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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 031 249 kInt. Cl. : A23L 1/30

11 N.◦ de publicaci´ on: 5

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˜ ESPANA

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C12H 1/00

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 88400094.4 kFecha de presentaci´on : 18.01.88 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 277 062 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 03.08.88

T3

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54 T´ıtulo: Procedimiento de aromatizaci´ on por tratamiento con levadura de productos alimenticios y

productos alimenticios obtenidos.

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73 Titular/es: Pernod-Ricard

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72 Inventor/es: Vladescu, Barbu Dinu Vladimir

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74 Agente: Curell Su˜ nol, Marcelino

30 Prioridad: 19.01.87 FR 8700501

142, Boulevard Haussmann F-75008 Paris, FR

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.12.92

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.12.92

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

2 031 249 DESCRIPCION

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La presente invenci´on se refiere a un procedimiento de aromatizaci´ on por tratamiento con levadura de productos alimenticios particularmente a base de materias primas vegetales, as´ı como a la aplicaci´on de este procedimiento para la mejora del aroma de preparaciones a base de frutas, y de legumbres. Por aromatizaci´ on, se entiende la regeneraci´on y/o el refuerzo de un perfil arom´ atico. Esta expresi´ on cubre la aparici´ on de nuevas aromas, as´ı como la desaparici´on de ciertos compuestos de olor desagradable, tal como el furfural. Esta definici´ on se aplica al conjunto del texto de la descripci´ on que sigue, as´ı como a las reivindicaciones. El desarrollo de las t´ecnicas de la industria agroalimenticia ha provocado, desde hace numerosos a˜ nos, un consumo muy importante de preparaciones a base de frutas, tales como los jugos de frutas, los concentrados, las compotas, etc. ...

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Estos productos est´ an preparados de tal manera que se pueden conservar, en su embalaje, durante algunas semanas, incluso algunos meses. A fin de obtener un producto “de larga conservaci´ on” es necesario someterlo a un tratamiento t´ermico tal como una esterilizaci´on o una pasteurizaci´on. Sin embargo, esta etapa, pr´ acticamente obligatoria, ocasiona, en numerosos casos, la p´erdida de una parte del aroma inicial de las materias primas. Por otra parte, algunas preparaciones est´ an naturalmente poco aromatizadas y ofrecen, por consiguiente, poco inter´es para el consumidor. En efecto, ´este prefiere los alimentos en los cuales se encuentra el aroma de los frutos frescos. Finalmente, la pasteurizaci´on de los pur´es de frutas conduce frecuentemente a la aparici´ on de furfural cuyo aroma es desagradable.

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La presente invenci´on tiene por objeto evitar los inconvenientes citados proponiendo un procedimiento de aromatizaci´on por tratamiento con levadura de productos alimenticios, en particular a base de materias vegetales, as´ı como la aplicaci´on de este procedimiento para la mejora del aroma de preparaciones a base de frutas, y de legumbres. La FR-A-511 967 describe un procedimiento que utiliza levadura alcoh´ olica para aumentar la finura de los aromas de algunos frutos y legumbres, pero no revela ni la elecci´ on espec´ıfica de las levaduras, ni sus actividad ester´asicas. ags. 147.154 describe el an´alisis de la actividad de las Cellular and Molecular Biology, 26 (1980), p´ estearasas en la levadura de panader´ıa. M´ as particularmente, la invenci´on se refiere a un procedimiento de aromatizaci´ on por tratamiento con levadura de productos alimenticios en particular a base de materias primas vegetales poco aromatizadas o desaromatizadas, o de composiciones a base de dichas materias, caracterizado porque dichas materias primas vegetales se tratan con un cultivo de levadura o un extracto acelular de dichas levaduras, presentando estas levaduras una baja actividad ester´asica. El tratamiento se efect´ ua preferentemente sin fermentaci´on alcoh´olica.

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Seg´ un una caracter´ıstica del procedimiento de la presente invenci´on, los productos, en particular las materias primas vegetales, o las composiciones se utilizan despu´es de tratamiento t´ermico. Se entiende por materias primas vegetales, por ejemplo unos jugos de frutas y unos pur´es de frutas frescas, concentrados de frutas, etc. ... Y se entiende por composiciones, unos productos elaborados, tales como unos jarabes, licores, etc. ... Finalmente, “extracto acelular” se refiere a una preparaci´ on de levadura que se ha molido y de la cual se han eliminado los residuos celulares. Seg´ un otra caracter´ıstica de la presente invenci´ on, se emplea, para la transformaci´ on con levadura, unas levaduras con actividad ester´ asica inferior o igual a 5 µmoles de p-nitrofenol/mg de prote´ınas celulares y preferentemente inferior a 2 µmoles de p-nitrofenol/mg de prote´ınas celulares. La presencia de ´esteres tienen una funci´ on importante en la constituci´ on del aroma de las materias primas vegetales. Ahora bien, se ha constatado que la capacidad ester´ogena de ciertas especies de levadu2

2 031 249 ras engendra la (re)generaci´on de aromas en unas preparaciones de frutas inoculadas con estas levaduras. La capacidad ester´ogena de las levaduras est´ a ligada a una baja actividad ester´ asica.

