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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on:

2 174 328

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 97952968.2 kFecha de presentaci´on: 22.12.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 948 340 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 13.10.1999

T3

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54 T´ıtulo: Substancias con actividad biol´ ogica, su procedimiento de obtenci´ on y las composiciones

que las incluyen.

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30 Prioridad: 27.12.1996 FR 96 16116

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73 Titular/es: Inovat Sarl

c/o Cabinet Ellouze, Cite Mahrajane, Immeuble Chiaar, Appartement A Tunis 1002, TN

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45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.11.2002

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 174 328 T3

01.11.2002

Aviso:

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72 Inventor/es: Gutierrez, Gilles;

Serrar, Mostafa; Viornery, Lionel y Norton, James

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74 Agente: Gil Vega, V´ıctor

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 174 328 T3 DESCRIPCION Substancias con actividad biol´ ogica, su procedimiento de obtenci´ on y las composiciones que las incluyen. 5

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La presente invenci´on se refiere al a´mbito de la bioqu´ımica, y m´as precisamente a compuestos biol´ogicos de origen vegetal. La presente invenci´on se refiere a nuevas substancias con actividad biol´ ogica extra´ıdas de la piel del fruto de plantas con metabolismo CAM, a su procedimiento de obtenci´ on y a las composiciones farmac´euticas, cosm´eticas y/o alimentarias que las contienen. Las composiciones de la presente invenci´on est´an destinadas para acelerar y ampliar la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (o prote´ınas de estr´es) de las c´elulas de los seres vivos. En efecto, las condiciones de estr´es o de agresi´on alteran naturalmente la calidad de la s´ıntesis de las prote´ınas. Las eucariotas est´an llamadas para desarrollar v´ıas metab´olicas destinadas a preservar su estructura. Las plantas con metabolismo CAM pertenecen principalmente a las familias de las Cact´aceas, Crasul´ aceas y de las Saxifrag´ aceas, que forman la u ´nica entidad susceptible de desarrollar este tipo de metabolismo. Estas plantas est´an particularmente adaptadas a las condiciones clim´ aticas severas y presentan un metabolismo clorof´ılico particular que hace intervenir un ciclo del carbono, llamado CAM (“Crassulacees Acid Metabolism”). Algunas plantas son aptas para vivir en unas condiciones estresantes (es particularmente el caso de las plantas que viven en las zonas ´aridas de los desiertos calientes o fr´ıos o en las zonas de altura), y presentan un metabolismo particular de incorporaci´ on del CO2 , llamado CAM. Las plantas de la familia de las Cact´aceas, Crasul´ aceas y de las Saxifrag´ aceas est´an bien adaptadas para estas condiciones de estr´es t´ermico. La s´ıntesis de las substancias biol´ ogicas que activan o ampl´ıan la expresi´ on de las prote´ınas de choque t´ermico es sobre todo abundante en el fruto durante su formaci´ on; la maduraci´ on del fruto se realiza especialmente en per´ıodo de retorno a una temperatura normal. El fruto al estar muy expuesto al calor, cabe pensar que dispone de medios para proteger sus s´ıntesis proteicas. Esta medida de protecci´on podr´ıa encontrarse igualmente en otras especies vivas. Entre las plantas con metabolismo CAM, se citar´an particularmente las Cact´ aceas. Las Cact´aceas constituyen una familia de plantas dicotiled´oneas, com´ unmente llamadas cactus, apreciadas por sus formas curiosas y sus flores brillantemente coloreadas. Uno de los g´eneros m´as extendidos de la familia de las Cact´aceas est´a constituido por las Opuntias. La Opuntia ficus-indica o chumbera (familia de las Cact´ aceas) est´a formada por segmentos aplastados, de forma oval, las “raquettes”, cuya superficie est´ a salpicada de areolas. Cada una de ellas comprende un punto vegetativo durmiente, protegido por sedas, pelos arpados o pelos vegetales curvados (caracter´ısticas del g´enero), espinas; las mismas constituyen as´ı el hom´ ologo de las yemas. En los brotes j´ ovenes, las areolas est´an axiladas por hojitas carnosas, r´ apidamente caducas. El crecimiento y la proliferaci´on de los organismos vivos suponen una gran autonom´ıa no solamente para restaurar el material gen´etico, garante de la perpetuidad de la especie, sino tambi´en para reparar las lesiones de su cuerpo, con el fin de preservar su integridad. Estas dos necesidades recurren a sistemas biol´ ogicos complementarios. Se han descubierto ya diversos mecanismos utilizados por las c´elulas para asegurar la conservaci´on intacta del patrimonio gen´etico; a t´ıtulo de ejemplo, se puede citar el sistema de la prote´ına p 53. De igual modo, existen mecanismos para asegurar la conformidad estructural de las prote´ınas elaboradas a partir de la trascripci´ on de las informaciones contenidas en el genoma. Estos mecanismos de protecci´on de s´ıntesis utilizan diversos procedimientos y, entre estos, la s´ıntesis de lo que se llama “prote´ınas de choque t´ermico”, aunque las mismas no respondan u ´ nicamente de forma espec´ıfica a los estreses t´ermicos. El t´ermino estr´es debe ser tomado en el sentido amplio: comprende estreses de diversos or´ıgenes, ya se trate de elevaci´on de temperatura (de ah´ı el nombre de prote´ınas de choque t´ermico), de estreses oxidativos, de irradiaciones a los UV, de infecciones virales o bacterianas, o de estreses consecutivos a diversos est´ımulos tales como una privaci´on nutricional, una agresi´ on mec´anica o un choque metab´ olico. Es por lo que, las prote´ınas de choque t´ermico se sintetizan por las c´elulas para responder tanto a las agresiones de origen qu´ımico (venenos, ...), f´ısico (radiaciones ionizantes, osmolaridad, pH,...) biol´ ogico (citoquinas), o mec´anico. Las prote´ınas de choque t´ermico (HSP) son prote´ınas encargadas de proteger la c´elula, y m´ as particularmente las s´ıntesis proteicas, de las agresiones de cualquier origen. Con la edad, las capacidades de 2

