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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 083 732 kInt. Cl. : C12N 15/82

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˜ ESPANA

C12N 15/54 A01H 5/00 C12P 7/64 //C12N 9/10

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 92902750.6 kFecha de presentaci´on : 14.01.92 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 567 648 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 03.11.93

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54 T´ıtulo: Plantas resistentes al fr´ıo y su producci´ on.

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30 Prioridad: 16.01.91 JP 15883/91

04.10.91 JP 283807/91

26-1, Jingumae 6-chome Shibuya-ku Tokyo 150, JP

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72 Inventor/es: Nishizawa, Osamu

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74 Agente: Ponti Sales, Adelaida

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.04.96

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

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73 Titular/es: Kirin Beer Kabushiki Kaisha

16.04.96

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 083 732 T3 DESCRIPCION Campo de la invenci´ on 5

La presente invenci´on hace referencia a una planta con una composici´ on de los ´acidos grasos de l´ıpidos alterada, m´ as espec´ıficamente, una planta resistente al da˜ no por fr´ıo mediante la alteraci´on de la composici´on de los ´acidos grasos de los l´ıpidos, y un proceso para producir dicha planta. Antecedentes de la invenci´ on

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El da˜ no provocado por las bajas temperaturas en las plantas superiores se clasifica principalmente en no dos tipos diferentes. Uno es el da˜ no causado por temperaturas de 0◦ C o inferiores, y se denomina “da˜ por congelaci´on”. El otro, el cual es el sujeto de la presente invenci´ on, se denomina “da˜ no por fr´ıo” y es totalmente diferente al da˜ no por congelaci´on. La mayor´ıa de plantas tropicales y subtropicales sufren da˜ no por fr´ıo en un rango de temperatura de 5 a 15◦ C, lo que causa desperfectos en el/los tejido/s en la totalidad y/o una parte de las plantas lo que conduce a una variedad de disfunciones fisiol´ ogicas y finalmente a la muerte en los casos m´ as severos. Las plantas susceptibles al da˜ no por fr´ıo se denominan plantas “sensibles al fr´ıo” e incluyen muchos cultivos importantes como el arroz, el ma´ız, el boniato, la batata, el pepino, el pimiento verde, la berenjena, la calabaza, la banana, el mel´ on, kalanchoe, el ciclamen, el lirio, la rosa, la alubia, el pepino “sponge” y el tabaco. Estas plantas sufren una variedad de da˜ nos, tales como la inhibici´ on de la germinaci´on y del crecimiento, necrosis tisular as´ı como la muerte de toda la planta, a temperaturas entre 5 no por y 15◦ C, en la mayor´ıa de los casos alrededor de los 10◦ C, y de este modo son susceptibles al da˜ tiempo fr´ıo y por escarcha. Adem´ as, las frutas, los vegetales, y similares cosechados a partir de plantas sensibles al fr´ıo no toleran el almacenamiento a bajas temperaturas (tal como muestran los puntos negros en descomposici´on que aparecen r´ apidamente en las bananas cuando se sacan de la nevera) haciendo dif´ıcil el almacenamiento de estas cosechas durante un largo per´ıodo tras la cosecha. Por otro lado, la mayor´ıa de las plantas de origen templado, son resistentes al fr´ıo y no sufren da˜ no incluso a temperaturas cercanas a 0◦C. Los cultivos resistentes al fr´ıo incluyen el trigo, la cebada, la espinaca, la lechuga, el r´abano, el guisante, el puerro, y la col. Las malas hierbas silvestres, tales como el diente de le´on y Arabidopsis tambi´en son resistentes al fr´ıo. El da˜ no por fr´ıo est´a relacionado de manera significativa con la fluidez de los l´ıpidos de membranas que constituyen las biomembranas. Las biomembranas son una de las unidades de organizaci´ on b´ asicas de las c´elulas vivas. Ellas definen el interior y el exterior de las c´elulas como la membrana celular y en c´elulas eucariotas tambi´en organizan una variedad de estructuras membranosas (org´ anulos celulares) que dividen la c´elula en varias unidades funcionales. Las biomembranas no son meras barreras f´ısicas contra sustancias de alto peso molecular y electr´olitos de bajo peso molecular; la funci´ on de las prote´ınas asociadas con las membranas permiten la permeabilizaci´ on selectiva y/o el transporte activo frente un gradiente de concentraci´ on, de sustancias particulares. De esta manera, las biomembranas mantienen el microambiente del citoplasma y de los org´ anulos celulares en una condici´ on adecuada para su prop´ osito. Algunos procesos bioqu´ımicos, como la producci´on de energ´ıa mediante la respiraci´on y la fotos´ıntesis, requieren un gradiente de concentraci´ on espec´ıfico de sustancias particulares a trav´es de las biomembranas. En la fotos´ıntesis, la energ´ıa de la luz genera un gradiente potencial de hidr´ ogeno ionizado a trav´es de la membrana del tilacoide dentro de los cloroplastos, cuya energ´ıa potencial se convierte entonces en ATP, un compuesto de alta energ´ıa utilizada por las c´elulas vivas, mediante prote´ınas en la membrana del tilacoide. En consecuencia, si las biomembranas no ejercen en su funci´ on como barrera tal como se ha descrito anteriormente, no s´ olo se alterar´ a el micro-ambiente de las c´elulas, sino que se da˜ nar´ an esas funciones celulares basadas en un gradiente de concentraci´ on, lo que conducir´ a a serias disfunciones en las c´elulas vivas. Los l´ıpidos de membrana que constituyen las biomembranas son principalmente fosfol´ıpidos y, en el caso de los cloroplastos glicerol´ıpidos. Los fosfol´ıpidos son ´esteres (acil grasos) alquil 1,2-bi de cadena larga del glicerol con un grupo polar unido a la posici´ on 3 como fosfoester. Estos son compuestos amfip´aticos compuestos por una porci´ on hidrof´ılica (el grupo polar) y una porci´ on hidrof´ obica (los grupos acil grasos) en una mol´ecula y as´ı forman una bicapa lip´ıdica con las porciones hidrof´ obicas hacia el interior y las porciones hidrof´ılicas hacia la superficie cuando se dispersan en una soluci´ on acuosa. Esta bicapa lip´ıdica es la estructura b´ asica de las biomembranas y “encierra” una variedad de prote´ınas en su interior y/o en su superficie. Bajo condiciones fisiol´ogicas, la bicapa lip´ıdica est´a en fase l´ıquida-cristalina, en la cual se mantiene en el interior de la bicapa lip´ıdica una alta fluidez, lo que permite una dispersi´ on horizontal y una rotaci´ on libre de mol´eculas prote´ıcas y lip´ıdicas en el interior de la membrana. Esta fluidez de las 2

ES 2 083 732 T3 biomembranas es esencial para las funciones celulares (Darnell, J. et al., Molecular cell biology, Scientific American Books, 1986).

