG obtenida a partir de un donante (cuadrados oscuros de la Figura 5), por ejemplo el mismo paciente descrito anteriormente (del que se obtuvo el KRIX 1), MoAb4H1D7 o IgG de un paciente no hemofílico (triángulos oscuros de la Figura 5). Se añadió IgG en las concentraciones indicadas a las placas de microvaloración recubiertas con un anticuerpo murino, el MoAb4H1D7 contra el factor de Von Willebrand y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente. Después de realizar el lavado, se activó el factor VIII con trombina durante 2 minutos a 37ºC. Se detectó el enlace del factor VIII con el factor de Von Willebrand mediante la adición de peroxidasa de avidina. Los controles comprendían la detección del factor VIII biotinado enlazado en ausencia de la digestión con trombina (DO 450 = 460 + 47,7 SD (DT)) y del factor VIII biotinado enlazado tras la digestión con trombina en ausencia del anticuerpo (DO 450 = 160 + 16,0 SD (DT)). Los resultados de dichos experimentos se ilustran en la Figura 5 para los anticuerpos policlonales. En dicha figura, se indican los valores medios así como la desviación típica de los triplicados. La Figura, 5 demuestra claramente que una proporción significativamente superior del factor VIII activado permanece enlazada a la placa en presencia de concentraciones crecientes del anticuerpo, es decir, demuestra una reducción de la disociación del factor VIII activado del factor de Von Willebrand en presencia de un anticuerpo inhibidor que reconoce, el factor VIII enlazado con el factor de Von Willebrand. Los anticuerpos monoclonales se han obtenido a partir de dichos anticuerpos policlonales según los métodos descritos en la presente invención, indicando de este modo que la presente invención se puede ampliar a los anticuerpos monoclonales y a fragmentos y derivados de los mismos que se enlazan con los complejos del factor VIII/factor de Von Willebrand. Ejemplo 5

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Secuenciación de los dominios variables de los anticuerpos La secuenciación de los dominios variables de los anticuerpos se realizó del siguiente modo. El aislamiento del ARN obtenido a partir de estirpes celulares de linfocitos B humanos perpetuados se realizó utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Se sintetizó el ADNc con el sistema de preamplificación SuperScript para la síntesis de la primera cadena de ADNc . El ADNc que codificaba los genes de la región variable de la cadena pesada (VH ) se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores específicos de la secuencia delantera de las familias VH y para el exón inicial de la región C gamma, se realizó el apareamiento tal como se ha descrito (Bakkus et al., Blood, 80: 2326, 1992) a 60ºC durante 40 ciclos de PCR. Los productos de la PCR con un tamaño adecuado (460 pares de bases) se aislaron con gel de agarosa al 1,5% y se clonaron utilizando el TA Cloning Kit (Invitrogen BV, Leek, Holanda). Se realizó una detección sistemática con la PCR utilizando parejas de iniciadores correspondientes a la familia génica VH de interés en cultivos de colonias seleccionadas al azar. Se aisló el ADN plasmídico de las colonias positivas utilizando el Wizard Plus Minipreps (Promega, Menlo Park, CA) y se secuenció en ambas direcciones con el Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH), según las instrucciones del fabricante. El análisis de las secuencias genéticas se realizó utilizando el V BASE Sequence Directory (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Las secuencias completas de las regiones VH y VL del anticuerpo BO2C11 descrito en el Ejemplo 1 se enviaron a la EMBL Nucleotide Sequence Database con los números de entrada AJ224083 y AJ224084, respectivamente.

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Las secuencias de aminoácidos ilustradas en las Figuras 6 y 7 definen las regiones VH y VL del anticuerpo BO2C11 comprendiendo las tres CDR para cada una de las cadenas pesada y ligera. Se proporcionan asimismo las secuencias de polinucleótidos que codifican dichas regiones. Las SEC. Nº 2 y 3 son las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del BO2C11, respectivamente, mientras que las SEC. Nº 5 y 6 proporciona las secuencias de polinucleótidos que codifican dichas regiones variables.

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Las secuencias de aminoácidos ilustradas en la Figuras 8 y 9 definen las regiones VH y VL del anticuerpo KRIX1 comprendiendo las CDR 1 a 3 para cada una de las cadenas pesada y ligera. Se proporcionan asimismo las secuencias de polinucleótidos que codifican dichas regiones. Las SEC. Nº 8 y 1 son las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del KRIX-1, respectivamente, mientras que las SEC. Nº 7 y 4 proporciona las secuencias de polinucleótidos que codifican dichas regiones variables.