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s´ıntesis proteicas disminuyen considerablemente, y por este motivo el comportamiento para responder a una agresi´ on se adapta cada vez menos. Esto tiene por consecuencia la muerte de numerosas c´elulas, el defecto de protecci´ on, y una disminuci´ on del capital celular, que se traduce, particularmente a nivel de la piel de los mam´ıferos, por la disminuci´on del n´ umero de queratinocitos disponibles para proteger la dermis. El tiempo de exposici´on al sol y las variaciones de temperatura inducen agresiones que agreden las c´elulas. La piel del joven adulto humano est´ a particularmente bien adaptada para responder r´ apidamente a la agresi´ on pues la misma es capaz de sintetizar grandes cantidades de prote´ınas de choque t´ermico para proteger la conformaci´ on de las prote´ınas en el transcurso de la s´ıntesis. Con la edad, las capacidades de s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico disminuyen.

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La protecci´on solar de la piel es una de los cuidados m´ as solicitados por los consumidores y los m´as recomendados por los prescriptores. La variabilidad de la capa de ozono protectora, la b´ usqueda del calor estival, las posibilidades de viaje a los tr´opicos han agravado considerablemente el riesgo de aparici´on de los trastornos cut´ aneos que tienen por origen la exposici´on solar y la agresi´on t´ermica. Hoy en d´ıa, la protecci´on con respecto a las radiaciones UV e IR existe bajo diferentes posibilidades de filtraci´on o de reflexi´ on, pero, no existen productos para aplicar sobre la piel, para protegerla contra el calor o un fr´ıo excesivo. El cuerpo utiliza las prote´ınas de choque t´ermico para prevenir los da˜ nos inducidos por numerosos tipos de agresi´ on: agresiones que provienen del exterior (radiaci´on fotoluminosa, t´ermica, compuestos qu´ımicos o biol´ ogicos), pero tambi´en agresiones que provienen del interior (hipertermia, hipotermia, variaci´ on de los par´ametros biol´ ogicos, como por ejemplo la osmolaridad, la concentraci´ on de algunas substancias, etc...).

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Las prote´ınas de choque t´ermico se llaman tambi´en prote´ınas de estr´es, prote´ınas de choque o, en terminolog´ıa anglosajona, “heat shock protein”; la terminolog´ıa cient´ıfica las denomina HSP. Estas prote´ınas pueden tambi´en llamarse, en algunos casos, prote´ınas caperuzas, y para otras, “glucose regulated protein” (GRP).

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Las prote´ınas de choque t´ermico (HSP) reagrupan un n´ umero muy elevado de mol´eculas. Tambi´en, para simplificar su denominaci´ on, se ha convenido definirlas espec´ıficamente por su peso molecular, expresado en kilodaltons (kDA). Se distinguen as´ı diferentes grupos de HSP: las hsp 110, (110 kDa), hsp 90 (90 kDa), hsp 70 (70 kDa) que representan la familia m´as grande de hsp; las hsp 60, (60 kDa), hsp 47, (47 kDa) y las hsp de tama˜ no peque˜ no (o sea entre 16 y 40 kDa). Las prote´ınas de choque t´ermico constituyen una gran familia molecular que interviene en el mantenimiento de la conformaci´ on espacial de las prote´ınas. Es as´ı como en una elevaci´on de temperatura, las prote´ınas ven su estructura espacial modificada (se trata del mismo fen´ omeno que la coagulaci´ on de la alb´ umina en medio a´cido).