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Cuando la temperatura de una bicapa lip´ıdica simple en fase l´ıquida-cristalina se baja a cierta temperatura que se denomina temperatura de fase de transici´on (Tc), la bicapa experimenta una fase de transici´on a la fase de gel, en donde hay menos fluidez en el interior de la membrana. En el caso de las biomembranas, las cuales est´an compuestas de diferentes tipos de l´ıpidos, algunos l´ıpidos con una alta Tc empiezan a formar dominios en fase de gel a cierta temperatura mientras que otros, con una Tc inferior, siguen en fase l´ıquida-cristalina dando como resultado una separaci´ on de fases, en la que coexisten ambas fases, l´ıquida-cristalina y gel. En un estado de fases separadas, las biomembranas tienen filtraciones y ya no sirven como una barrera contra electr´olitos de bajo peso molecular. Una relaci´on entre da˜ no por fr´ıo y la fase de transici´on de los l´ıpidos de la membrana se propuso por primera vez a principios de los 70 (Lyons, J.M., Ann. Rev. Plant Physiol., 24:445, 1973). Por entonces, sin embargo, no hab´ıa datos concretos que apoyaran la existencia de esta relaci´on. M´ as tarde, en una serie de experimentos en los que se utilizaron cianobacterias (alga azul-verde) como organismo modelo, se demostr´o que el da˜ no por fr´ıo de las cianobacterias es el resultado de una afluencia irreversible, desde las c´elulas, de electr´olitos como iones que sirven a la separaci´on de fases de la membrana celular a una temperatura fr´ıa (Murata, N. y Nishida, I., en The biochemistry of plants vol. 9 Lipids:Structure and function, p.315, Academic Press, Orlando, 1987). Los l´ıpidos se clasifican generalmente por el grupo polar (v´ease anteriormente la estructura de los l´ıpidos de membrana), puesto que su comportamiento en cromatograf´ıas de columna y de capa fina se determina principalmente por el grupo polar. Dentro de una clase particular de l´ıpidos con el mismo grupo polar, hay muchas mol´eculas diferentes con varias combinaciones de los dos grupos de acil grasos en la mol´ecula. El t´ermino “especie molecular” se utiliza para distinguir estas mol´eculas. La Tc de cada especie molecular de l´ıpidos depende tanto del grupo polar como de la longitud de la cadena y grado de insaturaci´ on (el n´ umero de doble enlaces) de los grupos acil grasos, y en algunos casos, de la concentraci´on de sal ambiental y similar. Entre estos, el grado de insaturaci´ on del grupo acil graso tiene el mayor efecto; mientras una especie molecular particular con dos grupos acil graso saturados tiene normalmente una Te superior a temperatura ambiente, la introducci´ on de un doble enlace solo en uno de los grupos acil graso resulta en el decrecimiento de la Tc alrededor de 0◦ C (Santaren, J.F. et al., Biochem. Biophys. Acta, 687:231, 1982). (Sin embargo, si el doble enlace est´a en la configuraci´ on trans, el efecto sobre la Tc es muy peque˜ no [Phillips, M.C. et al., Chem. Phys. Lipids, 8:127, 1972]. La mayor´ıa de los dobles enlaces de los l´ıpidos de membrana est´ an en la configuraci´ on cis, y la configuraci´ on trans es relativamente rara). Esto indica que una especie molecular lip´ıdica con al menos un doble enlace en sus grupos acil graso (de ahora en adelante se denominar´a “especie molecular no saturada”) no experimentan transici´on de no por fr´ıo. Consecuentemente, s´ olo aquellas fase alrededor de los 10◦C, la temperatura cr´ıtica para el da˜ mol´eculas de l´ıpidos con dos grupos acil graso saturados (de ahora en adelante se denominar´a “especie molecular saturada”) podr´ıa inducir a la separaci´ on de fase de las biomembranas, lo cual se considera el principal evento en el da˜ no por fr´ıo. Se extrajeron l´ıpidos de membrana de diversas plantas, sensibles y resistentes al fr´ıo, se separaron en funci´ on de su grupo polar, y se analizaron sus composiciones de ´acido graso y especie molecular. Los resultados mostraron que s´ olo el fosfatidilglicerol (PG) contiene una cantidad significativa de especie molecular saturada entre los l´ıpidos de membrana de plantas, y que el contenido de mol´eculas saturadas en PG es elevado (30-70 %) en las plantas sensibles al fr´ıo, y bajo (< 20 %) en las plantas resistentes al fr´ıo (Murata, N., Plant Cell Physiol., 24:81, 1983; Roughan, P.G., Plant Physiol., 77:740, 1985). Debido a que el PG es uno de los componentes principales de las biomembranas plast´ıdicas (cloroplastos, cromoplastos), esta correlaci´on entre la composici´on de la especie molecular del PG y la sensibilidad al fr´ıo sugiere, fuertemente, que el principal evento en el da˜ no por fr´ıo de las plantas superiores es la separaci´ on de fase en las biomembranas plast´ıdicas, inducida por la transici´ on de fase del PG (Murata, N. y Nishida, I., en Chilling injury of horicultural crops, p. 181, CRC Press, Boca Raton, 1990). El PG est´ a localizado en pl´astidos y, en el caso de las hojas verdes, se sintetiza principalmente en los cloroplastos (Sparace, S.A. y Mudd, J.B., Plant Physiol., 70:1260, 1982). Su bios´ıntesis sigue los pasos mostrados a continuaci´on. 1. Transferencia de un grupo acil graso a la posici´on sn-1 del glicerol 3-fosfato.

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2. Transferencia de otro grupo acil graso a la posici´on sn-2.

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ES 2 083 732 T3 3. Esterificaci´on de glicerol al grupo 3-fosfato. 4. Desaturaci´ on de grupos acil graso en la mol´ecula. 5

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Los ´acidos grasos se sintetizan exclusivamente en los cloroplastos. Los ´acidos grasos sintetizados se suministran a los pasos 1 y 2 de la s´ıntesis de PG como complejos acil-ACP, en donde los ´acidos grasos est´an ligados a una prote´ına denominada prote´ına portadora de acil (ACP). La mayor´ıa de los a´cidos grasos sintetizados en cloroplastos son el ´acido palm´ıtico (´acido C-16 saturado, de ahora en adelante se designar´ a como 16:0) y ´acido oleico (´acido mono no-saturado C-18, de ahora en adelante se designar´ a como 18:1). El a´cido acil-ACP:glicerol 3-fosfato aciltransferasa (EC 2.3.1.15) (de ahora en adelante se denominar´ a ATasa) cataliza el paso 1 del esquema anterior. Esta enzima es una enzima soluble en el estroma del cloroplasto. Se purific´ o parcialmente a partir de la espinaca y el guisante (Bertrams, M. y Heinz, E., Plant Physiol., 68:653, 1981), y se purific´ o hasta la homogeneidad a partir de la calabaza (Nishidam I. et al., Plant Cell Physiol, 28:1071, 1987). La ATasa est´a codifica para por un gen nuclear, el cual se clon´ oa partir de la calabaza, Arabidopsis y, recientemente, del guisante (Ishizaki, O. et al., FEBS Lett., 238: 424, 1988; Nishida, I. et al., en Plant lipid biochemistry, structure and utilization, Portland Press, London, 1990; Weber, S. et al., Plant Molec. Biol. 17:1067, 1991). Las ATasas de diferentes fuentes var´ıan en la selectividad por el substrato acil-ACP. Mientras las ATasas de la espinaca, el guisante y Arabidopsis, que son resistentes al fr´ıo, tienen una alta selectividad para el 18:1-ACP, la ATasa de la calabaza, una planta sensible al fr´ıo, utiliza indiferentemente el 18:1-ACP y el 16:0-ACP (Frentzen, M. et al., Eur. J. Biochem., 129: 629, 1983; Frentzen, M. et al., Plant Cell Physiol., 28:1195, 1988). La enzima que cataliza el paso 2 del esquema anterior es una enzima unida a la membrana de la cubierta del cloroplasto y utiliza solamente el 16:0-ACP. (Frentzen, M. et al., Eur. J. Biochem., 129:629, 1983). En varias especies de plantas, que se denominan plantas 16:3, el producto intermediario de los pasos 1 y 2, a´cido fosfat´ıdico (1,2-diacilglicerol 3-fosfato), es tambi´en un compuesto intermedio de la bios´ıntesis de glicerol´ıpidos (mono- y digalactosildiaeilgliceroles, y sulfoquinovosildiacilglicerol) que se sintetiza en cloroplastos. De esta manera, los pasos 1 y 2 son comunes en la bios´ıntesis de l´ıpidos en los clorolastos de las plantas 16:3. Se sabe muy poco sobre las enzimas de los pasos 3 y 4 de la bios´ıntesis del PG. Sin embargo, es muy conocido que la desaturaci´on de los grupos acil grasos en el PG es asim´etrica. En la posici´ on sn-1, la mayor´ıa de los 18:1 se desaturan incluso m´as, y llegan a tener dos o tres dobles enlaces, mientras que el 16:0 no se desatura. Parte del 16:0 enlazado en la posici´ on sn-2 se desatura a a´cido 3-trans-hexadecenoico (de ahora en adelante se denominar´ a 16:1t), pero no se introduce ning´ un doble enlace en cis. Debido a que un doble enlace en trans es mucho menos efectivo en disminuir la temperatura de la fase de transici´ on, la conversi´on del 16:0 a 16:1t en la posici´ on 2 del PG disminuir´ıa la Tc tan s´ olo unos 10◦ C, de tal manera que la Tc todav´ıa es m´as elevada que la temperatura cr´ıtica del da˜ no por fr´ıo (Bishop, D.G. y Kenrick, J.R., Phytochemistry, 26:3065, 1987). Por lo tanto, a partir de ahora, las especies moleculares PG que contienen 16:1t se incluir´ an dentro de la especie molecular saturada. Dado que no se introduce ning´ un doble enlace en cis en el grupo acil graso de la posici´on 2, el grupo acil graso de la posici´ on 1 es muy importante en la determinaci´on del contenido de especies moleculares saturadas.

