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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

A61K 9/16 (2006.01) A61K 38/48 (2006.01) A61P 25/14 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 259 665

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

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86 Número de solicitud europea: 01952135 .0

86 Fecha de presentación : 25.05.2001

87 Número de publicación de la solicitud: 1289504

87 Fecha de publicación de la solicitud: 12.03.2003

54 Título: Implante de neurotoxina.

30 Prioridad: 02.06.2000 US 587250

73 Titular/es: ALLERGAN, Inc.

2525 Dupont Drive Irvine, California 92612, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.10.2006

72 Inventor/es: Donovan, Stephen y

Brady, Daniel, G.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Arias Sanz, Juan

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16.10.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 259 665 T3 DESCRIPCIÓN Implante de neurotoxina. 5

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La presente invención se refiere a un sistema de administración de fármacos de liberación controlada. Específicamente, la presente invención se refiere a un sistema de suministro de toxina botulínica de liberación controlada. Un sistema de liberación controlada puede suministrar un fármaco in vivo a una velocidad predeterminada durante un período de tiempo específico. Generalmente, las velocidades de liberación están determinadas por el diseño del sistema, y pueden ser muy independientes de condiciones ambientales como el pH. Se conocen sistemas de liberación controlada que pueden suministrar un fármaco durante un período de varios años. Por el contrario, los sistemas de liberación sostenida normalmente suministran el fármaco en 24 horas o menos y los factores ambientales pueden influir en la velocidad de liberación. Así, la velocidad de liberación de un fármaco de un sistema de liberación controlada implantado (un “implante”) es una función de las propiedades fisioquímicas del material vehículo del implante y del propio fármaco. Normalmente, el implante está hecho de un material inerte que desencadena una respuesta del receptor mínima o nula. Un sistema de liberación controlada puede estar compuesto de un fármaco con una actividad biológica incorporado en un vehículo. El vehículo puede ser un material polimérico o biocerámico. El sistema de liberación controlada puede inyectarse, insertarse o implantarse en una ubicación seleccionada del cuerpo de un paciente y residir en ella por un período prolongado durante el cual el fármaco se libera desde el implante de una manera y con una concentración que proporcionan una eficacia terapéutica deseada. Los materiales poliméricos pueden liberar fármacos por difusión, reacción química o activación de disolventes, así como por la influencia de factores de cambio magnéticos, ultrasónicos o de temperatura. La difusión puede ocurrir desde un depósito o matriz. El control químico puede deberse a la degradación del polímero o escisión del fármaco del polímero. La activación de disolventes puede implicar el hinchado del polímero o un efecto osmótico. Véase, por ejemplo, Science 249; 1527-1533:1990. Un implante de membrana o depósito depende de la difusión de un agente bioactivo a través de una membrana polimérica. Un implante de matriz está compuesto de una matriz polimérica en la que el agente bioactivo está distribuido uniformemente. Los sistemas de liberación controlada por hinchado normalmente están basados en polímeros hidrófilos y vítreos que se hinchan en presencia de fluidos biológicos o ante la presencia de ciertos estímulos ambientales.

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Preferentemente, el material de implante usado es sustancialmente no tóxico, no carcinógeno y no inmunogénico. Los materiales de implante adecuados incluyen polímeros, como poli(2-hidroxi etil metacrilato) (p-HEMA), poli(Nvinilpirrolidona) (p-NVP)+, poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido acrílico) (PAA), polidimetil siloxanos (PDMS), copolímeros de etilen-vinil acetato(EVAc), copolímeros de polivinilpirrolidona/metilacrilato, polimetilacrilato (PMMA), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), polianhídridos, poli(ortoesteres), colágeno y derivados celulósicos y biocerámicas, como la hidroxiapatita (HPA), fosfato de tricalcio (TCP) y fosfato de aluminocalcio (ALCAP). El ácido láctico, ácido glicólico y colágeno pueden usarse para producir implantes biodegradables. Se conocen sistemas de liberación controlada que comprenden un polímero para el suministro prolongado de un fármaco terapéutico. Por ejemplo, un implante de depósito subcutáneo compuesto de un polímero no biodegradable puede usarse para liberar un esteroide anticonceptivo, como la progestina, en cantidades de 25-30 mg/día durante hasta seis meses (es decir, el implante Norplant®). Además, se ha liberado Dextran (peso molecular de aproximadamente 2 millones) desde implantes poliméricos.

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Un material de implante puede ser biodegradable o bioerosionable. Una ventaja de un implante bioerosionable es que no necesita extraerse del paciente. Un implante bioerosionable puede estar basado en una liberación por membrana o matriz de la sustancia bioactiva. Las microesferas biodegradables preparadas de PLA-PGA son conocidas para la administración subcutánea o intramuscular.

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Un implante degradable preferentemente retiene su integridad estructural durante la duración de la liberación controlada para que pueda extraerse si se desea o necesita extraerlo. Cuando el fármaco incorporado cae por debajo de un nivel terapéutico, un implante biodegradable puede degradarse completamente sin retener ningún fármaco que pueda liberarse en niveles bajos en un período posterior. Se conocen implantes subcutáneos y microesferas inyectables hechas de materiales degradables, como copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico, policaprolactonas y colesterol, para el suministro de esteroides.

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Implantes de proteínas 65

Se conocen sistemas de liberación controlada para macromoléculas grandes, como las proteínas. Así, se han implantado gránulos poliméricos biocompatibles que incorporan proteína de alto peso molecular y han mostrado una liberación continua de la proteína durante períodos superiores a 100 días. Varias enzimas lábiles, de alto peso molecular (como la fosfatasa alcalina, peso molecular 88 kD y la catalasa, peso molecular 250 kD) se han incorporado a implantes poliméricos biocompatibles con características de liberación continua durante un período largo. General2

ES 2 259 665 T3 mente un aumento de la concentración de polímero en la solución de vaciado reduce la velocidad inicial a la que se libera la proteína del implante. Nature 263; 797-800:1976. 5

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Además, la albúmina puede liberarse de un implante EVAc y la polilisina puede liberarse de microesferas basadas en colágeno. Mallapragada S.K. y col., página 431 del capítulo 27 de Von Recum, A.F. Handbook of Biomaterials Evaluation, segunda edición, Taylor & Francis (1999). Además, se ha estudiado la liberación de toxoide tetánico de microesferas. Ibídem en 432. El copolímero sinterizado EVAc insertado subcutáneamente ha demostrado liberar insulina durante un período de 100 días. Ibídem en 433. Asimismo, se conoce encapsular una proteína, como la hormona del crecimiento humano (hGH) (peso molecular aproximado 26 kD) dentro de una matriz polimérica que cuando se implanta permite que la hormona del crecimiento humano se libere in vivo durante un período aproximado de una semana. Patente estadounidense nº 5.667.808. Un sistema de liberación controlada (es decir, un “implante”) puede presentar una alta estallido inicial de liberación de proteína, seguida de una liberación mínima. Lamentablemente, debido a la alta concentración de proteína dentro de una matriz de liberación controlada, las moléculas de proteína tienden a acumularse y formar concentraciones desnaturalizadas e inmunogénicas de proteína. Implantes de liberación pulsátil

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Los hidrogeles se han usado para construir implantes de suministro de fármacos de un único impulso y de múltiples impulsos. Un implante de único impulso puede estar controlado por ósmosis o por fusión. Doelker E., Cellulose Derivatives, Adv Polym Sci 107; 199-265:1993. Se sabe que múltiples impulsos de ciertas sustancias de un implante pueden lograrse como respuesta a un cambio ambiental en un parámetro como la temperatura (Mater Res Soc Symp Proc, 331; 211-216:1994; J. Contr Rel 15; 141-152:1991), el pH (Mater Res Soc Symp Proc, 331; 199-204:1994), la fuerza iónica (React Polym, 25; 127-137:1995), los campos magnéticos (J. Biomed Mater Res, 21; 1367-1373:1987) o el ultrasonido. Lamentablemente, un gránulo de fármaco implantable por vía subcutánea hecho de polímero no biodegradable tiene la desventaja de requerir una implantación y extracción quirúrgicas. El uso de un implante biocompatible y bioerosionable puede superar las deficiencias evidentes de los implantes no biodegradables. Un implante biodegradable puede liberar un fármaco durante un largo período de tiempo con una degradación simultánea o subsiguiente del polímero dentro del tejido en constituyentes, y así evita la necesidad de extraer el implante. Véase por ejemplo Drug Development and Industrial Pharmacy 24(12); 1129-1138:1998.

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Un polímero degradable puede ser un polímero de superficie erosionable, por oposición a un polímero que parece masivo u homogéneo. Un polímero de superficie erosionable se degrada solo desde su superficie externa, y la liberación de fármaco por tanto es proporcional a la velocidad de erosión del polímero. Un polímero de este tipo adecuado puede ser un polianhídrido. 40

Toxina botulínica

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La bacteria anaeróbica gram-positiva Clostridium botulinum produce una neurotoxina polipéptida potente, la toxina botulínica, que produce una afección neuroparalítica en humanos y animales a la que se refiere como botulismo. Las esporas de la Clostridium botulinum se encuentran en el suelo y pueden crecer en contenedores de alimentos no esterilizados ni sellados correctamente en conservas de producción doméstica, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo típicamente aparecen de 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede aparentemente pasar sin atenuación por la pared de los intestinos y atacar las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de la intoxicación con toxina botulínica pueden avanzar desde dificultad para caminar, tragar y hablar a parálisis de los músculos respiratorios y fallecimiento. La toxina botulínica tipo A es el agente biológico natural más letal que el hombre conoce. Unos 50 picogramos de una toxina botulínica tipo A disponible en el mercado (complejo de neurotoxina purificada)1 . Disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California con el nombre comercial BOTOX® en frascos de 100 unidades es una LD50 en ratones (es decir, 1 unidad). Una unidad de BOTOX® contiene aproximadamente 50 picogramos (unos 56 atomoles) de complejo de toxina botulínica tipo A. Es interesante que, en una base molar, la toxina botulínica tipo A es aproximadamente 1,8 mil millones de veces más letal que la difteria, aproximadamente 600 millones de veces más letal que el cianuro sódico, aproximadamente 30 millones de veces más letal que la toxina de la cobra y aproximadamente 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B.R. Singh y col., Plenum Press, Nueva York (1996) (en que el enunciado de que la LD50 de toxina botulínica tipo A de 0,3 ng equivale a 1 U se corrige con el dato de que 0,05 ng de BOTOX® equivale a 1 unidad). Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la LD50 en la inyección intraperitoneal en ratones hembras Swiss Webster que pesan de 18 a 20 gramos cada uno.