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El gran n´ umero de HSP proviene del hecho de que las mismas act´ uan con una especificidad que depende del tipo celular, de su destino o tambi´en del tipo de estr´es. As´ı, cada miembro de la familia de las HSP tiene una funci´ on bien precisa y los puntos de intervenci´ on son muy numerosos. Las HSP se aplican no solamente en las etapas post-traduccionales que se inscriben en una funci´on normal de la s´ıntesis y de la vida de las prote´ınas, como la colocaci´on de la conformaci´ on y su transporte, sino tambi´en a nivel de acontecimientos que alteran la s´ıntesis proteica interviniendo en la selecci´on de las v´ıas metab´olicas: restauraci´ on, destrucci´on y eliminaci´on de los substratos modificados. Algunas HSP tienen una acci´ on que se desarrolla durante una agresi´ on t´ermica, otras solo juegan su papel en presencia de un riesgo qu´ımico. Existe pues un gran n´ umero de prote´ınas de choque, cada una adaptada a un mecanismo particular de protecci´on. Estas substancias, de naturaleza proteica, est´an codificadas por genes para los cuales la localizaci´on cromos´omica solo est´a establecida para algunos. Es preciso notar que estas substancias se mantienen en condiciones de una forma completamente constante a todo lo largo de la filogenia tanto en el plano de la secuencia como de la funci´on, lo cual quiere decir que las consecuencias del est´ımulo o las modificaciones de la s´ıntesis se encuentran de nuevo no solamente con c´elulas humanas, sino sin duda con las c´elulas de todas las especies animales. Aunque las HSP 70 se sinteticen de forma constitutiva, para resistir a las agresiones, las c´elulas sintetizan, en caso de necesidad, grandes cantidades de estas prote´ınas. Por consiguiente es posible tratar c´elulas mediante estas substancias proteicas para mejorar su viabilidad frente a un estr´es. Se puede por consiguiente intervenir sobre la mejora de la viabilidad celular a˜ nadiendo estas substancias bien sea en el medio nutritivo, o en el n´ ucleo mismo de las c´elulas. Su acci´on ha sido estudiada, gracias a la ingenier´ıa gen´etica o la biolog´ıa molecular, vectorizando los genes codantes para las HSP. 3

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Las t´ecnicas de adici´on presentan numerosos inconvenientes para los organismos pluricelulares: - no es posible dirigir las c´elulas en cuesti´on, 5

- la sustancia puede ser destruida en los medios extracelulares, - no es posible aportar una prote´ına a numerosas c´elulas. Las t´ecnicas de biolog´ıa molecular presentan tambi´en inconvenientes principales:

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- el n´ umero muy elevado de HSP y su especificidad hacen las operaciones delicadas, numerosas y fastidiosas, - la amplificaci´on del genoma-codante cortocircuita las regulaciones, 15

- no es posible hoy en d´ıa controlar la s´ıntesis de la prote´ına, - durante la transfecci´ on g´enica, la prote´ına est´a siempre sobreexpresada sean cuales fueren las circunstancias.

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La producci´ on de las HSP por inducci´ on de la trascripci´ on (s´ıntesis de los ARNm a partir del ADN) o de la traducci´on (s´ıntesis de las prote´ınas por los ribosomas a partir de los ARNm) es posible si se dispone de substancias farmacol´ ogicas que act´ uen bien sea a nivel de la membrana pl´ asmica, o en el citoplasma, o incluso a nivel nuclear.

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La Firma solicitante ha encontrado, en las plantas con metabolismo CAM, y m´as particularmente en el fruto de las plantas de la familia de las Cact´aceas, substancias susceptibles de proteger las s´ıntesis proteicas. Despu´es de diversas investigaciones, se ha descubierto, de una manera sorprendente, que estas substancias eran reconocidas por las c´elulas animales.

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La presente invenci´on tiene por objeto nuevas substancias de actividad biol´ ogica, particularmente para el metabolismo de las HSP, no cito-t´ oxicas, separadas de las plantas con metabolismo CAM, como las plantas de la familia de las Cact´ aceas, Crasul´ aceas y de las Saxifrag´ aceas. La presente invenci´on se refiere particularmente a las substancias obtenidas de la piel del fruto de las plantas de la familia de las Cact´ aceas, y m´ as precisamente de la piel del fruto de Opuntia, y principalmente las de la chumbera. La presente invenci´on se refiere tambi´en a un procedimiento de obtenci´ on de las substancias con actividad biol´ ogica, no citot´oxicas, aisladas de las plantas con metabolismo CAM. El procedimiento de obtenci´ on de las substancias con actividad biol´ ogica, no citot´ oxicas, se caracterizada porque se somete una fruta de una planta con metabolismo CAM a un secado, luego a una deshidrataci´ on, seguida de un agotamiento mediante un disolvente org´anico polar para obtener un extracto org´ anico de fruto, se diluye este extracto con agua, se purifica el extracto diluido mediante agotamiento con hexano, se separa la fracci´ on org´ anica hex´ anica que se evapora a sequedad a vac´ıo, y se obtiene la fracci´ on activa del fruto de planta con metabolismo CAM, a saber la que contiene las indicadas substancias de actividad biol´ ogica. La fracci´on activa se seca todav´ıa, y eventualmente se recupera mediante un disolvente biocompatible tal como el etanol, o mediante un disolvente adecuado seg´ un las operaciones deseadas.