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Los cultivos sensibles al fr´ıo sufren desventajas significativas en la tolerancia a las bajas temperaturas, y en el almacenamiento por largos per´ıodos despu´es de la cosecha, tal y como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, muchos cultivos sensibles al fr´ıo son muy importantes e indispensables para la producci´ on agraria; por ejemplo, el arroz y el ma´ız son los principales cultivos de cereales en muchas partes del mundo. Una mejora en la resistencia al fr´ıo de estos cultivos har´ıa m´ as f´acil su cultivo en un entorno fr´ıo y/o el almacenamiento de su cosecha por un largo per´ıodo. En el caso de las flores ornamentales y las verduras cultivadas en un invernadero debido a su sensibilidad al fr´ıo, la mejora de la resistencia al fr´ıo har´ıa innecesario el invernadero o ahorrar´ıa, en gran medida, los gastos de calefacci´ on. Adem´ as, la mejora podr´ıa expandir el a´rea donde crecen los cultivos, dado que la temperatura es, a menudo, el principal factor a la hora de definir los l´ımites del desarrollo del cultivo. Hay, pues, una demanda significativa de plantas resistentes al fr´ıo, y la resistencia al fr´ıo ha sido uno de los principales objetivos en la mejora de cultivos. Sin embargo, la mejora convencional de cultivos est´ a limitada, para este prop´osito, por los recursos gen´eticos, porque s´olo se puede cruzar el cultivo dentro de la misma especie. Progresos recientes en ingenier´ıa gen´etica de las plantas superiores han hecho posible introducir informaci´ on gen´etica en cultivos a partir de recursos gen´eticos ilimitados. La aplicaci´on de la ingenier´ıa gen´etica para introducir la resistencia al fr´ıo ser´ıa, por lo tanto, de valor incalculable. 4

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Tal como se ha descrito anteriormente, el principal evento en el da˜ no por fr´ıo de las plantas superiores es la separaci´on de fases de las membranas plast´ıdicas, y las membranas plast´ıdicas de plantas sensibles al fr´ıo contienen una cantidad superior de la especie molecular PG saturada, que se considera inductora de la separaci´ on en fases. Por consiguiente, se sugiri´ o que podr´ıa ser posible incrementar la resistencia al fr´ıo de las plantas sensibles al fr´ıo mediante la alteraci´on de la composici´on de los ´acidos grasos de sus PG, para reducir el contenido de especies moleculares saturadas (Murata, N., Plant Cell Physiol., 24:81, 1983). Sin embargo, esto era s´ olo una hip´ otesis y, hasta la fecha, no ha habido ning´ un informe sobre ning´ un procedimiento para alterar la composici´on en ´acidos grasos de los l´ıpidos celulares, ni ning´ un informe sobre ninguna planta con la composici´ on alterada en ´acidos grasos. Weber et al, Plant Molecular Biology, 17:1067 -1076, 1991 (publicado despu´es de la fecha de prioridad reivindicada de la presente solicitud) informa sobre el aislamiento de una oleato-selectiva acil-ACP (glicerol-3 -fosfato aciltransferasa) (ATasa) a partir de cloroplastos de una planta resistente al fr´ıo (guisante). La secuencia se delucid´o y se seleccion´o un clon positivo, mediante el rastreo de una genoteca de ADNc de hoja de guisante, que muestra una fase abierta de lectura que codifica para 457 amino´acidos. El ADN del clon se expres´o funcionalmente en E. coli. Se describi´ o, adem´ as, que el ADN del clon que codifica para una oleato-selectiva aciltransferasa “podr´ıa permitir una mejora biotecnol´ ogica de la tolerancia al fr´ıo”. No hay ninguna evidencia, sin embargo, de c´ omo el ADN del clon proporcion´ o, realmente, un efecto en la planta sensible al fr´ıo, como por ejemplo un incremento en la proporci´ on de a´cidos grasos no saturados en el cloroplasto, debido a que el ADN del clon se expres´ o solamente en E. coli y no en ninguna planta. Descripci´ on resumida de la Invenci´ on

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La presente invenci´on proporciona procedimientos originales para incrementar el contenido de a´cidos grasos no saturados en los l´ıpidos de membrana, en particular el fosfatidilglicerol (PG), en las plantas superiores. Resumidos brevemente, estos procedimientos comprenden la introducci´on y la expresi´on de una secuencia de ADN que codifica para un polip´eptido con una actividad glicerol 3-fosfato aciltransferasa (ATasa) provista de una selectividad de sustrato m´ as elevada para el oleoil-(acil -prote´ına-portadora) (18:1-ACP) que para el palmitoil -(acil-prote´ına-portadora) (16:0-ACP). La presente invenci´on tambi´en incluye a las plantas superiores que contienen m´as ´acidos grasos no saturados en los l´ıpidos de membrana que los inherentes a plantas de la especie. Una realizaci´on preferida de dicha planta es una planta transg´enica que expresa un polip´eptido con una actividad glicerol 3-fosfato aciltransferasa provista de una selectividad de sustrato m´ as elevada para el oleoil-(acil-prote´ınaportadora) que para el palmitoil-(acil-prote´ına-portadora). Tal como se ha descrito anteriormente, la ATasa cataliza el primer paso de la bios´ıntesis de l´ıpidos en cloroplastos, y ATasas de diferentes especies de plantas manifiestan una diferencia en la selectividad de sustratos acil-ACPs. Las ATasas de plantas resistentes al fr´ıo, como por ejemplo la espinaca, el guisante y Arabidopsis, tienen una selectividad m´ as elevada para el 18:1-ACP, y las ATasas de plantas sensibles al fr´ıo, como por ejemplo la calabaza, utilizan tanto el 18:1-ACP como el 16:0-ACP. Las secuencias de ADN que se usan en la presente invenci´ on y que codifican para una ATasa provista de una selectividad de sustrato m´ as elevada para el 18:1-ACP, pueden ser cualquiera de las secuencias de ADN que codifican para una ATasa de una planta resistente al fr´ıo, y de las secuencias de ADN que codifican para ATasas de organismos diferentes a las plantas superiores. Preferiblemente se emplea una secuencia de ADN que codifica para una ATasa de una planta resistente al fr´ıo, y m´as preferiblemente, la ATasa de la espinaca, el guisante o Arabidopsis. La expresi´on de la secuencia de ADN ex´ogena y, consecuentemente, la producci´ on de la ATasa, se pueden conseguir mediante el suministro a la secuencia de ADN de combinaciones apropiadas de secuencias reguladoras de expresi´on (promotora, terminadora, y dem´ as) y de una secuencia que codifica para un p´eptido se˜ nal necesario para el transporte de prote´ınas a los cloroplastos. La construcci´on de ADN puede ser introducida en el genoma de la planta mediante cualquier t´ecnica convencional conocida por expertos en la materia y adecuada para el uso con la planta diana.

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Seg´ un la presente invenci´ on, la introducci´ on y expresi´ on, en una planta superior, de una secuencia ex´ogena de ADN que codifica para una ATasa provista de una selectividad m´ as elevada para el 18:1-ACP, incrementa el contenido de ´acidos grasos no saturados en los l´ıpidos de membrana de la planta. De particular importancia al practicar la invenci´ on es el incremento en el contenido de ´acido graso no saturado del PG que resulta en una importante reducci´ on de las especies moleculares del PG saturadas. Tal como se ha descrito anteriormente, las especies moleculares del PG saturadas inducen a la separaci´ on de fases de las biomembranas plast´ıdicas, y se demostr´ o que la resistencia al da˜ no por fr´ıo est´a inversamente 5

ES 2 083 732 T3 correlacionada con el contenido de especies moleculares PG saturadas dentro de una especie de planta particular.

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Consecuentemente, en otro aspecto de la presente invenci´ on se proporciona un proceso para reducir la temperatura cr´ıtica de da˜ no por fr´ıo de una especie de planta superior que es, inherentemente, da˜ nada por una baja temperatura superior a los 0◦ C (una planta sensible al fr´ıo) mediante la reducci´on del contenido de las especies moleculares fosfatidilglicerol saturadas. A´ un otro aspecto de la presente invenci´on proporciona a las plantas superiores una resistencia superior al da˜ no por fr´ıo. En otras palabras, la presente invenci´on proporciona a especies de plantas superiores inherentemente sensibles al fr´ıo una reducci´on de la temperatura cr´ıtica de da˜ no por fr´ıo. Una realizaci´ on preferida de dicha planta es una planta transg´enica cuyo fosfatidilglicerol contiene una cantidad reducida de especies moleculares saturadas debido a la expresi´on de un polip´eptido con una actividad glicerol 3-fosfato aciltransferasa provista de una selectividad m´ as elevada para el sustrato oleoil-(acil-prote´ınaportadora) que para el palmitoil-(acil-prote´ına-portadora). Descripci´ on esquem´ atica de los dibujos

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La figura 1 muestra el resultado de un an´ alisis de una transferencia de Western de la ATasa de Arabidopsis en plantas de tabaco transg´enicas mediante el uso de un anticuerpo anti-ATasa de Arabidopsis. El carril 1 contiene 50 ng de una preparaci´ on de ATasa de Arabidopsis expresado en E. coli. El carril 2 contiene 10 µg de prote´ına total de cloroplasto de una planta control no-transformada. Los carriles 3-7 contienen 10 µg cada uno de prote´ına total de cloroplasto de las plantas transg´enicas n´ umeros 1-5, respectivamente. El carril 8 contiene 10 µg de prote´ına total de hoja de la planta transg´enica N◦ .1.

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La figura 2 muestra el efecto de un tratamiento de fr´ıo en la actividad fotosint´etica de las plantas de tabaco transg´enicas. De arriba a abajo: tabaco transformado con el vector pBI121, el ADNc de la ATasa de Arabidopsis, y el ADNc de la ATasa de la calabaza. 30

La figura 3 muestra el efecto de un tratamiento de fr´ıo en las plantas de tabaco transg´enicas a nivel de toda la planta. Las placas superiores e inferiores son plantas control de tabaco transformadas con pBI121, y plantas transg´enicas con el ADNc de la ATasa de Arabidopsis, respectivamente, antes (izquierda) y despu´es (derecha) del tratamiento de fr´ıo.

