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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

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A23J 3/34

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 94110229.5 kFecha de presentaci´on: 30.06.1994 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 631 731 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 04.01.1995

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54 T´ıtulo: Hidrolizado parcial de prote´ınas de la leche y procedimiento de preparaci´ on.

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73 Titular/es: Bristol-Myers Squibb Company

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72 Inventor/es: Martinez, Sarah B.;

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74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

30 Prioridad: 30.06.1993 US 85213

345 Park Avenue New York, N.Y. 10154, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.11.2001

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 160 606 T3

16.11.2001

Aviso:

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Leary, H. Lee, Jr. y Nichols, Debra J.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 160 606 T3 DESCRIPCION Hidrolizado parcial de prote´ınas de la leche y procedimiento de preparaci´on. 5

La presente invenci´on se refiere a un procedimiento para la preparaci´ on enzim´atica de un hidrolizado parcial de prote´ınas de la leche y productos preparados de f´ ormula para ni˜ nos, de antigenidad reducida, que contienen el mencionado hidrolizado. Antecedentes de la invenci´ on

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Numerosas f´ormulas infantiles est´an basadas en prote´ınas de la leche de vaca. Los ni˜ nos que son realmente al´ergicos a las prote´ınas de la leche de vaca requieren f´ ormulas infantiles en las que las prote´ınas est´an extensamente hidrolizadas para contener un m´ınimo de estructuras moleculares. Para ni˜ nos no al´ergicos, una f´ormula infantil con una antigenidad reducida tiene beneficios profil´ acticos en cuanto a que puede retrasar o impedir una sensibilizaci´on que de otra forma podr´ıa conducir a s´ıntomas cl´ınicos de alergia. El potencial alerg´enico de las f´ormulas basadas en prote´ınas de leche de vaca puede reducirse por hidr´ olisis de las prote´ınas. Para satisfacer idealmente la composici´ on de la leche humana, las prote´ınas de la leche de vaca en f´ ormulas infantiles deben contener prote´ınas de suero y case´ına en una proporci´ on apropiada. Si bien algunos productos basados en prote´ınas intactas de leche satisfacen una relaci´ on deseable de prote´ınas de suero a case´ına, casi todas las f´ ormulas parcialmente hidrolizadas disponibles comercialmente est´ an basadas en 100 % de prote´ına de suero. Los procedimientos para la preparaci´ on de hidrolizados parciales descritos en la literatura generalmente implican hidr´olisis parcial y separaciones en m´ ultiples etapas despu´es de la hidr´ olisis para eliminar enzimas y/o prote´ınas residuales. La mayor´ıa de los procedimientos implica tambi´en un control constante del pH durante la hidr´ olisis. Tambi´en, a no ser que se introduzca otra etapa, el hidrolizado resultante usualmente tendr´ a un nivel alto de sales que pueden plantear problemas de formulaci´ on en las f´ormulas infantiles, cuyo nivel de minerales usualmente se regula a un cierto nivel. atica para conseguir un hidroLa patente U.S. n◦ . 5.039.532 describe dos etapas de hidrolisis enzim´ lizado de las caracter´ısticas deseadas. Tambi´en describe la preparaci´on de una f´ ormula infantil que se esteriliza a temperatura ultraalta (UHT). Gmoshinsky y otros describen en Vopr. Pitan., 3, 21-27 (1991) preparados derivados de prote´ınas de leche de vaca con una antigenidad aminorada. Las patentes U.S. n◦ . aticas, cuya 4.293.571 y n◦ . 4.981.704 describen hidrolizados parciales preparados usando enzimas pancre´ preparaci´ on implica procedimientos de membrana posteriores a la hidr´olisis para separar las prote´ınas y enzimas residuales. Una caracter´ıstica com´ un de los hidrolizados de prote´ınas, en particular de hidrolizados que contienen case´ına, es el desarrollo de un sabor amargo supuestamente debido a la liberaci´ on de p´eptidos con grupos terminales hidr´ ofobos. Adem´ as, por lo general, a medida que aumenta el grado de hidr´ olisis, se aminora la capacidad emulsiva de las prote´ınas. La patente japonesa 1160458 describe un hidrolizado de prote´ına de leche (hidrolizada en 5-20 %) que es tensoactivo y presenta una actividad emulsiva en alimentos tales como helados y batidos. Sin embargo, en productos tales como f´ ormulas l´ıquidas infantiles que se someten a procesos de esterilizaci´on, la mayor desnaturalizaci´ on del hidrolizado de prote´ına lo hace menos funcional en una emulsi´ on. Esto se manifiesta en el producto como una separaci´ on de suero y capa de crema. Com´ unmente se prefieren las condiciones de alta temperatura-tiempo corto de la esterilizaci´on UHT a la esterilizaci´on convencional en retorta para evitar la exposici´ on adversa al calor. Por todo ello, ser´ıa muy deseable tener un hidrolizado parcial de prote´ına que tuviera una antigenidad reducida, una relaci´ on de prote´ınas de suero a case´ına que proporcionara una composici´ on de prote´ınas similar a la de la leche humana, un sabor mejor y/o una mejor actividad emulsiva. Sumario de la invenci´ on La presente invenci´on est´a dirigida a un hidrolizado parcial de una mezcla de prote´ınas, en la que la mencionada mezcla de prote´ınas comprende prote´ınas de suero y case´ına, hidrolizado que tiene un grado de hidr´olisis entre 4 y 10 %, y a una f´ ormula infantil que contiene el mencionado hidrolizado parcial.