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Se utiliza el fruto de la planta con metabolismo CAM y particularmente la piel del fruto de las plantas de la familia de las Cact´aceas. El fruto de la planta con metabolismo CAM es un fruto de la planta de la familia de las Cact´aceas, y particularmente el fruto de Opuntia, y espec´ıficamente la chumbera. 50

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Por el documento DE 1617409 se desprende que los cladodios de Opuntia indica, es decir ramas aplastadas que simulan las hojas, han sido ya utilizadas en terap´eutica, en particular como agente antiviral no citot´ oxico y administrado por v´ıa t´ opica. Sin embargo, nada en la literatura anterior permit´ıa deducir que los frutos, y m´as particularmente las pieles de los frutos de Opuntia, inclu´ıan un principio activo que interviene en la s´ıntesis de las HSP. Tampoco se encuentra informaci´on en la literatura sobre el hecho de que las substancias extra´ıdas de la piel del fruto de Opuntia-indica sean susceptibles de acelerar y ampliar la s´ıntesis de las HSP en estos medios de cultivo celular o en las c´elulas de los seres vivos in vivo o in vitro.

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El procedimiento de obtenci´ on de la, o de las substancias activas se caracteriza tambi´en por el hecho de que se puede utilizar la piel del fruto maduro o no maduro; la piel del fruto se obtiene por pelado, erosi´on o triturado del fruto. El disolvente org´ anico polar utilizado en el procedimiento de obtenci´on es 4

ES 2 174 328 T3 preferentemente un disolvente seleccionado entre los alcoholes alif´aticos y las cetonas alif´aticas miscibles con agua como el etanol y/o la acetona. La extracci´on directa de la planta mediante un disolvente poco o nada polar puede ser tambi´en una alternativa que conlleva un afrontamiento con un disolvente polar. 5

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Las substancias con actividad biol´ogica seg´ un la invenci´ on, no citot´ oxicas, extra´ıdas de plantas con metabolismo CAM como las plantas de la familia de las Cact´ aceas, Crasul´ aceas y de las Saxifrag´ aceas, y particularmente las extra´ıdas de la piel del fruto de Opuntia, y espec´ıficamente las de la chumbera, manifiestan propiedades farmacol´ ogicas muy interesantes, particularmente sobre el metabolismo de las HSP, y encuentran por este motivo un empleo en terap´eutica, en cosm´etica y/o en alimentaci´on. Estas substancias no citot´oxicas, extra´ıdas de plantas con metabolismo CAM como las Cact´aceas, las Crasul´ aceas, las Saxifrag´ aceas act´ uan sobre las c´elulas de los tejidos o de los seres vivos acelerando y/o ampliando la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (HSP), cuando la c´elula se somete a un estr´es o a diversas agresiones que ponen en juego la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico.

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Es importante insistir sobre la no citotoxicidad de estas substancias, pues la mayor´ıa de las substancias citot´ oxicas inducen un aumento de la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (HSP). Las substancias de la presente invenci´ on est´an destinadas para tratar las c´elulas de los tejidos o de los seres vivos, para mejorar su resistencia a un estr´es o a diversas agresiones que inducen la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico, o para prevenir y/o tratar las consecuencias de un estr´es o de diversas agresiones que inducen la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico y que modifican la s´ıntesis de las prote´ınas.

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De una manera general, las substancias de la presente invenci´on est´an destinadas para prevenir y/o para tratar cualquier consecuencia de una manifestaci´on que produzca un estr´es o una agresi´on celular. Estas substancias encuentran una utilizaci´ on en un a´mbito muy amplio de la terap´eutica, de la cosm´etica y/o de la alimentaci´on.

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As´ı, las substancias de la presente invenci´on se pueden utilizar en la prevenci´on y/o el tratamiento de las consecuencias de isquemias vasculares; de fibrosis cut´aneas (queloides), pulmonares, hep´ aticas, de intervenciones quir´ urgicas (efectos secundarios debidos a los tratamientos por quimioterapia, a las radiaciones ionizantes o a la radioterapia, etc.), la menopausia; agresiones por los radicales libres; lesiones mec´anicas: estiramiento de un m´ usculo, de la piel (estr´ıas); roces mec´anicos (caballos, tiro, calzados, prendas de vestir, etc): radiaciones t´ermicas, fot´onicas; la prevenci´ on de riesgos relacionados con la actividad terap´eutica, con la complicaci´on de ciertas enfermedades (hepatitis virales, c´anceres, infecciones diversas, enfermedades degenerativas que implican un fen´ omeno apopt´ otico...), con ciertas actividades humanas profesionales como las de los bomberos o de los trabajadores susceptibles de experimentar radiaciones ionizantes, como la inmersi´on subacu´ atica y otros, etc. Para estos fines, una o varias substancias seg´ un la invenci´on, separadas de la piel de los frutos de las plantas con metabolismo CAM como las plantas de la familia de las Cact´aceas, Crasul´ aceas, y de las Saxifrag´ aceas, y particularmente de la piel del fruto de Opuntia y espec´ıficamente de la chumbera, se utilizan solas o en asociaci´on o en mezcla con uno o varios principios activos de acci´on complementaria as´ı como con un excipiente o un veh´ıculo inerte, no t´ oxico, adecuado para el uso considerado, con miras a la realizaci´ on de composiciones farmac´euticas, cosm´eticas y/o alimentarias.

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La presente invenci´on se refiere tambi´en a la utilizaci´on de la o de las substancias con actividad biol´ ogica, para acelerar y ampliar la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (HSP) en medios de cultivo celulares.