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Se han caracterizado siete neurotoxinas inmunológicamente diferentes de botulinum, que son respectivamente las neurotoxinas botulínicas de serotipos A, B, C1 , D, E, F y G cada uno de los cuales se distingue por la neutralización con anticuerpos específicos para cada tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en la especie animal 3

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a la que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que causa. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica tipo A es 500 veces más potente, medida por la velocidad de la parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica tipo B. Además, la toxina botulínica tipo B se ha determinado que es no tóxica en primates en una dosis de 480 U/kg, que es aproximadamente 12 veces la LD50 del primate para la toxina botulínica tipo A. La toxina botulínica aparentemente se enlaza con gran afinidad con neuronas motoras colinérgicas, se transloca a la neurona y bloquea la liberación de acetilcolina. Sin importar el serotipo, el mecanismo molecular de intoxicación por toxina parece ser similar e implicar al menos tres etapas o estadios. En la primera etapa del proceso, la toxina se enlaza a la membrana presináptica de la neurona objetivo a través de una interacción específica entre la cadena pesada, cadena H y un receptor celular superficial, el receptor se cree que es diferente para cada tipo de toxina botulínica y para la toxina tetánica. El segmento terminal de carboxilo de la cadena H, Hc , parece ser importante para el acceso de la toxina a la superficie celular. En la segunda etapa, la toxina atraviesa la membrana de plasma de la célula envenenada. La toxina primero es absorbida por la célula por medio de endocitosis mediada por el receptor, y se forma un endosoma que contiene la toxina. La toxina luego escapa del endosoma al citoplasma de la célula. Esta etapa se cree que está mediada por el segmento terminal amino de la cadena H, HN , que dispara un cambio de conformación de la toxina en respuesta a un pH aproximado de 5,5 o inferior. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que reduce el pH intraendosómico. El cambio de conformación expone los residuos hidrófobos de la toxina, lo que permite a la toxina incrustarse en la membrana endosómica. La toxina (o como mínimo la cadena ligera) luego se transloca por la membrana endosómica al citoplasma. La última etapa del mecanismo de actividad de la toxina botulínica parece implicar la reducción del enlace disulfuro que une la cadena pesada, cadena H, y la cadena ligera, cadena L. Toda la actividad tóxica de las toxinas botulínicas y tetánicas está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de zinc (Zn++) que corta selectivamente proteínas esenciales para el reconocimiento y acoplamiento de vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie citoplásmica de la membrana de plasma. La neurotoxina tetánica y las toxinas botulínicas B, D, F y G provocan degradación de la sinaptobrevina (también llamada proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)), una proteína de membrana sinaptosómica. La mayor parte de la VAMP presente en la superficie citoplásmica de la vesícula sináptica se extrae como consecuencia de uno cualquiera de estos eventos de corte. Los serotipos A y E cortan SNAP-25. El serotipo C1 se creía originalmente que cortaba la sintaxina, pero se descubrió que corta la sintaxina y SNAP-25. Cada toxina específicamente corta un enlace diferente (excepto el tétanos y tipo B que cortan el mismo enlace). Se ha dado uso clínico a las toxinas botulínicas para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por la hiperactividad de músculos del esqueleto. La toxina botulínica tipo A fue aprobada por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los EE.UU en 1989 para el tratamiento de blefarospasmo, estrabismo y espasmo hemifacial. Los serotipos de toxina botulínica que no son tipo A aparentemente tienen una potencia inferior y/o una duración de actividad más corta comparados con la toxina botulínica tipo A. Los efectos clínicos de la toxina botulínica tipo A periférica intramuscular se ven habitualmente una semana después de la inyección. La duración típica del alivio sintomático de una única inyección intramuscular de toxina botulínica tipo A en promedio es de tres meses. Aunque todos los serotipos de toxina botulínica aparentemente inhiben la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o cortando estas proteínas por sitios diferentes. Por ejemplo, los tipos botulínicos A y E ambos cortan la proteína sinaptosómica asociada de 25 kiloDalton (kD) (SNAP-25), pero acceden a diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína. Las toxinas botulínicas tipo B, D, F y G actúan en una proteína asociada a vesículas (VAMP, también llamada sinaptobrevina), en que cada serotipo corta la proteína por un sitio diferente. Finalmente, la toxina botulínica tipo C1 ha demostrado cortar tanto sintaxina como SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar a la potencia y/o duración relativas de la acción de los diversos serotipos de toxina botulínica. Aparentemente, un sustrato para una toxina botulínica puede encontrarse en una variedad de tipos de células diferentes. Véase, por ejemplo, Biochem, J1; 339 (parte 1): 159-65:1999, y Mov Disord, 10(3):376:1995 (las células islote B pancreáticas contienen al menos SNAP-25 y sinaptobrevina). El peso molecular de la molécula de proteína de la toxina botulínica, para los siete serotipos conocidos de toxina botulínica, es aproximadamente de 150 kD. Es interesante que las toxinas botulínicas son liberadas por la bacteria clostridial como complejos que comprenden los 150 kD de molécula de proteína de toxina botulínica junto con las proteínas no toxinas asociadas. Así, el complejo de toxina botulínica tipo A puede producirlo la bacteria clostridial en formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. Las toxinas botulínicas tipo B y C se producen aparentemente solo como un complejo de 700 kD o 500 kD. La toxina botulínica tipo D se produce como complejos de 300 kD y 500 kD. Finalmente, las toxinas botulínicas tipo E y F se producen solo como complejos de aproximadamente 300 kD. Los complejos (es decir, peso molecular mayor de aproximadamente 150 kD) se cree que contienen una proteína hemaglutinina no toxina y una proteína no hemaglutinina no toxina y no tóxica. Estas dos proteínas no toxinas (que junto con la molécula de toxina botulínica componen el complejo de neurotoxina de interés) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización de la molécula de toxina botulínica y protección contra los ácidos digestivos cuando se ingiere la toxina. Además, es posible que los complejos de toxina botulínica mayores (mayores de aproximadamente 150 kD de peso molecular) puedan producir una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica desde un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica. 4

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Los estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por cationes de potasio de acetilcolina y norepinefrina de cultivos de células primarias de tejido del tronco cerebral. Además, se ha informado que la toxina botulínica inhibe la liberación evocada de glicina y glutamato en cultivos primarios de neuronas de médula espinal y que en las preparaciones de sinaptosomas cerebrales la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina (Habermann E., y col., Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J Neurochem 51 (2); 522-527: 1988) CGRP, sustancia P y glutamato (Sanchez-Prieto, J., y col., Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem 165; 675-681: 1987). Así, cuando se usan concentraciones suficientes, la liberación provocada por el estímulo de la mayoría de los neurotransmisores se bloquea con la toxina botulínica. Véase, por ejemplo, Pearce, L. B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine, Toxicon 35 (9); 1373-1412 en 1393 (1997); Bigalke H., y col., Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360; 318324: 1985; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the Release of[3 H] Noradrenaline and [3 H] GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44; 224-226: 1988, Bigalke H., y col., Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 316; 244-251: 1981, y Jankovic J. y col., Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc, (1994), página 5. La toxina botulínica tipo A puede obtenerse estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y luego recolectando y purificando la mezcla fermentada de acuerdo con los procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas inactivas de cadena única que deben cortarse o mellarse con proteasas para hacerse neuroactivas. Las cepas bacterianas que componen los serotipos A y G de toxina botulínica poseen proteasas endógenas y serotipos A y G y pueden por lo tanto recuperarse de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. Por el contrario, los serotipos C1 , D y E de toxina botulínica se sintetizan con cepas no proteolíticas y por lo tanto típicamente se inactivan al recuperarlos del cultivo. Los serotipos B y F se producen con cepas proteolíticas y también no proteolíticas y por lo tanto pueden recuperarse en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica tipo B solo cortan una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas melladas o no melladas depende de la duración de la incubación y la temperatura del cultivo. Por lo tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, toxina de toxina botulínica tipo B es probable que sea inactiva, posiblemente debido a la conocida potencia mucho menor de la toxina botulínica tipo B comparada con la toxina botulínica tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactivas en una preparación clínica contribuirá a la carga general de proteína de la preparación, lo que se ha vinculado con una antigenicidad aumentada, sin contribuir a su eficacia clínica. Además, se sabe que la toxina botulínica tipo B tiene, tras la inyección intramuscular, una duración más corta de actividad y también es menos potente que la toxina botulínica tipo A en el mismo nivel de dosis. La toxina botulínica tipo A cristalina de alta calidad puede producirse de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con características de ≥3 X 107 U/mg, un A260 /A278 de menos de 0,60 y un patrón diferente de bandeo en la electroforesis en gel. El proceso conocido Shantz puede usarse para obtener toxina botulínica cristalina tipo A, como se expone en Shantz, E. J., y col., Properties and Use of Botulinum Toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56; 80-99: 1992. Generalmente, el complejo de toxina botulínica tipo A puede aislarse y purificarse a partir de una fermentación anaeróbica mediante el cultivo de Clostridium botulinum tipo A en un medio adecuado. El procedimiento conocido también puede usarse, al separar las proteínas no toxinas, para obtener toxinas botulínicas puras, como por ejemplo: toxina botulínica tipo A purificada con un peso molecular aproximado de 150 kD con una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o mayor; toxina botulínica tipo B purificada con un peso molecular aproximado de 156 kD con una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o mayor, y toxina botulínica tipo F purificada con un peso molecular aproximado de 155 kD con una potencia específica de 1-2 X 107 LD50 U/mg o mayor.

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Las toxinas botulínicas y/o complejos de toxina botulínica pueden obtenerse de List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osaka, Japan), Metabiologics (Madison, Wisconsin) así como de Sigma Chemicals de St. Louis, Missouri. 55

La toxina botulínica pura es tan lábil que generalmente no se usa para preparar una composición farmacéutica. Además, los complejos de toxina botulínica, como el complejo de toxina tipo A son también extremadamente susceptibles a la desnaturalización debido a la desnaturalización de la superficie, calor y condiciones alcalinas. La toxina inactivada forma proteínas toxoides que pueden ser inmunogénicas. Los anticuerpos producidos pueden hacer que un paciente se vuelva refractario a la inyección de toxina.

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Como ocurre con las enzimas en general, las actividades biológicas de las toxinas botulínicas (que son peptidasas intracelulares) dependen, al menos en parte, de su conformación tridimensional. Así, la toxina botulínica tipo A se detoxifica con el calor, estirando y secando la superficie de diversos productos químicos. Además, se sabe que la dilución del complejo de toxina obtenido mediante el cultivo, fermentación y purificación conocidos a las concentraciones de toxinas muchísimo menores que se usan para la formulación de composiciones farmacéuticas produce una detoxificación rápida de la toxina a menos que esté presente un agente estabilizante adecuado. La dilución de la toxina de cantidades de miligramos a una solución que contiene nanogramos por mililitro presenta dificultades importantes por la pérdida rápida de la toxicidad específica ante dicha gran dilución. Además, la toxina puede usarse durante meses 5

ES 2 259 665 T3 o años después de que se formule la composición farmacéutica que contiene toxina. Cabe destacar que se sabe que la toxina puede estabilizarse durante los procesos de fabricación y composición así como durante el almacenamiento mediante el uso de un agente estabilizante como albúmina y gelatina. 5

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Una toxina botulínica disponible en el mercado que contiene la composición farmacéutica se vende con el nombre comercial de BOTOX® (disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California). BOTOX® consiste en un complejo de toxina botulínica tipo A purificado, albúmina y cloruro de sodio envasado en una forma estéril y secada al vacío. La toxina botulínica tipo A se crea a partir de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum cultivada en un medio que contiene amina N-Z y extracto de levadura. El complejo de toxina botulínica tipo A se purifica a partir de la solución del cultivo mediante una serie de precipitaciones ácidas en un complejo cristalino que consiste en la proteína activa de toxina de alto peso molecular y una proteína asociada de hemaglutinina. El complejo cristalino se vuelve a disolver en una solución que contiene una sustancia salina y albúmina y se filtra para esterilizar (0,2 micrómetros) antes del secado al vacío. El producto secado al vacío se almacena en un congelador a -5ºC o menos. BOTOX® puede reconstituirse con una sustancia salina estéril no conservada antes de la inyección intramuscular. Cada frasco de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de neurotoxina purificado de toxina de Clostridium botulinum tipo A, 0,5 miligramos de albúmina de suero humano y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en una forma estéril y secada al vacío sin un conservante. Para reconstituir el BOTOX® secado al vacío, se usa una sustancia salina estéril normal sin conservante (inyección de cloruro de sodio 0,9%) recogiendo la cantidad suficiente de diluyente en una jeringa del tamaño adecuado. Dado que BOTOX® puede desnaturalizarse mediante burbujas u otra agitación violenta similar, el diluyente se inyecta con cuidado en el frasco. Por motivos de esterilidad, BOTOX® se administra preferentemente dentro de las cuatro horas siguientes a la extracción del frasco del congelador y su reconstitución. Durante estas cuatro horas, el BOTOX® reconstituido puede almacenarse en un refrigerador entre aproximadamente 2ºC y 8ºC. El BOTOX® reconstituido y refrigerado conserva su potencia durante al menos dos semanas. Neurology, 48:249-53:1997. Se ha informado que la toxina botulínica tipo A se ha usado en usos clínicos de la manera siguiente: (1) aproximadamente 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (múltiples músculos) para tratar la distonía cervical;

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(2) 5-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (surcos en la frente) (5 unidades inyectadas por vía intramuscular en el músculo procero y 10 unidades inyectadas por vía intramuscular en cada músculo corrugador superciliar); 35

(3) aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar el estreñimiento por inyección intraesfínter del músculo puborrectal;

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(4) aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado por vía intramuscular para tratar el blefarospasmo mediante inyección del músculo ocular orbicular de los párpados lateral pretarsal del párpado inferior.