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La presente invenci´on est´a dirigida tambi´en a un procedimiento para preparar un hidrolizado parcial de una mezcla de prote´ınas, que comprende poner en contacto una mezcla de prote´ınas de suero y case´ına con una mezcla de enzimas que comprende como m´ınimo 1800 unidades USP de tripsina/mg y como m´ınimo 2

ES 2 160 606 T3 350 unidades USP de quimotripsina/mg en una suspensi´ on acuosa en condiciones que dan lugar a una hidr´ olisis de entre 4 y 10 %, siendo la relaci´ on de unidades USP de tripsina a quimotripsina de 1,3 a 18. Descripci´ on detallada de la invenci´ on 5

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La presente invenci´on proporciona un hidrolizado parcial de una mezcla de prote´ınas de suero y case´ına que es apropiado para la producci´ on de productos nutritivos de antigenidad reducida, as´ı como a un procedimiento para su preparaci´ on. El hidrolizado parcial de la invenci´ on tiene comparativamente una relaci´on de prote´ınas de suero/case´ına m´ as pr´ oxima a la de la leche humana que la de los hidrolizados parciales de prote´ınas de la t´ecnica anterior. Adem´ as, el hidrolizado parcial de la invenci´ on preferiblemente tiene un sabor mejor y una mejor actividad emulsiva. El procedimiento de la invenci´on puede efectuarse usando materiales de partida que constan de mezclas de prote´ına de suero y case´ına, preferiblemente en relaci´on similar a la encontrada en la leche humana. Preferiblemente, la mezcla de prote´ınas comprende de 60 a 80 % de prote´ınas de suero y de 40 a 20 % de case´ına, m´ as preferiblemente de 40 a 60 % de prote´ınas de suero y de 60 a 40 % de case´ına. Los porcentajes de case´ına y prote´ınas de suero se dan en base ponderal. Las prote´ınas de suero pueden aprovisionarse de un suero obtenido de la producci´ on de queso, en particular un suero fresco tal como el resultante de la coagulaci´ on de case´ına con cuajo. Las prote´ınas de suero tambi´en pueden usarse en forma de concentrados en la franja de 35 a 80 % de prote´ına obtenidos por ultrafiltraci´ on (suero UF). Opcionalmente, este material de suero puede desmineralizarse por intercambio i´ onico y/o electrodi´alisis (suero ED). La fuente de case´ına puede ser case´ına a´cida o s´olidos de leche no grasa (NFDM). Las prote´ınas de suero y la case´ına pueden usarse en forma de concentrados l´ıquidos o polvos. Para el procedimiento de esta invenci´on, las prote´ınas se diluyen o reconstituyen com soluciones que contienen de 10 a 60 g de prote´ına por litro, preferiblemente de 40 a 60 gramos de prote´ına por litro. Para el procedimiento de la presente invenci´on se usa una mezcla de tripsina y quimotripsina, cuyas especifidades enzim´aticas son complementarias. Preferiblemente, la mezcla de enzimas est´ a exenta de proteasas contaminantes tales como carboxipeptidasa A y B o aminopeptidasa de leucina. La tripsina de la mezcla tiene 800 unidades USP/mg o m´as, preferiblemente 1000 unidades USP/mg o m´ as y, m´as preferiblemente, 1800 unidades USP/mg o m´ as. Una unidad USP de tripsina es la actividad que causa un cambio de absorbancia de 0,003 por ciento en las condiciones de un tiempo de ensayo de 5 min, un pH de 7,6, a 25±0,1◦C e hidrocloruro del ´ester N-benzo´ıl-L-arginina etilo (BAEE) como sustrato. La quimotripsina de la mezcla tiene 150 unidades USP/mg o m´ as, preferiblemente 200 unidades UPS/mg o m´as, m´as preferiblemente 350 unidades UPS o m´ as. Una unidad UPS de quimotripsina es la actividad que causa un cambio de absorbancia de 0,0075 por minuto en las condiciones indicadas de 5 minutos de duraci´ on del ensayo, pH 7,6, temperatura de 25±0,1◦C con N-acetil-L-tirosina etil ´ester (ATEE) como sustrato.