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Descripci´ on detallada de la invenci´ on.

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En general, cuando se expresa una secuencia de ADN para producir el polip´eptido que esta secuencia codifica, son esenciales, adem´as de la correspondiente secuencia que codifica para el polip´eptido, las secuencias reguladoras de la expresi´ on. De particular importancia son una secuencia promotora cadena arriba y se˜ nales de poliadenilaci´on cadena abajo de la secuencia codificante. En la presente invenci´ on, se puede emplear cualquier combinaci´ on apropiada de promotores y se˜ nales de poliadenilaci´on que se sabe que funcionan en c´elulas vegetales; por ejemplo, el promotor del virus 35S del mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintasa, y el promotor de la sub-unidad peque˜ na de la ribulosa bisfosfato carboxilasa/oxigenasa, as´ı como se˜ nales de poliadenilaci´on de la nopalina sintasa y se˜ nales de poliadenilaci´on de la octopina sintasa. Adem´as, si el polip´eptido expresado se tiene que transportar a un compartimiento espec´ıfico de la c´elula, como pueden ser los cloroplastos, es necesaria una secuencia pept´ıdica se˜ nal o l´ıder en el terminal N del polip´eptido. De acuerdo con esto, en la presente invenci´ on, “una secuencia de ADN que codifica para ATasa (o un polip´eptido con una actividad ATasa)” no estar´ a limitada a la regi´on codificante, sino que incluir´ a las secuencias reguladoras de expresi´ on y/o una secuencia de ADN que codifica para el p´eptido se˜ nal. Una secuencia de ADN que codifica para un polip´eptido provisto de una actividad ATasa, con una selectividad m´as elevada para el sustrato 18:1-ACP que para el 16:0-ACP, apropiada para utilizar en la presente invenci´on, es, preferiblemente, una que codifica para la ATasa de una planta resistente al fr´ıo, en particular, la espinaca, el guisante, o Arabidopsis. Se pueden obtener dichas secuencias de ADN, parcial o totalmente, mediante s´ıntesis qu´ımica; de otra forma, y m´ as preferiblemente, se puede obtener la secuencia de ADN mediante el clonaje de un ADNc o ADN gen´ omico que codifica para la ATasa de plantas resistentes al fr´ıo. En los siguientes ejemplos se utiliz´o una secuencia de ADNc que codifica para la ATasa de Arabidopsis Thaliana (Nishida, I. et al., en Plant lipid biochemistry, structure and utilization, Portland Press, London, 1990). Sin embargo, las secuencias de ADN que pueden utilizarse en esta invenci´ on no est´an limitadas a esta secuencia de ADN en particular.

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La secuencia nucleot´ıdica del ADNc que codifica para la ATasa de Arabidopsis se muestra en SEQ ID N0:1. El aislamiento del ADNc, en s´ı mismo, no forma parte de la presente invenci´ on; sin embargo, un proceso detallado para su aislamiento se describe abajo en los Ejemplos experimentales 1 y 2. De manera resumida, se obtuvo un clon gen´ omico que codificaba para la ATasa de Arabidopsis a partir de una genoteca gen´omica de Arabidopsis mediante el uso de un fragmento de ADNc de la ATasa de la calabaza como sonda. Este ADN gen´ omico se utiliz´o entonces para rastrear una genoteca de ADNc de Arabidopsis para obtener el clon de ADNc. El ADNc de Arabidopsis de SEQ ID N0:1 codifica para un polip´eptido de 459 amino´ acidos, con un peso molecular de 50.431. Se supone que la porci´ on de 90 amino´acidos del terminal N de este polip´eptido es un p´eptido se˜ nal para el transporte a los cloroplastos, que se corta durante el proceso de transporte, y resulta en una enzima madura de 369 amino´ acidos. Una preparaci´ on de la ATasa de E. coli que expresa este ADNc tiene una selectividad m´as elevada para el sustrato 18:1 que para el 16:0 (Ejemplo experimental 3). Cuando la secuencia de ADN es un ADNc son necesarias secuencias reguladoras de expresi´on apropiadas, cadena arriba y abajo de la secuencia del ADNc, para la expresi´ on del ADNc en las plantas transg´enicas. Cuando la secuencia de ADN es un fragmento de ADN gen´ omico y contiene secuencias reguladoras, el fragmento se puede utilizar por s´ı s´olo. Adem´as. dado que la ATasa expresada seg´ un esta invenci´on est´a involucrada en la bios´ıntesis de l´ıpidos de los cloroplastos, la ATasa expresada en las plantas transg´enicas debe ser transportada desde el citoplasma hasta los cloroplastos. Generalmente, es necesaria una secuencia de p´eptido se˜ nal en el terminal N para transportar una prote´ına, codificada en el n´ ucleo, a los cloroplastos (Van den Broeck et al., Nature, 313:358, 1985). Dado que las ATasas de pl´ astidos de plantas superiores se producen en el citosol y funcionan por naturaleza en los cloroplastos, las secuencias de ADN que codifican para una ATasa de plantas superiores, sea un ADNc o un fragmento de ADN gen´ omico, deben contener una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de amino´acidos que ejerce como un p´eptido se˜ nal, como muestra el ADNc de la ATasa de Arabidopsis usada en los siguientes ejemplos. Sin embargo, si es necesario, pueden emplearse las secuencias de ADN que codifican para un p´eptido se˜ nal conocido, como puede ser la subunidad menor de la ribulosa bisfosfato carboxylasa/oxigenasa. La secuencia de ADN que codifica para un polip´eptido provisto de una actividad ATasa con una selectividad m´as elevada para el sustrato 18:1-ACP que para el 16:0-ACP, seg´ un la presente invenci´ on, puede ser aquella que codifica para una ATasa derivada de organismos diferentes a las plantas superiores, como pueden ser las bacterias. Cuando se usa dicha secuencia de ADN, pueden requerirse secuencias reguladoras de expresi´ on apropiadas as´ı como una secuencia que codifica para un p´eptido se˜ nal, en una situaci´on apropiada, cadena arriba y/o cadena abajo de la secuencia de ADN. Se pueden encontrar construcciones detalladas y procedimientos para generar dichas inserciones en manuales de laboratorio, como puede ser el Molecular cloning 2a ¯ ed. (Sambrook et al. eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, y son obvios para los expertos en la materia. Una secuencia de ADN que codifica para un polip´eptido provisto de una actividad ATasa con una selectividad m´as elevada para el sustrato 18:1-ACP que para el 16:0-ACP para utilizar en la presente invenci´on, tambi´en puede ser una que codifica para una derivada de las ATasas descritas anteriormente. En este contexto, “derivada” significa un polip´ eptido con una o m´ as sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones, de amino´acidos en cualquiera de las ATasas anteriormente descritas, con la condici´ on de que el/los cambio/s en la secuencia de amino´acidos proporcionado/s no merme la actividad de la ATasa ni la selectividad de sustrato para el 18:1. Una lista de plantas superiores resistentes al fr´ıo apropiadas para la pr´ actica de la presente invenci´on para obtener plantas transg´enicas comprende, pero no se limita al arroz, el ma´ız, el boniato, la batata, el pepino, el pimiento verde, la berenjena, la calabaza, la banana, el mel´ on, el Kalanchoe, el ciclamen, el lirio, la rosa, la alubia, el pepino sponge, y el tabaco. La introducci´ on de la secuencia de ADN en las plantas superiores se puede conseguir mediante cualquiera de los procedimientos establecidos para la transformaci´ on de plantas, como por ejemplo el sistema de vector plasm´ıdico Ti de Agrobacterium y la electroporaci´on de protoplastos (por ejemplo, v´ease Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual (Draper, J. et al. eds.), Blackwell Scientific Publications, 1988), de acuerdo con la planta diana. En general, se prefiere la utilizaci´ on del vector plasm´ıdico Ti para las plantas dicotiled´ oneas, y se prefieren los procedimientos f´ısicos, como la electroporaci´ on, para las plantas monocotiled´ oneas y dicotiled´ oneas que no son susceptibles a la infecci´on por Agrobacterium. Los materiales vegetales para ser transformados pueden ser de cualquier explante, como por ejemplo, discos de hoja, discos de tallo, discos de tub´erculo, protoplastos, callos, polen o tubos pol´ınicos, seg´ un el protocolo de transformaci´ on. 7

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Seg´ un la presente invenci´ on, la introducci´ on y expresi´ on en una planta superior de una secuencia de ADN que codifica para una ATasa provista de una selectividad m´ as elevada para el sustrato 18:1-ACP que para el 16:0, incrementa el contenido de a´cidos grasos no saturados, particularmente en PG, y tambi´en resulta en una destacada reducci´ on de las especies moleculares del PG saturadas. La ATasa cataliza el primer paso de la bios´ıntesis del PG; sin embargo, al mismo tiempo, este paso es com´ un a las rutas de s´ıntesis de otros l´ıpidos en cloroplastos de otras plantas (v´ease antecedentes de la invenci´on) y, de esta manera, los productos de las reacciones de la ATasa se utilizan no tan s´ olo para el PG sino tambi´en para otros l´ıpidos. Adem´ as, dado que la/s ATasa/s intr´ınseca/s no se elimina/n en una planta transg´enica que expresa una ATasa ajena con una selectividad de sustrato diferente, la ATasa ajena tiene que competir con la ATasa intr´ınseca. Por estas razones no fue posible predecir si la composici´ on de los ´acidos grasos de los l´ıpidos de membrana, y mucho menos la composici´on de la especie molecular de PG, se cambiar´ıa mediante la expresi´ on de una ATasa ajena. Una reducci´ on destacada de la especie molecular del PG saturada, tal como se observ´ o seg´ un la presente invenci´ on, fue totalmente inesperada. Seg´ un la presente invenci´ on, es posible reducir significativamente la cantidad de la especie molecular del PG no saturada, la especie lip´ıdica que origina la separaci´ on de fase de las biomembranas e induce el da˜ no por fr´ıo de las plantas superiores. Este es el primer caso de ingenier´ıa gen´etica de plantas para resistencia al fr´ıo. Los siguientes ejemplos muestran y describen con m´as detalle la presente invenci´on.

