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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 252 263

51 Int. Cl. : A61K 35/76

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C12N 7/00 C12N 15/86 A61P 31/04 A61K 48/00

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 01955955 .8

86 Fecha de presentación : 25.07.2001

87 Número de publicación de la solicitud: 1305038

87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.05.2003

54 Título: Bacteriófago que tiene una gama de hospedadores múltiple.

30 Prioridad: 25.07.2000 US 220987 P

73 Titular/es: THE GOVERNMENT OF THE UNITED

STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES The National Institute of Health Office of Technology Transfer 6011 Executive Boulevard, Suite 325 Rockville, Maryland 20852, US 45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.05.2006

72 Inventor/es: Merril, Carl, R.;

Adhya, Sankar y Scholl, Deal

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Arias Sanz, Juan

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16.05.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 252 263 T3 DESCRIPCIÓN Bacteriófago que tiene una gama de hospedadores múltiple. 5

Campo de la invención La presente invención describe composiciones farmacéuticas y usos de las mismas para la preparación de un medicamento para la profilaxis y tratamiento de infecciones bacterianas que implican el uso de un bacteriófago que tiene una gama múltiple de hospedadores basada en múltiples proteínas hidrolíticas de la cola diferentes.

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Campo de la invención

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Los polisacáridos capsulares de Escherichia coli (antígenos K) se han asociado a menudo con el incremento de la virulencia (17). El antígeno K1 en particular, incrementa la invasividad de E. coli y estas cepas a menudo están implicadas en casos de meningitis y septicemia (32). Estas cubiertas de polisacáridos también actúan como sitios de reconocimiento para bacteriófagos, que frecuentemente llevan espículas en la cola con actividad de despolimerización de polisacáridos. Se han descrito varios fagos específicos de K1 (10), uno de los cuales, ΦK1E, se encontró que posee N-acetilneuraminidasa (endosialidasa) como parte de la proteína de las fibras de la cola (37). Esta enzima cataliza la escisión de un polímero de carbohidrato de ácido N-acetilneuramínico con enlaces α-2, 8 de la cápsula K1. Se ha sugerido que la proteína de las fibras de la cola está implicada tanto en la adsorción a la superficie de la célula como en la penetración en la célula por degradación enzimática de la cápsula polisacárida. Se ha clonado y secuenciado el gen de la endosialidasa de ΦK1E (20). Un gen similar se ha clonado y secuenciado a partir de ΦK1F (29). ΦK5 es un bacteriófago relacionado específico de las cepas de E. coli que muestra el antígeno K5, un polímero compuesto de una estructura repetitiva de a-N-acetilglucosamina y ácido β-glucurónico (N-acetil heparina) con enlaces en posición 4. En este caso, ΦK5 codifica una proteína liasa específica de K5 asociada a la cola que también es responsable de la unión a la superficie de la célula y de la degradación de la cápsula de polisacárido K5 (12, 14). Se han encontrado fagos que son específicos de otros antígenos polisacáridos de E. coli que incluyen K3, K7, K12, K13 y K20 (26,27); todos poseen probablemente actividades de despolimerización de polisacáridos específicos como parte de la partícula de fago. Tanto ΦK5 como ΦK1E tienen un promotor semejante al del fago SP6 de Salmonella por delante de sus proteínas de la cola, así como una región de similitud de secuencia, que está justo después del gen de la liasa de ΦK5 y justo antes del gen de endosialidasa de ΦK1E (6). También son muy similares las secuencias antes de los promotores de los genes de la cola en ΦK1E y ΦK5. ΦK5, ΦK1E y SP6 comparten una morfología y ciclo vital comunes, lo que sugiere que pueden estar estrechamente relacionados. Los antibióticos reemplazaron al uso potencial de bacteriófagos en el tratamiento de infecciones. El amplio uso de antibióticos ha dado lugar a patógenos bacterianos resistentes a antibióticos. De este modo, los investigadores han vuelto a evaluar la terapia y profilaxis con bacteriófagos. Sin embargo, un obstáculo importante que surge frecuentemente con el uso de bacteriófagos es su gama de hospedadores excesivamente limitada. Es necesario en terapia y profilaxis usar bacteriófagos que tengan una gama múltiple de hospedadores. Resumen de la invención

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Se ha aislado un bacteriófago virulento de ADN de cadena doble, ΦK1-5, y se ha encontrado que es capaz de infectar cepas de E. coli que poseen la cápsula polisacárida K1 o K5. Las fotografías de microscopia electrónica muestran que los viriones constan de una pequeña cabeza icosaédrica con espículas cortas en la cola, semejante a los miembros de la familia Podoviridae. El análisis de la secuencia de ADN de la región que codifica la proteína de las fibras de la cola mostró dos marcos de lectura abiertos que codifican proteínas hidrolíticas de las fibras de la cola del fago previamente caracterizadas. El primero es el gen de la proteína K5 liasa de ΦK5, que permite a este fago infectar específicamente cepas K5 de E. coli. Un segundo marco de lectura abierto codifica una proteína casi idéntica en su secuencia de aminoácidos a la proteína N-acetilneuraminidasa (endosialidasa) de ΦK1E, que permite a este fago infectar específicamente cepas K1 de E. coli. Proporcionamos evidencia experimental de que las partículas del fago maduras contienen ambas proteínas de las fibras de la cola y el análisis de mutaciones indica que cada proteína puede inactivarse independientemente. Una comparación de las regiones de los genes de la cola de ΦK5, ΦK1E, y ΦK1-5 muestra que los genes están ordenados en una configuración modular o en casete. La demostración de que un fago puede contener múltiples proteínas de la cola que amplían su gama de hospedadores es útil en la generación de fagos con propiedades antibacterianas de amplio espectro para terapia y profilaxis de infecciones bacterianas.

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Breve descripción de los dibujos

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Figura 1. Fotografía de microscopia electrónica de ΦK1-5 teñido negativamente con ácido fosfotúngstico a una ampliación de X115.500. Morfológicamente este fago puede clasificarse en la familia Podoviridae que incluye a T7 y SP6. Figura 2. Comparación de las regiones codificadoras de las proteínas de la cola de ΦK1-5, ΦK5, y ΦK1E. Los tres fagos comparten similitud de secuencia en la región anterior al extremo 5’ (que contiene un promotor SP6), así como 2

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una región intergénica de 85 bases. Inmediatamente después del promotor, ΦK1-5 y ΦK5 codifican una proteína liasa y ΦK1E codifica ORFL . Inmediatamente a continuación de los codones de terminación de las liasas o de ORFL está la región intergénica que contiene una posible estructura en forma de horquilla, la primera de las cuales podría ser un terminador de la transcripción independiente de Rho. Inmediatamente a continuación de esto, ΦK1-5 y ΦK1E codifican una endosialidasa donde ΦK5 codifica ORFP . Ninguno de los tres fagos tiene regiones codificadoras después del extremo 3’ y en los tres casos, la molécula de ADN termina aquí. No existe similitud de secuencia en esta región terminal. Figura 3. Dos posibles modelos para el ordenamiento de las proteínas de la cola de la cápside del fago. (a) Hay tres copias de cada cola formando un hexámero. (b) Hay seis copias de cada cola. Una está unida a la cabeza y es parte del “núcleo” de la cola. La otra se une a continuación a la primera proteína de la cola, haciendo en realidad una fibra de la cola más larga con dos actividades enzimáticas diferentes. Figura 4. Comparación de las regiones codificadoras de las proteínas de la cola de ΦK1-5, ΦK5, ΦK1E y SP6.

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Breve descripción de las secuencias La ID SEC Nº 1 es la secuencia de ADN de la región del gen de la cola de ΦK1-5. La ID SEC Nº 2 es la secuencia de ADN del gen de la cola de ΦSP6.

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La ID SEC Nº 3 es la secuencia de ADN transcrita de ΦK1-5. La ID SEC Nº 4 es la secuencia de ADN complementaria de ΦK1-5.

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Breve descripción de los depósitos biológicos ΦK1-5 se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 201102209, EE.UU., con el Nº de Acceso de ATCC PTA-3495 el 2 de julio de 2001. Este depósito se hizo bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y sujeto a las Regulaciones de éste (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. La ATCC pondrá a disposición el depósito bajo los términos del Tratado de Budapest y sujeto a un acuerdo entre el solicitante y la ATCC que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente de EE.UU. pertinente o tras la exposición al público de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a quien determine el Comisario de Patentes y Marcas de EE.UU. que tiene derecho a ello, según el título 35 del USC § 122 y las normas del Comisario (incluyendo el título 37 del CFR § 1.14). La disponibilidad de la cepa depositada no se interpreta como una licencia para poner en práctica la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

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Descripción detallada de la realización preferida