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Las composiciones seg´ un la invenci´ on est´an destinadas para la administraci´ on por v´ıa digestiva, parenteral, t´opica o rectal. Las composiciones est´an por consiguiente presentadas en forma de comprimidos sin revestir o revestidos, de grageas, de sellos, de c´apsulas, de p´ıldoras, de tabletas, de jarabes, de polvos para ingerir o de uso externo, de composiciones adyuvantes para la cicatrizaci´ on postoperatoria, para las quemaduras, los traumatismos; supositorios; solutos o suspensiones inyectables acondicionadas en ampollas; cremas, geles o pomadas.

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Los principios activos complementarios que son adecuados para tales administraciones y para tales composiciones son por ejemplo los filtros solares, los antis´epticos, los antibi´ oticos, los analg´esicos, etc. Los excipientes que son adecuados para tales administraciones y para tales composiciones son adyuvantes de fabricaci´ on (ligantes, fluidificantes...), agentes de sapidez, colorantes y estabilizantes, etc.

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Para el uso terap´eutico, cosm´etico y/o alimentario, el contenido en principio activo (a saber las substancias con actividad biol´ ogica seg´ un la invenci´ on) oscila, en equivalente de plantas secas, de 10 x 10−3 mg/ml a 400 mg/ml, en particular de 0,1 mg/ml a 200 mg/ml, y de preferencia de 0,5 mg/ml a 100 5

ES 2 174 328 T3 mg/ml por toma unitaria. La posolog´ıa diaria oscila entre 0,1 mg/kg a 200 mg/kg por d´ıa, en funci´ on de la indicaci´on terap´eutica, cosm´etica y/o alimentaria, y de la v´ıa de administraci´on.

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La planta y el extracto seco al no ser t´oxicos, el l´ımite superior de la dosis administrada est´a limitado u ´ nicamente por las capacidades de ingesti´on, la solubilidad, la disponibilidad biol´ ogica y farmacol´ogica o tambi´en por el efecto asociado con al menos otro principio activo presente en la planta e independiente de la fracci´on activa. Los ejemplos siguientes ilustran la invenci´ on. Estos ejemplos se describen teniendo en cuenta las figuras adjuntas. Ejemplo 1 Ampliaci´ on de la s´ıntesis de HSP 90 de los fibroblastos sometidos a un tratamiento t´ermico

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Las prote´ınas de choque t´ermico (HSP) son indispensables para la preservaci´ on de la s´ıntesis de las prote´ınas en una agresi´ on externa. El aumento de la s´ıntesis de las HSP permite proteger mejor la c´elula, por ejemplo en el momento de un aumento de temperatura. En el marco del ensayo descrito a continuaci´ on, se han investigado substancias que son susceptibles de ampliar la s´ıntesis de la HSP 90 durante una elevaci´ on de la temperatura a 43◦C sin inducir la s´ıntesis ◦ on normal) para eliminar la inducci´ on de eventuales producciones de de esta mol´ecula a 37 C (condici´ HSP por una sustancia t´ oxica. La sustancia estudiada a continuaci´ on proviene de un extracto alcoh´ olico obtenido a partir de la piel de los frutos de Opuntia ficus-indica o chumbera. Esta sustancia se denomina a continuaci´on “OE”, lo cual significa “Opuntia Extract” o extracto de Opuntia. Para ello, se trataron 100 g de planta deshidratada o de fruto entero deshidratado o tambi´en 1 g de piel de fruto deshidratado, con 10 veces su peso en disolvente org´ anico polar. Se a˜ nadieron 10 µl del extracto obtenido en 1 ml de medio adecuado para el cultivo de los queratinocitos o de los fibroblastos. Tras su incubaci´ on de una noche a 37◦C, la s´ıntesis de las HSP no se modifica, pero despu´es de una exposici´on a as precoz. A t´ıtulo de ejemplo, las HSP una temperatura de 43◦C, las HSP aparecen de forma mucho m´ 90 reveladas por inmunofluorescencia indirecta aparece entre 10 y 20 mn en un cultivo de fibroblastos incubados en presencia de extracto de Cact´aceas (O.E) mientras que los medios de cultivo que contienen c´elulas no incubadas solo muestran HSP 90 de una a dos horas m´ as tarde. Los valores de las tablas y de los gr´ aficos 1, 2, 3 y 4 se expresan en unidades arbitrarias en funci´ on de la superficie de fluorescencia para un umbral fijado para el conjunto de observaciones. Se trata de valores relativos en unidades arbitrarias establecidas a partir de un umbral de detecci´ on id´entico para el conjunto de observaciones con un aparato Biocom, y mediante c´alculo de las zonas de fluorescencia reveladas por un anticuerpo copulado con la fluoresce´ına y dirigido contra el anticuerpo espec´ıfico de la HSP.