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Ejemplo experimental 1 Aislamiento de un fragmento de ADN gen´ omico de Arabidopsis que codifica para la ATasa (1) Construcci´ on de una genoteca de ADN gen´ omico

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El ADN gen´ omico se prepar´ o a partir de unos 10 g (peso fresco) de hojas y tallos de Arabidopsis thaliana (l´ınea Lansberg) como se describe en el Current Protocols in Molecular Biology (Ausbel, F.M. et al, eds.) vol. 1, p´ ag. 2,3,1-2,3,3, John Wiley and Sons, 1987. 35

El ADN gen´ omico se digiri´ o parcialmente con una enzima de restricci´on Sau3AI, se insert´ o en la diana BamHI de un vector de fago lambda λDASH (Stratagene), y se empaquet´ o in vitro mediante un kit de empaquetamiento in vitro (GIGAPACK GOLD; Stratagene) para obtener una genoteca de ADN gen´ omico en fago λ.

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(2) Aislamiento del fragmento de ADN gen´ omico de la ATasa

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La cepa P2392 de Escherichia coli (Stratagene) se infect´ o con la genoteca del fago, y se rastrearon tres placas (10 em x 14 cm) con 6 x 103 - 6 x 104 calvas cada una. Los fagos se transfirieron a filtros, que on de hibridaci´ on compuesto de 5 x de la soluci´ on de se incubaron a 68◦ C durante 2 horas en un tamp´ Denhart [Ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, alb´ umina de suero bovino al 0,1%], SSC 6 x [NaCl 900 mM, citrato s´ odico 90 mM, pH 7,4], sulfato de dextrano al 10%, SDS al 0,1% y 100 µg/ml ADN de esperma de salm´on. Se obtuvo un fragmento de ADNc, de 1,4 kb, de la ATasa de la calabaza (Cucurbita moschata Duch) mediante el corte, con una enzima de restricci´on EcoRI, del pl´ asmido recombinante pAT-03 que lleva el ADNc de la ATasa de la calabaza, aislado a partir de E. coli AT-03 (FERM BP-3094). Este fragmento de ADNc fue sujeto al desplazamiento de mella (kit de desplazamiento de mella; Takara Shuzo) con 32 P-dATP para obtener una sonda con una actividad espec´ıfica de unos 108 dpm/µg. La sonda se a˜ nadi´ o al tamp´ on de hibridaci´ on, y los filtros se incubaron en esta soluci´ on a 50◦ C durante on de SSC 2 x y SDS al 0,1%, y se 12 horas m´ as. Entonces, se lavaron los filtros a 40◦C con una soluci´ realiz´ o la autorradiograf´ıa para seleccionar fagos que hibridar´ an fuertemente con la sonda. El ADN gen´ omico de Arabidopsis se separ´ o del ADN de fago con una enzima de restricci´on BamHI, y se someti´o a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para recuperar un fragmento de ADN de 2,6 kb. Este fragmento hibrid´ o fuertemente con la sonda. Se subclon´ o en un vector plasm´ıdico pBLUESCRIPT (Stratagene) para obtener un pl´ asmido pBB2.6. 8

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Ejemplo experimental 2 Aislamiento del ADNc de la ATasa de Arabidopsis 5

(1) Construcci´ on de una genoteca de ADNc.

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El ARN total se prepar´ o a partir de unos 15 g (peso fresco) de hojas y tallos de Arabidopsis thaliana (l´ınea Lansberg) seg´ un el procedimiento que se describe en el Current Protocols in molecular Biology (Ausbel, F.M. et al, eds.) vol. 1, p´ ag. 4,3,1-4,3,4, John Wiley and Sons, 1987. Se prepar´o ARN poli(A)+ a partir de ARN total seg´ un Wolf et al. (Nucleic Acids Res., 15:2911, 1987). otido El ADN complementario al anterior ARN poli(A)+ se sintetiz´o mediante el uso de un nucle´ oligo(dT) como cebador, seg´ un el manual de un kit de s´ıntesis de ADNc que se adquiri´o en Pharmacia (C´ odigo n´ umero 27-9260-01). Un adaptador EcoRI, que contiene una secuencia de reconocimiento NotI (Pharmacia), se lig´o a cada terminal del ADNc de doble cadena que se sintetiz´ o, y seguidamente se lig´o a la diana EcoRI de un vector de fago lambda λZAPII (Stratagene). El ADN de fago se empaquet´ o in vitro, mediante un kit de empaquetamiento in vitro (GIGAPACK II GOLD; Stratagene), para obtener una genoteca de ADNc en λZAPII.

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(2) Aislamiento del ADNc de la ATasa

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La cepa XL1-BLUE de Escherichia coli (Stratagene) se infect´ o con la genoteca de fago λ, y se rastrearon cinco placas (10 em x 14 cm) con 2 x 104 calvas cada una. Los fagos se transfirieron a filtros, que on de hibridaci´ on compuesto de SSC 6 x, leche desnatada se incubaron a 65◦ C durante 1 hora en un tamp´ al 0,05%, y azida s´ odica al 0,02%. Se obtuvo un fragmento del gen gen´ omico de ATasa de Arabidopsis mediante el corte, con una enzima de restricci´on BamHI, del pl´ asmido recombinante pBB2.6 que lleva un fragmento del gen de la ATasa de Arabidopsis (Ejemplo experimental 1(2)). Este fragmento de ADN se someti´o al desplazamiento de mella (kit de desplazamiento de mella; Takara Shuzo) con 32 P-dATP para obtener una sonda con una actividad espec´ıfica de unos 107 dpm/µg. La sonda se a˜ nadi´ o a la soluci´on de hibridaci´ on, y los filtros se incubaron en este tamp´ on a 65◦C ◦ on de SSC 1 x y SDS al 0,1%, durante 16 horas m´ as. Entonces, se lavaron los filtros a 65 C con una soluci´ y se realiz´o la autorradiograf´ıa para seleccionar los fagos que hibridar´ an fuertemente con la sonda.

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Se separaron los insertos del ADN de los fagos mediante una enzima de restricci´ on EcoRI, y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% para determinar el tama˜ no de los fragmentos. Uno de los fragmentos de ADN era de unos 1,4 kb. Se subclon´ o en un vector plasm´ıdico pBLUESCRIPT (Stratagene) para obtener un pl´ asmido pARAT. La secuencia nucleot´ıdica del fragmento se determin´ o mediante el procedimiento de terminaci´ on dideoxi (Proc. Natk. Acad. Sci. USA, 84:4767, 1987). El inserto ten´ıa una longitud de 1.445 pb con una fase abierta de lectura de 1.380 pb (con un cod´ on de terminaci´on), que se muestra en el listado de secuencia SEQ ID N0:1. Debido a la alta homolog´ıa de la fase abierta de lectura al ADNc de la ATasa de la calabaza, tanto para la secuencia nucleot´ıdica como para la secuencia de amino´acidos, se dedujo que la secuencia de ADN desde el nucle´otido 16 hasta el 1392 del SEQ ID N0:1 codifica para el precursor de la ATasa de Arabidopsis, que contiene un p´eptido se˜ nal a los cloroplastos, que est´ a compuesto de 459 amino´ acidos con una masa molecular de 50.431. Regiones no codificantes de 15 pb y 53 pb estaban presentes cadena arriba y cadena abajo de la fase abierta de lectura, respectivamente. La secuencia de amino´acidos de -90 a -1 en SEQ ID N0:1 es, presumiblemente, un p´eptido se˜ nal a cloroplastos en comparaci´on con la ATasa de la calabaza. Ejemplo experimental 3

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Expresi´ on de los genes de la ATasa de Arabidopsis y de la calabaza (control) en E.coli, y la comparaci´ on de sus selectividades de sustrato. (1) Construcci´ on de vectores de expresi´ on en E. coli

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El pl´ asmido pARAT que se obtuvo en el Ejemplo experimental 2(2) se digiri´o con las enzimas de restricci´on HgaI, que corta despu´es del nucle´otido 285 de la SEQ ID N0:1, y EcoRI (la diana de restricci´ on que se encuentra en la secuencia del vector cadena abajo del ADNc). El fragmento de 1.1 kb resultante, que contiene el ADNc de la ATasa de Arabidopsis se aisl´o de un gel de agarosa de bajo punto de fusi´ on y 9

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se hicieron los extremos romos con el fragmento Klenow. Mientras tanto, el pl´asmido pET3c (Novagen) se digiri´o con una enzima de restricci´on BamHI y se hicieron los extremos romos con el fragmento Klenow y, entonces, el grupo fosforil del extremo 5’ se elimin´ o con fosfatasa alcalina bacteriana. El fragmento de ADNc de la ATasa de Arabidopsis y el pET3c as´ı obtenidos se ligaron con la ligasa T4 del ADN para obtener un vector de expresi´on plasm´ıdico pAR1 que contiene un promotor T7, una secuencia l´ıder T7, el ADNc de la ATasa de Arabidopsis, y un finalizador T7.