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Hemos descubierto que es posible expresar más de una proteína de la cola específica de hospedador en una única cepa de virus bacteriano y que la expresión de estas proteínas de la cola permite al virus infectar múltiples hospedadores específicos. Este descubrimiento facilita la manipulación genética de fagos con gamas de hospedadores ampliadas. Por ejemplo, hay fagos que pueden infectar cepas de E. coli que contienen el polisacárido K1 en su cápsula externa. Estas cepas bacterianas de E. coli a menudo están implicadas en la meningitis y en la septicemia, ya que el polisacárido K1 aumenta la invasividad de la bacteria (32). Un fago (ΦK1E) posee una proteína de la cola con actividad endosialidasa que puede infectar cepas de E. coli que contienen el polisacárido K1. Esta endosialidasa permite al fago ΦK1E atacar y degradar específicamente el polisacárido K1 (37). De forma similar, el fago ΦK5 puede infectar las cepas K5 de E. coli. Las cepas K5 de E. coli son frecuentemente causa de infecciones del tracto urinario (11). El fago ΦK5 contiene una proteína de la cola con actividad liasa que permite a este fago atacar la cápsula K5 bacteriana (12, 14). Hemos demostrado que es posible que un fago tenga las dos proteínas de la cola, la K1 endosialidasa y la K5 liasa. Este fago, que hemos denominado fago ΦK1-5, tiene una gama ampliada de hospedadores, ya que puede infectar tanto E. coli K1 como E. coli K5. Hemos demostrado que esta capacidad de gama ampliada de hospedadores se debe a la capacidad de este fago ΦK1-5 para exponer ambas proteínas de la cola, una K1 endosialidasa, así como una K5 liasa. Hemos demostrado a través del análisis de secuencia de los genes de las proteínas de la cola del fago ΦK1-5 que éstos están ordenados en una estructura modular o en casete, lo que indica que la gama de hospedadores de los fagos puede ampliarse a otros antígenos K, e incluso a otras especies de bacterias mediante técnicas de recombinación. La demostración de que un fago puede contener múltiples proteínas de la cola que amplíen su gama de hospedadores se prevé que sea útil en la generación de fagos con propiedades antibacterianas de amplio espectro para la terapia y profilaxis de infecciones infecciosas. Recientemente ha habido un interés renovado en el uso de fagos para tratar y prevenir infecciones bacterianas (para una revisión, véase Barrow y Soothill, 1997, Trends Microbiol. 5 (7), 268271). ΦK1-5 es muy lítico, no lisogénico, muy estable y mata a las bacterias rápidamente, aspectos todos que hacen de él un buen candidato para la terapia con fagos. El fago ΦK1-5 tiene una ventaja adicional porque reconoce y se une a la misma estructura (o estructuras) que confieren virulencia a la bacteria. Además, las bacterias que se hacen resistentes al fago han perdido generalmente la cápsula polisacárida y ya no son virulentas. Dado estos hallazgos, se prevé que se use el fago ΦK1-5 como plataforma general para aplicaciones terapéuticas y profilácticas en la que se alterará la 3

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especificidad del hospedador mediante manipulación de los genes de las proteínas de la cola. También se prevé que la capacidad para manipular la expresión de las proteínas de la cola proporcione al fago la capacidad de transferir genes a organismos que no son normalmente infectados por el fago. Este objetivo se consigue mediante la expresión de una proteína de un virus de mamífero en la cola del fago para permitir al fago transferir su material genético dentro de la célula de mamífero. Los fagos con esta capacidad se usarán en aplicaciones de terapia génica. Con respecto a la Figura 1, ΦK1-5 es un bacteriófago aislado que consta de una cabeza icosaédrica con un pequeño penacho de fibras cortas de la cola que es capaz de infectar y replicarse en cepas K1 o K5 de E. coli. Parece que su capacidad para replicarse en estas cepas se debe al hecho de que codifica dos proteínas de las fibras de la cola hidrolíticas diferentes. Una es una proteína endosialidasa, casi idéntica a la proteína similar de ΦK1E, que le permite unirse y degradar la cápsula de polisacárido K1. La otra es casi idéntica a la proteína liasa que se ha demostrado que permite a ΦK5 unirse y degradar la cápsula de polisacárido K5. Este es el primer ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador doble basada en tener dos proteínas de la cola diferentes. Con respecto a la Figura 2, estos tres fagos comparten similitud de secuencia por delante de la región que codifica las proteínas de la cola y todos tienen un promotor semejante al de ΦSP6 que probablemente dirige la transcripción del gen (o genes) de la cola. En ΦK1-5 y ΦK5, el primer gen después de este promotor es la proteína K5 liasa. ΦK1E no codifica esta proteína y en su lugar tiene un ORF de 111 aminoácidos (ORFL ) de función desconocida. Inmediatamente después de las proteínas K5 liasas de ΦK1-5 y ΦK5, y después del ORFL en ΦK1E hay una región de 85 bases de similitud entre los tres fagos. Esta región contiene dos elementos simétricos potentes que pueden estar implicados en la terminación de la transcripción. Aún más delante, los fagos ΦK1-5 y ΦK1E codifican el gen de endosialidasa. ΦK5 no codifica este gen, sino que en su lugar codifica el ORFP de 523 aminoácidos. ΦK1-5 es un bacteriófago que se aisló de aguas residuales usando una cepa K5 de E. coli como hospedador. Analizando la gama de hospedadores de ΦK1-5, encontramos que se puede replicar en las cepas K1 o K5. El análisis de la secuencia de ADN de los genes de las fibras de la cola reveló que codifica tanto una proteína K5 liasa similar a la de ΦK5, como una proteína endosialidasa similar a la de ΦK1E. El ordenamiento de estos genes indica que la gama de hospedadores del fago puede ampliarse o modificarse mediante la adquisición de nuevos genes de la cola por recombinación natural o tecnológicamente en el laboratorio. ΦK5 también es capaz de replicarse en las cepas K95 de E. coli (28). Puesto que ORFP está en una posición análoga a la de la endosialidasa de ΦK1-5, también se prevé como una proteína de la cola responsable del crecimiento en cepas K95. Otro fago específico del antígeno K, ΦK20, también es capaz de lisar dos tipos diferentes de hospedadores E. coli, los que poseen el antígeno K5 y los que poseen el polisacárido K20 (26). Prevemos que ΦK20 lleve una proteína K5 liasa similar a la proteína de ΦK5/ΦK1-5 junto con una proteína hidrolítica de la cola específica de K20. También se han aislado fagos que son específicos de los antígenos capsulares K3, K7, K12 y K13 de E. coli. Presumiblemente, estos fagos tienen las correspondientes proteínas hidrolíticas de la cola específicas de K. Prevemos otros fagos que tengan múltiples especificidades con otras combinaciones de antígenos K. La gama de hospedadores de un bacteriófago se amplía más allá de E. coli expresando los genes que codifican las múltiples proteínas de la cola diferentes, siendo una restricción el conocimiento del mecanismo por el cual la proteína de la cola se une a la estructura de la cápside de un fago. Se cree que el extremo N-terminal de la proteína de la cola de T7 está implicado en la unión (29). Ni la endosialidasa ni la K5 liasa tienen esta región o cualquier otra región similar a cualquier otra proteína de la cola (o similar entre ellas). Morfológicamente, ΦK1E, ΦK5 y ΦK1-5 son similares al fago P22 de Salmonella. La proteína de la cola de P22 se ha estudiado ampliamente y es también una proteína hidrolítica implicada en la degradación del antígeno O de Salmonella typhimurium. Esta proteína es un homotrímero con seis copias por fago (30). La fibra de la cola gp17 de T7 también es un trímero con 6 copias del trímero por partícula de fago (33). La endosialidasa de ΦK1E también es un trímero (20), pero aún tiene que demostrarse que hay 6 copias del trímero por partícula de fago. El bacteriófago 63D recién caracterizado es otro fago que contiene sialidasa en el que se ha demostrado mediante microscopía electrónica que la sialidasa está presente con 6 copias por partícula (21). Este fago es muy diferente morfológicamente de ΦK1E, ΦK5, y ΦK1-5 y tiene una cola larga similar a la del bacteriófago lambda, con la sialidasa localizada en el extremo de la cola. Seis copias de una proteína de la cola trimérica parecen ser un motivo estructural general. Asumiendo que la endosialidasa y la K5 liasa están también ordenadas en seis copias por virión, es interesante especular cómo se ordenan las dos proteínas de la cola en la estructura de la cabeza de ΦK1E. Pueden ordenarse de forma alterna, con tres copias de cada una (Figura 3a). En el caso de P22, hay evidencias de que sólo son necesarias tres copias de la cola para la infección (16), lo que sugiere que este modelo es teóricamente posible. El hecho de que no haya similitudes de secuencia comunes entre las dos proteínas de la cola contradice este modelo, ya que se podría predecir un motivo común dentro de las proteínas de la cola que se necesitan para unirse a regiones similares de la estructura de la cabeza. Un modelo alternativo es que puede haber 6 copias de cada proteína de la cola, unidas una a la otra (Figura 3b). Puesto que se cree que el extremo N-terminal de la proteína de la cola de T7 se cree que está implicado en la unión de la proteína de la cola a la estructura de la cabeza, esta región de la proteína y regiones similares de otras proteínas de la cola (o regiones alternativas de proteínas de la cola que median en la unión de la una a la otra), se prevé que tengan una función de unión, de este modo, el conocimiento del mecanismo ya no constituye una restricción. Nuestros hallazgos indican que los fagos ΦK5, ΦK1E y ΦK1-5 también comparten una región de similitud de secuencia antes del extremo 5’ de las proteínas de la cola. Esta región contiene un promotor del fago SP6 de Salmonella. La secuencia de ADN que rodea al promotor descrita en Nam y col., Gene 1986,46: 57 coincide con la secuencia 4