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Entre las fuentes comerciales de enzimas adecuadas para uso en la presente invenci´on est´an incluidas Novo Nordisk Bioindustries, Inc., Danbury, CT, USA, (en particular PEM 2500S); Enzyme Development Corp., New York, NY, USA; Intergen Company, Purchase, NY, USA y Scientific Protein Labs., Waunakee, WI, USA. 45

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Para obtener un hidrolizado de las propiedades deseadas, t´ıpicamente es necesario que la mezcla de tripsina y quimotripsina tenga una relaci´ on de tripsina a quimotripsina de 1,3 a 18 en las unidades USP descritas antes, preferiblemente de 1,3 a 10 y, m´ as preferiblemente, de 4 a 6. A los fines de la invenci´on, la mezcla de enzimas t´ıpicamente se usa a niveles de 0,4 % a 1,2 % en peso del total de prote´ına que se est´a hidrolizando, preferiblemente de 0,6 % a 0,8 % en peso. Una etapa opcional preliminar, anterior a la hidr´ olisis, es el precalentamiento de la soluci´ on de prote´ına para asegurar la desnaturalizaci´on de las fracciones de prote´ınas de suero, esto es, alb´ umina de suero (BSA) e inmunoglobulinas (en particular, IqG). Usualmente esta etapa da por resultado una antigenidad residual disminuida cuando se eval´ua inmunoqu´ımicamente (como se describe posteriormente). La etapa de precalentamiento se realiza, t´ıpicamente, calentando a 75◦C 85◦ C durante 10 a 30 minutos. La propia hidr´ olisis se realiza t´ıpicamente a temperaturas entre 30◦C y 50◦ C inclusive durante de 2 a 6 horas, correspondiendo el l´ımite inferior de temperaturas al l´ımite superior de tiempos, y viceversa. T´ıpicamente no se requiere el mantenimiento del pH durante la hidr´olisis, ya que usualmente transcurre a pH de 6,6-6,8 sin control adicional del pH. El pH debe mantenerse en la franja de 6,5 a 8,0 con o sin control. Independientemente de las condiciones de hidr´ olisis, preferiblemente el hidrolizado se somete a una 3

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etapa adicional de inactivaci´ on de las enzimas. Esta inactivaci´on de las enzimas puede ser un tratamiento t´ermico que comprende el calentamiento a la temperatura de 85◦C durante 10 minutos. Alternativamente, la enzima puede ser inactivada por esterilizaci´on a temperatura ultraalta (por ejemplo, a 130◦C durante 45 segundos), pudiendo almacenarse despu´es el producto en estado l´ıquido. Tambi´en puede concentrarse el hidrolizado por evaporaci´ on o secarse por proyecci´on. Para controlar el grado de hidr´ olisis se usa el m´etodo de titulaci´ on con formol de la United States Pharmacopeia (USP), en el que el aumento de grupos amino libres durante la hidr´ olisis de las uniones pept´ıdicas puede estimarse por titulaci´on con hidr´ oxido s´ odico. El grado de hidr´ olisis es de entre 4 % y 10 %, preferiblemente de entre 5 % y 7 %. Es una ventaja de la presente invenci´on que el grado de hidr´ olisis sea m´as bajo que el conseguido en ciertos procedimientos de la t´ecnica anterior; a pesar de ello, se obtiene una reducci´on significativa de la antigenidad. Para la determinaci´ on de la distribuci´ on del peso molecular de los p´eptidos del hidrolizado se utiliza la cromatograf´ıa de exclusi´on por tama˜ nos (SEC). Los p´eptidos del hidrolizado se separan de acuerdo con su tama˜ no molecular en una columna TSK-G2000 SWXL mantenida a 37◦C y eluida a 0,7 ml/min con TFA y acetonitrilo en KCl. Se genera la funci´ on de la absorci´ on a 214 nm frente a tiempo de retenci´ on con un detector de UV y se compara con las de prote´ınas y p´eptidos patr´ on de peso molecular conocido. El hidrolizado parcial de la invenci´ on tiene preferiblemente un peso molecular medio de 2.000, un peso molecular m´aximo de 19.000 y consta de p´eptidos con la siguiente distribuci´on, como funci´ on de su masa molar: Masa Molar (g por mol)

Distribuci´ on del peso molecular, %

MM>5000 5000>MM>3000 3000>MM>2000 2000>MM>1000 1000>MM>500 MM5000 5000>MM>3000 3000>MM>2000 2000>MM>1000 1000>MM>500 MM