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El pl´ asmido pAT-03, que contiene un ADNc de la ATasa de la calabaza, se prepar´o a partir de E. coli AT-03 (FERM BP-3094), se digiri´ o con las enzimas de restricci´on EcoRI y NaeI, y se someti´o a electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusi´ on para aislar un fragmento de 1.2 kb de ADNc de la ATasa de la calabaza. Se hicieron los extremos romos en este fragmento, con el fragmento Klenow, y se elimin´o el grupo fosforil del extremo 5’ con fosfatasa alcalina bacteriana. El fragmento de ADNc de la ATasa de la calabaza y el pET3c as´ı obtenidos se ligaron con la ligasa T4 del ADN para obtener un vector de expresi´on plasm´ıdico pSQ1 que contiene un promotor T7, una secuencia l´ıder T7, el ADNc de la ATasa de la calabaza, y un finalizador T7.

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C´elulas competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) se prepararon tal como se describe en Molecular cloning (Maniatis, T. et al. eds.), p´ ags. 250-251, 1982. Cualquiera de los dos pl´asmidos, pAR1 o pSQ1, obtenidos anteriormente, fueron introducidos en las c´elulas competentes, y la selecci´on con ampicilina dio los transformantes BLAR1 y BLSQ1, respectivamente.

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Se inocularon 500 ml de medio LB (que contiene 200 µg/ml de ampicilina) con los transformantes oa BLAR1 y BLSQ1 y se cultivaron a 37◦ C. Se cultivaron las c´elulas hasta que la turbidez del cultivo lleg´ D.0. de 0,5, medida a una longitud de onda de 600 nm. Entonces se a˜ nadi´ o isopropil-tio-galact´ osido hasta una concentraci´ on final de 0,4 mM, y se continu´ o el cultivo durante 3 horas para inducir la expresi´ on de la prote´ına de la ATasa. Se obtuvieron las c´ elulas bacterianas del cultivo mediante centrifugaci´on a 14.000 g durante 10 minutos. Se lavaron los precipitados con Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) y se resuspendieron en tamp´ on HM (Tris-HCl 45 EM, pH 7,4, DTT 2 mM, glicerol al 10%, ascorbato s´ odico 10 mM, benzamidina-HCl 1 mM, leupeptina 10 µg/ml, a´cido 6-aminohexanoico 5 mM). La suspensi´ on bacteriana se pas´o por una c´elula de presi´on Francesa a 10.000 psi para romper las c´elulas. El homogenado se centrifug´ o a 16.000 g durante 10 minutos, y a 100.000 g durante 60 minutos m´as, y el sobrenadante se recobr´o como una fracci´on de enzima cruda. La fracci´on de enzima cruda se someti´o a electroforesis en SDS en un gel de poliacrilamida al 10%, y se ti˜ no´ con azul brillante de Coomassie para detectar la ATasa de Arabidopsis o de la calabaza como una prote´ına con un peso molecular de alrededor de 40.000.

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(2) Ensayo de la actividad de la ATasa

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La actividad de la ATasa de las fracciones de enzima cruda que se prepararon anteriormente se ensayaron mediante el procedimiento de Nishida et al. (Plant Cell Physiol., 28:1071 1987) con 16:0-CoA y L-(U-14 C) glicerol 3-fosfato como sustratos. Las dos fracciones de enzima cruda de los transformantes de E. coli, BLAR1 y BLSQ1, mostraron la actividad ATasa (la transferencia de 16:0 a glicerol 3-fosfato). Las actividades espec´ıficas de la Atasa en las fracciones fueron de 2.000 y 530 nmol/min mg de prote´ına, respectivamente. La selectividad para el sustrato de la actividad Atasa que se obtuvo de esta manera, se analiz´ o seg´ un Frentzen et al. (Plant Cell Physiol. 28:1195, 1987). La mezcla de la reacci´on incluy´ o glicerol 3-fosfato 30 mM, (1-14 C) 16:0-ACP y (1-14 C) 18:1-ACP 1,5 µM cada uno, y las fracciones de enzima cruda de la ATasa expresada que correspondan a una actividad enzim´atica de unos 180 pmol/min. La selectividad se ensay´o a pH 7,4 y 8,2. Los resultados se muestran en la tabla 1. La ATasa de Arabidopsis expresada, en contraste con la ATasa de la calabaza expresada, mostr´o una alta selectividad para 18:1-ACP.

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ES 2 083 732 T3 TABLA 1 Selectividad de Sustrato de las ATasas expresadas en E. coli 5

Incorporaci´ on en a´cido liso-fosfat´ıdico Fuente de cDNA 18:1/16:0

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Arabidopsis Squash

pH 7,4 73/27 68/32

pH 8,2 65/35 56/44

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∗ En presencia de glicerol 3-fosfato 30 mM, 1,5 y µM [1-14 C] 18:1-ACP y 1,5 µM [1-14 C] 16:0-ACP 20

Ejemplo 1 Expresi´ on del ADNc de la Atasa de Arabidopsis en tabaco transg´enico

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El tabaco es una planta sensible al fr´ıo, pero relativamente resistente al fr´ıo entre las plantas sensibles al fr´ıo. El ADNc de la ATasa de Arabidopsis se introdujo y se expres´ o en plantas de tabaco transg´enicas de la siguiente manera. (1) Construcci´ on del vector de expresi´ on para la planta

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Un pl´ asmido de expresi´ on binaria de planta pBI121 (Clontech) se digiri´ o con las enzimas de restricci´on SacI y BamHI, se hicieron los extremos romos con el fragmento Klenow, y se lig´o con la ligasa T4 del ADN. El pl´ asmido pBI121(-GUS) as´ı obtenido contiene el gen de la β-glucuronidasa (GUS) delecionado. Este pl´ asmido tiene dianas de clonaci´on u ´ nicas de XbaI y BamHI entre el promotor del virus 35S mosaico de la coliflor (de ahora en adelante se denominar´a promotor 35S), y el finalizador de la nopalina sintasa (NOS). El pl´ asmido pARAT, obtenido en el Ejemplo experimental 2, se digiri´ o con EcoRI, y el fragmento de 1,4 kb de ADNc de la ATasa de Arabidopsis y el fragmento del vector se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusi´ on. El fragmento de ADNc se separ´ o del gel, se purific´ o, y se rellen´o con el fragmento Klenow. El fragmento de ADNc se clon´o en la diana XbaI rellenada del pBI121(-GUS), que se obtuvo anteriormente, para construir un pl´ asmido de expresi´ on pPI121-35SART, que lleva el ADNc de la ATasa de Arabidopsis bajo el control del promotor 35S y el finalizador NOS. (2) Introducci´ on de pBI121-35SART en Agrobacterium

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Se inocul´ o 50 ml. de medio YEB [5 g/l de extracto de carne de vaca, 1 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de peptona, 5 g/l de sacarosa, y MgSO4 2 mM, pH 7,4] con Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech), y se precipit´ o despu´es de un cultivo de 24 horas a 28 ◦ C, mediante centrifugaci´on a 3.000 rpm a 4◦ C durante 20 minutos. Se lavaron las c´elulas tres veces con 10 ml de HEPES 1 mM (pH 7,4), se lavaron una vez con 3 ml de glicerol al 10%, y se resuspendieron en 3 ml de glicerol al 10% para utilizarse en el siguiente experimento. 50 µl de la suspensi´ on de Agrobacterium y 1 µg de pl´ asmido pBI121-35SART se pusieron en una cubeta y fueron sujetos a un pulso el´ectrico, mediante un Electroporador Gene Pulser (Bio-Rad) bajo las condiciones de 25 µF 2500 V, y 200 Ω, para introducir el pl´ asmido en la bacteria. La suspensi´on electroporada se transfiri´ o a un tubo Eppendorf y se a˜ nadieron 800 µl de medio SOC [20 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 0,5 g/l NaCl, KCl 2,5 mM, pH 7,0], y el tubo se mantuvo a 28◦ C durante 1,5 horas. Se extendieron 50 µl de la suspensi´ on bacteriana en una placa YEB (agar al 1,2%) que conten´ıa 100 ppm de Canamicina, y se incub´ o a 28◦ C durante 2 d´ıas. Se recogi´ o una sola colonia de las colonias que se formaron en la placa. Se cultiv´ o la colonia a peque˜ na escala, y el ADN plasm´ıdico se aisl´o mediante el procedimiento alcalino. El ADN plasm´ıdico se digiri´o con las enzimas de restricci´on apropiadas, se separ´ o en un gel de agarosa al 1%, y la presencia de 11