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análoga en ΦK1-5. Según esta información, diseñamos un cebador a partir de esta región para secuenciar después de la región análoga en el fago ΦSP6. En la secuenciación de ADN se identificó un marco de lectura abierto que tiene un alto grado de similitud de aminoácidos con la proteína de la cola del fago P22. ΦP22 es un fago de Salmonella bien caracterizado que tiene una morfología similar a la de ΦSP6, pero que tiene un ciclo vital muy diferente. (ΦP22 es un fago lambda de E. coli de tipo lisogénico y ΦSP6 es de T7 de tipo lítico, o los tres fagos del antígeno K). La proteína de la cola de P22 también tiene actividad de degradación de polisacáridos. Inmediatamente después del gen de la cola de SP6 hay una región intergénica de 85 pares de bases común para ΦK5, ΦK1E y ΦK1-5 y poco después el final de la molécula de ADN. La Figura 4 compara las regiones que codifican las proteínas de la cola en los cuatro fagos. La proteína de la cola de SP6 está en la posición análoga a la proteína liasa de ΦK1-5 y ΦK5, y ORFL de ΦK1E. ΦSP6 comparte la estructura en casete de los tres fagos K, lo que indica que los cuatro están estrechamente relacionados y difieren principalmente en las proteínas de la cola. Prevemos la sustitución de la proteína liasa de ΦK1-5 por la cola de SP6 para crear un fago que pueda atacar Salmonella y E. coli K1. Debería ser fácil construirlo mediante recombinación homóloga con la secuencia común antes de las proteínas de cola y la secuencia de 85 bases común entre las dos proteínas de la cola. Una alternativa es crear un fago que pueda atacar Salmonella, E. coli K2 y E. coli K5 diseñando una construcción para codificar las tres proteínas. En el caso de ΦK1-5, tenemos evidencias de que se desarrolla una amplia gama de hospedadores mediante la adquisición de una segunda proteína de la cola específica. De este modo, prevemos incrementar la gama de hospedadores bajo la teoría de la evolución modular, en la que duplicaciones y reordenamientos de las regiones dentro de los genes de las fibras de la cola de diferentes fagos parecen mediar en los cambios de la especificidad de hospedador, incluso además diseñar la adquisición de una tercera proteína de la cola específica, una cuarta proteína de la cola específica y múltiples proteínas de la cola específicas. Definiciones

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El término “aislado” requiere que un material se retire de su entorno original (por ejemplo, del entorno natural si aparecen de forma natural). Por ejemplo, un fago natural presente en un sistema natural no está aislado, pero el mismo fago, separado de algunos o de todos los materiales con los que coexiste en el sistema natural, está aislado. El término “purificado” no requiere pureza absoluta; antes bien se pretende que sea una definición relativa con respecto a la pureza del material en su estado natural. Se contempla expresamente la purificación de material natural en al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes de magnitud, y más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud. El término “enriquecido” significa que la concentración del material es al menos aproximadamente 2, 5, 10, 100 ó 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), de forma ventajosa, 0,01% en peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de aproximadamente el 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% en peso. Especificidad de hospedador múltiple en función de las múltiples proteínas de la cola de hospedadores diferentes

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La terapia con fagos aprovecha la capacidad del fago para lisar bacterias. Con el incremento de la incidencia de bacterias resistentes a antibióticos, existe la necesidad de contrarrestarlas. La presente invención afronta esa necesidad superando la desventaja adicional con frecuencia provocada por el uso de fagos, que es su gama de hospedadores excesivamente limitada. Un bacteriófago prototipo tiene una cabeza y una cola. La cabeza es un icosaedro. La cola tiene un agujero central. El aparato completo funciona como una jeringa para la inyección del ADN del fago en el interior de una célula bacteriana. El ciclo vital consiste en la expresión de los genes virales, el ensamblaje de los viriones y la lisis celular que libera las partículas infecciosas al medio. De esta manera, el bacteriófago mata al patógeno hospedador. Una forma de evadir una respuesta anticorpal del hospedador es recubrir la propia bacteria con una cápsula. Una cápsula es una red de polímeros que está compuesta normalmente de polisacáridos, pero puede estar compuesta de proteínas o mezclas de proteína-carbohidrato, y que se asemeja a los polímeros del tejido del hospedador. En E. coli, actualmente la Organización Mundial de la Salud reconoce aproximadamente 70 polisacáridos o antígenos de proteína K diferentes. El bacteriófago tiene una proteína de la cola que se une a la estructura superficial de una bacteria, mediante la cual el genoma viral entra en la célula infectada. Algunos bacteriófagos poseen una proteína de la cola que tiene actividad enzimática que degrada la cápsula. Estas enzimas facilitan la penetración de la cápsula de la pared celular por el bacteriófago. En el bacteriófago específico de K1, la proteína de la cola es una neuraminidasa. En el bacteriófago específico de K5, la proteína de la cola es una liasa. En otros bacteriófagos específicos de K, la proteína de la cola es otra proteína hidrolítica. La clasificación filogenética indica que las bacterias gram negativas forman un grupo de bacterias. Escherichia, Shigella, Enterobacter y Salmonella son géneros de bacterias que están estrechamente relacionados los unos con los otros. Yersinia y Vibrio son los siguientes géneros más estrechamente relacionados con el grupo de E. coli. Serratia y Klebsiella son los géneros siguientes más estrechamente relacionados con el grupo de E. coli. Campylobacter es también un género del filum Proteobacteria. Los géneros Legionella, Pseudomonas y Neisseria están menos relacionados. Se desconoce la relación con Bordetella. Helicobacter es el género menos relacionado con el grupo de E. coli de bacterias gram negativas. Las bacterias gram positivas forman otro grupo, siendo Listeria la más relacionada con 5

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los cocos gram positivos Staphylococcus y Streptococcus, Enterococcus y Clostridium, que con otros bacilos gram positivos. Corynebacterium es la más estrechamente relacionada con Mycobacterium. Las espiroquetas Treponema y Borrelia forman un tercer grupo filogenético, mientras que Chlamydia está menos relacionada con este grupo. A pesar de la diversidad genética representada por las bacterias patogénicas, se han desarrollado estrategias similares en tipos muy diferentes de bacterias para superar la defensa de hospedadores. Nosotros contemplamos el uso de nuestra invención frente, pero sin limitaciones, a las siguientes bacterias patogénicas que se presentan en la siguiente tabla. Patógeno

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Escherichia Shigella

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Salmonella Enterobacter Yersinia

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Vibrio Legionella

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Enfermedad Colitis hemorrágica; Trombocitopenia, síndrome urémico hemolítico

+, ATCC

Disentería

+, ATCC

Tifus

+, ATCC

Infecciones del tracto urinario

+, ATCC

Plaga

+, ATCC

Cólera, diarrea aguda, rápida deshidratación

+, ATCC

Enfermedad del legionario: malestar general, mialgia, fiebre, cefalea, enfermedad respiratoria

+, ATCC

Neisseria

Meningitis bacteriana

+, ATCC

Bordetella

Pertussis (tos ferina)

+, refa

Gastritis, úlceras peptídicas, posiblemente cáncer de estómago

+, refb

Helicobacter

Listeriosis (meningitis)

+, ATCC

Staphylococcus

Abcesos, neumonía, endocarditis, choque tóxico

+, ATCC

Streptococcus

Fiebre escarlata, fiebre reumática, choque tóxico

+, ATCC

Enterococcus

Infecciones del tracto urinario

+, ATCC

Clostridium

Tétanos

+, ATCC

Corynebacterium

Difteria

+, ATCC

Tuberculosis: tos, pérdida de peso, lesiones pulmonares; la infección puede extenderse a otros órganos

+, ATCC

Listeria

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-

Infecciones oportunistas

Pseudomonas

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Fago

Mycobacterium 45

Treponema Borrelia

Sífilis

+, refc

Enfermedad de Lyme: erupción, fiebre, anomalías neurológicas y cardiacas, artritis

+, refd

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Campylobacter Chlamydia 55

Haemophilus Serratia Klebsiella

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Enteritis por Campylobacter: dolor abdominal, diarrea, fiebre Tracoma, infecciones genitales, conjuntivitis, neumonía en el bebé

+, ATCC +, refe

Fiebre púrpura brasileña: conjuntivitis purulenta, fiebre, vómitos

+, ATCC

Infección oportunista en neonatos

+, ATCC

Neumonía

+, ATCC

Donde: “+, ATCC” indica la presencia del correspondiente bacteriófago (o bacteriófagos) en la ATCC; “+, ref” indica que la información existente sobre el correspondiente bacteriófago se puede encontrar en la siguiente literatura científica: refa - Holzmayer TA, y col. 1988 Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 269 (2): 147-55; Gol’tsmaier TA, y col. 1987 Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 5:9-13; refb - Heintschel von Heinegg E, y col. 1993 J Med Microbiol 38 (4): 245-9; refc - Ritchie AE, y col. 1978 Vet Rec 103 (2):34-5; refd - Eggers CH, y col. 2000 J Mol Microbiol Biotechnol 2 (4):365-73; refe - Hsia R, y col. 2000 Microbes Infect 2(7):761-72; Hsia RC, y col. 2000 Microbiology 146 (Pt 7):1651-60. 6

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En una realización de la presente invención, un fago tiene una especificidad de hospedador doble basada en tener dos proteínas de la cola diferentes. En otra realización, un fago tiene una especificidad de hospedador triple basada en tener tres proteínas de la cola diferentes. En una realización adicional, un fago tiene una especificidad de hospedador cuádruple basada en tener cuatro proteínas de la cola diferentes. Y así sucesivamente, de modo que en una realización adicional, un fago tiene una especificidad de hospedador múltiple según las múltiples proteínas de la cola de hospedadores diferentes. En otra realización de la presente invención, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica tiene una especificidad de hospedador doble basada en tener dos proteínas de la cola hidrolíticas diferentes. En otra realización de la presente invención, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica tiene una especificidad de hospedador triple basada en tener tres proteínas de la cola hidrolíticas diferentes. En una realización adicional, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica tiene una especificidad de hospedador cuádruple basada en tener las cuatro proteínas de la cola hidrolíticas diferentes. Y así sucesivamente, de modo que en una realización adicional, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica tiene una especificidad de hospedador múltiple según las múltiples proteínas de la cola hidrolíticas diferentes. En otra realización de la presente invención, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica específica de K tiene una especificidad de hospedador doble basada en tener dos proteínas de la cola hidrolíticas específicas de K diferentes. En otra realización, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica específica de K tiene una especificidad de hospedador triple basada en tener las tres proteínas de la cola hidrolíticas específicas de K diferentes. En una realización adicional, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica específica de K tiene una especificidad de hospedador cuádruple basada en tener las cuatro proteínas de la cola hidrolíticas específicas de K diferentes. Y así sucesivamente, de modo que en una realización adicional, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica específica de K tiene una especificidad de hospedador múltiple según las múltiples proteínas de la cola hidrolíticas específicas de K diferentes. Un primer ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador doble es ΦK1-5. Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador triple es ΦK1-5 con una tercera proteína de cola diferente. Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador cuádruple es ΦK1-5 con una tercera y cuarta proteína de la cola diferente. Y así sucesivamente, de modo que un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple es ΦK1-5 con múltiples proteínas de la cola de hospedadores diferentes. Un segundo ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador doble es ΦK1E con una segunda proteína de la cola diferente, como K1-5. Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador triple es ΦK1E con una segunda y tercera proteína de la cola diferente. Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador cuádruple es ΦK1E con una segunda, tercera y cuarta proteína de la cola diferente. Y así sucesivamente, de modo que un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple es ΦK1E con múltiples proteínas de la cola de hospedadores diferentes. Un tercer ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador doble es ΦK5 con una segunda proteína de la cola diferente, como K1-5. Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador triple es ΦK5 con una segunda y tercera proteína de la cola diferente. Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador cuádruple es ΦK5 con una segunda, tercera y cuarta proteína de la cola diferente. Y así sucesivamente, de modo que un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple es ΦK5 con múltiples proteínas de la cola de hospedadores diferentes. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Escherichia y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Shigella y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Salmonella y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Enterobacter y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebac7

ES 2 252 263 T3 terium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella.

