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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : C12N 15/12

11 N´ umero de publicaci´on:

2 135 464

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˜ ESPANA

C07K 14/435 A01N 63/02 C12N 7/01 //C12N 15/86

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93904013.5 kFecha de presentaci´on : 25.02.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 629 239 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 21.12.1994

T3

86 86 87 87

k

54 T´ıtulo: Toxinas insecticidas de la avispa par´ asita Bracon hebetor.

k

30 Prioridad: 04.03.1992 US 847570

10.06.1992 US 897192

Schwarzwaldallee 215 4058 Basel, CH

k

72 Inventor/es: Leisy, Douglas Jerald y

k

74 Agente: D´ avila Baz, Angel

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.11.1999

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 135 464 T3

k

73 Titular/es: Novartis AG

01.11.1999

Aviso:

k

Quistad, Gary Bennet

k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 135 464 T3 DESCRIPCION Toxinas insecticidas de la avispa par´ asita Bracon hebetor. 5

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Esta invenci´on se dirige a toxinas activas contra insectos que se a´ıslan de la avispa par´ asita Bracon hebetor, a los ´acidos nucleicos que codifican las toxinas, a la clonaci´on de las toxinas, al uso de las toxinas para controlar insectos, y a vectores de virus obtenidos mediante ingenier´ıa gen´etica que tienen el gen de la toxina. Antecedentes de la invenci´ on En los u ´ltimos a˜ nos, se han investigado venenos de insectos y ar´acnidos, en particular ara˜ nas y escorpiones, como una fuente potencial de sustancias biol´ ogicamente activas para usar en diversos campos tales como medicina y agricultura. Ejemplos de tal trabajo incluyen:

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Solicitud de Patente EP, Publicaci´ on N◦ . 208 523 A2: Glutamate Antagonists Isolated from New World Spiders Argiope trifasciata and Araneus gemma. Solicitud de Patente EP, Publicaci´ on N◦ . 156 540: Glutamate Receptor Inhibitor obtained from Nephila clavata. Grishin y otros, 1986. “Ion Channel Blocker from the Venom of Argiope lobata” Biorg. Khim. 12(8):1121-1124.

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Usherwood y otros, 1984. “Glutamate Channel Blockade by Venoms of Argiope trifasciata and Araneus gemma” J. Physiol. Paris 79:241-245. Aramaki y otros, 1986 “Glutamate Potential Suppressor from Nephila clavata and Nephila maculata” Proc. Japan Acad. 62, Ser B:359-362.

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Usherwood y otros, 1985. “Antagonism of Glutamate Receptor Channel Complexes by Spider Venom Polypeptides” Neurotoxicology 6(2):239-250. Adams y otros, 1986 “Synaptic Toxins from Agelenopsis aptera” Insect Neurophysiology, Borkovec y otros, Eds. Humana Press, Clifton, NJ 397-408. Bracon hebetor (tambi´en conocida como Habrobracon hebetor y Microbracon hebetor)es una avispa ectopar´ asita peque˜ na (alrededor de 2 mm, menos de 1 mg) que tiene un veneno que es paral´ıtico para los lepid´ opteros (Drenth, D. 1974, Toxicon 12:189-192). La b´ usqueda para identificar toxinas en veneno de B. hebetor ha continuado durante varios a˜ nos (v´eanse, por ejemplo Visser y otros, 1976, Toxicon 14:357-307; Visser y otros, 1983, Comp. Biochem. Physiol. 75B:523-530; y Spanjer y otros, 1977, Toxicon 15:413421). La mayor´ıa de los intentos se han frustrado por la labilidad de las toxinas. Dos toxinas de prote´ına (peso molecular 44 y 57 kDa) se han purificado y caracterizado parcialmente, pero representan s´olo 2 % de la actividad insecticida original (Visser y otros, anteriormente, 1983). M´ as recientemente, Slavnova y otros, 1987 Doklady Akademii Nauk USSR 297:492-494 presenta el aislamiento de una toxina que tiene una masa de 18 kDa. Descripci´ on de la invenci´ on

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Se ha encontrado ahora que ciertos polip´eptidos, cuando se a´ıslan del veneno de la avispa Bracon hebetor, son t´ oxicos, es decir paral´ıticos y/o letales para insectos, particularmente del orden Lepidoptera, en concentraciones sorprendentemente bajas. La presente invenci´on, por lo tanto, trata de toxinas libres de polip´eptidos de avispa asociados que demuestran toxicidad hacia insectos. Estos polip´eptidos pueden aislarse de, o construirse para mostrar una homolog´ıa de secuencia sustancial con polip´eptidos aislados de, el veneno de Bracon hebetor. Los p´eptidos preferidos son bastante grandes, y pueden caracterizarse por tener un peso molecular que supera 70.000 Da y comprenden la secuencia de la ID SEC N◦ 1, ID SEC N◦ 2, ID SEC N◦ 3 o ID SEC N◦ 5. Se aislaron cinco polip´eptidos y se denominaron Brh-I a Brh-V. Seg´ un se usan a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se pretenden las siguientes definiciones:

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ES 2 135 464 T3 Polip´eptidos de avispa asociados - polip´eptidos presentes naturalmente en el veneno de B. hebetor que son t´ oxicos para insectos.