ES 2 083 732 T3 pBI121-35SART se confirm´ o mediante el an´ alisis de transferencia de Southern mediante una sonda del o fragmento de ADNc de la ATasa de Arabidopsis que se marc´ o con 32 P. Este Agrobacterium se denomin´ ALBSART. 5

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(3) Transformaci´ on del tabaco Se cultiv´ o el ALBSART en medio l´ıquido LB, que conten´ıa 50 ppm de canamicina, durante 12 horas on de 1,5 ml del cultivo mediante centrifugaci´ on a 28◦C. Se cosecharon las c´elulas a partir de una porci´ a 10.000 rpm durante 3 minutos, se lavaron con 1 ml de medio LB para eliminar la canamicina, y se resuspendieron en 1,5 ml de medio LB para utilizarse en el siguiente experimento. Se sumergieron hojas de tabaco joven en NaClO al 0,5% durante 10 minutos, se lavaron 3 veces con agua est´eril, y el exceso de agua se elimin´o con papel de filtro est´eril. Se cortaron as´epticamente las hojas en trozos de 1 cm2 , y se colocaron sobre la suspensi´on de ALBSART con el lado reverso hacia arriba, durante 2 minutos, con agitaci´ on suave, y se elimin´o el exceso de suspensi´on bacteriana con papel de filtro est´eril. 1 ml de un cultivo de suspensi´ on de tomate (cultivo “Kurikoma”) se extendi´ o en una placa MS-BS [medio MS compuesto de 1.0 ppm benziladenina, 0,1 ppm acetato de naftalina, agar al 0,8%] (Murashige, T. and Skoog, F. S., Plant Physiol., 15:473 1962). Se puso un trozo de papel de filtro Whatman N◦ 1 (Φ 7 cm) sobre el cultivo de suspensi´on de tomate, y los trozos de hoja de tabaco se R y se incub´ o pusieron en el papel de filtro con el lado reverso hacia arriba. Se sell´ o la placa con Parafilm ◦ a 25 C durante 2 d´ıas bajo las condiciones de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad (si no se indica lo contrario, los explantes/plantas de tabaco se incubaron bajo estas condiciones). Se transfirieron las hojas a una placa MS-BS que conten´ıa 250 ppm de Claforan (Hoechst), y se incubaron durante 10 d´ıas m´as para eliminar el Agrobacterium. Las hojas, entonces, se pusieron sobre un medio MS-BS que conten´ıa 250 ppm de Claforan y 100 ppm de Canamicina, y se incubaron durante 7 d´ıas, y durante este per´ıodo de tiempo, los bordes de los trozos de hojas formaron callos y brotes primordios. Tras otros 10 d´ıas de incubaci´ on, los brotes alargados se transfirieron a medio MS libre de hormonas, que conten´ıa 250 ppm de Claforan y 100 ppm de Canamicina. Los brotes que arraigaron en este medio dentro de los 10 d´ıas de incubaci´ on, se recogieron como transformantes resistentes a la Canamicina, y se transfirieron a medio MS libre de hormonas, que conten´ıa 250 PPM de Claforan, en contenedores de pl´ astico transparente. (4) An´ alisis de transferencias de Western de las plantas de tabaco transformadas

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Se homogenizaron, en un mortero, 0,5 g (peso fresco) de muestras de hoja de tabaco en un tamp´ on de extracci´on que conten´ıa Tris-HCl 80 mM (pH 6,8), SDS al 2%, glicerol al 5%, y 2-mercaptoetanol 720 mM. El homogenado se transfiri´ o a un tubo de Eppendorf y se calent´ o a 100◦ C durante 3 minutos, despu´es de los cuales se recogi´o el sobrenadante mediante una centrifugaci´ on a 15.000 rpm, a 20◦ C, durante 10 minutos, para obtener un extracto crudo de prote´ına total. La concentraci´on de prote´ına se midi´ o mediante un kit de ensayo de prote´ına (Bio-Rad) y se ajust´ o a 1 µg/µl.

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10 µl del extracto de prote´ına total se mezcl´ o con el tamp´ on de carga de muestra, y fue sujeto a electroforesis en un gel SDS-PAGE (Daiichi-kagaku Co.) seg´ un Laemmli (Nature, 227:680, 1970). Las prote´ınas se transfirieron a un filtro de membrana PVDF (Millipore) mediante un aparato de electrotransferencia (Atto) en un tamp´ on de transferencia que conten´ıa Tris 0,025 M, glicina 0,192 M, etanol al 20%, y SDS al 0,01%, a 100 V durante una hora. La membrana se sumergi´o en la soluci´on de leche [leche desnatada al 5% (Difco), Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0,05%, NaN3 0,05%, pH 7,2] y se lav´o mediante agitaci´on a temperatura ambiente durante 3 x 10 minutos. Se incub´ o en la soluci´on de leche a temperatura ambiente durante 3 horas m´as para bloquear la absorci´ on no espec´ıfica del anticuerpo, y entonces se lav´o mediante agitaci´on durante 2 x 3 minutos en tamp´ on TBS-T [Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,5%, NaN3 al 0,05%, pH 7,2]. La membrana se incub´o en un antisuero de rat´ on anti-(ATasa de Arabidopsis), diluido 500 veces con tamp´ on TBS-T, con agitaci´on a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido por lavados en la soluci´ on de leche durante 3 x 10 minutos y en tamp´ on TBS-T durante 2 x 3 minutos, a temperatura ambiente. Las prote´ınas que reaccionaron con el anticuerpo se visualizaron mediante tinci´ on con peroxidasa mediante el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) seg´ un las instrucciones del proveedor. Las prote´ınas totales que se extrajeron de las plantas de tabaco transformadas conten´ıan una prote´ına que reaccionaba con el anticuerpo contra la ATasa de Arabidopsis en una proporci´ on de aproximadamente 0,5% de las prote´ınas totales. 12

ES 2 083 732 T3

Ejemplo 2 Composici´ on de ´ acidos grasos del fosfatidilglicerol de las hojas de tabaco transg´enico. 5

Se extrajo fosfatidilglicerol (PG) a partir de las hojas de las plantas de tabaco transg´enico, obtenidas anteriormente, y de plantas de control de tabaco no transformadas para analizar la composici´ on de los ´acidos grasos. 10

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(1) Extracci´ on de l´ıpidos totales Los l´ıpidos totales se extrajeron seg´ un Bligh y Dyer (Can. J. Biochem. Physiol., 37:911, 1959). 2 g (peso fresco) de muestras de hoja se cortaron en tiras con un bistur´ı y r´ apidamente se pusieron en 5 ml de isopropanol precalentado (80◦C) que conten´ıa butilhidroxitolueno al 0,1%, se mantuvo a 80◦C durante 5 minutos, y se enfri´ o a temperatura ambiente. Se a˜ nadieron 20 ml de cloroformo:metanol (1:2 v/v) y las hojas se homogeneizaron con un homogeneizador, dej´ andose reposar durante 15 minutos. Se a˜ nadieron 12 ml de cloroformo y 12 ml de agua destilada y la mezcla se agit´o vigorosamente, centrifug´ andose a anica. La capa continuaci´on a 3000 rpm, 4◦C, durante 30 minutos, para separar las capas acuosa y org´ org´ anica (inferior) se recuper´ o y, despu´es de a˜ nadir una cantidad apropiada de etanol, se evapor´ o hasta secar el contenido bajo presi´ on reducida a 30◦ C mediante un evaporador rotatorio. Los l´ıpidos totales as´ı obtenidos se disolvieron en 2 ml de cloroformo:metanol (1:4, v/v). (2) Fraccionamiento de las clases de l´ıpidos

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Se mezclaron 25 ml de una suspensi´ on de DEAE -Toyopearl (Toso) con 25 ml de acetato s´ odico 1 M para activar la resina. Entonces se lav´ o con agua destilada, metanol, se suspendi´o en metanol y se empaquet´ o en una columna (Φ 2 cm) hasta una altura de 1,5 cm. Se lav´ o la columna con 50 ml de cloroformo:metanol (1:4, v/v).