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Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Yersinia y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Vibrio y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Legionella y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella.

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Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Pseudomonas y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Neisseria y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple en función de las proteínas de la cola de hospedadores diferentes que tiene es un fago que infecta a Bordetella y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Helicobacter y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella.

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Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Listeria y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Staphylococcus y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Streptococcus y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Enterococcus y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. 8

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Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Clostridium y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Corynebacterium y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Mycobacterium y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella.

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Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Treponema y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Borrelia y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Campylobacter y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Chlamydia y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Haemophilus y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella.

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Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Serratia y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Otro ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a Klebsiella y que además infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia y Klebsiella. Gama de hospedadores del fago para que incluyan células bacterianas que requieren cofactores

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En otra realización de la presente invención, un fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes, adicionalmente tiene un gen que codifica un cofactor que le permite crecer en otros tipos de bacterias. Una vez que tiene las proteínas de la cola apropiadas, es necesario que el fago infecte una cepa de bacterias, como se ilustra mediante los presentes experimentos. Por ejemplo, un fago 9

ES 2 252 263 T3 que tiene proteínas de la cola de hospedadores diferentes es capaz de infectar múltiples hospedadores, cuando el hospedador expresa al menos una de estas proteínas de la cola del hospedador. Sin embargo, pueden ser necesarios factores adicionales para que un fago infecte otras cepas de bacterias. La presente invención proporciona estos fagos cuando también pueden ser necesarios cofactores para aumentar su gama de hospedadores. 5

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Por ejemplo, el fago lambda de E. coli generalmente no infecta a Salmonella. El fago lambda de E. coli necesita un gen Nus A de E. coli funcional para que lambda promueva la transcripción/anti-terminación de ADN → ARN que permite al virus replicarse y funcionar. Como la bacteria Salmonella no tiene el gen Nus A de E. coli, lambda no puede crecer en Salmonella. Cuando el gen Nus A de E. coli se clona en el genoma de lambda, este virus puede entonces infectar ciertas cepas de Salmonella. En un experimento de confirmación, el genoma de E. coli se cortó en fragmentos con enzimas de restricción y se clonaron los fragmentos en una biblioteca de lambda. Cuando estos fagos lambda se sembraron en placas sobre Salmonella, sólo crecieron las que tenían el gen Nus A de E. coli. De este modo, el lambda que porta el gen Nus A de E. coli proporciona un ejemplo de cómo puede ampliarse la gama de hospedadores de un fago.

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En otro ejemplo de fago generalmente que no infecta a otro tipo de bacterias, puede conocerse el gen que permite al virus replicarse y funcionar en las bacterias. Si se conoce, el gen puede clonarse en el genoma viral para que este virus pueda entonces infectar otros tipos de bacterias. Si no se conoce, el gen puede identificarse, por ejemplo, cortando el genoma bacteriano en fragmentos con enzimas de restricción y posteriormente clonando los fragmentos en una biblioteca de ese virus. Cuando estos fagos se siembran en placas sobre las bacterias, sólo crecerán las que tienen el gen. De este modo, se puede identificar el gen que permite al virus replicarse y funcionar en las bacterias. Una vez conocido el gen, el virus puede manipularse genéticamente para que lleve el gen. De este modo, puede ampliarse la gama de hospedadores del fago, incluso cuando son necesarios cofactores para crecer en otros tipos de bacterias. Gama de hospedadores del fago para que incluyan células de mamífero En otra realización de la presente invención, un fago tiene especificidad por un hospedador mamífero según la incorporación en el genoma del fago del gen de un ligando de un receptor de la superficie celular, de modo que se exprese en la cola del fago, facilitando de ese modo, la endocitosis mediada por receptor. Poul y col., J Mol Biol 1999, 288:203 y Larocca y col., FASEB J 1999, 13:727 describen el suministro de genes a células de mamíferos mediante bacteriófagos que expresan ligandos de un receptor de la superficie celular como fusiones genéticas con las proteínas de la cubierta del fago o que presentan sobre las cubiertas del fago ligandos de un receptor de la superficie celular, siendo el objetivo el desarrollo de vectores para terapia génica. La presente invención prevé la sustitución de proteínas de la cola del fago.

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Un ligando de un receptor de la superficie celular se fusiona genéticamente con una proteína de la cola del fago o se presenta en las colas de los fagos de cualquier otra forma. También pueden modificarse la secuencia nucleotídica que codifica las fusiones de ligando-fago o de los propios ligandos de receptor de la superficie celular, mediante inserción de genes indicadores de mamífero, para comprobar la unión, internalización y expresión. Finalmente, el gen indicador de mamífero se sustituye por una secuencia nucleotídica terapéutica. La secuencia nucleotídica terapéutica codifica factor que tiene un efecto terapéutico. En realizaciones alternativas, un factor es una proteína citocida, antisentido, ribozima, mutante negativa dominante o terapéutica (por ejemplo, un factor de crecimiento, una hormona, una citoquina, un receptor o un ligando). En el documento USP 6.054.312 de Larocca y col. se muestra un ejemplo de suministro de gen mediado por receptor usando vectores de despliegue en bacteriófagos de ligandos como fusiones genéticas con proteínas de la cubierta del fago o presentando ligandos de un receptor de la superficie celular en las cubiertas del fago. Procedimientos de fabricación

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En una realización diferente, la adquisición de nuevos genes de la cola se produce mediante recombinación en la naturaleza. En una realización alternativa, la adquisición de nuevos genes de la cola se genera tecnológicamente en el laboratorio. De este modo, el fago puede desarrollarse mediante selección o manipulación génica. 55

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Se pueden seleccionar fagos que tienen especificidades múltiples mediante ensayos para determinar la gama de hospedadores de los fagos, tal como ensayos de formación de placas. Alternativamente, los fagos que tienen especificidades múltiples pueden manipularse genéticamente mediante la clonación del gen de una proteína de la cola en un sistema de vector plasmídico y, a continuación, incorporar esta configuración en el fago de interés por un sistema de recombinación generalizado in vivo en la bacteria hospedadora del fago de interés; o mediante clonación del gen de una primera proteína de la cola en un sistema de vector plasmídico y, posteriormente, clonar el gen de una segunda proteína de la cola en este vector vehículo mediante la fusión en marco en el extremo 3’ o 5’ del gen de la primera proteína de la cola y, a continuación, incorporar esta configuración en el fago de interés mediante un sistema de recombinación generalizada in vivo en la bacteria hospedadora del fago de interés, o mediante la clonación del gen de una primera proteína de la cola en un sistema de vector plasmídico y, posteriormente, clonar el gen de una segunda proteína de la cola en este vector vehículo mediante la fusión en marco en el extremo 3’ o 5’ del gen de la primera proteína y, a continuación, clonar el gen de una tercera proteína de la cola en este vector vehículo mediante la fusión en marco en el extremo 3’ o 5’ de los genes de la primera y segunda 10

ES 2 252 263 T3 proteína de la cola, y así sucesivamente, y, posteriormente, incorporar esta configuración en el fago de interés mediante un sistema de recombinación generalizada in vivo en la bacteria hospedadora del fago de interés. Procedimientos de uso, formulaciones y administración 5

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La presente invención puede aplicarse a lo largo del espectro de enfermedades bacterianas, seleccionando o manipulando genéticamente fagos, de manera que se desarrollen fagos que son específicos de más de una cepa bacteriana de interés. De ese modo, se desarrolla una matriz completa de bacteriófagos polivalentes para prácticamente todos los patógenos bacterianos del hombre, sus mascotas, el ganado y los animales de zoológico (bien mamíferos, aves o de piscicultura). Entonces, la terapia con fagos estará disponible: 1) como un complemento o como una sustitución de antibióticos y/o fármacos quimioterapéuticos que ya no funcionan como bacteriostáticos o bactericidas debido al desarrollo de resistencia múltiple a fármacos.

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2) como un tratamiento para aquellos pacientes que son alérgicos a los antibióticos y/o fármacos quimioterapéuticos que, de otro modo, estarían indicados; y 3) como un tratamiento que tiene efectos secundarios menores que muchos de los antibióticos y/o fármacos quimioterapéuticos que, de otro modo, estaría indicado para una infección determinada.