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(5) para tratar el estrabismo, se han inyectado por vía intramuscular los músculos extraoculares con unas 1-5 unidades de BOTOX®, la cantidad inyectada varía según el tamaño del músculo que debe inyectarse y la cantidad de parálisis muscular deseada (es decir, la cantidad de corrección de dioptría deseada). (6) para tratar la espasticidad del miembro superior tras un accidente cerebrovascular mediante inyecciones intramusculares de BOTOX® en cinco músculos flexores diferentes de miembros superiores, de la manera siguiente:

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(a) flexor profundo de los dedos: 7,5 U a 30 U (b) flexor superficial de los dedos: 7,5 U a 30 U 55

(c) flexor cubital del carpo: 10 U a 40 U (d) flexor radial del carpo: 15 U a 60 U

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(e) bíceps braquial: 50 U a 200 U. Cada uno de los cinco músculos indicados se ha inyectado en la misma sesión de tratamiento, de modo que el paciente recibe entre 90 U y 360 U de BOTOX® en músculos flexores del miembro superior mediante inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento.

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(7) para tratar la migraña, la inyección por vía pericraneal (inyectado simétricamente en los músculos glabelar, temporal y frontal) de una inyección de 25 U de BOTOX® ha demostrado un beneficio importante como tratamiento profiláctico de la migraña comparado con un vehículo medido por una reducción en las mediciones de frecuencia de migraña, gravedad máxima, vómitos asociados y uso agudo de medicación durante el período de tres meses que sigue a la inyección de 25 U. 6

ES 2 259 665 T3 Se sabe que la toxina botulínica tipo A puede tener una eficacia de hasta 12 meses (European J. Neurology 6 (Supp 4):S111-S1150: 1999), y en algunas circunstancias hasta 27 meses (The Laryngoscope 109: 1344-1346: 1999). Sin embargo, la duración habitual de la inyección intramuscular de BOTOX® es normalmente de unos 3 a 4 meses. 5

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El éxito de la toxina botulínica tipo A para tratar varias condiciones clínicas ha producido interés en otros serotipos de toxina botulínica. Se ha realizado un estudio de dos preparaciones de toxina botulínica tipo A disponibles en el mercado (BOTOX® y Dysport®) y preparaciones de toxinas botulínicas tipo B y F (ambas se obtienen de Wako Chemicals, Japón) para determinar la eficacia de debilitamiento localizado del músculo, seguridad y potencial antigénico. Las preparaciones de toxina botulínica se inyectaron en la cabeza del músculo gastrocnemio derecho (0,5 a 200 unidades/kg) y la debilidad del músculo se evaluó usando el ensayo de puntuación de abducción digital del ratón (DAS). Los valores ED50 se calcularon a partir de curvas de respuesta a dosis. Se pusieron inyecciones intramusculares a ratones adicionales para determinar las dosis LD50 . El índice terapéutico se calculó como LD50 /ED50 . Grupos diferentes de ratones recibieron inyecciones en miembros traseros de BOTOX® (5 a 10 unidades/kg) o toxina botulínica tipo B (50 a 400 unidades/kg), y se les hicieron pruebas para evaluar la debilidad muscular y aumento del consumo de agua, este último es un modelo putativo de la sequedad bucal. El potencial antigénico se evaluó mediante inyecciones intramusculares mensuales en conejos (1,5 ó 6,5 ng/kg para la toxina botulínica tipo B o 0,15 ng/kg para BOTOX®). Los picos de debilidad muscular y duración estuvieron relacionados con las dosis en todos los serotipos. Los valores DAS ED50 (unidades/kg) fueron los siguientes: BOTOX®: 6,7, Dysport®: 24,7, toxina botulínica tipo B: 27 a 244, toxina botulínica tipo F: 4,3. BOTOX® tuvo una duración de acción mayor que la toxina botulínica tipo B o la toxina botulínica tipo F. Los valores de índice terapéutico fueron los siguientes: BOTOX®: 10,5, Dysport® 6,3, toxina botulínica tipo B: 3,2. El consumo de agua fue superior en los ratones inyectados con toxina botulínica tipo B que con BOTOX®, aunque la toxina botulínica tipo B fue menos efectiva para debilitar músculos. Después de cuatro meses de inyecciones, 2 de 4 (cuando se trataron con 1,5 ng/kg) y 4 de 4 (cuando se trataron con 6,5 ng/kg) conejos desarrollaron anticuerpos contra la toxina botulínica tipo B. En un estudio separado, 0 de 9 conejos tratados con BOTOX® presentaron anticuerpos contra la toxina botulínica tipo A. Los resultados DAS indican que las potencias pico relativas de la toxina botulínica tipo A son iguales a las de la toxina botulínica tipo F, y la toxina botulínica tipo F es mayor que la toxina botulínica tipo B. Con respecto a la duración del efecto, la de la toxina botulínica tipo A fue mayor que la de la toxina botulínica tipo B, y la duración del efecto de la toxina botulínica tipo B fue mayor que la de la toxina botulínica tipo F. Como demuestran los valores de índice terapéutico, las dos preparaciones comerciales de toxina botulínica tipo A (BOTOX® y Dysport®) son diferentes. El comportamiento de aumento del consumo de agua observado tras la inyección en miembros posteriores de toxina botulínica tipo B indica que valores clínicamente significativos de este serotipo entraron al sistema circulatorio del ratón. Los resultados también indican que para lograr una eficacia comparable a la de la toxina botulínica tipo A, es necesario aumentar las dosis de los otros serotipos examinados. La dosificación aumentada puede comprometer la seguridad. Además, en los conejos, el tipo B fue más antigénico que BOTOX®, posiblemente por la carga mayor de proteína inyectada para lograr una dosis efectiva de toxina botulínica tipo B. Eur J Neurol 1999 Nov; 6 (Suppl 4): S3-S10.

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Además de tener acciones farmacológicas en un lugar periférico, una toxina botulínica también puede producir un efecto de desnervación del sistema nervioso central. Wiegand y col., Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, y Habermann, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol, 1974; 281, 47-56 informaron que la toxina botulínica puede ascender al área espinal por transporte retrógrado. Así, una toxina botulínica inyectada en un lugar periférico, por ejemplo por vía intramuscular, puede potencialmente llegar por transporte retrógrado a la médula espinal.

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La patente estadounidense nº 5.989.545 desvela que una neurotoxina clostridial modificada o fragmento de ella, preferentemente una toxina botulínica, conjugada químicamente o fundida de manera recombinante con una fracción objetivo específica puede usarse para tratar el dolor mediante administración del agente a la médula espinal. Acetilcolina

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Típicamente cada tipo de neurona en el sistema nervioso del mamífero solo libera un único tipo de neurotransmisor de molécula pequeña. El neurotransmisor acetilcolina es secretado por las neuronas en muchas áreas del cerebro, pero específicamente en las grandes células piramidales de la corteza motora, por varias neuronas diferentes en los ganglios basales, por varias neuronas motoras que inervan los músculos esqueléticos, por las neuronas preganglionares del sistema nervioso autónomo (tanto el simpático como el parasimpático), por las neuronas postganglionares del sistema nervioso parasimpático, y por algunas de las neuronas postganglionares del sistema nervioso simpático. Esencialmente, solo las fibras de nervios simpáticos postganglionares que van a las glándulas sudoríparas, los músculos piloerectores y algunos vasos sanguíneos son colinérgicos dado que la mayoría de las neuronas postganglionares del sistema nervioso simpático secretan el neurotransmisor norepinefina. En la mayoría de los casos la acetilcolina tiene un efecto de excitación. Sin embargo, se sabe que la acetilcolina tiene efectos inhibitorios en algunas de las terminaciones nerviosas parasimpáticas periféricas, como la inhibición del ritmo cardíaco por el nervio vago. Las señales eferentes del sistema nervioso autónomo se transmiten al cuerpo a través del sistema nervioso simpático o del sistema nervioso parasimpático. Las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático se extienden de los cuerpos celulares de neuronas preganglionares simpáticas ubicadas en el cuerno intermediolateral de la médula espinal. Las fibras nerviosas preganglionares simpáticas, que se extienden desde el cuerpo celular, hacen sinapsis con las neuronas postganglionares localizadas en un ganglio simpático paravertebral o en un ganglio prevertebral. Dado que las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático y parasimpático son colinérgicas, la aplicación de acetilcolina a los ganglios excitará tanto a las neuronas postganglionares simpáticas como a las parasimpáticas. 7

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La acetilcolina activa dos tipos de receptores, los receptores muscarínicos y nicotínicos. Los receptores muscarínicos se encuentran en todas las células efectoras estimuladas por las neuronas postganglionares del sistema nervioso parasimpático así como en aquellas estimuladas por las neuronas postganglionares colinérgicas del sistema nervioso simpático. Los receptores nicotínicos se encuentran en la médula suprarrenal, así como en los ganglios autónomos, es decir, en la superficie celular de la neurona postganglionar en la sinapsis entre las neuronas preganglionares y postganglionares de los sistemas simpático y parasimpático. Los receptores nicotínicos también se encuentran en muchas terminaciones nerviosas no autónomas, por ejemplo en las membranas de fibras de músculos esqueléticos en la unión neuromuscular. La acetilcolina se libera de las neuronas colinérgicas cuando las vesículas intracelulares, pequeñas y claras se funden con la membrana presináptica de la célula neuronal. Una amplia variedad de células no neuronales secretoras, como por ejemplo, la médula suprarrenal (así como la línea de células PC12) y las células islote pancreáticas liberan catecolaminas y hormona paratiroidea, respectivamente, desde vesículas grandes de núcleo denso. La línea de células PC12 es un clon de células de feocromocitoma de rata usadas ampliamente como modelo de cultivo de tejido para estudios de desarrollo simpatosuprarrenal. La toxina botulínica inhibe la liberación de ambos tipos de compuestos de ambos tipos de células in vitro, permeabilizadas (por ejemplo por electroporación) o por inyección directa de la toxina en la célula desnervada. También se sabe que la toxina botulínica bloquea la liberación del neurotransmisor glutamato de los cultivos de células corticales de sinaptosomas. Una unión neuromuscular se forma en el músculo esquelético por la proximidad de los axones a las células musculares. Una señal transmitida a través del sistema nervioso produce un potencial de acción en el axón terminal, con la activación de canales iónicos y la liberación consiguiente de la acetilcolina neurotransmisora de las vesículas sinápticas intraneuronales, por ejemplo en el pie motor de la unión neuromuscular. La acetilcolina cruza el espacio extracelular para enlazarse con las proteínas receptoras de acetilcolina en la superficie del pie muscular. Cuando ha ocurrido un enlace suficiente, un potencial de acción de la célula muscular produce cambios específicos de canales iónicos en la membrana, lo que produce la contracción de la célula muscular. La acetilcolina entonces se libera de las células musculares y se metaboliza con colinesterasas en el espacio extracelular. Los metabolitos se recirculan al axón terminal para reproducirse como acetilcolina adicional. Por lo tanto, existe una necesidad de un implante biocompatible, no inmunogénico, no biodegradable que permita la liberación continuada en un período prolongado de una neurotoxina terapéuticamente efectiva en un paciente humano. Resumen

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La presente invención satisface esta necesidad y proporciona un implante biocompatible, no inmunogénico y no biodegradable que permite una liberación continua durante un largo período de toxina botulínica en un paciente humano. Nuestra invención proporciona un implante de neurotoxina que supera los problemas, dificultades y deficiencias conocidos asociados con los bolos o inyección subcutánea de una neurotoxina repetitivos, como la toxina botulínica, para tratar una aflicción como un trastorno del movimiento, incluido el espasmo muscular. Un sistema de liberación controlada dentro del alcance de nuestra invención comprende una matriz polimérica, y una cantidad de neurotoxina colocada dentro de la matriz polimérica, en la que cantidades mínimas de la neurotoxina pueden liberarse de una matriz polimérica durante un período de tiempo prolongado. La neurotoxina puede liberarse de la matriz polimérica de una manera sustancialmente continua o monofásica y el período de tiempo prolongado durante el cual la neurotoxina se libera de la matriz polimérica puede ser de 10 días a 6 años.