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Polip´eptido hom´ ologo - un polip´eptido que es id´entico a una de las toxinas naturales de esta invenci´ on, o sustancialmente hom´ologo (al menos 80 %) con respecto a la secuencia de amino´acidos, tal que demuestra sustancialmente la misma toxicidad hacia insectos en ensayos in vivo que una toxina natural. Secuencia nucleot´ıdica hom´ ologa - una secuencia que se hibridar´ a a la secuencia de referencia bajo condiciones de hibridaci´ on rigurosas.

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Condiciones de hibridaci´ on rigurosas - aqu´ellas en las que la hibridaci´on se efect´ ua de una manera on de SSPE) 4X seguido por est´andar a 65◦C en soluci´on salina tamponada (tambi´en conocida como tamp´ a a los h´ıbridos verdaderos que se han formado. un mero lavado a 52◦C en SSPE 0,2 X, lo que no afectar´ 15

Descripci´ on de las figuras La Figura 1 muestra la purificaci´ on de toxinas de 300 gl´ andulas venenosas de B. hebetor usando cromatograf´ıa de intercambio ani´ onico.

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La Figura 2 es el an´alisis de HPLC en fase inversa de fracciones 7-13 combinadas de la Figura 1, usando equivalentes de 25 gl´ andulas. La Figura 3 es el an´alisis de HPLC en fase inversa de la Fracci´ on 8 de la Figura 1 (equivalentes de 25 gl´ andulas). Esta es predominantemente Brh-I.

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La Figura 4 es el an´alisis de HPLC en fase inversa de la Fracci´ on 11 de la Figura 1 (equivalentes de 25 gl´andulas). Esta es predominantemente Brh-V.

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La Figura 5 es el an´ alisis de HPLC de exclusi´on por tama˜ nos de toxinas de 80 gl´ andulas venenosas de B. hebetor. La Figura 6 es un diagrama del pl´asmido pSCI810, que contiene el gen Brh-I.

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La Figura 7 es un diagrama del pl´asmido pSCI277, que contiene el gen Brh-I conectado al promotor p10. Las toxinas de esta invenci´ on son bastante l´ abiles bajo muchas condiciones de aislamiento. Como son particularmente inestables a pH bajo, la HPLC en fase inversa estaba contraindicada. La elucidaci´ on estructural satisfactoria de toxinas que son parte de esta invenci´ on se basa en la purificaci´ on mediante cromatograf´ıa por intercambio ani´ onico que se verificaba mediante HPLC en fase inversa. Los resultados de la cromatograf´ıa de intercambio ani´ onico se muestran en la Figura 1. Se identifican diversas fracciones, denominadas Fracciones 7-13, y se determina su mortalidad para los insectos. Como la absorbancia ultravioleta era de utilidad limitada durante la purificaci´ on de las toxinas mediante intercambio i´onico, se recogieron fracciones cortas (1 minuto) con relaci´on a la absorbancia contaminante (280 nm) y se determin´ o la bioactividad y la pureza de cada fracci´ on (t´ıpicamente equivalentes de 25 gl´andulas usando HPLC en fase inversa). Los resultados se ilustran en las Figuras 2, 3 y 4. Para recuperar consistentemente toxinas que exhiben alta actividad, era necesario a˜ nadir un portador prote´ınico (alb´ umina de suero bovino) antes de desalar mediante filtraci´ on con membrana. Las toxinas purificadas no pod´ıan liofilizarse, incluso en presencia de BSA, y se almacenaban mejor en una soluci´ on (carbonato am´ onico 0,02 M, pH 9,2, 4◦ C). Bajo estas condiciones, las toxinas eran estables durante al menos dos semanas. As´ı, un aspecto de esta invenci´on es un polip´eptido libre de polip´eptidos de avispa asociados, sustancialmente hom´ ologo a un polip´eptido aislado de Bracon hebetor y que exhibe toxicidad hacia insectos. Los polip´eptidos preferidos tienen un peso molecular de al menos 70.000 Da. Ejemplos de polip´eptidos preferidos de esta invenci´on incluyen: Brh-I, Brh-II, Brh-III, Brh-IV y Brh-V. Los polip´eptidos preferidos de esta invenci´ on pueden caracterizarse por su comportamiento durante HPLC de Intercambio Ani´ onico y de Fase Inversa como sigue, cuyas condiciones completas se dan en el Ejemplo 1. Siguiendo los procedimientos indicados en el Ejemplo 1, es decir cromatograf´ıa de Intercambio Ani´onico seguido por Cromatograf´ıa en Fase Inversa, pueden identificarse picos caracter´ısticos de Brh-I, 3

ES 2 135 464 T3 Brh-II, Brh-III, Brh-IV y Brh-V. Tres de las cinco toxinas naturales se sometieron a secuenciaci´on al menos parcialmente. Los resultados se presentan posteriormente. 5