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Otra realización de la presente invención es el desarrollo de procedimientos para tratar infecciones bacterianas en animales mediante terapia con fagos con los bacteriófagos polivalentes descritos anteriormente. Se conocen en la técnica cientos de bacteriófagos y las especies bacterianas que infectan. La presente invención puede utilizarse para desarrollar bacteriófagos polivalentes que pueden usarse para tratar cualquiera o todas las infecciones causadas por sus bacterias hospedadoras. Mientras se contempla que la presente invención puede usarse para tratar cualquier infección bacteriana en un animal y en un humano, se contempla especialmente que los procedimientos descritos en este documento serán muy útiles como terapia (complementaria o independiente) en infecciones causadas por bacterias resistentes a fármacos. Los expertos informan (véase, por ejemplo: Gibbons, A., “Exploring New Strategies to Fight Drug-Resistant Microbes”, Science, 21 Ago. 1993, pág. 1036-38) que en el momento actual, las especies y cepas bacterianas resistentes a fármacos enumeradas a continuación, representan la mayor amenaza para la humanidad. 1. Todos los miembros de importancia clínica de la familia Enterobacteriaceae, más en particular, pero sin limitaciones, los siguientes: a) Todas las cepas clínicamente importantes de Escherichia, más en particular, E. coli. Uno entre varios fagos de tipo silvestre candidatos frente a estos patógenos en particular que podría usarse como punto de partida para la manipulación genética de la presente invención sería ΦK1-5 que tiene el Nº de acceso de la ATCC PTA-3495 (Nota: Con el fin de ser breve, en todos los ejemplos siguientes de patógenos, el fago de tipo silvestre correspondiente se indicará mediante la siguiente expresión: “Ejemplo de fago correspondiente:______________________”.) b) Todas las cepas clínicamente importantes de Klebsiella, más en particular, K. pneumoniae (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 23356-B1).

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c) Todas las cepas clínicamente importantes de Shigella, más en particular, S. dysenteriae (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 11456a-B1). 50

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d) Todas las cepas clínicamente importantes de Salmonella, más en particular, S. abortus-equi (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 9842-B1), S. typhi (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 19937-B1), S. typhimurium (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 19585-B1), S. newport (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 27869-B1), S. paratyphi-A (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 12176-B1), S. paratyphi-B (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 19940-B1), S. potsdam (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 25957-B2) y S. pollurum (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 19945-B1). e) Todas las cepas clínicamente importantes de Serratia, más en particular, S. marcescens (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 14764-B1).

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f) Todas las cepas clínicamente importantes de Yersinia, más en particular, Y. pestis (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 11953-B1). g) Todas las cepas clínicamente importantes de Enterobacter, más en particular, E. cloacae (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 23355-B1).

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2. Todos los Enterococci de importancia clínica, más en particular, E. faecalis (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 19948-B1) y E. faecium (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 19953-B1). 11

ES 2 252 263 T3 3. Todas las cepas clínicamente importantes de Haemophilus, más en particular, H. influenzae (la ATCC no dispone de un fago correspondiente para este patógeno, pero pueden obtenerse varios de la OMS o de otros laboratorios que los ponen a disposición pública). 5

4. Todas las Mycobacteria de importancia clínica, más en particular, M. tuberculosis (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 25618-B1), M. avium-intracellulare, M. bovis y M. leprae. (Los fagos correspondientes a estos patógenos están disponibles en el mercado de la OMS; a través del Instituto Nacional de Salud Pública y Protección del Medio Ambiente, Bilthoven, Países Bajos):

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5. Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis (el fago correspondiente para ambas puede obtenerse públicamente de la OMS o de otras fuentes). 6. Todas las Pseudomonas de importancia clínica, más en particular, P. aeruginosa (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 14203-B1).

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7. Todos los Staplylococci de importancia clínica, más en particular, S. aureus (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 27690-B1) y S. epidermidis (el fago correspondiente está a disposición pública a través de la OMS, por medio del Instituto Colindale de Londres). 20

8. Todos los Streptococci de importancia clínica, más en particular S. pneumoniae (El fago correspondiente puede obtenerse públicamente a partir de la OMS o de otras fuentes). 9. Vibrio cholera (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº 14100-B1).

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Hay más patógenos bacterianos, demasiado numerosos para mencionarse que, mientras que actualmente no están en situación de crisis de resistencia a antibióticos, sin embargo son candidatos excelentes para el tratamiento con bacteriófagos polivalentes según la presente invención. De este modo, usando la presente invención pueden tratarse todas las infecciones bacterianas causadas por bacterias para las que hay un fago correspondiente.

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Cualquier cepa de fago capaz de hacer un daño directo o indirecto a una bacteria (u otro patógeno), se contempla como útil en la presente invención. De este modo, serán útiles para la presente invención los fagos que son líticos, los fagos que son lisogénicos pero que posteriormente se convierten en líticos y los fagos no líticos que puede suministrar un producto que será perjudicial para las bacterias.

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Los animales para ser tratados mediante los procedimientos de la presente invención incluyen, pero sin limitaciones, el hombre, sus mascotas domésticas, ganado, piscicultivos y los animales de zoológicos y parques acuáticos.

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Los bacteriófagos polivalentes de la presente invención pueden usarse como terapia independiente o como una terapia complementaria para el tratamiento de infecciones bacterianas. Se conocen en la técnica numerosos agentes antimicrobianos (incluyendo agentes antibióticos y quimioterapéuticos), que serían útiles para el tratamiento de infecciones bacterianas en combinación con bacteriófagos polivalentes. A continuación se enumeran ejemplos de agentes antimicrobianos adecuados y las infecciones bacterianas que pueden tratarse con los agentes antimicrobianos especificados. Sin embargo, la presente invención no se limita a los agentes antimicrobianos enumerados a continuación, ya que un experto en la materia fácilmente podría determinar otros agentes antimicrobianos útiles en combinación con bacteriófagos polivalentes.

Patógeno 50

Agente antimicrobiano o grupo antimicrobiano

E. coli: Infección del tracto urinario sin complicaciones

trimetoprim-sulfametoxazol (abrev. TMO-SMO) o ampicilina; cefalosporinas de 1a generación, ciprofloxacina

Infección sistémica

ampicilina, o una cefalosporina de 3a generación; aminoglicósidos, aztreonam o una penicilina + un inhibidor de la penicilinasa

Klebsiella pneumoniae

cefalosporinas de 1a generación; cefalosporinas de 3a generación, cefotaxima, moxalactama, amikacina, cloranfenicol

Shigella (varias)

ciprofloxacina; TMO-SMO, ampicilina, cloranfenicol

55

60

65

12

ES 2 252 263 T3 (Continuación) Patógeno 5

10

15

Agente antimicrobiano o grupo antimicrobiano

Salmonella: s. typhi

cloranfenicol; ampicilina o TMO-SMO

especies no typhi

ampicilina; cloranfenicol, TMO-SMO, ciprofloxacina

Yersinia pestis

estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol

Enterobacter cloacoe

cefalosporinas de 3a generación, gentamicina o tobramicina; carbenicilina, amikacina, aztreonam, imipenem

Hemophilus influenzae: 20

25

Meningitis

cloranfenicol o cefalosporinas de 3a generación; ampicilina

Otras infecciones por H. infl.

ampicilina; TMO-SMO, cefaclor, cefuroxima, ciprofloxacina

Mycobacterium tuberculosis y M. avium-intracellulare

isoniazina (INH) + rifampina o rifabutina, dándose la última junto con pirazinamida +/o etambutol

Neisseria: 30

N. meningitidis

penicilina G, cloranfenicol o una sulfonamida

N. gonorrhoeae: Sensible a la penicilina

penicilina G; espectinomicina; ceftriaxona

Resistente a la penicilina

Ceftriaxona; epectinomicina, cefuroxima o cefoxitina, ciprofloxacina

Pseudomonas aeruginosa

tobramicina o gentamicina (+/- carbenicilina, aminoglucósidos); amikacina, ceftazidima, aztreonam, imipenem

35

40

Staph. aureus:

45

50

no productoras de penicilinasa

penicilina G; cefalosporinas de 1a generación, vancomicina, imipenem, eritromicina

Productoras de penicilinasa

una penicilina resistente a la penicilinasa; cefalosporinas de 1a generación, vancomicina, imipenem, eritromicina

Streptococcus pneumoniae

penicilina G; cefalosporinas de 1a generación, eritromicina, cloranfenicol

Vibrio cholera

Tetraciclina; TMO-SMO

55

En otra realización de la presente invención, la bacteria polivalente de la invención se proporciona como composiciones útiles para el tratamiento y prevención de diversas infecciones bacterianas, tales como diarrea, disentería, síndrome urémico hemolítico, infección de vejiga, infección de riñón, infección del tracto urinario, septicemia, neumonía y meningitis y otras enfermedades, síndromes y trastornos. 60

65

El bacteriófago polivalente de la invención puede usarse para el tratamiento o prevención de Hemophilus influenzae, Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus fasciae, Streptococcus del grupo B, Listeria, Salmonella, E. coli, Campylobacter, y otras bacterias, y cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, si hay una infección bacteriana en el tracto respiratorio superior, la infección puede ser tratada profiláctica o terapéuticamente con una composición que comprenda al menos un bacteriófago polivalente específico de esta bacteria y un vehículo para el suministro del bacteriófago polivalente en la boca, garganta o fosas nasales. Si un individuo ha estado expuesto a alguna persona con trastorno respiratorio superior, el bacteriófago polivalente residirá en la capa mucosa y prevendrá cualquier colonización de la bacteria infectiva. 13