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ES 2 283 308 T3 Ejemplo 6 (Comparativo) 5

Inhibición de la actividad del factor VIII por parte del anticuerpo SAF8C-Ig

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Se determinaron los niveles del factor VIII en un ensayo funcional a continuación de un período de incubación de dos horas a 37ºC con diversas concentraciones del anticuerpo SAF8C-Ig, utilizando el ensayo cromogénico descrito en el Ejemplo 1. Tal como se ilustra en la Figura 10, la actividad residual del factor VIII se reduce de un modo dependiente de la dosis. Ya a los 100 pg/ml de SAF8C-Ig, la actividad residual del factor VIII es inferior al 1% de la actividad normal. Dichos niveles bajos del factor VIII exponen al paciente a un riesgo elevado de hemorragias espontáneas, tal como resulta muy conocido, por ejemplo, a partir de Levine, Ann. NYAcad. Sci. (1975) 240: 201 y Gilbert, Mount Sinai J. Med. (1977) 44: 339.

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Ejemplo 7 Inhibición de la trombosis venosa en hámsteres por parte del KRIX 1

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Se provocó experimentalmente la trombosis en la vena femoral de hámsteres anestesiados, al inyectar el tinte rosa bengala en la vena yugular y al exponer la vena femoral a la luz verde de una lámpara de xenón durante 4 minutos (Kawazaki et al., Thromb. Haemost. (1999) 81: 306-11). Como consecuencia de la iluminación del vaso, se descompone el tinte y genera unos radicales que dañan las células endoteliales del vaso. Por lo tanto, se exponen la estructuras subendoteliales a la circulación sanguínea y se inicia la formación de trombos. La cantidad de trombos formados se determina mediante la transiluminación del vaso dañado (Kawazaki et al., Thromb. Haemost. (1999) 81: 306-11) y se realiza la determinación cuantitativa mediante la cantidad de luz blanca que se transilumina a través del vaso. Tal como se ilustra en la Figura 11, cuando se realizó dicho experimento en animales de control, el tamaño medio de los trombos determinado en 13 hámsteres fue de 220,000 ± 32,575 (media ± SEM [error típico de la media]) unidades luminosas arbitrarias (A.U., por sus siglas en inglés), mientras que el tratamiento de un grupo de 12 hámsteres con KRIX-1 (400 a 800 µg/kg, administrados mediante inyección intravenosa en embolada inmediatamente antes de la provocación de la trombosis) redujo el tamaño medio de los trombos 122,000 ± 27,100 A.U. (p = 0,0188 test de Mann-Whitney). Además, se analizó la cinética de la inhibición del factor VIII por parte del KRIX-1 ex vivo del siguiente modo: se inyectaron los hámsteres por vía intravenosa con KRIX-1 (1600 µg/kg). Se determinaron los niveles del factor VIII:c en un ensayo cromogénico (Coatest Factor VIII®, [Chromogenix AB, Mölndal, Suecia] y Factor VIII Chromogenic Assay (Dade, Düdingen, Suiza) utilizando plasma recogido antes y en distintos períodos de tiempo tras la inyección. La Figura 12 ilustra como en dichos hámsteres, la actividad del factor VIII se reduce desde 1,6 UI/ml hasta 0,3 UI/ml ya a los 30 minutos tras la inyección de los anticuerpos, confirmando de este modo que inhibe únicamente parcialmente el factor VIII.

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ES 2 283 308 T3 REIVINDICACIONES

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1. Estirpe celular denominada KRIX 1 depositada en la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (“Depósitos coordinados de microorganismos en Bélgica”), con el número de entrada LMBP 5089CB. 2. Anticuerpo monoclonal que se enlaza con una región del factor VIII o con un complejo de dos o más factores que comprende el factor VIII, caracterizado porque dicho anticuerpo monoclonal presenta la capacidad de inactivar el factor VIII o un complejo de dos o más factores que comprende el factor VIII en por lo menos un 98% tal como se puede determinar mediante un ensayo cromogénico del factor VIII, cuando dicho anticuerpo monoclonal se encuentra en un excedente molar. 3. Estirpe celular que produce anticuerpos monoclonales humanos según la reivindicación 2.

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4. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, en el que la región de enlace del anticuerpo monoclonal no se encuentra directamente implicada en una interacción fisiológica de dicho factor o complejo. 5. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, en el que el Krix-I es el anticuerpo producido por la estirpe celular denominada KRIX 1 depositada en la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, con el número de entrada LMBP 5089CB o un anticuerpo que presenta por lo menos un nivel de homología en la secuencia del 80% con el mismo en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). 6. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, siendo un anticuerpo monoclonal humano que se puede obtener a partir de la estirpe celular de la reivindicación 1.