TABLA I

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Los polip´eptidos de esta invenci´on pueden prepararse mediante una variedad de t´ecnicas. Por ejemplo, pueden aislarse del veneno en bruto de B. hebetor usando t´ecnicas de purificaci´ on, tales como las presentadas en los Ejemplos. Alternativamente, con el conocimiento de la secuencia de amino´acidos de los polip´eptidos, puede emplearse construcci´ on sint´etica, usando t´ecnicas convencionales de s´ıntesis de prote´ınas. Una t´ecnica adicional que puede emplearse ventajosamente en la producci´ on de polip´eptidos de esta invenci´on implica la construcci´on, mediante m´etodos convencionales, de una secuencia de DNA que, durante la expresi´ on, codifica un polip´eptido de acuerdo con esta invenci´ on. Tales secuencias de DNA pueden insertarse entonces en un vector apropiado, solo o en combinaci´ on con otras secuencias de DNA hom´ ologas o heter´ ologas cuya funci´ on puede ser controlar la expresi´on de la secuencia de DNA de inter´es que codifica el polip´eptido o pueden dar como resultado, por ejemplo, una prote´ına de fusi´ on, que mejora o que extiende la actividad del producto de expresi´ on del DNA de la toxina a partir de la misma. Adecuadamente empleados como vectores son pl´asmidos, fagos y virus, cuyo uso para tal prop´ osito es de conocimiento com´ un para el experto normal. C´elulas en las que puede expresarse un vector que contiene tal DNA de toxina incluye, por ejemplo, c´elulas procari´ oticas tales como E. coli y especies Bacillus, o c´elulas eucari´oticas tales como c´elulas de levadura o c´elulas de insectos. Un m´etodo preferido para producir los polip´eptidos de toxina directamente como un producto de toxina de modo que no se requiera un tratamiento para el aislamiento, la purificaci´on y la formulaci´ on de un producto de expresi´ on es empleando un virus espec´ıfico para insecto (baculovirus) como un vector. Un gen que codifica la toxina de polip´eptido deseada se inserta en el DNA del baculovirus, y est´a bajo el control de un promotor de baculovirus. Despu´es de que el baculovirus h´ıbrido recombinante sea ingerido por el insecto, el virus se multiplica dentro del insecto y la toxina se expresa (se produce) en una cantidad suficiente para mejorar el efecto insecticida del virus sobre el insecto. Tal DNA de baculovirus modificado recombinantemente tambi´en puede usarse como un vector para la introducci´ on del gen que produce la toxina de la avispa en c´elulas, particularmente c´elulas de insectos, para proporcionar sistemas adicionales para la producci´ on de toxinas. Por lo tanto, tambi´en se proporciona un m´etodo para controlar insectos que comprende infectar a los insectos con un baculovirus h´ıbrido recombinante.

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Un n´ umero de baculovirus es adecuado para usar como vectores, y se conocen en la t´ecnica, tales como el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica, Heliothis virescens, y Bombyx mori. T´ecnicas adecuadas se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Europea 0 175 852 y en la Patente de EE.UU. 4.745.051, ambas de las cuales se incorporan aqu´ı mediante referencia. As´ı, otros aspectos de esta invenci´on son secuencias de ´acidos nucleicos (RNAs y DNAs) que comprenden las que codifican polip´eptidos de toxinas y secuencias de a´cidos nucleicos que son sustancialmente hom´ ologas a una secuencia natural. Las secuencias de ´acidos nucleicos de esta invenci´on tambi´en pueden incluir secuencias que no se expresan en el producto polipept´ıdico final, tales como secuencias de se˜ nal, secuencias de terminaci´on y similares. Un aspecto adicional de esta invenci´on implica por lo tanto la clonaci´on y el tratamiento por ingenier´ıa gen´etica de genes que codifican las diversas toxinas, y en particular Brh-I. Aunque Brh-I se presenta como un Ejemplo, cualquiera de los polip´eptidos de esta invenci´on puede someterse a secuenciaci´on y clonarse 4

ES 2 135 464 T3 de forma similar.