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5

10

15

20

25

Dos ejemplos de bacterias que infectan el sistema respiratorio superior son Streptococcus pneumoniae y Hemophilus influenzae. En los últimos años, ha habido un incremento en el número de personas, especialmente niños y ancianos, que están infectados o son portadores de Streptococcus pneumoniae y Hemophilus resistente a la penicilina. Mientras que estas bacterias normalmente son residentes inocuos del hospedador, hay organismos oportunistas que son capaces de causar infecciones cuando está comprometida la resistencia del hospedador. Eliminando o reduciendo el número de estos organismos en el tracto respiratorio superior, habrá una reducción proporcional en el número de infecciones debidas a estas bacterias. La bacteria Hemophilus se infecta con el bacteriófago HP1 (un miembro de la familia de fagos similares a P2 con fuertes similitudes con los colifagos P2 y 186, y algunas similitudes con el retrófago Ec67), que produce una enzima lítica capaz de lisar la bacteria. Streptococcus pneumoniae se infecta con el bacteriófago Pa1, que produce una enzima lítica identificada como una N-acetil-muramoil-L-alanina amidasa. La composición farmacéutica de la invención puede contener un bacteriófago polivalente que reconoce a estas dos bacterias y puede contener otro bacteriófago polivalente para otras bacterias. La composición que puede usarse para el tratamiento profiláctico y terapéutico de una infección por estreptococos, incluye el bacteriófago polivalente y un medio de aplicación (tal como un sistema de transporte o un modelo de suministro oral) a la capa mucosa de la cavidad oral y nasal, de modo que el bacteriófago polivalente se coloca en el sistema de transporte o en el modo de suministro oral para que alcance la capa mucosa. Otra infección que puede tratarse profilácticamente es la debida a Streptococcus del grupo A, que pueden producir lo que normalmente se conoce como “faringitis estreptocócica”. Los Streptococcos del Grupo A se infectan con un bacteriófago C1, que produce una enzima específica para la lisis de Streptococcus del grupo A. Otro uso de un bacteriófago polivalente de la invención es para el tratamiento de infecciones bacterianas del tracto digestivo. El procedimiento para el tratamiento de una infección bacteriana del tracto digestivo comprende tratar la infección bacteriana con una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos un bacteriófago polivalente específico para la bacteria y un vehículo para suministrar dicho bacteriófago polivalente al tracto digestivo. En una realización preferida de la invención, las infecciones bacterianas que están siendo tratados están causadas por bacterias gram negativas seleccionadas entre el grupo compuesto por Listeria, Salmonella, E. coli y Campylobacter. Sin embargo, este procedimiento y composición tratará de forma eficaz otras bacterias, cuando se use el bacteriófago polivalente apropiado.

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35

Otra composición y uso del bacteriófago polivalente de la invención es para el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones bacterianas de quemaduras y heridas de la piel. La composición comprende una cantidad eficaz de al menos un bacteriófago polivalente específico para la bacteria y un vehículo para suministrar al menos un bacteriófago polivalente a piel dañada. El bacteriófago polivalente puede aplicarse directamente en un vendaje o en uno u otro vehículo. El vendaje puede ponerse húmedo o seco, en donde el bacteriófago polivalente está en la venda en forma liofilizada. Este procedimiento de aplicación es más eficaz para el tratamiento de quemaduras. En algunas realizaciones de la invención, puede incorporarse un bacteriófago polivalente para Pseudomonas, Staphylococcus y Streptococcus, conjunta o individualmente en uno u otro vehículo, o en un vendaje para su uso en pacientes quemados.

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Aun otro uso de los bacteriófagos polivalentes es para las infecciones bacterianas causadas por cepas K1 y/o K5 de E. coli. Estas bacterias están implicadas en una diversidad de infecciones, siendo las más comunes las infecciones del tracto urinario (ITU). El bacteriófago polivalente de la presente invención se aplicaría directamente al sitio de infección; en el caso de ITU, esto significaría suministrar el fago en la vejiga mediante un catéter.

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En el caso de septicemias causadas por E. coli K1, el fago polivalente de la presente invención podría inyectarse directamente en el sistema circulatorio o por vía intraperitoneal. En caso de meningitis causada por E. coli, el fago polivalente de la presente invención se suministrará en el líquido cefalorraquídeo o se aplicará directamente en el cerebro o en las meninges.

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Aún otro uso de los bacteriófagos polivalentes de la invención es para el tratamiento terapéutico o profiláctico de infecciones vaginales. Este tratamiento comprende tratar la infección vaginal con una cantidad eficaz de al menos un bacteriófago polivalente específico de esta bacteria, en el que este bacteriófago polivalente se incorpora en un vehículo para colocarlo en la vagina. El vehículo preferido es un tampón, o una ducha vaginal. También puede usarse como vehículo una compresa, aunque no es tan eficaz. Mientras que usando esta composición y procedimiento puede tratarse cualquier número de bacterias, se cree que el uso más óptimo de esta composición y procedimiento de tratamiento sería del tratamiento de una infección por E. coli y Streptococcus B. Las infecciones vaginales causadas por Streptococcus del Grupo B pueden causar meningitis del neonato que tiene como resultado un daño cerebral y muerte prematura. El bacteriófago polivalente incorporado en tampones, específico para estreptococos del grupo B, eliminaría los organismos del grupo B sin alterar la flora normal, de modo que las mujeres no sufrirían infecciones por levadura tras la terapia antibiótica. El uso del bacteriófago polivalente en la vagina proporcionaría un efecto profiláctico mejor, aunque su uso terapéutico también sería aconsejable. Otro uso de la invención es para el tratamiento profiláctico y terapéutico de infecciones oculares. El procedimiento de tratamiento comprende administrar un colirio que contiene una cantidad eficaz de al menos un bacteriófago polivalente específico para la bacteria y un vehículo capaz de aplicarse de forma segura en un ojo, con el vehículo que contiene el bacteriófago polivalente. En algunas realizaciones de la invención, las bacterias tratadas son Hemophilus o Staphylococcus. Los colirios están en forma de una solución isotónica. 14

ES 2 252 263 T3 También puede usarse el bacteriófago polivalente para luchar contra la caries dental. Específicamente, puede incorporarse un bacteriófago polivalente específico para Streptococcus mutans a una pasta dentífrica o colutorio. De forma similar, este bacteriófago polivalente también puede incorporarse a una goma de mascar o a una gragea. Puede usarse cualquier otro vehículo que permita la exposición de la boca, encías y dientes al bacteriófago polivalente. 5

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20

Las vías de administración incluyen, pero sin limitaciones, la vía oral, aerosol, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, vaginal, rectal, tópica, punción lumbar y aplicación directa en el cerebro o en las meninges. Los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse como vehículo para el suministro del fago serán aparentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el fago libre podría estar en forma liofilizada y disolverse justo antes de la administración mediante inyección IV. Se contempla que la dosificación de la administración esté comprendida en el intervalo de aproximadamente 106 a aproximadamente 1013 ufp/por kg/por día y, preferiblemente, aproximadamente 1012 ufp/por kg/por día. Los fagos se administran hasta que se logra la eliminación con éxito de las bacterias. Con respecto a la administración de un aerosol a los pulmones, el bacteriófago polivalente se incorpora en una formulación de aerosol diseñado específicamente para la administración a los pulmones por inhalación. Muchos de estos aerosoles son conocidos en la técnica, y la presente invención no se limita a ninguna formulación en particular. Un ejemplo de este aerosol es el inhalador ProventilTM fabricado por Schering-Plough, cuyo propulsor contiene tricloromonofluorometano, diclorodifluorometano y ácido oleico. Las concentraciones de los ingredientes del propulsor y emulsionantes se ajustan, si es necesario, según el fago que se está usando en el tratamiento. El número de fagos que se administran por tratamiento con aerosol estará en el intervalo de 106 a 1013 ufp, y preferiblemente de 1012 ufp. Aislamiento y caracterización de ΦK1-5

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35

ΦK1-5 se aisló usando como hospedador E. coli ATCC 23506 (K5). Las fotografías de microscopía electrónica muestran que ΦK1-5 es morfológicamente similar a la familia Podoviridae, que incluye los colifagos T7, T3 y los fagos SP6 y P22 de Salmonella. Las partículas de fago constan de una cabeza icosaédrica de aproximadamente 60 nm de diámetro con un pequeño penacho de fibras de la cola cortas (Figura 1). ΦK1-5 es muy lítico. Cuando se añadió el fago a un cultivo logarítmico de un hospedador susceptible a una multiplicidad de infección (mdi) de 1:1, se produjo la lisis en 15-20 minutos. El número de viriones producidos por las células se determinó mediante una curva de crecimiento de una etapa y se encontró que era de aproximadamente 110. Las placas de ΦK1-5 eran claras y grandes, de aproximadamente 4,0-5,0 mm de diámetro, con un halo de aproximadamente 12,0-15,0 mm de diámetro en placas de LB agar. Las placas alcanzaban un tamaño límite después de 24 horas. Por el contrario, las placas de T7 pueden continuar creciendo durante varios días (38). Se aisló el ADN a partir de un gradiente de densidad de cloruro de cesio del fago purificado por extracción con fenol. La digestión del ADN con varias enzimas de restricción indicaba que es de cadena doble, con un tamaño estimado de 40 kb. Gama de hospedadores de ΦK1-5 ampliada

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45

La gama de hospedadores de ΦK1-5 se comparó con la de ΦK1E (específico del antígeno K1) y ΦK5 (específico del antígeno K5). Las cepas de E. coli, ATCC 23506 y ATCC 23508, poseen la cápsula de polisacárido K5, y las cepas ATCC 23503 y ATCC 23511 poseen la capsula de K1. También se analizó un grupo de cepas K5 recogidas por Ian Roberts de la Universidad de Manchester y un grupo de aislados K1 recogidos por Richard Silver de la Universidad de Rochester (Tabla 1). ΦK1-5 es capaz de infectar y crecer en todas las cepas K1 y K5, ΦK1E sólo crece en las cepas K1 y ΦK5 sólo crece en las cepas K5. Se analizó también el crecimiento de ΦK1E, ΦK5 y ΦK1-5 en las siguientes cepas del ATCC: 23502 (K4), 23504 (K8), 23505 (K9), 23507 (K10), 23509 (K11), 23510 (K14), 23515 (K17), 23516 (K20), 23517 (K13), 23518 (K18), 19110 (K7), 19138 (K2) y 31616 (K35). En ninguna de estas cepas se observó crecimiento de ΦK1-5, ΦK1E o ΦK5. TABLA 1