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7. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, la reivindicación 4 o la reivindicación 6, siendo de la clase IgG. 8. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, pudiendo reconocer un epítopo que se encuentre en el dominio G1 del factor VIII. 9. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, 4, 7 u 8, que se puede obtener mediante la inmunización realizada a propósito en animales.

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10. Anticuerpo monoclonal humanizado que se puede obtener a partir del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 9. 11. Fragmento de enlace con un antígeno tal como Fab, Fab’, F(ab’)2 , una región determinante de la complementariedad, una parte variable de cadena simple soluble o fijada a la membrana, un derivado o un dominio variable simple de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9 o de un anticuerpo monoclonal humanizado según la reivindicación 10, presentando dicho fragmento de enlace con un antígeno la capacidad de inactivar el factor VIII o un complejo de dos o más factores que comprende el factor VIII en por lo menos el 98% tal como se puede determinar mediante un ensayo cromogénico del factor VIII, cuando dicho fragmento se encuentra en un excedente molar. 12. Composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de trastornos de la hemostasis, trastornos de la coagulación, patologías trombóticas o la atenuación de la coagulación en mamíferos, que comprende como principio activo un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 o cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9 o un anticuerpo monoclonal humanizado según la reivindicación 10 o un fragmento de enlace con un antígeno según la reivindicación 11, mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, que comprende, además, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico.

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14. Un polinucleótido que codifica un fragmento de enlace con un antígeno tal como Fab, Fab’, F(ab’)2 o una región determinante de la complementariedad, una parte variable de cadena simple soluble o fijada a la membrana, o un dominio variable simple o un derivado según la reivindicación 11. 15. Método de obtención de anticuerpos monoclonales de un mamífero no humano, que comprende las etapas de:

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a) seleccionar un mamífero no humano que presente una proteína modificada y parcialmente funcional, realizándose la modificación con respecto a una proteína natural de la cascada de coagulación y encontrándose en un dominio de la proteína; b) administrar la proteína natural a un mamífero no humano a fin de provocar una respuesta inmunitaria, y c) seleccionar linfocitos B del mamífero no humano que produzcan anticuerpos que inactiven únicamente parcialmente la proteína natural. 18

ES 2 283 308 T3 16. Anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es producido por linfocitos B humanos. 5

17. Uso del anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 a 10 ó 16, o del fragmento de enlace con un antígeno según la reivindicación 11, en la producción de un medicamento destinado a la prevención o tratamiento de un trastorno de la hemostasis, un trastorno de la coagulación o una patología trombótica o la atenuación de la coagulación en un mamífero.

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15

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19

ES 2 283 308 T3

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ES 2 283 308 T3

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ES 2 283 308 T3

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ES 2 283 308 T3

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ES 2 283 308 T3

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ES 2 283 308 T3 LISTA DE SECUENCIAS

5

Investigación y desarrollo LEUVEN vzw Jacquemin, Marc G Saint-Remy, Jean Marie R. Ligandos para utilizar en composiciones farmacéuticas en el tratamiento de trastornos de la hemostasis

10

K1564-PCT

15

20

GB9916450.1 14-07-1999 US 60/143,891 14-07-1999 8

25

PatentIn Ver. 2.1

30

1 143 PRT anticuerpo monoclonal humano

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1

ES 2 283 308 T3

5

2 150 PRT anticuerpo monoclonal humano 2

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3 122 PRT anticuerpo monoclonal humano

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2

ES 2 283 308 T3 3

5

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4 429 ADN anticuerpo monoclonal humano

40

Región V (1)..(429) 45

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60

característica_misc (127)..(162) región que determina la complementariedad número uno característica_misc (205)..(225) región que determina la complementariedad número dos característica_misc (325)..(354) región que determina la complementariedad número tres

65

3

ES 2 283 308 T3 4

5

10

15

20

25

5 450 ADN anticuerpo monoclonal humano Región V (1)..(450) característica_misc (130)..(159) región que determina la complementariedad número uno

30

35

40

45

característica_misc (202)..(258) región que determina la complementariedad número dos característica_misc (343)..(357) región que determina la complementariedad número tres 5

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65

6 426 ADN anticuerpo monoclonal humano Región V 4

ES 2 283 308 T3 (1)..(426)

5

10

característica_misc (7)..(162) región que determina la complementariedad número uno característica_misc (205)..(225) región que determina la complementariedad número dos

15

20

característica_misc (325)..(351) región que determina la complementariedad número tres 6

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7 468 ADN anticuerpo monoclonal humano Región V (1)..(468) característica_misc (124)..(192) región que determina la complementariedad número uno característica_misc (232)..(285) región que determina la complementariedad número dos

60

65

característica_misc (282)..(435) región que determina la complementariedad número tres

5

ES 2 283 308 T3 7

5

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8 156 PRT anticuerpo monoclonal humano 8

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