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TABLA I S´ıntesis de HSP 90 por los fibroblastos de piel humana en cultivo a 43◦ C Testigo 37◦ C

30 mn

60 mn

120 mn

Fph

0

0

1

5

Fph + OE

0

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5

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Fph = Fibroblastos de piel humana 55

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La tabla 1 est´ a ilustrada por la Figura 1. El extracto de Opuntia, a˜ nadido a la dosis de un 1 % en el medio de cultivo, no expres´o actividad alguna despu´es de una incubaci´ on de una noche a 37◦ C, mientras que los mismo fibroblastos de piel humana cultivados a una temperatura de 43◦C, en presencia de extracto de Opuntia, llevan a la aparici´ on m´ as r´apida de las HSP 90. As´ı, la presencia de extracto de Opuntia (OE) en el medio de cultivo permite una activaci´ on del proceso de s´ıntesis de las HSP 90 con relaci´on a lo que desarrolla la c´elula no tratada. La s´ıntesis no se amplifica, la misma es activada m´as r´ apidamente. En lugar de producirse normalmente despu´es de 120 mn, la s´ıntesis de las HSP 90, por los fibroblastos en presencia de OE, se desencadena en 30 minutos despu´es de la elevaci´on de la temperatura 6

ES 2 174 328 T3 a 43◦C (v´ease Figura 1). En el transcurso de una agresi´ on t´ermica, OE permite una mejor preservaci´on del material celular gracias al desencadenamiento r´apido del proceso de s´ıntesis de las HSP.

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Ha sido posible precisar en el transcurso de otro ensayo que la aparici´ on de HSP 90 por los fibroblastos de piel humana, procedentes de un explante quir´ urgico procedente de un sujeto de 5 a˜ nos de edad someo entre 10 y 20 minutos, mientras que las c´elulas procedentes tido a un estr´es t´ermico de 43◦C, se realiz´ del mismo ni˜ no pero no tratadas mediante el extracto de Cact´ aceas solo aparecen las HSP 90 a partir de los 60 min. Los grupos de datos que figuran en las 3 tablas son independientes los unos de los otros, y no pueden por consiguiente ser comparados. TABLA II S´ıntesis de las HSP 90 por los fibroblastos

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Sin tratar

Tratados mediante OE

A

1

1

10 mn

1

1

20 mn

1

2,5

30 mn

1

5

La tabla II se ilustra por la Figura 2. Ejemplo II S´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (HSP) por las c´elulas epiteliales humanas

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TABLA III S´ıntesis de las HSP 90 mediante los queratinocitos Sin tratar

Tratados mediante OE

A

1

1

30 mn

1

4

60 mn

1

5

120 mn

4

5

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La tabla III se ilustra por la Figura 3. 55

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ES 2 174 328 T3 TABLA IV S´ıntesis de las HSP 27 por los queratinocitos Sin tratar

Tratados mediante OE

A

1

1

30 mn

1

5

60 mn

2

5

120 mn

4

5

5

10

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La tabla IV se ilustra por la Figura 4. Ejemplo III 20

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30

35

Estudio de la citocompatibilidad del extracto de Opuntia El extracto de plantas que tiene el metabolismo CAM no debe ser citot´ oxico para no inducir s´ıntesis de HSP debido a su toxicidad. Los estudios de citocompatibilidad se realizaron sobre los fibroblastos y los queratinocitos. Dos tipos de ensayos fueron realizados: la actividad mitoc´ ondrica y la proliferaci´ on de las c´elulas. La actividad mitoc´ondrica se evalu´ o por el ensayo XTT. El ensayo XTT es un ensayo colorim´etrico basado en la reducci´on de una sal de tetrazolio soluble (XTT = 2,3-bis [2-metoxi-4-nitro5-sulfo-fenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida), (si el derivado es insoluble: ensayo MTT = [bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio], por la NADPH reductasa mitoc´ondrica en un colorante del tipo formazan azul violeta. Por ejemplo, 2.104 c´elulas se cultivaron cl´asicamente y se trataron mediante diversas concentraciones del agente activo a ensayar. La lectura se realiz´o a las 25 h o a las 48 h. El ensayo XTT proporcion´ o un valor de la actividad mitoc´ ondrica, valor proporcionado en densidad ´optica (D.O.) a la longitud de onda asociada con el azul de formazan. La proliferaci´ on de las c´elulas se realiz´ o por numeraci´ on con la ayuda de un contador de c´elulas. La misma se expresa en n´ umero de c´elulas. A) Ensayo sobre los fibroblastos Los fibroblastos proceden de explante de piel humana obtenido de un ni˜ no de 3 a˜ nos de edad (c´elulas en el tercer paso).

40

TABLA V Estudio del metabolismo de los fibroblastos cultivados en presencia de extracto de Opuntia

45

50

55

60

Media (DO)

Diferencia tipo

Testigo

0,314

0,368

0,479

0,387

0,069

OE 5 %

0,309

0,364

0,361

0,345

0,025

OE 2 %

0,314

0,415

0,428

0,386

0,051

OE 1 %

0,312

0,522

0,585

0,473

0,117

OE 0,5 %

0,320

0,405

0,354

0,360

0,035

OE 0,2 %

0,300

0,318

0,330

0,316

0,012

OE 0,1 %

0,247

0,287

0,327

0,287

0,033

OE 0,05 %

0,230

0,249

0,281

0,253

0,021

8

ES 2 174 328 T3 El extracto de Opuntia no modifica el metabolismo de los fibroblastos: los valores no son estad´ısticamente significativos con relaci´on al testigo. La tabla V se ilustra por la figura 5. TABLA VI 5