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Gamas de hospedadores de los fagos ΦK1E, ΦK5, ΦK1-5, ΦK1-5(K1− ) y ΦK1-5(K5− ) a 55

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65

Cepa de E. coli ATTC 23503 ATCC 23511 RS164 RS166 RS167 RS168 RS176 RS179

Antígeno K

ΦK1-5

ΦK1E

ΦK5

ΦK1-5(K1− )

ΦK1-5(K5− )

K1 K1 K1 K1 K1 K1 K1 K1

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

-

-

+ + + + + + + +

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ES 2 252 263 T3 TABLA 1 (continuación)

Gamas de hospedadores de los fagos ΦK1E, ΦK5, ΦK1-5, ΦK1-5(K1− ) y ΦK1-5(K5− ) a 5

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Cepa de E. coli RS180 RS188 RS203 RS215 RS218 RS228 ATCC 23506 ATCC 23508 20026 21195 21386 21786 21795 21831 21832 21834 21835 a

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Antígeno K

ΦK1-5

ΦK1E

ΦK5

ΦK1-5(K1− )

ΦK1-5(K5− )

K1 K1 K1 K1 K1 K1 K5 K5 K5 K5 K5 K5 K5 K5 K5 K5 K5

+ + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + -

+ + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + +

+ + + + + + -

Se hicieron ensayos de formación de placas para determinar la gama de hospedadores frente a una colección cepas K1 y K5 de E. coli . ΦK1E sólo crece en cepas K1, ΦK5 sólo crece en cepas K5 y ΦK1-5 crecen en ambas. ΦK1-5(K1− ) y ΦK1-5(K5− ) son mutantes defectivas de ΦK1-5 para el crecimiento en las cepas K1 y K5, respectivamente.

Debido a la similitud de la secuencia promotora entre ΦK1-5 y SP6, ensayamos si ΦK1-5 podía crecer en la cepa LT2 de Salmonella typhimurium (el hospedador de SP6) y si SP6 podía crecer en cualquiera de los aislados de E. coli sensibles a ΦK1-5. SP6 no crecía en ninguna de las cepas de E. coli y, de igual modo, ΦK1-5 no crecía en Salmonella typhimurium. ΦK1-5 codifica dos genes de la cola ΦK1E y ΦK5 comparten una región de similitud de secuencia por delante de las proteínas de la cola (incluyendo el promotor similar a SP6, 3). Puesto que ΦK1-5 tienen similitudes estructurales, biológicas y de hospedadores con estos dos fagos, supusimos que los tres podrían estar estrechamente relacionados y compartir esta similitud de secuencia por delante. Diseñamos un cebador basado en la secuencia de esta región en ΦK1E y ΦK5 para determinar la secuencia antes del extremo 5’ del promotor. El cebador hibridaba cuando se usaba el ADN de ΦK1-5 como molde, y fuimos capaces de generar la secuencia. Continuamos secuenciando después del extremo 3’ por desplazamiento del cebador. La secuencia inmediatamente después del promotor era muy similar a la de ΦK5 y codificaba un marco de lectura abierto con un alto grado de similitud de secuencia (>92% de identidad de aminoácidos) con la de ésta proteína de la cola de ΦK5. La secuenciación continuada después del extremo 3’ reveló un segundo marco de lectura abierto que era prácticamente idéntico (>97% de identidad de aminoácidos) a la proteína endosialidasa de ΦK1E. Entre el codon de terminación del gen de la liasa y el codon de inicio del gen de la endosialidasa se encuentra una región intergénica de 85 pares de bases. Esta región también está presente en ΦK5, inmediatamente después del gen K5 liasa y también en ΦK1E, inmediatamente antes del extremo 5’ del gen de la endosialidasa e inmediatamente después del extremo 3’ de un marco de lectura abierto de 111 aminoácidos (ORFL , 6). No se encontró ningún promotor reconocible en esta región, pero hay dos regiones de potente simetría que pueden actuar como terminador transcripcional independiente de Rho. Se determinó la secuencia de 598 pares de bases después del extremo 3’ del codon de terminación del gen de la endosialidasa, en cuyo punto se alcanzó el extremo de la molécula de ADN. No se encontraron marcos de lectura abiertos en esta área. También se determinó en ΦK1-5 la secuencia de 500 pares de bases por delante del gen K5 liasa. Al igual que en los otros fagos, aparece un promotor similar a SP6 que probablemente, es necesario para la transcripción de los genes de la cola. La secuencia antes del extremo 5’ comparte un elevado grado (> 90%) de identidad con la de la región análoga en ΦK5 y ΦK1E. También secuenciamos por detrás del gen de la endosialidasa de ΦK1E; 718 pares de bases después del extremo 3’ desde el codon de terminación de la endosialidasa llegamos al final de la molécula de ADN. Hay poca similitud de secuencia entre esta región y la región análoga de ΦK1-5. 16

ES 2 252 263 T3 Cada virión ΦK1-5 contiene ambas proteínas de la cola

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Abordamos la cuestión de si las partículas ΦK1-5 contenían ambas proteínas de la fibra de la cola o si tras la infección, se producían dos poblaciones de partículas (una que contenía la K5 liasa y la otra que contenía la endosialidasa). Hicimos una preparación de fagos usando como hospedador ATCC 23506 (K5) y determinamos su valor sobre ATCC 23506 (K5) y ATCC 23503 (K1) (Tabla 2). A continuación se incubó una muestra del fago con ATCC 23506 durante 5 min, que es tiempo suficiente para que el fago se una y, posiblemente, inyecte el ADN, pero no para la producción de nuevas partículas de fago. El MDI era de 1/100 partículas de fago/bacteria. A continuación, la mezcla se filtró rápidamente. Las partículas de fago que se habían unido a las células se eliminarían con la filtración. Después, se valoró el filtrado tanto en la cepa K1 como en K5. Si la preparación del fago fuera inicialmente una mezcla de dos poblaciones, entonces sólo se unirían y eliminarían los que expresaban la K5 liasa. El fago restante principalmente sería el que contenía la endosialidasa específica de K1, y por tanto, el valor sería más alto en las cepas K1 de E. coli que en la cepa K5. Por otro lado, si cada una de las partículas del fago contuviera ambas proteínas de la cola, los valores del fago remanente en el filtrado sería el mismo en las dos cepas, es decir, los niveles de los fagos que contienen la K5 liasa no se reducirían de forma selectiva. Encontramos que éste último era el caso y concluimos que cada virión tenían tanto la K1 endosialidasa como la K5 liasa. Se vieron resultados similares en los experimentos recíprocos en los que se realizó la incubación durante 5 min usando la cepa K1 de E. coli (Tabla 2). Como controles, realizamos los experimentos tanto con ΦK1E como con ΦK5, usando ambas cepas para la incubación. Los valores de ΦK1E se redujeron el 99% por preincubación con la cepa K1, pero no con la cepa K5, y los valores de ΦK5 se redujeron de forma similar tras la preincubación con la cepa K5, pero no con la cepa K1. TABLA 2 Experimentos de preincubación para demostrar que todas las partículas ΦK1-5 contienen ambas proteínas de la colaa

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Fago 30

ΦK1-5

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Preincubado con 23506 Valorado en 23506 tras la preincubación Valorado en 23503 tras la preincubación Preincubado con 23503 Valorado en 23506 tras la preincubación Valorado en 23503 tras la preincubación

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ΦK5

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Valor

5,2 x 108 3,1 x 106 3,7 x 106 5,2 x 108 6,8 x 106 6,4 x 106

4,0 x 108 8,5 x 105 4,0 x 108 3,3x 108

Preincubado con 23506 Valorado en 23506 tras la preincubación Preincubado con 23503 Valorado en 23506 tras la preincubación ΦK1E

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7,7 x 108 6,8 x 108 7,7 x 108 3,0x 106

Preincubado con 23506 Valorado en 23503 tras la preincubación Preincubado con 23503 Valorado en 23503 tras la preincubación a

La preincubación de Φ K1-5 con ATCC 23503 (K1) o ATCC 23506 (K5) durante 5 min dio lugar a una pérdida de aproximadamente 100 veces en las partículas del fago cuando se valoró cada cepa. Si la preparación del fago está compuesta de dos poblaciones que contienen cada una sólo una proteína de la cola, entonces, los valores tras la incubación se reducirían sólo en la cepa que se usa en la preincubación. Los valores de Φ K5 se reducen mediante la preincubación con un hospedador permisivo (23506) pero no con un hospedador no permisivo (23503). Los valores de Φ K1E también se reducen sólo mediante preincubación con un hospedador permisivo (23503) y no con un hospedador no permisivo (23506).

Mutantes ΦK1-5 de crecimiento defectuoso en E. coli K1 o K5 Se usó un césped mixto de cepas K1 y K5 de E. coli para seleccionar mutantes ΦK1-5 de crecimiento defectuoso o en una u otra cepa hospedadora. Las formas ΦK1-5 aclaran las placas de césped mixto de K1 y K5 de E. coli; 17

ES 2 252 263 T3

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los mutantes en cada cola daría lugar a placas turbias debido al crecimiento del hospedador no permisivo. Los fagos se trataron con el mutágeno hidroxilamina y se sembraron sobre placas en un césped doble. Las placas turbias se identificaron, picaron y purificaron por aislamientos de placas múltiples en el césped doble. A continuación, estos se seleccionaron ensayando el crecimiento en cada cepa de forma individual. De los ocho aislados purificados, tres eran incapaces de formar placas en la cepa K5, pero pudieron formar placas en la cepa K1. Uno de estos, ΦK1-5(K5− ) , se seleccionó por crecimiento frente a la colección completa de hospedadores y se encontró que era incapaz de replicarse en cualquiera de las cepas K5, pero era capaz de crecer en todas las cepas K1 (Tabla 1). Cinco de los aislados podían seguir replicándose tanto en las cepas K1 como en las K5, pero en las de las cepas K5 daba una morfología de placas turbias.