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Partiendo de aproximadamente 3,1 g de avispas, se obtuvieron aproximadamente 8 µg de mRNA de poli A+ usando los procedimientos detallados en los Ejemplos. Cebadores oligonucleot´ıdicos degenerados correspondientes a dos regiones de la secuencia nucleot´ıdica obtenida mediante traducci´ on inversa del p´eptido Brh-I maduro se sintetizaron y se usaron para la amplificaci´ on por PCR a partir de mRNA de B. hebetor. Fragmentos de DNA con el tama˜ no esperado de aproximadamente 130 pb se produjeron en la reacci´on de PCR. Los fragmentos de DNA se purificaron en gel, se clonaron en pTZ18R, y tres clones se sometieron a secuenciaci´on. Estos tres clones conten´ıan un marco de lectura que coincid´ıa con una porci´ on de la secuencia de amino´acidos de la toxina Brh-I madura. Un cebador no degenerado dise˜ nado para coincidir con una regi´ on de dentro de la secuencia amplificada se marc´o en el extremo con 32 P y se us´ o para rastrear una biblioteca de cDNA de λZAPII elaborada a partir de B. hebetor. Se detectaron tres placas positivas en un rastreo de la biblioteca de aproximadamente 1,2 x 106 placas. Despu´es de la purificaci´ on de las placas y el corte in vivo del cDNA que conten´ıa pl´ asmidos pBluescript SK de los clones λZAPII, los insertos de cDNA de 3 clones se sometieron al an´alisis de la secuencia de DNA. Para determinar el tama˜ no esperado de un cDNA de longitud completa, se realiz´ o una reacci´ on de extensi´on con cebador con mRNA de B. hebetor. La secuencia de ´acidos nucleicos y amino´acidos de on de la traducci´ on se produce Brh-I se da en la TABLA 2 (ID. SEC. N◦ : 4 e ID. SEC. N◦ : 5). La iniciaci´ muy probablemente en el ATG seg´ un se indica en la TABLA 2 debido a que a) este es el primer cod´on de metionina encontrado en el cDNA; b) el cod´ on para la metionina se encuentra en la secuencia ATAATGC, que est´ a de acuerdo con la secuencia de consenso del sitio de iniciaci´ on del ribosoma determinada por Kozak, M., 1989, J. Cell. Biol. 108:229-241; y c) hay una secuencia de terminaci´ on de la traducci´ on, TAA, enmarcada con el marco de lectura abierto de Brh-I justo aguas arriba de este cod´on de metionina. El producto de traducci´ on predicho para el cDNA es una mol´ecula de 678 amino´acidos. La secuencia de amino´acidos dada en la TABLA 2 tiene una secuencia de 18 amino´acidos en el t´ermino N que precede a la secuencia determinada por el an´alisis del polip´eptido aislado (Tabla 1). Como esta secuencia de 18 amino´acidos tiene muchas de las propiedades esperadas para una secuencia de se˜ nal (v´ease, por ejemplo, von Heijne, G. Nucl. Acids Res. 14:4683-4690), parece que esta secuencia es una secuencia de se˜ nal que se segmenta despu´es de la traducci´ on. El peso molecular de Brh-I maduro predicho a partir de la secuencia de cDNA es 77.912. Esto es algo mayor que el valor determinado mediante an´ alisis de SDS-PAGE de Brh-I aislado (aproximadamente 73.000), sin embargo, la composici´on de amino´ acidos determinada para Brh-I y para el producto de traducci´ on de cDNA est´an de acuerdo dentro del error experimental, sugiriendo que no se produce otro procesamiento proteol´ıtico extensivo adem´as de la segmentaci´on de la secuencia de se˜ nal. Debido al nivel muy alto de actividad paral´ıtica que provoca Brh-I en la inyecci´on de un n´ umero de diferentes insectos, cDNAs que codifican la toxina Brh-I pueden clonarse en un baculovirus de insecto. Durante la expresi´ on en el insecto, habr´a un cese m´as r´apido de la alimentaci´on que el que se produce despu´es de la invenci´on con baculovirus de tipo salvaje. Los baculovirus de insecto se presentan en dos formas, virus ocluidos, que son responsables de la extensi´ on de virus entre insectos, y virus no ocluidos o g´emicos, que son responsables de la extensi´on de c´elula a c´elula de virus dentro de un insecto infectado. La infecci´on de insectos por boca requiere normalmente la forma ocluida del virus. As´ı, un aspecto adicional de esta invenci´ on es un virus recombinante que contiene un gen que codifica una toxina de esta invenci´on insertado en un lugar tal que no se rompe la formaci´ on del cuerpo de oclusi´ on. Uno de tales lugares es el lugar p10. Polip´eptidos aislados de, o los que muestran homolog´ıa sustancial con, los aislados del veneno de B. hebetor son u ´ tiles como agentes t´oxicos para insectos. En particular, son agentes t´ oxicos u ´tiles contra insectos del orden Lepidoptera, por ejemplo, Heliothis virescens, Autographa californica, y los insectos del g´enero Spodoptera. Tanto la toxina purificada como los virus transformados para producir la toxina se ensayan para la bioactividad sobre larvas que incluyen: gusanos cornudos del tabaco (Manduca sexta), gusanos de las yemas del tabaco (Heliothis virescens) y gardama de la remolacha (Spodoptera exigua). La toxicidad se demuestra por la capacidad de los polip´eptidos para causar par´ alisis y/o muerte de las larvas de prueba. La presente invenci´on tambi´en proporciona el uso de polip´eptidos aislados de, o polip´eptidos que muestran una homolog´ıa de secuencia sustancial con los aislados de, Bracon hebetor como agentes t´oxicos para los insectos. As´ı, un aspecto adicional de la invenci´ on es un m´etodo para controlar insectos que comprende exponer los insectos a una cantidad para el control de insectos del polip´eptido de la invenci´on. Para usar como insecticidas, los virus recombinantes que producen polip´eptidos de la invenci´ on pueden combinarse con sustancias portadoras adecuadas tales como las encontradas t´ıpicamente en formulaciones 5

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para el control de insectos, tales como adyuvantes, diluyentes, modificadores o agentes acondicionadores. Las formulaciones pueden estar en forma de soluciones, emulsiones, dispersiones, polvos, polvos espolvoreables, gr´ anulos y similares. Puede ser ventajoso incluir un agente tensioactivo tal como DMSO en la formulaci´ on, de modo que la toxina pasa directamente a trav´es de la cut´ıcula del insecto y evita las enzimas digestivas que pod´ıan afectar a su actividad. Estas composiciones se aplican ventajosamente al insecto o su emplazamiento en una cantidad adecuada para controlar los insectos elegidos. Por control, seg´ un se usa aqu´ı, se entiende la inducci´on de par´ alisis, mortalidad o cese de la alimentaci´on. Las dosificaciones de la composici´on de la invenci´ on depender´ an de numerosos factores, incluyendo la plaga que ha de controlarse y las condiciones clim´aticas, pero generalmente estar´ an en el intervalo de 0,5 a 100 kg/hect´ area, preferiblemente 10-50 kg/hect´ area. Los siguientes Ejemplos no limitativos se presentan para ilustrar mejor la invenci´on.

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Ejemplo 1 Aislamiento de Toxinas

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Avispas adultas B. hebetor se adquirieron de Biofac, Inc., Mathis TX. Al recibirlas, las avispas se congelaron a -20◦ C hasta que se usaban. Las gl´andulas venenosas y el tejido asociado se extirparon de las avispas hembra y se almacenaron en tubos de polipropileno de 1,5 ml a -20◦C hasta que se procesaban.