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La matriz polimérica puede estar hecha de una sustancia que es sustancialmente no biodegradable y la neurotoxina puede ser un polipéptido. Además, la neurotoxina puede ser una neurotoxina presináptica, como una neurotoxina clostridial. Además, la neurotoxina puede ser una toxina botulínica, como una toxina botulínica seleccionada del grupo que consiste en las toxinas botulínicas tipo A, B, C1 , D, E, F y G. Preferentemente, la neurotoxina es una toxina botulínica tipo A. El polímero que comprende la matriz polimérica se selecciona del grupo compuesto por metacrilato, vinilpirrolidona, alcohol vinílico, ácido acrílico, siloxano, acetato de vinilo, ácido láctico, ácido glicólico, colágeno y polímeros biocerámicos y copolímeros de ellos.

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La cantidad de neurotoxina contenida en el implante es de entre 1 unidad y 100.000 unidades de una toxina botulínica y, preferentemente, de 1 a 50.000 unidades de una toxina botulínica. Así, la cantidad de neurotoxina puede ser de entre 10 unidades y 2.000 unidades de una toxina botulínica tipo A y la cantidad de neurotoxina puede ser de entre 100 unidades y 30.000 unidades de una toxina botulínica tipo B. 65

La neurotoxina puede ser una toxina botulínica que se libera del implante en una cantidad efectiva para provocar parálisis muscular flácida de un músculo o grupo de músculos en o cerca del sistema implantado. 8

ES 2 259 665 T3 Una realización detallada de la presente invención puede ser un sistema de liberación controlada que comprende una matriz polimérica y entre 10 unidades y 20.000 unidades de una toxina botulínica dentro de la matriz polimérica, en la que cantidades mínimas de la toxina botulínica pueden liberarse de la matriz polimérica durante un período de tiempo prolongado de entre 2 meses y 5 años. 5

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Un procedimiento para producir un sistema de liberación controlada dentro del alcance de la invención puede tener las etapas de (a) disolver un polímero en un disolvente para realizar una solución polimérica; b) mezclar o dispersar una neurotoxina en la solución polimérica para formar una mezcla polímero-neurotoxina, y, (c) permitir que la mezcla de polímero-neurotoxina se asiente, produciendo así un sistema de liberación controlada. También puede existir la etapa de evaporar el disolvente después de la etapa de mezcla. Además, un procedimiento para usar un sistema de liberación continua según las reivindicaciones puede comprender la inyección o implantación de un sistema de liberación controlada que incluye una matriz polimérica, por la que se trata un trastorno del movimiento o un trastorno influido por la inervación colinérgica.

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Finalmente, un procedimiento para formar una neurotoxina de complejo de catión de metal que comprende las etapas de (a) formar una solución que contiene una neurotoxina; (b) dispersar un componente de catión de metal multivalente con la solución de neurotoxina en condiciones de pH adecuadas para formar un complejo del catión de metal multivalente con la neurotoxina, y así se forma una suspensión de neurotoxina compleja-catión de metal en la que la relación molar entre el componente de catión de metal y la neurotoxina está entre aproximadamente 4:1 y aproximadamente 100:1; y (c) secar dicha suspensión para formar la neurotoxina compleja-catión de metal. La cantidad de neurotoxina administrada por un sistema de liberación continua dentro del alcance de la presente invención durante un período de tiempo dado puede estar entre 10−3 U/kg y 35 U/kg para una toxina botulínica tipo A y hasta aproximadamente 200 U/kg para otras toxinas botulínicas, como la toxina botulínica tipo B. 35 U/kg o 200 U/kg es un límite superior porque se aproxima a una dosis letal de ciertas neurotoxinas, como la toxina botulínica tipo A y la toxina botulínica tipo B, respectivamente. Preferentemente, la cantidad de neurotoxina administrada por un sistema de liberación continua durante un período dado es de entre 10−2 U/kg y 25 U/kg. Más preferentemente, la neurotoxina se administra en una cantidad de entre 10−1 U/kg y 15 U/kg. Más preferentemente, la neurotoxina se administra en una cantidad de entre 1 U/kg y 10 U/kg. En muchos casos, una administración de entre 1 unidades hasta 500 unidades de una neurotoxina, como la toxina botulínica tipo A, proporciona un alivio terapéutico efectivo y de larga duración. Más preferentemente, pueden usarse de 5 unidades a 300 unidades de una neurotoxina, como la toxina botulínica tipo A, y más preferentemente, de 10 unidades a 200 unidades de una neurotoxina, como la toxina botulínica tipo A, pueden administrarse localizadamente a un tejido objetivo con resultados eficaces. En una realización especialmente preferida de la presente invención, de 1 unidades a 100 unidades de una toxina botulínica, como la toxina botulínica tipo A, pueden administrarse localizadamente a un tejido objetivo con resultados terapéuticamente efectivos.

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La neurotoxina es una toxina botulínica, como uno de los serotipos de toxinas botulínicas A, B, C1 , D, E, F o G. Preferentemente, la neurotoxina es toxina botulínica tipo A.

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Cabe destacar que la toxina botulínica puede administrarse por implantación subcutánea al paciente mediante colocación de un implante de toxina botulínica. La toxina botulínica puede administrarse a un músculo de un paciente en una cantidad de entre 1 unidad y 10.000 unidades. Cuando la toxina botulínica es toxina botulínica tipo A, la toxina botulínica puede administrarse a un músculo del paciente en una cantidad de entre 1 unidad y 100 unidades. En particular se ha informado que el tejido glandular tratado mediante una toxina botulínica puede presentar una actividad secretora reducida durante hasta 27 meses tras la inyección de la toxina. Laryngoscope 1999; 109:13441346, Laryngoscope 1998; 108:381-384.

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Nuestra invención se refiere a un implante para la liberación controlada de una neurotoxina y a procedimientos para producir y usar dichos implantes. El implante puede comprender una matriz polimérica que contiene una neurotoxina. El implante está diseñado para administrar niveles efectivos de neurotoxina durante un período de tiempo prolongado cuando se administra, por ejemplo, por vía intramuscular, epidural o subcutánea para el tratamiento de diversas afecciones.

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Esta invención además se refiere a una composición, y procedimientos de producción y uso de la composición para la neurotoxina controlada biológicamente activa y estabilizada. La composición de liberación controlada de esta invención puede comprender una matriz polimérica de un polímero biocompatible y una neurotoxina biológicamente activa y estabilizada dispersada dentro del polímero biocompatible. Definiciones Las siguientes definiciones se aplican en el presente documento:

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“Biocompatible” significa que hay una respuesta inflamatoria insignificante en el lugar de implantación derivada del uso del implante. 9

ES 2 259 665 T3 “Compuesto biológicamente activo” significa un compuesto que puede producir un cambio beneficioso en el sujeto al que se administra. Por ejemplo, “compuestos biológicamente activos” incluye a las neurotoxinas. 5

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“Cantidad efectiva” aplicada a un compuesto biológicamente activo significa la cantidad del compuesto que es generalmente suficiente para producir un cambio deseado en el sujeto. Por ejemplo, cuando el efecto deseado es la parálisis flácida del músculo, una cantidad efectiva del compuesto es la cantidad que produce al menos una parálisis sustancial de los músculos deseados sin provocar una parálisis sustancial del músculo adyacente del que no se desea la parálisis, y sin que produzca una reacción de toxicidad sistémica significativa. “Cantidad efectiva” aplicada a un ingrediente no activo constituyente de un implante (como un polímero usado para formar una matriz o una composición de recubrimiento) se refiere a una cantidad del ingrediente no activo constituyente suficiente para influir claramente en la liberación de un agente biológicamente activo a la velocidad deseada durante un período de tiempo deseado. Por ejemplo, cuando el efecto deseado es la parálisis muscular usando un único implante, la “cantidad efectiva” es la cantidad que puede facilitar la extensión de la liberación durante un período de entre aproximadamente 60 días y 6 años. Esta “cantidad efectiva” puede determinarse a partir de la enseñanza de esta memoria y del conocimiento general de la técnica. “Cantidad efectiva” aplicada a la cantidad de área superficial de un implante es aquella cantidad de área superficial del implante suficiente para efectuar un flujo de compuesto biológicamente activo para lograr un efecto deseado, como una parálisis muscular. El área necesaria puede determinarse y ajustarse directamente mediante la medición de la liberación obtenida para el compuesto activo específico. El área superficial del implante o de un recubrimiento del implante es aquella cantidad de membrana necesaria para encapsular completamente el compuesto biológicamente activo. El área superficial depende de la geometría del implante. Preferentemente, el área superficial se minimiza en lo posible, para reducir el tamaño del implante.

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“Implante” significa un sistema de administración de un fármaco de liberación controlada. El implante comprende un polímero biocompatible o un material cerámico que contiene o que puede funcionar como vehículo de una molécula con una actividad biológica. El implante puede inyectarse, insertarse o implantarse en el cuerpo humano. 30

“Administración localizada” significa administración directa de un compuesto biológicamente activo, como un fármaco terapéutico a un tejido mediante una vía no sistémica. La administración localizada por tanto incluye la administración subcutánea, intramuscular, intraespinal (es decir, intratecal y epidural), intracraneal e intraglandular. La administración localizada excluye una vía sistémica de administración como la administración oral o intravenosa.

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“Neurotoxina” significa un agente que puede interrumpir la transmisión de impulsos nerviosos a través de una unión neuromuscular o neuroglandular, bloquear o reducir la exocitosis neuronal de un neurotransmisor o alterar el potencial de acción en una puerta de tensión de un canal sódico de una neurona.

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“Tratamiento” significa cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, e incluye: (i) prevenir la ocurrencia de la enfermedad o (ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; (iii) aliviar la enfermedad, es decir, reducir la incidencia de los síntomas o producir una remisión de la enfermedad.

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Un procedimiento para producir un implante dentro del alcance de la presente invención para la liberación controlada de una neurotoxina puede incluir disolver un polímero biocompatible en un disolvente de polímero para formar una solución polimérica, dispersar partículas de una neurotoxina estabilizada y biológicamente activa en la solución polimérica, y luego solidificar el polímero para formar una matriz polimérica que contiene una dispersión de partículas de neurotoxina.

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Un procedimiento de uso de un implante dentro del alcance de la presente invención para la liberación controlada de una neurotoxina puede comprender proporcionar un nivel terapéuticamente efectivo de una neurotoxina biológicamente activa en un paciente durante un período de tiempo prologado mediante la implantación del implante en el paciente. Descripción

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La presente invención está basada en el descubrimiento de un implante de liberación continua, que comprende un polímero biocompatible, no biodegradable o biodegradable que puede presentar una liberación prolongada in vivo de cantidades terapéuticas de toxina botulínica. 60

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Un implante dentro del alcance de nuestra invención puede insertarse quirúrgicamente mediante incisión en el sitio de efecto deseado (es decir, para la reducción de un espasmo muscular) o el implante puede administrarse por vía subcutánea o intramuscular usando una pistola de implantación de aguja hueca, por ejemplo del tipo desvelado en la patente estadounidense número 4.474.572. El diámetro de la aguja puede ajustarse para que corresponda al tamaño del implante usado. Además, un implante dentro del alcance de la presente invención puede implantarse intracranealmente para proporcionar una administración de larga duración de una cantidad terapéutica de una neurotoxina a un tejido cerebral objetivo. La extracción de un implante no biodegradable dentro del alcance de la presente invención no es necesaria cuando el implante se ha agotado, porque el implante está compuesto de un material biocompatible y no inmunogénico. 10