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Ninguno de los mutantes aislados de esta forma tenían crecimiento defectuoso en las cepas K1, de modo que ideamos un esquema de selección/amplificación para enriquecer los que se replican en hospedadores K5 pero no en K1. Se amplificaron aquellos fagos mutagenizados en una cepa K5, se filtraron para retirar los restos de bacterias y, a continuación, se usaron para infectar durante 5 min una cepa K1 en crecimiento logarítmico. Esta mezcla se filtró rápidamente antes de que tuviera lugar la lisis de la célula que libera los fagos. El fago capaz de crecer en la cepa K1 se uniría a las células y se eliminaría por filtración. A continuación, la muestra se reamplificó en la cepa K5 y se repitió el ciclo ocho veces. Esto permite seleccionar totalmente fagos que puede replicarse en hospedadores K5 pero no en hospedadores K1. Los valores del filtrado eran 200 veces mayores en la cepa K5 que en la cepa K1. Se picaron varios y se purificaron mediante rondas múltiples de aislamiento de placa única. Un aislado, ΦK1-5(K1− ) , se caracterizó más en profundidad y se encontró que era incapaz de crecer en ninguna de las cepas K1 (Tabla 1). Secuencia de ADN de un probable gen ΦK5 de la cola

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Clarke y col. describieron una secuencia parcial de un marco de lectura abierto (ORPp ) en ΦK5 inmediatamente después de la región de 85 bases común a los tres fagos (6). Continuamos secuenciando por delante y encontramos que el marco de lectura abierto completo es de 523 aminoácidos. Una búsqueda con BLAST reveló una región pequeña de similitud de secuencia con el componente IIABC de la N-acetilglucosamina-permeasa próxima al extremo Nterminal. No tenía similitud de secuencia significativa con ninguna otra entrada de la base de datos o cualquier otra de las proteínas de la cola descritas aquí. Se determinó la secuencia de 163 bases adicionales después del extremo 3’, en cuyo punto se llegaba al final de la molécula de ADN. En la Figura 2 se comparan las regiones que codifican las proteínas de la cola en los tres fagos. ΦK1-5 tiene una proteína K5 liasa en la misma posición que la de ΦK5. ΦK1E tiene en esta posición un marco de lectura abierto de 111 aminoácidos (ORFL ) de función desconocida. Inmediatamente después, los tres fagos tienen una región intergénica de 85 bases que tiene dos ejes binarios de simetría. Inmediatamente después del extremo 3’ de esta región, ΦK1-5 codifica su proteína endosialidasa, que está en la posición análoga a la endosialidasa de ΦK1E. ΦK5 codifica en esta posición un marco de lectura abierto (ORFP ) de 523 aminoácidos. Los tres fagos comparten similitud de secuencia por delante de los genes de la cola. No se ha apreciado similitud de secuencia por detrás y, en los tres fagos, la molécula de ADN termina después del extremo 3’.

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Ejemplo 1 Aislamiento de K1-5 45

50

55

ΦK1-5 se aisló de aguas residuales sin procesar usando la técnica de formación de placas. Brevemente, se centrifugó una muestra de 1 l de aguas residuales a 6000 rpm en un rotor GSA para retirar el material sólido y, a continuación, se pasó a través de un filtro de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros (Nalgene). Se añadieron 100 µl del filtrado a 200 µl de un cultivo de una noche de E. coli ATCC 23506 (K5) cultivadas en medio LB. Se añadieron 3 ml de agar blando de superficie atemperado y fundido (5 g/l de agar en LB) y la mezcla se sembró sobre una placa de LB agar y se incubó a 37ºC durante una noche. Al día siguiente, las placas se picaron y se volvieron a sembrar 3 veces sobre placas para asegurar la pureza del cultivo. Los aislados finales de la placa se almacenaron como un tapón de agar a partir de una pipeta Pasteur, depositado en 1 ml de tampón SM (MgSO4 10 mM, NaCl 100 mM, gelatina al 0,01%, Tris 50 mM, pH 7,5). Inicialmente, se seleccionó una gama de hospedadores distribuyendo 10 µl de tampón SM que contenían un tapón sobre un césped de una cepa apropiada. La gama de hospedadores de los fagos aislados de interés se confirmó adicionalmente mediante el ensayo de formación de placas. Todas las valoraciones del fago se hicieron mediante la técnica de ensayo de formación de placas.

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Purificación a gran escala

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Los fagos se prepararon mediante el procedimiento de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Se creció 1 l de un hospedador apropiado en medio de cultivo LB, hasta una D.O. 600 de entre 0,4 a 0,6 a 37ºC con agitación a 200 rpm. Los fagos se añadieron a una mdi de 1 fago/100 bacterias, y se dejó incubar el cultivo durante un mínimo de 30 min hasta que se alcanzó la D.O. Se añadieron 10 ml de cloroformo, se mantuvo la agitación durante 10 min y a continuación, se centrifugó durante 20 min a 6000 rpm en un rotor GSA para retirar los restos de células. Se recogió el sobrenadante y se añadió 1/10 del volumen de NaCl 5M y 1/10 p/v de polietilénglicol para precipitar el fago; éste se mantuvo a 4ºC durante una noche. A continuación, el fago se sedimentó por centrifugación a 6000 rpm en un rotor 18

ES 2 252 263 T3 GSA a 4ºC. El sedimento se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato y se añadió CsCl a una densidad de 1,5 g/ml. La muestra se centrifugó en un rotor Ti80 (Beckman) a 34.000 rpm durante una noche. La banda del fago se extrajo con una jeringa y se dializó frente a solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). 5

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Aislamiento y secuenciación de ADN El ADN se aisló del fago purificado por CsCl mediante la extracción con bifenol/cloroformo. El ADN del fago se usó directamente como molde para secuenciar el ADN, lo que se llevó a cabo en Commonwealth Biotechnologies en Richmond, VA. Se secuenciaron ambas cadenas (de la región del gen de la cola de ΦK1-5). Las búsquedas en bases de datos de ADN se hicieron mediante BLAST (1) y el alineamiento de secuencias se realizó con el Paquete Wisconsin (9). Mutagénesis

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El fago purificado por cesio se mutagenizó con luz U.V., usando un transiluminador chromatovue modelo TM 36 (UVP, Inc.). Los fagos se expusieron típicamente durante 10-20 s, lo que reducía la viabilidad 1000 veces. A continuación, los fagos mutagenizados se amplificaron en ATCC 23503 o en ATCC 23506 y se sometieron a una selección y amplificación como se ha descrito anteriormente. Los fagos también se mutagenizaron por incubación con hidroxilamina 400 mM hasta que el valor del fago se redujo 100 veces. A continuación, se sembraron sobre placas en un césped doble de ATCC 23503 y ATCC 23506. Se picaron las placas turbias, se pusieron de nuevo sobre placas para su aislamiento y se ensayó su crecimiento frente a una colección de cepas de E. coli K1 y K5. Referencias

25

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ES 2 252 263 T3 REIVINDICACIONES

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1. Una composición farmacéutica que comprende un fago que tiene especificidad de hospedadores múltiple basada en múltiples proteínas de la cola de diferentes hospedadores y un excipiente farmacéuticamente aceptable, teniendo dicho fago múltiples proteínas de la cola hidrolíticas diferentes. 2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, teniendo dicho fago múltiples proteínas de la cola hidrolíticas diferentes específicas de K.

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3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, comprendiendo dicho fago el genoma de longitud completa de ΦK1E. 4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, comprendiendo dicho fago el genoma de longitud completa de ΦK5. 5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, comprendiendo dicho fago el genoma de longitud completa de ΦK20.

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6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Escherichia y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Shigella y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Salmonella y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 9. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Yersinia y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 10. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Vibrio y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Legionella y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 12. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Pseudomonas y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 13. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Neisseria y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 14. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Bordetella y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 15. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Helicobacter y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 22

ES 2 252 263 T3 16. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Listeria y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 5

17. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Staphylococcus y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 10

18. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Streptococcus y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 15

19. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Clostridium y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 20

20. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Corynebacterium y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 25

21. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Mycobacterium y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 30

22. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Treponema y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 35

23. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Borrelia y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo formado por Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y Borrelia. 40

24. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, teniendo dicho fago además un gen que codifica un factor que permite a dicho fago replicarse y funcionar en otro tipo de bacterias, generalmente no infectadas por dicho fago. 45

25. Un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica que comprende: (a) aislar un fago según la reivindicación 1, en el que la adquisición de nuevos genes de la cola se produce mediante recombinación en la naturaleza; y

50

(b) combinar dicho fago con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 26. Un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica que comprende:

55

(a) generar un fago según la reivindicación 1, en el que la adquisición de nuevos genes de la cola se genera tecnológicamente en el laboratorio; y (b) combinar dicho fago con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

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27. Uso de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-26 para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de infección bacteriana.

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EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA REPRESENTADO POR LA SECRETARÍA DEL DEPARTAMENTO DE SALUD Y SERVICIOS HUMANOS MERRIL, CARL L. ADHYA, SANKAR L. SCHOLL, DEAN BACTERIÓFAGO QUE TIENE UNA GAMA DE HOSPEDADORES MÚLTIPLE NIH205.001VPC

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desconocido Documento US 60/220-987 25-07-2000 4

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FastSEQ para Windows, versión 4.0 1 5518 ADN Bacteriófago K1-5 1

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2 2211 ADN Fago SP6 de Salmonella div_características (1)...(2211) n = A,T,C o G 2

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