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Purificaci´ on. Lotes de 100 gl´andulas venenosas se homogeneizan manualmente con un mortero de vidrio en 1 ml de agua. Despu´es de la centrifugaci´ on a 3000 x g, los sobrenadantes de 300 gl´andulas se hacen pasar a trav´es de columnas de exclusi´on por tama˜ nos Bio-Rad 10 DG. La fracci´on excluida (peso molecular > 6 kda) se purifica mediante cromatograf´ıa de intercambio i´onico.

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La cromatograf´ıa de intercambio ani´ onico se realiza con una bomba Perkin-Elmer (410 BIO), un detector ultravioleta Spectra-Physics (Modelo 8300, 280 nm) y una columna Altex (Spherogel-TSK, DEAE-5PW, 7,5 X 75 mm) con una eluci´ on a 1 ml/minuto. El disolvente de eluci´on es citrato en carbonato am´ onico 0,02 M que contiene 10 % de acetonitrilo, pH 8,2; citrato 0 mM durante 15 minutos, gradiente lineal hasta 25 mM durante 5 minutos, y de 25 a 75 mM durante 50 minutos. Las fracciones individuales se bioensayan usando larvas de M. sexta. Como se muestra en la Figura 1, toda la actividad insecticida se encuentra en una zona amplia (Fracciones 7-13). Colectivamente, estas fracciones contienen varias toxinas de avispa (V´eanse las Fig. 2, 3 y 4), pero s´olo 59 µg de prote´ına total de 300 gl´andulas venenosas, representando una purificaci´ on de aproximadamente 4000 veces de toxinas basadas en la masa total inicial de avispas. La cromatograf´ıa l´ıquida en fase inversa (HPLC) se realiza usando una bomba Hewlett Packard (HP) (Modelo 1090), un detector de ordenaci´ on de diodos HP (Modelo 1040, 220 y 280 nm) y una columna ametro interno estrecho (15 X 0,2 cm) con un caudal de 0,3 ml/minuto. El eluVydac C4 -300 A de di´ yente es acetonitrilo en ´acido trifluoroac´etico al 0,1 %: 35 % durante 5 minutos, gradiente lineal de 35 a 60 % durante 25 minutos. La HPLC demuestra que la mayor´ıa de las fracciones individuales de la cromatograf´ıa de intercambio i´onico son mezclas de toxinas. Sin embargo, las Fracciones 8 y 11 son suficientemente puras para permitir caracterizaciones adicionales. La Fracci´ on 8 contiene predominantemente Brh-I mientras que la Fracci´on 11 contiene en su mayor parte Brh-V (V´eanse las Figs. 3 y 4). La cromatograf´ıa de exclusi´on por tama˜ nos empleaba la misma bomba Perkin-Elmer y el mismo detector Spectra-Physics que anteriormente con una columna Altex Spherogel-TSK 3000SW (7,5 x 300 mm) con un flujo de 0,5 ml/minuto. El eluyente es acetonitrilo al 10 %. Los resultados se muestran en la Figura 5.

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Ejemplo 2 Bioensayo 55

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La bioactividad de gl´ andulas venenosas enteras se determina para 50 gl´ andulas homogeneizadas en agua de hielo. Despu´es de la centrifugaci´ on a 3000 x g, partes al´ıcuotas de 3 µl se inyectan en el pronoto de larvas de lepid´ optero que se punt´ uan para la mortalidad en 24 horas. La dosis letal para el 50 % de las andulas, larvas tratadas (LD50 ) se calcula mediante an´alisis de Probit a partir de lotes duplicados de gl´ cada uno con al menos cuatro grados de dosis. Toxinas Brh-I y Brh-V purificadas se ensayan de forma similar. Antes del bioensayo, una fracci´ on de R -10 1 minuto de la purificaci´ on por intercambio i´ onico se desala usando microconcentradores Centricon

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ES 2 135 464 T3 (Amicon). Alb´ umina de suero bovino (100 µg) se a˜ nade a muestras antes de desalar para mejorar la recuperaci´on de toxinas. Las toxinas se concentran hasta aproximadamente 150 µl en carbonato am´ onico 0,02 M para bioensayo. 5

10

Se bioensayan las siguientes larvas: tercer estadio de Manduca sexta (gusano cornudo del tabaco); cuarto estadio de Heliothis virescens (gusano de las yemas del tabaco); cuarto estadio de Helicoverpa zea (gusano orejudo del ma´ız); quinto estadio de Spodoptera exigua (gardama de la remolacha), cuarto estadio de Galleria mellonella (polilla de la cera); quinto estadio de Trichoplusia ni (larva de polilla de la col); tercer estadio de Pieris rapae (mariposa de la col); y tercer ensayo de Diabrotica undecimpunctata (escarabajo del pepino moteado occidental). Los resultados se presentan en las Tablas 3 y 4 posteriormente. TABLA 3 Bioactividad de Extracto de Gl´ andulas Venenosas

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M. sexta H. virescens S. exigua G. mellonella H. zea T. ni D. undecimpunctata P. rapae

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Masa de Larvas (mg)

LD50 gl´andulas/larva

LD50 gl´ andulas/g

47 48 50 61 41 66 13 56

0,0036 0,080 0,065 0,00046 0,038 0,0014 >0,2 0,000073

0,77 1,7 1,3 0,0076 0,95 0,021 >13 0,0013

TABLA 4 30

Ensayo de Inyecci´ on LD50 (µg/g) Brh-I

LD50 (µg/g) Brh-V

0,05∗ 0,033∗ 0,18∗ 0,045∗ 0,0023∗ 0,019

0,04∗ 0,051∗ 0,26∗ 0,085 0,00011 0,0038

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M. sexta S. exigua H. virescens H. zea G. mellonella T. ni