Efecto de los extractos de plantas con metabolismo CAM sobre la proliferaci´ on de los fibroblastos Siembra de 104 c´elulas Valor en millares de c´elulas

10

15

20

25

Testigo

255

OE 5,00 %

281

OE 2,00 %

215

OE 1,00 %

260

OE 0,50 %

251

OE 0,20 %

225

OE 0,10 %

252

OE 0,05 %

257

El extracto de Opuntia no modifica la proliferaci´ on de los fibroblastos despu´es de dos d´ıas de incubaci´on. La tabla VI se ilustra por la figura 6. 30

B) Ensayo sobre los queratinocitos Los queratinocitos provienen de explante de piel humana procedente de prepucios de ni˜ nos con edades de 2 a˜ nos.

35

TABLA VII Estudio del metabolismo mitoc´ ondrico de los queratinocitos humanos cultivados en presencia del extracto de Opuntia

40

45

50

Media (D.O.)

Diferencia tipo

Testigo 37◦ C

0,948

1,182

1,139

1,090

0,125

OE 0,05 %

1,151

1,169

1,235

1,185

0,044

OE 0,1 %

0,940

0,984

1,006

0,977

0,34

OE 0,2 %

1,003

1,130

1,096

1,076

0,066

OE 0,5 %

1,098

1,217

1,225

1,180

0,071

OE 1,0 %

1,057

1,204

1,402

1,221

0,173

OE 2,0 %

1,185

1,305

1,297

1,262

0,067

OE 5,0 %

1,180

1,243

1,180

1,201

0,036

55

60

El extracto de Opuntia es citocompatible con los queratinocitos. No se observa variaci´ on estad´ısticamente significativa de la actividad mitoc´ondrica de los queratinocitos cultivados con concentraciones de extracto de Opuntia que var´ıa de 0,05 % al 5 %. 9

ES 2 174 328 T3

La tabla VII se ilustra por la figura 7. TABLA VIII 5

Proliferaci´ on de los queratinocitos en millares de c´elulas Valor en millares de c´elulas

10

15

20

25

Testigo

82,300

OE 5,00 %

114,600

OE 2,00 %

86,300

OE 1,00 %

102,300

OE 0,50 %

82,600

OE 0,20 %

82,500

OE 0,10 %

82,300

OE 0,05 %

81,900

El extracto de Opuntia no modifica la proliferaci´ on de los queratinocitos. La Tabla VIII se ilustra por la figura 8. 30

Ejemplo IV Estudio de la influencia de diferentes dosis de extracto de plantas con metabolismo CAM sobre la viabilidad de los queratinocitos sometidos a un tratamiento t´ermico de una hora a 48◦ C

35

Despu´es de 30 minutos de contacto con el extracto de Opuntia, los queratinocitos se incubaron una hora a 48◦C. La viabilidad de las c´elulas se apreci´o por el ensayo XTT. TABLA IX Actividad mitoc´ ondrica de los queratinocitos por el extracto de Opuntia y tratados a 48◦ C

40

45

50

55

60

Media (D.O.)

Dif. tipo

Testigo 37◦C

0,19 9

0,19 8

0,19 8

0,19 5

0,19 5

0,19 8

0,197

0,002

Testigo 48◦ C (∗ )

0,10 4

0,10 1

0,10 2

0,09 7

0,10 0

0,10 1

0,101

0,002

Krc 48◦ C + 0,1 % de OE

0,12 3

0,12 9

0,12 8

0,12 6

0,12 7

0,12 2

0,126

0,003

Krc 48◦ C + 0,5 % de OE

0,15 2

0,15 5

0,11 5

0,15 6

0,15 3

0,14 9

0,147

0,016

Krc 48◦ C + 1,0 % de OE

0,17 8

0,18 2

0,17 8

0,17 8

0,17 9

0,17 7

0,179

0,002

(∗ ); sin tratar Krc: queratinocitos 10

ES 2 174 328 T3 La tabla IX se ilustra por la figura 9

5

El efecto termoprotector es dosis dependiente y aparece con la utilizaci´on de 10 µl mediante pocillos de cultivo de 1 ml obtenido por maceraci´ on de 1 g de plantas en 10 ml de disolvente org´ anico anhidro polar. Ejemplo V Efecto termoprotector de los extractos de planta con metabolismo CAM

10

Estudio de la viabilidad de c´elulas tratadas con extractos de Opuntia obtenidos de diferentes partes de la planta Las condiciones del ensayo XTT sobre los fibroblastos de piel humana son los siguientes: 15

- incubados una noche a 37◦ C con o sin OE (testigo choque t´ermico) - Primer choque t´ermico de 20 mn a 48◦C on de HSP) - Incubaci´ on de 40 mn a 37◦ C (producci´

20

- Segundo choque durante 20 mn a 50◦C - 15 mn a 37◦C

25

- Ensayo XTT durante 3 horas a 37◦C TABLA X Estudio de la resistencia de los fibroblastos a los choques t´ermicos cuando son tratados por el extracto de piel de fruto

30

35

40

45

60

Diferencia tipo

Testigo (37◦ C)