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Para estabilizar una neurotoxina, tanto en un formato que hace útil a la neurotoxina para mezclarla con un polímero adecuado que puede formar la matriz del implante (es decir, una neurotoxina en polvo que se ha secado por congelación o ha sido liofilizada) así como durante el tiempo en que la neurotoxina esté presente o incorporada en la matriz del polímero seleccionado, pueden usarse varios excipientes farmacéuticos. Los excipientes adecuados incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio y leche desnatada en polvo. El grosor del implante puede usarse para controlar la absorción de agua de una composición de la invención, y por lo tanto su velocidad de liberación de una neurotoxina, los implantes más gruesos liberan el polipéptido más lentamente que los más finos. El implante puede liberar rápidamente una cantidad subóptima de neurotoxina durante una primera fase, el período de estallido. El período de estallido normalmente dura menos de 24 horas y frecuentemente se extiende solo durante aproximadamente una hora después de la implantación. Después, la cantidad de neurotoxina liberada por el implante cae rápidamente y se estabiliza en un nivel de neurotoxina liberada mucho más reducido y, cabe destacar, relativamente constante (es decir, cinética de orden cero). Esta segunda fase prolongada de liberación de neurotoxina puede extenderse durante un período de entre aproximadamente un año a unos cinco o seis años. Una parte inicial de la segunda fase puede llamarse período de constitución. La cantidad aditiva de neurotoxina liberada durante la fase de estallido y el período de constitución es preferentemente igual a una cantidad óptima de neurotoxina para tratar un trastorno o aflicción particular. La duración temporal del período de constitución es algo menor al período de tiempo tras el cual la administración óptima de neurotoxina presenta una eficacia claramente reducida. Por ejemplo, para tratar la espasticidad de miembros superiores, la cantidad óptima de toxina botulínica tipo A intramuscular puede ser de unas 90 unidades inyectadas en el músculo bíceps braquial. Típicamente, la parálisis flácida así inducida dentro de los 1-7 días siguientes al bolo, se desvanece sustancialmente después de unos 3 meses. Un implante subcutáneo de neurotoxina dentro del alcance de nuestra invención puede configurarse para liberar unas 60 unidades de toxina botulínica esencialmente en seguida después de la implantación (es decir, durante el período de estallido). Esta cantidad subóptima de neurotoxina proporciona un alivio rápido y sustancial. Durante la fase 2 el implante libera continuamente unas 0,4 unidades/día de una neurotoxina, como la toxina botulínica tipo A, de modo que tras unos 75 días la cantidad óptima de 90 unidades se ha liberado desde el implante al tejido objetivo. No se ha identificado el receptor neuronal presináptico para el que la toxina botulínica presenta una afinidad alta y específica. Tampoco se ha descubierto un mecanismo generalmente aceptado para explicar la larga semivida intraneuronal de la toxina botulínica. Sin embargo, se sabe que ocurre un proceso dinámico, que puede ser el desbloqueo, reaparición, resíntesis y/o reactivación del receptor de toxina botulínica o la aparición de nuevos brotes neuronales, o ambos, y explica el desvanecimiento gradual del efecto paralítico que resulta de la administración de una toxina botulínica. Así, aunque en el ejemplo precedente puede llevar hasta 75 días que una cantidad óptima (total de 90 unidades) de toxina botulínica se libere desde el implante, debido al carácter dinámico de la atenuación del efecto de la toxina botulínica, la liberación consiguiente de toxina (es decir, más allá de los 75 días) desde el implante no produce una parálisis del área excesiva o no deseada. Así, puede esperarse, en este ejemplo, que la toxina liberada por el implante en el día 76 se enlace con los nuevos receptores y/o los brotes neuronales formados en respuesta a la desnervación provocada por la toxina liberada desde el implante en el primer día o cerca de él. El carácter rotativo del proceso de desnervación significa que, antes que producir un exceso de toxina que puede difundirse de manera sistémica o producir parálisis no deseada, la liberación continua de toxina después del fin del período de constitución simplemente desnerva otra vez dentro del mismo lugar deseado del músculo. Así, suponiendo un patrón esférico de desnervación y manteniendo constantes otros factores, la liberación explosiva desnerva una esfera de tejido con un diámetro aproximado de 2/3 del tamaño óptimo de la masa de tejido para la que se desea la desnervación. La liberación posterior de neurotoxina durante el período de constitución y subsiguiente proporciona la cantidad óptima o deseada de desnervación de tejido y las cantidades de neurotoxina para renovar la desnervación en los sitios recién renervados dentro del tejido objetivo. Se sabe que el blefarospasmo puede tratarse por inyección intramuscular de unas 5 unidades (repetidas en intervalos de 2-4 meses) de toxina botulínica tipo A en el músculo orbicular lateral pretarsal de los párpados. Es importante que un único implante dentro del alcance de nuestra invención puede usarse para el tratamiento de blefarospasmo durante, por ejemplo, un período de un año. Con esta aflicción y un período de un año elegido para tratamiento de liberación de neurotoxina por implante, y el uso de un polímero característico de 15% de estallido, la carga total de neurotoxina en el implante puede ser de 20 unidades. Durante el período de estallido unas 3 unidades de la toxina se liberan (dentro de las 24 horas siguientes a la implantación) seguidas de una liberación continua de unas 0,0467 unidades por día (es decir, unos 2,3 picogramos de BOTOX® por día). Así, en el día 42 unas 5 unidades en total de neurotoxina se han liberado. La velocidad de liberación en este ejemplo (15% estallido, 85% restante durante 364 días) es 0,234%/día. En este ejemplo, en el día 1 el paciente recibe un implante de 20 unidades y un año después se extrae el implante gastado del paciente y se inserta otro implante de 20 unidades. Así se administran 25 unidades durante 365 días, con el efecto del segundo implante en el día 365 incluido.

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Dado que un mol (M) de complejo de toxina botulínica tipo A contiene aproximadamente 9 X 105 gramos, un picogramo (pg) de complejo de toxina botulínica tipo A es aproximadamente 1,1 X 10−18 M. Por tanto, una liberación deseada de 0,234%/día de la neurotoxina total incorporada equivale a la liberación de aproximadamente 2,53 11

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X 10−18 M/día. Con un período de tratamiento de un año, una estallido del 20%, seguida de 80% durante 364 días se produce una liberación controlada de aproximadamente 0,22%/día o 0,044 unidades/día o 2,2 picogramos/día o aproximadamente 2,42 X 10−18 M/día. Una estallido de 20% de un implante de 20 unidades proporciona 4 unidades de la neurotoxina en aproximadamente las primeras 24 horas siguientes a la implantación. En general, el área superficial del implante es igual a x unidades de toxina liberadas/día por cada y cm2 de área superficial del implante. Se tratan diferentes dolencias mediante inyección de toxina botulínica de 5 unidades a 100 unidades por inyección. Un implante típico para tratar, durante un período de un año, una dolencia para la que 25 unidades de tipo A constituyen la dosis de bolo óptima puede cargarse con 100 unidades de un complejo de toxina botulínica tipo A. La estallido puede ser de un 20%, seguida de un 80% durante 364 días, lo que equivale a 0,22%/día o 0,22 unidades/día u 11 picogramos/día o aproximadamente 1,21 X 10−17 M/día. Para un período de tratamiento de cinco años, es decir, 20 bolos de 25 unidades, la primera inyección se pone en el momento cero, y la vigésima inyección en el mes 57, para una serie de 500 unidades en total de inyecciones. Por el contrario, con nuestra invención, un implante de 5 años para tratar una dolencia que responde a 25 unidades de toxina botulínica, como la toxina botulínica tipo A, puede hacerse con un implante cargado con 500 unidades de toxina con las características de una estallido de 20 unidades (estallido del 4%), seguida de aproximadamente 480 unidades liberadas durante unos 1736 días, que es igual a 0,267 unidades/día o 5,56 X 10−4 %/día o 13,35 picogramos/día liberados por el implante.

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Un implante de matriz puede hacerse disolviendo un polímero seleccionado en un disolvente adecuado. En esta solución de vaciado se mezcla la cantidad deseada de neurotoxina potenciada, liofilizada o secada por congelación (es decir, la cantidad total deseada de la neurotoxina, como BOTOX® no reconstituido que debe liberarse durante un período terapéutico). Este procedimiento puede usarse para producir gránulos de implante recubiertos, con la modificación de que el recubrimiento usado en una realización de la presente invención es un polímero bioerosionable que es impermeable a la neurotoxina. Así, la neurotoxina no se difunde afuera de la matriz en el tejido circundante hasta que el recubrimiento se ha degradado. El pH del vaciado u otra solución en la que la toxina botulínica debe mezclarse se mantiene en un pH 4,2-6,8, porque a un pH por encima de 7 las proteínas no toxinas estabilizantes se disocian de la toxina botulínica lo que produce una pérdida gradual de toxicidad. Preferentemente, el pH está entre 5 y 6. Además la temperatura de la mezcla/solución no debe exceder de unos 35 grados Celsius, porque la toxina se detoxifica rápidamente cuando se encuentra en una mezcla/solución por encima de unos 40 grados Celsius. Los implantes adecuados dentro del alcance de la presente invención para la liberación controlada in vivo de una neurotoxina, como la toxina botulínica, pueden prepararse de modo que el implante libere la neurotoxina de una manera continua o pulsátil. “Liberación continua” significa liberación de la toxina en una manera sustancialmente monofásica, después de la fase inicial de estallido. Una liberación continua puede tener un punto de inflexión pero no una fase plana. La liberación continua no requiere una liberación desde el implante de una cantidad similar de neurotoxina por unidad de tiempo. Un implante de liberación pulsátil puede liberar una neurotoxina en una manera bifásica o multifásica. Así, el implante de liberación pulsátil puede tener un período inicial relativamente corto de inducción (estallido), seguido de períodos en los que se libera poca o ninguna neurotoxina. Una liberación controlada de una neurotoxina biológicamente activa es una liberación terapéuticamente efectiva, con niveles insignificantes de suero, de una neurotoxina biológicamente activa durante un período superior que el que se obtiene con la administración directa de neurotoxina acuosa. Se prefiere que una liberación controlada sea una liberación de neurotoxina durante un período de aproximadamente seis meses o más, y más preferentemente durante un período aproximado de un año o más. Los implantes adecuados dentro del alcance de la presente invención para la liberación controlada in vivo de una neurotoxina, como la toxina botulínica, pueden presentar una liberación continua o liberación pulsátil de la neurotoxina. Además, el implante puede comprender un material polimérico no biodegradable o biodegradable. Es importante que nuestra invención comprende: (1) implantes de neurotoxina de liberación continua y no biodegradables; (2) implantes de neurotoxina de liberación continua y biodegradables; (3) implantes de neurotoxina de liberación pulsátil y no biodegradables; y (4) implantes de liberación pulsátil y biodegradables, y cada uno de estos cuatro tipos comprende un implante que puede formularse en una variedad de conformaciones, adecuadas para la inyección subdérmica o la implantación en forma de gránulos, discos, microesferas, películas, tubos y barras, cada una de las cuales tiene, por ejemplo, uno o más recubrimientos sobre una estructura de depósito o matriz. Un implante dentro del alcance de nuestra invención puede también formularse como una suspensión para inyectar. Tales suspensiones pueden fabricarse con técnicas generales bien conocidas en la técnica farmacéutica, por ejemplo mediante el molido de la mezcla de poliláctido/polipéptido en un molino ultracentrifugador equipado con un filtro en forma de malla adecuado, por ejemplo una malla 120, y mediante la suspensión de las partículas molidas y filtradas en un disolvente para su inyección, por ejemplo glicol de propileno, agua optativamente con un agente convencional de aumento de la viscosidad o de suspensión, aceites u otros vehículos líquidos conocidos y adecuados para la inyección. La desnaturalización de la neurotoxina encapsulada en el cuerpo a 37 grados C durante un período de tiempo prolongado puede reducirse estabilizando la neurotoxina mediante su liofilización con albúmina, liofilización a partir de 12

ES 2 259 665 T3 una solución ácida, liofilización a partir de una solución de bajo contenido de humedad (estos tres criterios se cumplen con respecto a la toxina botulínica tipo A mediante el uso de Botox® no reconstituido), y uso de una composición de matriz polimérica específica. 5

Preferentemente, la liberación de neurotoxina biológicamente activa in vivo no produce una respuesta importante del sistema inmune durante el período de liberación de la neurotoxina. Neurotoxina estabilizada en matriz

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Hemos descubierto que una neurotoxina estabilizada puede comprender un complejo de neurotoxina biológicamente activa no acumulada con al menos un tipo de catión de metal multivalente que tiene una valencia de +2 o más. Los cationes de metal multivalente adecuados incluyen los cationes de metal contenidos en componentes biocompatibles de cationes de metal. Un componente de catión de metal es biocompatible si el componente catiónico es no tóxico para el recipiente en las cantidades usadas, y tampoco presenta efectos dañinos o contraproducentes en el cuerpo del recipiente, como una reacción inmunológica en el sitio de la inyección.

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Preferentemente, la relación molar entre el componente de catión de metal y la neurotoxina, para que el catión de metal estabilice la neurotoxina, está entre 4:1 y 100:1 y más típicamente entre 4:1 y 10:1.