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Aunque la invenci´ on sea m´as particularmente interesante para el tratamiento de los productos de origen vegetal, puede ser utilizada para unos productos de origen diferentes, tales como productos l´acteos. En el marco de la presente invenci´on, se utilizan preferentemente unas levaduras del g´enero Williopsis, Pachysolen o Candida.

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Las experiencias que siguen, ilustran unas caracter´ısticas y unas ventajas de la presente invenci´ on, mientras que las figuras 1a y 1b ilustran el enriquecimiento del perfil arom´atico de un concentrado de frutas de la granadilla por un cultivo de una cepa de Candida humicola. Ejemplo 1

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Elecci´ on de las levaduras

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La elecci´on de las cepas de levaduras se realiza por la medida de la hidr´ olisis del p-nitrofenilacetato por las c´elulas de levaduras. Un mililitro de mezcla de reacci´on (p-nitrofenilacetato 2 mM en un tamp´ on fosfato 0,5 M, pH = 6,4) se incuba durante 10 min a 30◦C con una cantidad de c´elulas que representan 1 a 2 mg de prote´ınas celulares totales (las c´elulas provienen de un cultivo standard en fase estacionaria). La cantidad de p-nitrofenol producida por la hidr´ olisis del p-nitrofenilacetato se determina con el espectrofot´ ometro (λ = 405 nm) con la ayuda de una gama de soluciones de p-nitrofenol (0,01 a 0,1 µmoles). Los resultados est´an expresados en µmoles de p-nitrofenol por mg de prote´ınas celulares.

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Ejemplo 2 Materias primas 30

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Unos concentrados de uva, de manzanas, de melocotones y de frutos de la granadilla se llevan a 10◦ Brix (un dens´ımetro graduado en grados Brix peso da, por simple lectura, el peso de az´ ucar puro contenido en 100 g de una soluci´ on acuosa, a la temperatura de 15◦C) con agua y el pH es ajustado a 3,4-3,5. Los productos son esterilizados por filtraci´ on (filtro Millipore 0,22 mµ). Unos pur´es de fresas, bananas, peras y grosellas negras se preparan a partir de 200 g de frutas, trituradas con 50 ml de agua. Las preparaciones son a continuaci´ on tratadas al autoclave 20 min a 120◦C. Unos residuos de destilaci´on de mostos de pera fermentados se utilizan diluidos 1 : 2 con agua y tratados al autoclave 20 min a 120◦ C.

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Ejemplo 3 Condiciones de cultivo 45

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A partir de un cultivo de colecci´ on, se prepara un cultivo madre en medio standard (extracto de levaon constante dura 3% bactopeptona 5% extracto de malta 3% glucosa 10% incubado a 25◦C bajo agitaci´ (150 rotaciones por minuto). Las c´elulas de inicio de fase estacionaria son lavadas con agua fisiol´ ogica y 108 c´elulas sirven para inocular 200 ml de preparaci´ on de frutas, en unos frascos Erlenmeyer de 500 ml, provistos de tapones de algod´on. Los cultivos son colocados a 25◦C en un agitador giratorio, a 150 rotaciones por minuto. Despu´es de 16 horas, se eval´ ua la transformaci´ on arom´ atica de los productos por an´ alisis sensorial y por cromatograf´ıa en fase gaseosa. Ejemplo 4 Resultados

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Se efect´ uan unos ensayos sobre unas cepas que provienen de colecciones p´ ublicas y privadas. Se eval´ ua la actividad ester´ asica de cada levadura y se anotan las transformaciones arom´aticas operadas para cada 3

2 031 249 preparaci´ on de frutas. La tabla I da el conjunto de los resultados de estos ensayos.

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Se constata que las levaduras que poseen una actividad ester´ asica inferior o igual a 5 µmoles de pnitrofenol (PNP) por mg de prote´ınas celulares son las m´as rendibles desde el punto de vista arom´ atico. Es en particular el caso para Williopsis saturnus, Pachysolen taunophilus y Candida humicola. La tabla II reune otras levaduras que tienen actividades ester´ asicas superiores a 5 µmoles ensayadas que no dan mejora significativa del aroma de las preparaciones de frutas.