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∗

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Aislamiento de toxinas duplicado para bioensayo

Ejemplo 3 An´ alisis de las Secuencias

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900 gl´andulas venenosas se procesan como se describe anteriormente. Las toxinas purificadas (43-77 picomoles) se someten a secuenciaci´on dos veces usando un secuenciador de prote´ınas en fase l´ıquida de impulsos Applied Biosystems Modelo 477A. Feniltiohidanto´ına-amino´ acidos liberados se analizan usando un analizador en l´ınea (Applied Biosystems Modelo 120A). El Brh-I tambi´en se convierte en un derivado carboximetilado reducido antes de someter a secuenciaci´on como se describe en Skinner y otros, 1989 J. Biol. Chem. 264:2150-2155, que se incorpora aqu´ı mediante referencia.

55

Las toxinas Brh-I y Brh-V se analizan para los amino´acidos constituyentes despu´es de la hidr´ olisis a vac´ıo mediante vapor de HCl 6 M/fenol al 1 % a 110◦ C durante 20 horas. Los hidrolizados se analizan usando un analizador de amino´ acidos AminoQuant de Hewlett Packard. 60

Ejemplo 4 Aislamiento de mRNA 7

ES 2 135 464 T3

5

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Avispas B. hebetor se almacenan a -80◦ C. 3,15 g de avispas tanto macho como hembra se homogeneizan con un Polytron durante 1 minuto en 20 ml de tamp´ on de extracci´ on de RNA (isotiocianato de guanidina 4 M, citrato s´ odico 50 mM, pH 7,0 y 2-mercaptoetanol 0,1 M). Despu´es de la homogeneizaci´on, se a˜ nade 1 ml de Sarkosyl al 15 %. El homogenado se centrifuga a 8.000 rpm durante 10 minutos a 4◦C en un rotor Sorvall HB-4, y los sobrenadantes se decantan en tubos limpios para retirar residuos insolubles. Esto se repite una vez y el sobrenadante se estratifica sobre 3 ml de CsCl 5,7 M en EDTA 0,01 M, pH 8,0, y se centrifuga durante 17 horas a 35.000 rpm en un rotor Beckman Ti55. La pella se resuspende en 15 ml de FastTrack Lysis Buffer (Invitrogen Corp) y el m RNA se a´ısla a continuaci´on siguiendo el procedimiento proporcionado por Invitrogen Corp para su estuche de aislamiento de mRNA FastTrack. Ejemplo 5 Amplificaci´ on por PCR

15

cDNA monocatenario se sintetiza a partir de mRNA de B. hebetor (0,5 µg) usando transcriptasa inversa M-MLC (GIBCO-Bethesda Research Laboratories) cebada con un cebador oligonucleot´ıdico 20mero degenerado con la siguiente secuencia (ID. SEC. N◦ : 6) 5’-A[A,G][C,T]TG[A,G]AA[ACGT]AC[C,T]TT[C,T]TT[C,T]TG-3’

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Este cebador es complementario con una secuencia derivada mediante traducci´on inversa de la secuencia de amino´acidos N-terminal de la toxina Brh-I. Despu´es de la s´ıntesis de cDNA, las reacciones se calientan hasta 90◦ C durante 5 minutos, se enfr´ıan hasta temperatura ambiente y se precipitan con etanol. El producto de reacci´on de cDNA se amplifica en una reacci´on de 50 µl con reactivos de PCR geneAMP (Perkin-Elmer Cetus Instruments) usando 2 µM de cada uno del cebador anterior y un segundo cebador degenerativo con la siguiente secuencia (ID. SEC. N◦ : 7): 5’-GA[C,T]TT[C,T]TA[C,T]TA[C,T]AC[A,C,G,T]GA[C,T]GT-3’

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Este cebador corresponde a una segunda porci´ on del producto de traducci´on inversa de la secuencia de amino´acidos N-terminal de la toxina Brh-I. Las condiciones de PCR son como sigue: 1 minuto a 94◦ C; 2 minutos a 37◦C; aumento lento de la temperatura durante 3 minutos hasta 72◦C; 3 minutos a 72◦ C; on de ciclo extensi´on de 10 segundos del segmento de 72◦ C por ciclo durante 30 ciclos; y una extensi´ on de PCR se someten a final del segmento de 72◦ C durante 10 minutos. Los productos de la reacci´ electroforesis sobre un gel de agarosa al 2 % en tamp´on de TBE (Sambrook y otros, 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se retira una rodaja de gel que se espera que contenga el producto de aproximadamente 70 pb, y el DNA se a´ısla usando reactivos Geneclean (Bio101) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El DNA se reamplifica a continuaci´on usando los mismos cebadores y las mismas condiciones de PCR que se describen anteriormente. Los fragmentos de DNA a continuaci´ on se purifican en gel y se clonan en pTZ18R (BIO-RAD Laboratories) y tres clones se someten a secuenciaci´on. Los tres clones coinciden con la secuencia de Brh-I de la Tabla 1. Un cebador no degenerado, dise˜ nado para coincidir con una regi´ on de dentro de la secuencia amplificada (V´ease la Tabla 5) se marca en el extremo con 32 P y se usa para rastrear una biblioteca de cDNA de λZAPII elaborada a partir de mRNA de B. hebetor. Tres placas positivas se detectan en un rastreo de la biblioteca de aproximadamente 1,2 x 106 placas. Uno de los clones positivos de Brh-I tiene un tama˜ no del inserto de aproximadamente 3,0 kb, y los otros dos tienen cada uno insertos de aproximadamente 2,3 kb. TABLA 5