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Un catión de metal preferido usado para estabilizar la neurotoxina es Zn++. Los cationes de zinc divalente se prefieren porque la toxina botulínica se sabe que es una endopeptidasa de zinc divalente. En una realización más preferida, la relación molar entre el componente de catión de metal que contiene Zn++ cationes y la neurotoxina es aproximadamente de 6:1.

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La capacidad de un catión de metal para estabilizar neurotoxina puede determinarla una persona con conocimientos medios en la técnica mediante la realización de varias técnicas indicadoras de estabilidad como la electroforesis en gel de poliacrilamida, enfoque isoeléctrico, cromatografía de fase inversa, CLAP y pruebas de potencia sobre las partículas de neurotoxina liofilizada que contienen cationes de metal para determinar la potencia de la neurotoxina después de la liofilización y durante la duración de la liberación de las micropartículas. En una neurotoxina estabilizada, la tendencia de la neurotoxina para acumularse dentro de una micropartícula durante la hidratación in vivo y/o para perder actividad biológica o potencia por la hidratación o debido al proceso de formación de una composición de liberación controlada, o debido a las características químicas de una composición de liberación controlada, se reduce mediante la formación de un complejo de al menos un tipo de catión de metal con neurotoxina antes de poner en contacto la neurotoxina con una solución polimérica.

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Mediante nuestra invención, la neurotoxina estabilizada se estabiliza contra una acumulación importante in vivo durante el período de liberación controlada. La acumulación importante se define como la cantidad de acumulación que produce una acumulación del 15% o más de la neurotoxina encapsulada en el polímero o incorporada en la matriz polimérica. Preferentemente, la acumulación se mantiene por debajo de aproximadamente 5% de la neurotoxina. Más preferentemente, la acumulación se mantiene por debajo del 2% de la neurotoxina presente en el polímero.

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La neurotoxina en una composición de liberación controlada de neurotoxina puede también mezclarse con otros excipientes, como agentes de carga o agentes estabilizantes adicionales, como los tampones para estabilizar la neurotoxina durante la liofilización. Los agentes de carga típicamente comprenden materiales inertes. Los agentes de carga adecuados son conocidos por los expertos en la materia.

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Un polímero o matriz polimérica adecuados para una composición de liberación controlada de la presente invención deben ser biocompatibles. Un polímero es biocompatible si el polímero o cualquier producto de degradación del polímero no es tóxico para el recipiente y tampoco presenta efectos dañinos o contraproducentes en el cuerpo del recipiente, como una reacción inmunológica en el sitio de inyección. 55

El polímero de la composición de liberación controlada de neurotoxina puede hacerse de un material biodegradable. Biodegradable, como se define en el presente documento, significa que la composición se degradará y erosionará in vivo para formar una especie química menor. La degradación puede producirse, por ejemplo, mediante procesos enzimáticos, químicos y físicos. 60

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Los polímeros adecuados biocompatibles y biodegradables incluyen, por ejemplo, poli(láctidos), poli(glicólidos), poli(láctido-co-glicólidos), poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), poli(ácidos láctidos-ácidos co-licólidos), policaprolactona, policarbonatos, poliesteramidas, polianhídridos, poli(aminoácidos), poliortoesteres, policianoacrilatos, poli(p-dioxanona), poli(oxalatos de alquileno), poliuretanos biodegradables, mezclas y copolímeros de ellos. Además, las funcionalidades terminales del polímero pueden modificarse. Por ejemplo, los poliésteres pueden ser bloqueados, desbloqueados o una mezcla de polímeros bloqueados y desbloqueados. Un polímero bloqueado es como 13

ES 2 259 665 T3 se define clásicamente en la técnica, específicamente tiene grupos terminales carboxilo bloqueados. Generalmente, el grupo que bloquea se deriva del iniciador de la polimerización y típicamente es un grupo alquilo. Un polímero desbloqueado generalmente tiene grupos carboxilo terminales libres. 5

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Los pesos moleculares aceptables para un polímero biodegradable usado en esta invención puede determinarlos una persona con conocimientos medios en la técnica teniendo en cuenta factores como la velocidad de degradación deseada del polímero, propiedades físicas como resistencia mecánica y velocidad de disolución del polímero en disolvente. Típicamente, una variedad aceptable de pesos moleculares es de entre 2000 Dalton y aproximadamente 2.000.000 Dalton. En una realización preferida, el polímero es un polímero biodegradable o copolímero. En una realización más preferida, el polímero es un poli(láctido-co-glicólido) (en adelante “PLGA”), con una relación entre láctido y glicólido de aproximadamente 1:1 y un peso molecular de aproximadamente 5.000 Dalton a aproximadamente 70.000 Dalton. En una realización aun más preferida, el peso molecular del PLGA usado en la presente invención tiene un peso molecular de aproximadamente 6.000 a aproximadamente 31.000 Dalton. La cantidad de neurotoxina contenida en una dosis de micropartículas de liberación controlada o en un sistema alternativo de liberación controlada, que tiene partículas de neurotoxina estabilizada y biológicamente activa en una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva, puede determinarla una persona con conocimientos medios en la técnica teniendo en cuenta factores como el peso corporal, dolencia que debe tratarse, tipo de polímero usado y velocidad de liberación del polímero.

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En una realización, una composición de liberación controlada de neurotoxina contiene entre aproximadamente 10−4 % (p/p) y 1% (p/p) de neurotoxina estabilizada biológicamente activa. La cantidad de dichas partículas de neurotoxina usada variará según el efecto deseado de la neurotoxina, los niveles de liberación planeados, los tiempos en que la neurotoxina debe liberarse y el período de tiempo sobre el que se liberará la neurotoxina. Una amplitud preferida de carga de partículas de neurotoxina es de entre 10−4 % (p/p) y 0,1% (p/p). Una variedad más preferida de carga de neurotoxina es de entre 10−3 % (p/p) y 1% (p/p) de neurotoxina. La carga más preferida de las partículas de neurotoxina biológicamente activa y estabilizada es de aproximadamente 10−2 % (p/p). En otra realización, una composición de liberación controlada de neurotoxina también contiene un segundo componente de catión de metal, que no está contenido en las partículas de neurotoxina estabilizadas, y que se dispersa dentro del polímero. El segundo componente de catión de metal preferentemente contiene la misma especie de catión de metal que está contenida en la neurotoxina estabilizada. Alternativamente, el segundo componente de catión de metal puede contener una o más especies diferentes de catión de metal.

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El segundo componente de catión de metal actúa para modular la liberación de la neurotoxina de la matriz polimérica de la composición de liberación controlada, por ejemplo actuando como depósito de cationes de metal para extender aun más el período de tiempo sobre el que se estabiliza la neurotoxina con un catión de metal para mejorar la estabilidad de la neurotoxina en la composición.

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Un componente de catión de metal usado en la modulación de la liberación típicamente contiene al menos un tipo de catión de metal multivalente. Ejemplos de segundos componentes de catión de metal incluyen o contienen, por ejemplo, Mg(OH)2 , MgCO3 (como 4MgCO3 Mg (OH)2 5H2 O), ZnCO3 (como 3Zn (OH)2 2ZnCO3 , CaCO3 , Zn3 (C6 H5 O7 )2 , Mg(OAc)2 , MgSO4 , Zn(OAc)2 , ZnSO4 , ZnCl2 , MgCl2 y Mg3 (C6 H5 O7 )2 . Una relación adecuada entre el segundo componente de catión de metal y polímero es de entre aproximadamente 1:99 y aproximadamente 1:2 sobre el peso. La relación óptima depende del polímero y del segundo componente de catión de metal usado.

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La composición de liberación controlada de neurotoxina de esta invención puede formarse de muchas formas, como una película, gránulo, cilindro, disco o micropartícula. Una micropartícula, como se define en el presente documento, comprende un componente polimérico que tiene un diámetro menor a un milímetro y tiene partículas estabilizadas de neurotoxina dispersadas en ella. Una micropartícula puede tener una forma esférica, no esférica o irregular. Se prefiere que una micropartícula sea una microesfera. Típicamente, la micropartícula será de un tamaño adecuado para la inyección. Una amplitud de tamaños preferida está entre 1 y 180 micrómetros de diámetro. En el procedimiento de esta invención para formar una composición para la liberación controlada de neurotoxina biológicamente activa no acumulada, una cantidad adecuada de partículas de neurotoxina biológicamente activa y estabilizada se dispersan en una solución polimérica. Una solución polimérica adecuada contiene entre 1% (p/p) y 30% (p/p) de un polímero biocompatible adecuado, en el que el polímero biocompatible se disuelve típicamente en un disolvente adecuado de polímero. Preferentemente, una solución polimérica contiene 2% (p/v) a 20% (p/v) de polímero. Una solución polimérica que contiene de 5% a 10% (p/p) de polímero es la más preferida. Un disolvente adecuado de polímero, como se define en el presente documento, es un disolvente en el que el polímero es soluble pero en el que las partículas estabilizadas de neurotoxina son sustancialmente insolubles y no reactivas. Ejemplos de disolventes de polímero adecuados incluyen líquidos polares orgánicos, como el cloruro de metileno, cloroformo, acetato de etilo y acetona. 14

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Para preparar neurotoxina biológicamente activa y estabilizada, la neurotoxina se mezcla en un disolvente acuoso adecuado con al menos un componente de catión de metal adecuado en condiciones de pH adecuadas para la formación de un complejo de catión de metal y neurotoxina. Típicamente, la neurotoxina compleja tendrá forma de precipitado nuboso, que se suspende en el disolvente. Sin embargo, la neurotoxina compleja también puede estar en solución. En una realización aun más preferida, la neurotoxina forma un complejo con Zn++. Las condiciones adecuadas de pH para formar un complejo de neurotoxina incluyen valores de pH entre 5 y 6,9. Las condiciones adecuadas de pH se logran típicamente por medio del uso de un tampón acuoso, como bicarbonato de sodio, como disolvente.

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Los disolventes adecuados son aquellos en que la neurotoxina y el componente de catión de metal cada uno es al menos ligeramente soluble, como en el tampón de bicarbonato de sodio acuoso. Para los disolventes acuosos, se prefiere que el agua usada sea agua desionizada o agua para inyección (WFI). 15

La neurotoxina puede estar en estado sólido o disuelto, antes de entrar en contacto con el componente de catión de metal. Además, el componente de catión de metal puede estar en un estado sólido o disuelto, antes de entrar en contacto con la neurotoxina. En una realización preferida, la solución acuosa de tampón de neurotoxina se mezcla con una solución acuosa del componente de catión de metal.

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Típicamente, la neurotoxina compleja estará en forma de precipitado nuboso, suspendido en el disolvente. Sin embargo, la neurotoxina compleja también puede estar en solución. En una realización preferida, la neurotoxina forma un complejo con Zn++.

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La neurotoxina formada en un complejo con Zn++ puede luego secarse, por ejemplo por liofilización, para formar particulados de neurotoxina estabilizada. La neurotoxina formada en complejo con Zn++, que está suspendida o en solución, puede liofilizarse en masa o dividirse en volúmenes menores que luego se liofilizan. En una realización preferida, la suspensión de neurotoxina formada en complejo con Zn++ se microniza, por ejemplo con una boquilla ultrasónica, y luego se liofiliza para formar partículas de neurotoxina estabilizadas. Los medios aceptables para liofilizar la mezcla de neurotoxina formada en complejo con Zn++ incluyen los conocidos en la técnica.