0,63 0

0,77 1

0,56 4

0,64 6

0,91 1

0,704

0,138

Testigo choque t´ermico

0,68 8

0,69 6

0,70 1

0,61 1

0,67 1

0,673

0,037

Disolvente + choque

0,52 3

0,70 0

0,71 7

0,71 3

0,67 1

0,665

0,081

1 = jugo

0,58 7

0,68 8

0,81 8

0,76 4

0,68 1

0,708

0,088

2 = pulpa

0,59 2

0,71 7

0,71 9

0,71 2

0,68 7

0,685

0,054

3 = piel

0,78 2

0,92 9

0,89 9

1,05 7

0,89 1

0,911

0,598

1+2+3

0,74 8

0,78 8

0,62 7

0,77 2

0,75 2

0,737

0,064

50

55

Media (D.O.)

El testigo a 37◦C se cultiv´o en otra placa. Las densidades o´pticas (D.O.) medidas durante el ensayo XTT para la piel de los frutos son estad´ısticamente significativas con relaci´ on a todas las dem´as medias de densidad o´ptica salvo en el caso de la soluci´ on total (1+2+3). Eso muestra que para ciertas Cact´ aceas la totalidad del efecto est´a contenida en la piel. Los fibroblastos resisten mejor a los choques t´ermicos 11

ES 2 174 328 T3 cuando se tratan mediante el extracto de piel del fruto. La tabla X se ilustra por la figura 10. Ejemplo VI 5

Estudio de la viabilidad de las c´elulas tratadas con extractos de Opuntia obtenidos con las diferentes partes del fruto TABLA XI

10

Ilustra la comparaci´ on con relaci´ on al testigo 37◦ C

15

Referencia (37◦ C)

Choque

Disolvente

-0,070

-0,100

Testigo Choque t´ermico

0,010

0,000

-0,700

Disolvente + choque

0,040

0,030

0,000

1 = jugo

0,078

0,068

0,038

2 = pulpa

0,049

0,039

0,009

3 = piel

0,283

0,273

0,243

1+2+3

0,075

0,065

0,035

20

25

30

Los fibroblastos resisten mejor a los choques t´ermicos cuando se tratan mediante el extracto de piel del fruto. La tabla XI se ilustra por la figura 11.

35

40

45

50

55

60

12

ES 2 174 328 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Substancias con actividad biol´ ogica, no citot´ oxicas, que aceleran y/o ampl´ıan la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (HSP) separadas a partir de la piel del fruto de las plantas con metabolismo CAM. 2. Substancias con actividad biol´ ogica seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizadas porque el fruto de las plantas con metabolismo CAM es un fruto de Opuntia.

10

3. Substancias con actividad biol´ ogica seg´ un una de las reivindicaciones 1 ´o 2, caracterizadas porque se obtienen a partir de la piel de frutos de Opuntia y espec´ıficamente de la chumbera.

15

4. Procedimiento de obtenci´on de substancias con actividad biol´ ogica seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se somete un fruto de una planta con metabolismo CAM, maduro o no maduro, a un secado, luego a una deshidrataci´ on, seguida de un agotamiento mediante un disolvente org´ anico polar para obtener un extracto org´ anico de fruto, se diluye este extracto con agua, se purifica el extracto diluido mediante agotamiento con hexano, se separa la fracci´ on org´ anica hex´ anica que se evapora a sequedad a vac´ıo, y se obtiene la fracci´ on activa del fruto de planta con metabolismo CAM.

20

25

30

35

5. Procedimiento de obtenci´on de substancias con actividad biol´ ogica seg´ un la reivindicaci´ on 4, caracterizado porque se utiliza como disolvente org´ anico polar, un disolvente seleccionado entre los alcoholes alif´ aticos y las cetonas alif´aticas. 6. Procedimiento de obtenci´on seg´ un las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque se utiliza la piel de fruto de planta con metabolismo CAM, obtenido por pelado, erosi´ on o triturado del fruto. 7. Composiciones farmac´euticas, cosm´eticas y/o alimentarias, que aceleran y ampl´ıan la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (HSP), caracterizadas porque incluyen a t´ıtulo de principio activo una o varias substancias con actividad biol´ ogica seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 3, en asociaci´on o en mezcla con un excipiente o un veh´ıculo inerte, no t´ oxico, adecuado para el uso considerado, y eventualmente uno o varios principios activos de acci´ on complementaria. 8. Composiciones farmac´euticas, cosm´eticas y/o alimentarias seg´ un la reivindicaci´ on 7, en las cuales el excipiente o el veh´ıculo inerte es uno de los que son adecuados para la administraci´ on por v´ıa oral, parenteral, t´ opica o rectal. 9. Composiciones farmac´euticas, cosm´eticas y/o alimentarias seg´ un las reivindicaciones 7 y 8, en las cuales el contenido de principio activo oscila entre 10 x 10−3 mg/ml a 400 mg/ml por toma unitaria.

40

10. Utilizaci´ on de la o de las substancias con actividad biol´ ogica seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 3, para acelerar y ampliar la s´ıntesis de las prote´ınas de choque t´ermico (HSP) en medios de cultivo celular.

45

50

55

60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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