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Traducci´ on inversa y Amplificaci´ on por PCR de mRNA de toxina Brh-I Las secuencias de amino´acidos de los amino´acidos 2 a 32 del t´ermino N de la toxina Brh-I se muestra en la l´ınea 1. La secuencia nucleot´ıdica derivada mediante traducci´ on inversa de la secuencia de amino´acidos de Brh-I se muestra debajo de la secuencia de amino´ acidos en la l´ınea 2. Todos los posibles nucle´otidos en cada posici´on se indican; Y=C o T; R=A o G; M=A o C; W=A o T; H=A, C o T; N=A, C, T o G. Oligonucle´otidos degenerados correspondientes a la primera regi´ on subrayada y el complemento de la segunda regi´on subrayada se usan como cebadores de PCR para la amplificaci´ on a partir de mRNA de Brh-I. Las l´ıneas 3, 4 y 5 muestran la secuencia nucleot´ıdica de tres fragmentos de PCR clonados. Las secuencias subrayadas corresponden a regiones cebadoras. La l´ınea 6 muestra la secuencia del oligonucle´otido no degenerado que se us´ o como una sonda de hibridaci´ on para rastrear la biblioteca de cDNA de B. hebetor.

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Secuenciaci´ on de DNA y An´ alisis de la Secuencia. DNA de pl´ asmido pBluescript SK de doble cadena que contiene insertos de cDNA se genera a partir de clones de cDNA de λZAPII siguiendo el procedimiento de excisi´on in vivo descrito en el manual de instrucciones de λZAPII. Los t´erminos 5’ de los insertos de cDNA se someten a continuaci´on a amplificaci´ on por PCR usando el cebador indicado en la Tabla 5 acoplado con cebador inverso M13. Los productos de PCR de los t´erminos 5’ de los insertos de cDNA de 2,3 kb tienen secuencias id´enticas y el de la secuencia de cDNA de 3,0 kb es igual que los de cDNA de 2,3 kb excepto por ser m´as corto en cuatro nucle´ otidos. Los dos fragmentos XhoI de dentro del inserto de cDNA se subclonan en el vector pBluescriptSK+II, y se genera una serie de deleciones unidireccionales desde ambos extremos de cada clon. Ambas cadenas del cDNA se someten a secuenciaci´on en su totalidad, y se dan en la Tabla 2 (ID. SEC. N◦ : 4 e ID. SEC. N◦ : 5). Las secuencias nucleot´ıdicas y las secuencias de prote´ınas predichas se analizan con el grupo de programas de an´ alisis de secuencia IntelliGenetics.

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Ejemplo 5 Construcci´ on de Vectores

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Un pl´ asmido que contiene cDNA de Brh-I se libera de un aislado de λZAPII recombinante mediante excisi´on in vivo. El pl´ asmido se corta con Xbai y KpnI, se trata con Klenow en presencia de los cuatro dNTPs para hacer los extremos romos, y a continuaci´on el inserto que contiene cDNA se a´ısla en gel. El pl´ asmido pACJJ2 (obtenido del Dr. Just Vlak, Dept. of Virology, Agricultural Univ., Wageningen, Pa´ıses Bajos), que tiene un policonector en lugar del marco de lectura abierta de p10 completo, se corta con BamHI, los extremos se rellenan, se fosfatan con fosfatasa intestinal de ternero, y a continuaci´ on se liga con el cDNA de Brh-I aislado para formar pSCI810, como se muestra en la Figura 6. A continuaci´ on, pBluescript KS+ y pBluescript SK+ se digieren cada uno con KpnI y XholI, se tratan con Klenow en presencia de dNPT’s para hacer los extremos romos, y a continuaci´ on se religan para formar pBluescript KS+ ∆XK y pBluescript SK+ ∆XK, respectivamente. Cada uno de estos pl´asmidos se digiere a continuaci´on con ScaI y SalI. El mayor de los dos fragmentos del pBluescript KS+ ∆XK digerido con ScaI y SalI y el menor de los dos fragmentos del pBluescript SK+ ∆XK digerido con ScaI y SalI se a´ıslan y se ligan entre s´ı para formar pSCI235. Otro pl´ asmido, pSCI839, se construye subclonando un fragmento SalI de aproximadamente 3 kb que contiene un gen de polihedrina intacto en pSCI234 para formar pSCI839. El fragmento SalI que contiene el gen de polihedrina en pSCI839 se a´ısla de pSCI275, que es un vector de c´ osmido basado en pWE15 que contiene un segmento grande de DNA de AcNPV (clonado aleatoriamente a partir de AcNPV cepa LI) que incluye el gen de polihedrina. El pl´ asmido pSCI276 se forma cortando pSCI810 con PstI y SpeI, haciendo los extremos romos con DNA polimerasa de T4 en presencia de dNTPs, y se religa. pSCI276 se corta a continuaci´on con SphI y SmaI, los extremos SphI se hacen romos con DNA polimerasa de T4 en presencia de dNTPs, y un segmento de aproximadamente 2650 pb que contiene el cDNA de Brh-I conectado al promotor p10 se a´ısla y se clona en el sitio EcoRV u ´ nico de pSCI839 para formar pSCI277. El pl´ asmido pSCI277 tiene 9