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Preferentemente, las partículas de neurotoxina estabilizada tienen un diámetro de entre 1 y 6 micrómetros. Las partículas de neurotoxina pueden fragmentarse por separado. Alternativamente, las partículas de neurotoxina pueden fragmentarse después de haber sido agregadas a una solución polimérica, por ejemplo por medio de una sonda ultrasónica o boquilla ultrasónica. 35

En otra realización, un segundo componente de catión de metal, no contenido en las partículas de neurotoxina estabilizada, también se dispersa dentro de la solución polimérica. 40

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Se entiende que un segundo componente de catión de metal y neurotoxina estabilizada pueden dispersarse en la solución polimérica secuencialmente, en orden inverso, intermitentemente, por separado o a través de adiciones concurrentes. Alternativamente, un polímero, un segundo componente de catión de metal y neurotoxina estabilizada pueden mezclarse en un disolvente polimérico secuencialmente, en orden inverso, intermitentemente, por separado o a través de adiciones concurrentes. En este procedimiento, el disolvente polimérico se solidifica entonces para formar una matriz polimérica que contiene una dispersión de partículas de neurotoxina estabilizada. Un procedimiento adecuado para formar una composición de liberación controlada de neurotoxina de una solución polimérica es el procedimiento de evaporación de disolvente descrito en las patentes estadounidenses con números 3.737.337; 3.523.906; 3.691.090 y 4.389.330. La evaporación de disolventes puede usarse como procedimiento para formar micropartículas de liberación controlada de neurotoxina. En el procedimiento de evaporación de disolvente, una solución polimérica que contiene una dispersión de partículas de neurotoxina estabilizada se mezcla o agita con una fase continua, en la que el disolvente polimérico es parcialmente miscible, para formar una emulsión. la fase continua normalmente es un disolvente acuoso. Los emulsionantes se incluyen con frecuencia en la fase continua para estabilizar la emulsión. El disolvente polimérico luego se evapora durante un período de varias horas o más, y así solidifica el polímero para formar una matriz polimérica que tiene una dispersión de las partículas de neurotoxina estabilizada contenida en él. Un procedimiento preferido para formar micropartículas de liberación controlada de neurotoxina desde una solución polimérica se describe en la patente estadounidense número 5.019.400. Este procedimiento de formación de microesferas, en comparación con otros procedimientos, como la separación de fases, además reduce la cantidad de neurotoxina necesaria para producir una composición de liberación controlada con un contenido de neurotoxina específico.

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En este procedimiento, la solución polimérica, que contiene la dispersión de partículas de neurotoxina estabilizada, se procesa para crear gotas, en las que al menos una parte significante de las gotas contiene solución polimérica y las partículas de neurotoxina estabilizada. Estas gotas después se congelan por medios adecuados para formar micropar15

ES 2 259 665 T3 tículas. Ejemplos de medios de procesamiento de la dispersión de la solución polimérica para formar gotas incluyen la dirección de la dispersión por una boquilla ultrasónica, boquilla a presión, chorro Rayleigh u otro medio conocido para crear gotas de una solución. 5

Los medios adecuados para congelar las gotas para formar micropartículas incluyen la dirección de las gotas a o cerca de gas licuado, como argón líquido y nitrógeno líquido para formar microgotas congeladas que se separan del gas líquido. Las microgotas congeladas luego se exponen a un no disolvente líquido, como etanol, o etanol mezclado con hexano o pentano.

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El disolvente en las microgotas congeladas se extrae como un sólido y/o líquido en el no disolvente para formar micropartículas que contienen neurotoxina estabilizada. La mezcla de etanol con otros no disolventes, como hexano o pentano, puede aumentar la velocidad de extracción del disolvente, por encima de la del etanol solo, a partir de ciertos polímeros, como polímeros poli(láctido-co-glicólido).

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Una amplia variedad de tamaños de micropartículas de liberación controlada de neurotoxina puede producirse mediante la variación del tamaño de las gotas, por ejemplo, cambiando el diámetro de la boquilla ultrasónica. Si se desean micropartículas muy grandes, las micropartículas pueden extrudirse a través de una jeringa directamente en el líquido frío. El aumento de la viscosidad de la solución polimérica también puede aumentar el tamaño de las micropartículas. El tamaño de las micropartículas puede producirse con este proceso, por ejemplo micropartículas desde más de aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 1 micrómetro de diámetro.

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Otro procedimiento adicional de formación de una composición de liberación controlada de neurotoxina, a partir de una solución polimérica incluye el vaciado de una película, por ejemplo en un molde, para formar una película o forma. Por ejemplo, después de poner la solución polimérica que contiene una dispersión de partículas de neurotoxina estabilizada en un molde, el disolvente de polímero luego se extrae por medios conocidos en la técnica, o la temperatura de la solución polimérica se reduce, hasta que se obtiene una película o forma, con un peso seco coherente. En el caso de un implante de polímero biodegradable, la liberación de neurotoxina por la degradación del polímero. La velocidad de degradación puede controlarse cambiando las propiedades poliméricas que influyen en la velocidad de hidratación del polímero. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, la relación de diferentes monómeros, como láctido y glicólido, que comprenden un polímero, el uso del L-isómero de un monómero en vez de una mezcla de racemato; y el peso molecular del polímero. Estas propiedades pueden afectar a la hidrofilidad y cristalinidad que controlan la velocidad de hidratación del polímero. Los excipientes hidrófilos como las sales, carbohidratos y tensioactivos también pueden incorporarse para aumentar la hidratación y pueden alterar la velocidad de erosión del polímero. Al alterar las propiedades de un polímero biodegradable, las contribuciones de la difusión y/o degradación del polímero a la liberación de neurotoxina pueden controlarse. Por ejemplo, al aumentar el contenido de glicólido de un polímero poli(láctido-co-glicólido) y reducir el peso molecular del polímero puede mejorar la hidrólisis del polímero y así se proporciona una liberación de neurotoxina aumentada por la erosión del polímero. Además, la velocidad de hidrólisis del polímero aumenta en pH no neutros. Por lo tanto, un excipiente ácido o básico puede agregarse a la solución de polímero y usarse para formar la microesfera, para alterar la velocidad de erosión del polímero.

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La composición de nuestra invención puede administrarse a un humano u otro animal, por cualquier medio no sistémico de administración, por ejemplo implantación (por ejemplo subcutánea, intramuscular, intracraneal, intravaginal e intradérmica), para proporcionar la dosis deseada de neurotoxina según los parámetros conocidos para el tratamiento con neurotoxina de varios problemas médicos. 50

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La dosis específica por implante que debe administrarse puede determinarla con facilidad una persona con conocimientos medios en la técnica según el factor antes descrito. La dosis puede depender también del tamaño de la masa de tejido que debe tratarse o desnervarse, y la preparación comercial de la toxina. Además, las estimaciones de dosis adecuadas en humanos pueden extrapolarse a partir de determinaciones de las cantidades de botulinum requeridas para una desnervación efectiva de otros tejidos. Así, la cantidad de botulinum A que debe inyectarse es proporcional a la masa y nivel de actividad del tejido que debe tratarse. Generalmente, entre 0,01 unidades por kilogramo a 35 unidades por kg de peso del paciente de una toxina botulínica, como toxina botulínica tipo A, pueden liberarse mediante el presente implante por unidad de período de tiempo (es decir, durante un período o una vez cada 2-4 meses) para lograr efectivamente una parálisis muscular deseada. Menos de aproximadamente 0,01 U/kg de una toxina botulínica no tienen un efecto terapéutico importante sobre un músculo, mientras que más de aproximadamente 35 U/kg de una toxina botulínica se aproxima a la dosis tóxica de una neurotoxina, como la toxina botulínica tipo A. La preparación y colocación cuidadosas del implante evitan que aparezcan sistémicamente cantidades importantes de toxina botulínica. Un intervalo de dosis más preferido está entre 0,01 U/kg y 25 U/kg de una toxina botulínica, como la formulada como BOTOX®. La cantidad real de U/kg de una toxina botulínica que debe administrarse depende de factores como la cantidad (masa) y nivel de actividad del tejido que debe tratarse y la vía de administración elegida. La toxina botulínica tipo A es un serotipo de toxina botulínica preferido para su uso en los procedimientos de la presente invención. 16

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La neurotoxina usada para ejercer un procedimiento dentro del alcance de la presente invención es una toxina botulínica, como una del serotipo de toxinas botulínicas A, B, C, D, E, F o G. Preferentemente, la toxina botulínica usada es toxina botulínica tipo A, por su alta potencia en humanos, disponibilidad inmediata, y uso que se sabe es seguro y eficaz para el tratamiento de trastornos musculares y de músculos lisos cuando se administra localizadamente por inyección intramuscular. Todos los serotipos de botulinum A, B, C, D, E, F y G pueden usarse ventajosamente en la práctica de la presente invención, aunque el tipo A es el serotipo más preferido, como se explicó antes. La práctica de la presente invención puede proporcionar un alivio efectivo durante desde 1 mes a aproximadamente 5 ó 6 años.

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La presente invención incluye dentro de su alcance: (a) complejo de neurotoxina así como neurotoxina pura obtenida o procesada por cultivo bacteriano, extracción de toxina, concentración, conservación, secado por congelación y/o reconstitución y (b) neurotoxina modificada o recombinante, es decir, neurotoxina de la que deliberadamente se han eliminado, modificado o reemplazado uno o más aminoácidos o secuencias de aminoácidos mediante procedimientos conocidos de modificación química/bioquímica de aminoácidos o mediante el uso de tecnologías conocidas de recombinación de célula hospedadora/vector recombinante, así como derivados o fragmentos de neurotoxinas así producidas, e incluye neurotoxinas con una o más porciones objetivo adheridas para un receptor celular superficial presente en una célula.

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Las toxinas botulínicas para uso según la presente invención pueden almacenarse en forma liofilizada o secada al vacío en contenedores bajo presión de vacío. Antes de la liofilización la toxina botulínica puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, estabilizadores y/o vehículos, como la albúmina. El material liofilizado o secado al vacío puede reconstituirse con sustancia salina o agua.

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Nuestra invención también incluye dentro de su alcance el uso de un complejo de neurotoxina implantado de liberación controlada para proporcionar alivio terapéutico de un trastorno crónico como un trastorno del movimiento. Así, la neurotoxina puede ser incrustada, envuelta o portada en una matriz polimérica adecuada que puede implantarse o incrustarse de forma subcutánea para proporcionar un año o más de liberación retardada y controlada de la neurotoxina al tejido objetivo deseado. Se conocen polímeros implantables que permiten la liberación controlada de fármacos polipéptidos, y pueden usarse para preparar un implante de toxina botulínica adecuado para insertarse o para colocarse de manera subcutánea. Véase, por ejemplo, Pain 1999; 82(1):49-55; Biomaterials 1994; 15(5):383-9; Brain Res 1990; 515(1-2):309-11 y las patentes estadounidenses con números 6.022.554, 6.011.011, 6.007.843, 5.667.808 y 5.980.945.

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Los procedimientos para determinar la vía de administración y dosis adecuadas los determina generalmente caso a caso el médico tratante. Dichas determinaciones son rutinarias para una persona con conocimientos medios en la técnica (véase, por ejemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine (1998); editado por Anthony Fauci y col., 14ª edición, publicado por McGraw Hill).

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Ejemplos Los ejemplos siguientes establecen composiciones y procedimientos específicos abarcados por la presente invención y no tienen la intención de limitar el alcance de nuestra invención.