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Las figuras 1a y 1b ilustran el enriquecimiento del perfil arom´ atico de un concentrado de frutas de la granadilla por cultivo de una cepa de Candida humicola. La figura 1a representa m´ as precisamente el perfil arom´ atico del concentrado diluido de frutas de granadilla por cromatograf´ıa en fase gaseosa. La figura 1b representa el perfil del mismo concentrado dilu´ıdo despu´es de tratamiento con una cepa de Candida humicola. Las referencias cifradas a 1 a 5 corresponden respectivamente a la aparici´on de los compuestos siguientes: isopentanol, a´cido isobut´ırico, alcohol furfur´ılico, alcohol benc´ılico, feniletanol. El efecto de mejora del aroma se traduce por la reconstituci´on del aroma inicial perdido en el curso de la esterilizaci´on t´ermica (pur´e de frutas) con el curso de la fabricaci´ on (concentrado de frutas).

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Se constata un reforzado del aroma t´ıpico de frutas en ciertas preparaciones d´ebilmente arom´aticas. Se crean nuevos aromas afrutados, inexistentes en el producto de origen pero susceptibles de aportar los perfumes agradables a la materia prima en cuesti´on. 25

Finalmente, algunos compuestos con olor desagradable, aparecidos cuando tiene lugar el tratamiento t´ermico desaparecen (por ejemplo, el furfural que es reducido a alcohol correspondiente y es a continuaci´ on esterificado). 30

TABLA I Actividad ester´ asica Residuo µmoles PNP/mg melo- uva grana- man- fre- ba- grode prote´ınas cot´ on dilla zana sa nana sella peras

Levadura 35

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B-Intermedius CBS 247 C-sorboxilosa CBS 2121 H-anomala CBS 247 Williopsis Saturnus CBS 1994 W. saturnus CBS 5761 W. saturnus CBS 4610 W. saturnus ENSIA Pachysolen taunophilus CBS 4044 P. taunophilus CBS 4045 P. taunophilus A.P. James* p126-1B Candida humicola CBS 2040

11,6 11,4 10,9

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2,7 3,6 3,2 2,9 1,8 2,4 1,9 1,7

RA AN RA AN RA RTA RTA

AN AN AN AN

AN AN AN RA RTA RTA

* A.P. James - National Research Council of Canada, Ottawa 55

AN : aroma nuevo RA : regeneraci´on del aroma inicial

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RTA : reforzamiento del aroma (Tabla II pasa a p´ agina siguiente) 4

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RA RA AN RA AN RA - RTA RTA - RTA RA AN RTA RA RA RTA

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RA RA RTA RTA

AN AN RA RA RA RA RA

2 031 249 TABLA II Levaduras 5

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Saccharomyces cerevisiae ATCC 36012 S. chevalieri ENSIA L 2010 S. bayanus CBS 429 S. Diastaticus H. Tamuaki(1) 5305-9D Zygosaccharomyces rouxii CBS 441 Schizosaccharomyces pombe CBS 1042 Saccaromycodes ludwigii CBS 1169 Kluyveromyces lactis CBS 4372 Dekkera intermedia CBS 2796 Hansenula anomala CBS 263 H. anomala CBS 442 H. anomala CBS 1683 H. anomala CBS 1685 H. anomala ENSIA H. anomala CRPR(2)-M4 9 Brettanomyces intermedius CBS 73 B. claussenii CBS 4608 B. claussenii CBS 4461 B. lambicus CBS 5206 Candida humicola CBS 2040 C. krusei CBS 2048 C. glabrata CBS 2663 (1): H. Tamaki Doshisha Women’s College, Kyoto 602, Jap´ on (2): Centre de Recherche Pernod-Ricard ATCC : American Type Culture Collection CBS : Centraal Bureau voor Schimmel Culture Delft Holland

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2 031 249 REIVINDICACIONES

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1. Procedimiento de aromatizaci´on por tratamiento con levaduras de productos alimenticios, particularmente a base de materias primas vegetales poco aromatizadas o desaromatizadas, o de composiciones a base de dichas materias, caracterizado porque dichos productos se tratan con un cultivo de levadura o un extracto acelular de dichas levaduras, presentando estas levaduras un extracto acelular una actividad ester´ asica inferior o igual a 5 µmoles de p-nitrofenol/mg de prote´ınas celulares, preferentemente inferior o igual a 2 µmoles de p-nitrofenol/mg de prote´ınas celulares. 2. Procedimiento de aromatizaci´on por tratamiento con levaduras seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque, despu´es de tratamiento t´ermico dichos productos particularmente a base de materias primas vegetales, se someten a tratamiento con cultivo de levaduras o extracto acelular. 3. Procedimiento seg´ un una de la reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque dichas levaduras se eligen de entre el grupo formado por las levaduras del g´enero Williopsis, Pachysolen y Candida. 4. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dichas levaduras se eligen de entre el grupo formado por Williopsis saturnus, Pachysolen taunophilus y Candida humicola.

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5. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las materias primas vegetales de las composiciones se eligen entre los zumos y los pur´es de frutas frescas y de legumbres, los concentrados de frutas, y los residuos de destilaci´on de frutas. 6. Productos alimenticios obtenidos por el procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 5.

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