ES 2 135 464 T3 un m´ odulo que contiene la regi´ on promotora p10 conectada al cDNA de Brh-I insertado en el sitio EcRV justo aguas arriba del gen de polihedrina intacto; se representa en la Figura 7. Despu´es de la transfecci´on de este pl´asmido con DNA de pl´asmido v´ırico de polihedrina, los virus recombinantes se seleccionan por su capacidad para formar placas polih´edricas. 5

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ES 2 135 464 T3 Listado de secuencias (1) INFORMACION GENERAL 5

(i) SOLICITANTE: Quistad, Gary B. Leisy, Douglas J. (ii) TITULO DE LA INVENCION: Toxinas Insecticidas de la Avispa Par´ asita Bracon Hebetor

10

(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 13 (iv) DIRECCION DE CORRESPONDENCIA: 15

(A) DIRECCION: Sandoz Agro Inc, Patent Dept. (B) CALLE: 975 Califorina Ave. (C) CIUDAD: Palo Alto

20

(D) ESTADO: CA (E) PAIS: EE.UU. de A. 25

(F) ZIP: 94304-1104 (v) FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible

30

(B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS 35

on N◦ 1.25 (D) SOPORTE LOGICO: PatentIn Release N◦ 1.0, Versi´ (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: (A) NUMERO DE SOLICITUD:

40

(B) FECHA DE PRESENTACION: (C) CLASIFICACION: 45

(viii) INFORMACION DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Giesser, Joanne M. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32.838

50

(C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: Z-703 (ix) INFORMACION DE TELECOMUNICACION: 55

(A) TELEFONO: (415) 354.3588 (B) TELEFAX: (415) 857-1125 (2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 1:

60

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

13

ES 2 135 464 T3 (A) LONGITUD: 45 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido 5

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına (iii) HIPOTETICO: NO

10

(iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal 15

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 1:

20

25

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 2: 30

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

35

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına

40

(iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

45

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 2:

50

55

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 3: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

60

(A) LONGITUD: 41 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

14

ES 2 135 464 T3 (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına 5

(iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

10

(ix) RASGO: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado 15

(B) SITUACION: 25..26 (C) OTRA INFORMACION: /marca = AA25 /nota = “el amino´acido N◦ 25 puede ser I o Q”

20

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 3:

25

30

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 4: 35

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2.387 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

40

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGIA: lineal 45

(ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´omico) (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO

50

(ix) RASGO: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS 55

(B) SITUACION: 85..2121 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 4:

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(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

60

(A) LONGITUD: 678 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

18

ES 2 135 464 T3 (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına 5

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 5:

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(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 6: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico 25

(C) TIPO DE CADENA: sencillo (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA

30

(iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO 35

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 6: ARYTGRAANA CYTTYTTYTG

20

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 7: 40

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases 45

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencillo (D) TOPOLOGIA: lineal

50

(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA (iii) HIPOTETICO: NO 55

(iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 7: GAYTTYTAYT AYACNGAYGT

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ES 2 135 464 T3 (2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 8: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencillo

10

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA 15

(iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 8:

20

GGAAATCTTG ATCAGCTATC AC ◦

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N : 9: 25

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

30

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına

35

(iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

40

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 9:

45

50

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 10: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 93 pares de bases

55

(B) TIPO: ´acido nucleico (D) TOPOLOGIA: sencillo

60

(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA (iii) HIPOTETICO: NO

22

22

ES 2 135 464 T3 (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 10: 5

10

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 11: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

15

(A) LONGITUD: 68 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencillo

20

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA

25

(iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 11:

30

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(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 12: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

40

(A) LONGITUD: 68 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencillo

45

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA 50

(iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 12:

55

60

(2) INFORMACION PARA LA ID SEC N◦ : 13:

23

ES 2 135 464 T3 (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 68 pares de bases 5

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencillo (D) TOPOLOGIA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA (iii) HIPOTETICO: NO 15

(iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: ID SEC N◦ : 13:

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ES 2 135 464 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Un polip´eptido aislado de la avispa Bracon hebetor, que exhibe toxicidad hacia insectos, tiene un peso molecular mayor que 70 kDa y comprende la secuencia de la ID SEC N◦ 1, la ID SEC N◦ 2 o la ID SEC N◦ 3. 2. Un polip´eptido que exhibe toxicidad hacia insectos, tiene un peso molecular mayor que 70 kDa y es al menos 80 % hom´ologo con uno de los polip´eptidos definidos en la reivindicaci´ on 1.

10

3. Un polip´eptido denominado Brh-1 aislado de la avispa Bracon hebetor, que exhibe toxicidad hacia insectos, tiene un peso molecular de m´ as de 70 kDa y tiene la secuencia de la ID SEC N◦ : 5. 4. Un polip´eptido que exhibe toxicidad hacia insectos, tiene un peso molecular mayor que 70 kDa y es al menos 80 % hom´ologo con el polip´eptido definido en la reivindicaci´ on 3.

15

5. Un a´cido nucleico que codifica un polip´eptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 6. Un a´cido nucleico de acuerdo con la reivindicaci´on 5, que es DNA.

20

7. Un vector que comprende el ´acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci´on 5. 8. Un baculovirus cuyo genoma comprende un a´cido nucleico de acuerdo con la reivindicaci´on 5.

25

9. Un m´etodo para controlar insectos, que comprende exponer los insectos a una cantidad para el control de insectos de un polip´eptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 10. Un m´etodo para controlar insectos, que comprende infectar a los insectos con un baculovirus definido en la reivindicaci´on 8.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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