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Ejemplo 1 Formación de Neurotoxina Estabilizada con Zinc++

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Cien unidades de neurotoxina, como Botox® no reconstituido, se disuelven en tampón de bicarbonato de sodio (pH 6,0) para formar una solución de neurotoxina. Se prepara una solución de Zn++ a partir de agua desionizada y acetato dihidrato de zinc y luego se agrega mediante agitación suave a la solución de neurotoxina para formar un complejo de neurotoxina con Zn++. El pH del complejo de neurotoxina con Zn++ luego se ajusta para que esté entre 6,5 y 6,9 agregando 1% de ácido acético. Un precipitado nuboso en suspensión, que comprende neurotoxina estabilizada con Zn++ insoluble, se forma de esta manera. Así se produce un complejo de neurotoxina (como toxina botulínica tipo A) estabilizado contra una acumulación importante en la incorporación posterior en una matriz de implante polimérica. Ejemplo 2 Gránulo de liberación controlada de neurotoxina

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Una neurotoxina adecuada para incorporar a un polímero o solución polimerizable puede ser toxina botulínica tipo A (como Botox®), que está disponible en el mercado en forma de polvo secado por congelación. Además, pueden mezclarse varios polímeros y copolímeros y almacenarse en estado seco sin efecto en el rendimiento del implante final. Por ejemplo, un copolímero de acrilato que usa un iniciador curado por UV. La neurotoxina puede formar un complejo con Zn++ como se establece en el Ejemplo 1 precedente. El complejo de neurotoxina estabilizado con Zn++ luego se mezcla con copolímero de acrilato no curado, iniciador UV y un ácido (pH entre 5,5 y 6,8). La mezcla se coloca en un vaso o molde de gránulo vacío de plástico lo que permite la penetración de la luz UV. El molde se coloca en un baño de agua de temperatura controlada que se mantiene a 20ºC. El gránulo se cura con luz UV durante 17

ES 2 259 665 T3 aproximadamente 50 segundos, se empaca y esteriliza. La duración e intensidad de la curación por UV son tales que una cantidad insignificante de neurotoxina se rompe o desnaturaliza. 5

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El tamaño del gránulo y la concentración de la cantidad de neurotoxina dentro del gránulo se definen según la aplicación deseada. Cuando se implanta un gránulo, el gránulo se hidrata dentro del cuerpo, lo que retarda ligeramente la estallido inicial de la neurotoxina desde el interior del implante. El recubrimiento externo del gránulo con una porción de la concentración de estallido inicial deseada de neurotoxina puede compensar este retardo. En este ejemplo la efectividad del gránulo sería de aproximadamente 4 a 6 meses. Ejemplo 3 Formulaciones de liberación controlada de neurotoxina

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Para aumentar la cantidad de tiempo que el gránulo puede suministrar efectivamente la neurotoxina, pueden usarse múltiples capas de materiales. Así, el material más interno puede estar hecho de un copolímero de polivinilpirrolidona/metilmetacrilato. Este material permite sostener una alta concentración de complejo de neurotoxina. Una cantidad adecuada de neurotoxina forma un complejo con Zn++ como se establece en el Ejemplo 1 precedente y este complejo luego se mezcla con copolímero no curado, iniciador a baja temperatura y un ácido (pH entre 5,5 y 6,8). La mezcla se coloca en un vaso o molde de gránulo de plástico. El molde se coloca en un baño de agua de temperatura controlada a aproximadamente 35 grados C durante entre 6 horas y 8 horas. Esto forma el depósito de neurotoxina requerido para una liberación prolongada y controlada. Para prolongar la liberación de la neurotoxina, se cura luego un segundo material alrededor del gránulo inicial. Este material se elige para que tenga una alta densidad molecular y biocompatibilidad. El polimetilmetacrilato (PMMA) es un ejemplo de un material con esta característica. El gránulo (arriba) se coloca en un molde (moldeo por inserción) con un iniciador no curado PMMA/de baja temperatura. Un recubrimiento secundario del PMMA no curado puede ser necesario para asegurar un recubrimiento uniforme del gránulo. Preferentemente, el grosor del PMMA es 0,5 mm. Después de la formación, el exterior del gránulo se recubre con la concentración deseada de neurotoxina para la estallido inicial. La capa de PMMA será suficientemente gruesa para permitir un retardo (de hasta 3 meses) de la neurotoxina en el depósito. Cuando la neurotoxina alcanza la superficie del implante, se obtiene una segunda gran estallido de neurotoxina. Esta estallido secundaria luego será seguida de una velocidad de liberación de la neurotoxina que se reducirá lentamente durante aproximadamente 3 meses. En este ejemplo la efectividad del gránulo es de 7 a 9 meses. Ejemplo 4 Implante de liberación controlada de neurotoxina de múltiples capas

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Al usar múltiples capas (polímero de alta densidad/polímero de baja densidad con neurotoxina) la extensión temporal de la liberación controlada de neurotoxina puede aumentarse, pero el tamaño del implante también puede aumentar. A medida que aumenta el tamaño del implante, la neurotoxina se dispersa en un área mayor dentro del cuerpo, lo que puede reducir la efectividad del implante. Para evitar esto, el implante se encapsula con un material impermeable como el titanio. Se mantiene una pequeña abertura para permitir la liberación en un punto de neurotoxina a través del gránulo encapsulado. Esto efectivamente puede permitir en general que el implante tenga características de liberación muy diferentes. Esencialmente esto puede también permitir que la sección del polímero que la neurotoxina debe atravesar sea más gruesa, y así aumenta efectivamente la duración de la liberación de neurotoxina. El material interno puede estar hecho de un material como copolímero de polivinilpirrolidona/ metilmetacrilato. Este material permite sostener una alta concentración de complejo de neurotoxina. La neurotoxina forma un complejo con Zn++. El complejo luego se mezcla con copolímero no curado, iniciador a baja temperatura y un ácido (pH entre 5,5 y 6,8). La mezcla se coloca en un vaso o molde de gránulo de plástico. El molde se coloca en un baño de agua de temperatura controlada a 35 grados C durante entre 6 horas y 8 horas aproximadamente. Esto forma el depósito de neurotoxina requerido para una liberación prolongada y controlada. Para prolongar la liberación de la neurotoxina, se cura luego un segundo material alrededor del gránulo inicial. El gránulo (arriba) se coloca en un molde (moldeo por inserción) con un iniciador no curado PMMA/de baja temperatura. Un recubrimiento secundario del PMMA no curado puede ser necesario para asegurar un recubrimiento uniforme del gránulo. Idealmente el grosor del PMMA es de 0,5 mm. Para formar múltiples capas, se aplica la misma técnica de moldeo por inserción antes descrita.

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Cuando la última capa de polímero de alta densidad debe aplicarse, se usa un gránulo de titanio como molde. El gránulo se coloca dentro del gránulo de titanio con PPMA no curado. La tapa del gránulo se asegura y el gránulo se coloca en un horno de aire forzado a aproximadamente 35 grados C durante aproximadamente 6 y 8 horas. La tapa del gránulo tiene una abertura 22 para permitir la liberación de neurotoxina. En este ejemplo la efectividad del gránulo puede ser de entre 10 y 24 meses.

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ES 2 259 665 T3 Ejemplo 5 Implante de neurotoxina con columna en capas 5

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Para sustentar la liberación durante períodos prolongados de tiempo, un enfoque alternativo es colocar una capa del polímero de alta densidad/polímero de baja densidad con neurotoxina dentro del gránulo de titanio antes descrito. La curación puede realizarse en un horno de aire forzado a aproximadamente 35 grados C durante entre 6 horas y 8 horas para cada capa aplicada. El diámetro del gránulo sería un factor determinante clave en la cantidad de neurotoxina aplicada. La cantidad de capas puede determinar cuánto tiempo el implante mantendrá la efectividad. Para cada capa el grosor de la capa de PMMA puede ser de aproximadamente 0,5 mm y el polímero de baja densidad con neurotoxina puede ser de aproximadamente 0,3 mm. Para cada capa agregada, se obtiene un aumento aproximado de 3 meses en la efectividad. Un implante de una vida de 2 años puede hacerse aumentando el largo del implante a aproximadamente 6,4 mm más el tamaño de la sección transversal del recubrimiento de titanio de aproximadamente 1 mm a un total de 7,4 mm.

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Las composiciones y procedimientos según la invención desvelada en el presente documento presentan muchas ventajas, entre ellas las siguientes: 20

1. Un implante único puede usarse para proporcionar una administración continua o pulsátil terapéuticamente efectiva de una neurotoxina durante un período de un año o mayor. 2. La neurotoxina se suministra a un área de tejido localizada sin que aparezca una cantidad importante de neurotoxina sistémicamente.

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3. Reducción en la necesidad de atención posterior al paciente. 4. Reducción en la necesidad de inyecciones periódicas de neurotoxina para tratar una dolencia, como un trastorno neuromuscular.

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5. Aumento en la comodidad del paciente debido a la cantidad reducida de inyecciones requerida. 6. Mejora en el cumplimiento terapéutico por parte del paciente.

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Una ventaja de nuestras formulaciones de liberación controlada de neurotoxinas incluye niveles terapéuticos a largo plazo de neurotoxina en el tejido objetivo. Las ventajas también incluyen un cumplimiento y aceptación mayores de los pacientes mediante la reducción de la cantidad necesaria de inyecciones. Todas las referencias, artículos, publicaciones y patentes y solicitudes de patentes citadas en el presente documento se incorporan íntegramente por referencia.

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Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con respecto a ciertos procedimientos preferidos, otras realizaciones, versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención son posibles. Por ejemplo, una amplia variedad de neurotoxinas puede usarse efectivamente en los procedimientos de la presente invención. Además, la presente invención incluye procedimientos de administración localizada (es decir, intramuscular, intraglandular, subcutánea e intracraneal) en los que dos o más neurotoxinas, como dos o más toxinas botulínicas, se administran concurrente o consecutivamente por medio de un implante. Por ejemplo, la toxina botulínica tipo A puede administrarse por medio del implante hasta la pérdida de una respuesta clínica o el desarrollo de anticuerpos neutralizantes, seguido de una administración por medio de un implante de una toxina botulínica tipo B o E. Alternativamente, una combinación de cualesquiera dos o más de los serotipos de botulinum A-G pueden administrarse localizadamente para controlar la aparición y duración de un resultado terapéutico deseado. Asimismo, los compuestos que no son de neurotoxinas pueden administrarse antes o concurrentemente con o de manera subsiguiente a la administración de neurotoxina por medio del implante para proporcionar un efecto adjunto, como una aparición mejorada o más rápida de la desnervación antes de que la neurotoxina, como una toxina botulínica, comience a ejercer su efecto terapéutico. Nuestra invención también incluye en su alcance el uso de una neurotoxina, como una toxina botulínica, en la preparación de un medicamento, como un implante de liberación controlada, para el tratamiento de un trastorno del movimiento, y/o un trastorno influido por la inervación colinérgica, mediante administración localizada por medio del implante de neurotoxina.

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ES 2 259 665 T3 REIVINDICACIONES 1. Un sistema de liberación controlada, que comprende: 5

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(a) una matriz polimérica; y (b) una cantidad de toxina botulínica colocada dentro de la matriz polimérica, en la que cantidades mínimas de la toxina botulínica pueden liberarse desde la matriz polimérica durante un período de tiempo prolongado sin una respuesta significativa del sistema inmune. 2. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la toxina botulínica se libera desde una matriz polimérica de una manera sustancialmente continua o monofásica.

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3. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que el período de tiempo prolongado durante el cual la toxina botulínica se libera desde la matriz polimérica se extiende durante un tiempo de entre 10 días y 6 años. 4. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la matriz polimérica está compuesta de una sustancia que es sustancialmente no biodegradable.

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5. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la toxina botulínica es una toxina botulínica seleccionada del grupo que consiste en toxinas botulínicas de tipos A, B, C, D, E, F y G. 6. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la toxina botulínica es una toxina botulínica tipo A. 7. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que el polímero que comprende la matriz polimérica se selecciona del grupo que consiste en metacrilato, vinilpirrolidona, alcohol vinílico, ácido acrílico, polimetilmetacrilato, siloxano, acetato de vinilo, ácido láctico, ácido glicólico, colágeno y sus polímeros y copolímeros biocerámicos. 8. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la cantidad de toxina botulínica es de entre 1 unidad y 50.000 unidades de una toxina botulínica.

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9. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la cantidad de toxina botulínica está entre 10 unidades y 2.000 unidades de una toxina botulínica tipo A. 10. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la cantidad de toxina botulínica es de entre 100 unidades y 30.000 unidades de una toxina botulínica tipo B.

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11. El sistema de liberación controlada de la reivindicación 1, en el que la toxina botulínica se libera en una cantidad efectiva para provocar una parálisis flácida muscular de un músculo o grupo de músculos en o cerca del sistema implantado. 12. Un sistema de liberación controlada, que comprende: (a) una matriz polimérica, y

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(b) entre 10 unidades y 20.000 unidades de una toxina botulínica dentro de la matriz polimérica, en la que cantidades mínimas de la toxina botulínica pueden liberarse desde la matriz polimérica durante un período de tiempo prolongado que se extiende entre 2 meses y 5 años sin una respuesta significativa del sistema inmune. 13. Un procedimiento para producir un sistema de liberación controlada, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: (a) disolver un polímero en un disolvente para formar una solución polimérica;

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(b) mezclar o dispersar una toxina botulínica en la solución polimérica para formar una mezcla de polímerotoxina botulínica, y (c) permitir que la mezcla de polímero-toxina botulínica se asiente o cure, produciendo así un sistema de liberación controlada del que pueden liberarse cantidades mínimas de la toxina botulínica durante un período de tiempo prolongado sin una respuesta significativa del sistema inmune.

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14. El procedimiento de la reivindicación 13, que además comprende la etapa, después de la etapa de mezcla, de evaporar el disolvente.

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ES 2 259 665 T3 15. El uso de un sistema de liberación continua que incluye una matriz polimérica y una toxina botulínica según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno del movimiento sin una respuesta significativa del sistema inmune. 5

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