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Los l´ıpidos totales se cargaron en la columna. Primero, se eluyeron el monogalactosildiacilglicerol, el digalactosildiacilglicerol, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilcolina, con 50 ml de cloroformo:metanol (1:4, v/v). Despu´es se eluy´o la fosfatidilserina con 5 ml de ´acido ac´etico. Finalmente se eluyeron el PG, el sulfoquinovosildiaglicerol, y el fosfatidilinisitol con 50 ml de cloroformo:metanol: acetato amon´ıaco acuoso 10 M (20:80:0,2, v/v). Despu´es de a˜ nadir 15 ml de etanol, la u ´ ltima fracci´ on se evapor´ o bajo presi´on reducida y se disolvi´ o el residuo en 1 ml de cloroformo:metanol (2:1, v/v).

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Se purific´ o el PG a partir de los l´ıpidos fraccionados mediante la TLC en una placa de gel de silicio (Merck #5721) en el que el solvente de revelado era cloroformo:acetona:metanol:´acido ac´etico:agua (50:20:10:15:5, v/v). Se visualizaron los l´ıpidos mediante fluorescencia de primulin y se identific´ o el PG mediante la comparaci´ on de la velocidad de migraci´ on con una preparaci´ on est´andar de PG. (3) An´ alisis de los a ´cidos grasos

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Los polvos de silicio que conten´ıan el PG se rasparon de la placa de TLC y se pusieron en un tubo de ensayo de tap´ on de rosca. Se a˜ nadieron 2,5 ml de HCl/metanol al 5% a el tubo de ensayo y el l´ıpido se metanoliz´ o a 85◦ C durante 2,5 horas en el tubo de ensayo fuertemente cerrado. Se extrajeron los metil ´esteres de ´acido graso resultantes cuatro veces con 5 ml de hexano, se combinaron y se concentraron bajo presi´ on reducida y se analizaron mediante cromatograf´ıa de gas. Se identificaron los a´cidos grasos mediante la comparaci´ on del tiempo de retenci´ on con un est´ andar de metil ´esteres de ´acidos grasos y se cuantificaron mediante un Shimadzu Chromatopack C-R2AX. Los resultados se muestran en la tabla 2. Mientras que el contenido de ´acidos grasos saturados (16:0 + 16:1t + ´acido este´arico (18:0)) en el PG era del 68±1% en las plantas control no transformadas, en las plantas transg´enicas que expresaban la ATasa de Arabidopsis estaba reducido al 63±1%. Teniendo en cuenta que la posici´on sn-2 del PG est´ a ocupada exclusivamente por el 16:0 y el 16:1t, el contenido de la especie molecular saturada en el PG, que se calcula a partir del contenido de a´cidos grasos, es del 36±1% para las plantas no transformadas y del 26±1% para las plantas transg´enicas (Tabla 2). No se observ´ o ninguna diferencia significativa en la composici´on de a´cidos grasos de las principales clases de l´ıpidos, aparte del PG, entre las plantas de control y las plantas transg´enicas.

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ES 2 083 732 T3 TABLA 2 Las composiciones de a ´cidos grasos y especies moleculares en el PG 5

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Planta

160:0 + 16:1t + 18:0

Especies moleculares no saturadas

Tabaco no transformado Arabidopsis Tabaco transg´enico

68±1% 60±1% 63±1%

36±1% 20±1% 26±1%

Ejemplo 3 Transporte de la ATasa expresada de Arabidopsis hacia los cloroplastos

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Se prepararon cloroplastos intactos del tabaco transg´enico del ejemplo 1 y de plantas control de tabaco no transformadas, y se analizaron las prote´ınas del cloroplasto. (1) Preparaci´ on de cloroplastos intactos

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Se cortaron 10 g (peso fresco) de muestras de hoja con tijeras, y se pusieron r´ apidamente en 30 ml de tamp´ on homogenizaci´on sumergido en hielo [pirofosfato s´ odico 50 mM, MgCl2 1 mM, EDTA.2Na 1 mM, isoascorbato s´odico 2 mM, alb´ umina de suero bovino al 0,1%, sorbitol 330 mM, pH 7,8]. Se R , y se filtraron a trav´es de cuatro capas de Miacloth. rompieron suavemente las hojas con un Politron Se centrifug´ o el filtrado a 2.000 g, a 4 ◦ C, durante 2 minutos para recuperar el precipitado, el cual se resuspendi´ o completamente en 3 ml de tamp´on de suspensi´on [HEPES-NaOH 50 mM, sorbitol 330 mM, pH 7,6] utilizando un pincel. Se eliminaron los restos celulares mediante una centrifugaci´on a 100 g, a on de cloroplastos se recuper´ o mediante centrifugaci´on a 2.000 g, a 4◦C, durante 2 minutos, y la fracci´ o el precipitado por completo en 1 ml del tamp´ on de suspensi´on 4◦C, durante 2 minutos. Se resuspendi´ utilizando un pincel. R (del inferior al superior: 2,6 ml al 80%, Se prepar´ o un tubo de ensayo con un gradiente de Percoll andose reposar por un tiempo. Se carg´ o la suspensi´on de cloro12 ml al 40%, 5,4 ml al 15%) a 4◦ C, dej´ plastos sobre el gradiente, y se centrifug´o a 7.000 g, a 4◦ C, durante 15 minutos. Los cloroplastos intactos se separaron en la interfase entre 80% y 40% de Percoll como una banda verde, la cual se lav´o con 5 vol´ umenes del tamp´ on de suspensi´on, y se recuper´ o mediante centrifugaci´on a 2.000 g, a 4◦ C, durante 5 minutos.

(2) An´ alisis de las prote´ınas de cloroplastos totales 45

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Se suspendieron los cloroplastos intactos en 400 µl de tamp´ on de extracci´on, y las prote´ınas totales de cloroplasto se extrajeron de la misma manera que se describi´ o en el Ejemplo 1(4). 10 µg de las prote´ınas totales de cloroplasto se someti´o al an´ alisis por transferencia de Western, tal como se describi´ o en el Ejemplo 1(4). Se muestra el resultado en la figura 1. Se detect´ o en las preparaciones de las prote´ınas totales de cloroplasto de las plantas de tabaco transg´enicas, una banda correspondiente a la ATasa de Arabidopsis, la cual reaccion´ o con el anticuerpo contra la ATasa de Arabidopsis. Esto indica que la ATasa de Arabidopsis expresada en las plantas de tabaco transg´enicas se transport´ o a los cloroplastos de tabaco. Adem´as, se prepar´ o una fracci´ on de prote´ına soluble a partir de los cloroplastos intactos de las plantas transg´enicas, y se analiz´ o mediante transferencia de Western. Se detect´ o en la preparaci´ on de prote´ına soluble de cloroplasto (no mostrada) una banda correspondiente a la ATasa de Arabidopsis, la cual reaccion´o con el anticuerpo contra la ATasa de Arabidopsis, lo cual indica que la ATasa de Arabidopsis transportada se localiz´o en el estroma del cloroplasto. Ejemplo 4 Expresi´ on de la ATasa de la calabaza en plantas de tabaco 14

ES 2 083 732 T3

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Para poder examinar con m´as detalle el efecto del contenido de especie molecular del PG saturada sobre la sensibilidad al fr´ıo de las plantas superiores, se introdujo y se expres´ o el ADNc que codifica para la ATasa de la calabaza en plantas de tabaco para obtener plantas transg´enicas provistas de m´as especies moleculares del PG saturadas que las inherentes al tabaco. Como se muestra en la tabla 1 del Ejemplo experimental 3, la ATasa de la calabaza no tiene una selectividad de sustrato para el 18:1-ACP, y transfiere tanto el 18:1-ACP como el 16:0-ACP en casi la misma proporci´ on a la posici´ on sn-1 del glicerol 3-fosfato.

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El solicitante clon´o el ADNc de la ATasa de la calabaza, y su secuencia nucleot´ıdica es conocida por el p´ ublico (Ishizaki (Nishizawa), O. et al., FEBS Lett., 238:424, 1988). Por lo tanto se puede obtener, mediante cualquiera de los procedimientos apropiados que se utilizan en el campo de la ingenier´ıa gen´etica, tal como la s´ıntesis qu´ımica de ADN, y la PCR, seg´ un la informaci´ on de la secuencia.

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Cuando se expresa la ATasa de la calabaza en plantas de tabaco transformadas, se tiene que transportar la ATasa hasta los cloroplastos debido a que all´ı es donde funciona (v´ease Descripci´on Detallada de la Invenci´on). Para asegurar este transporte, se fusion´ o en pauta la secuencia de ADN que codifica para la porci´ on de p´eptido se˜ nal de la ATasa de Arabidosis (amino´ acido -90 a -1 en la SEQ ID N0:1), con la secuencia de ADN que codifica para la prote´ına madura de la ATasa de la calabaza.

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Se digiri´ o el pARAT (Ejemplo experimental 2(2)) con las enzimas de restricci´on HgaI, que corta despu´es del nucle´otido 285 de la SEQ ID N0:1, y XhoI (la diana de restricci´on de la cual est´ a en la secuencia del vector cadena arriba del ADNc). Se aisl´ o un fragmento de 320 pb que conten´ıa la secuencia de ADN que codifica para el p´eptido se˜ nal de Arabidopsis y se hicieron los extremos romos con el fragmento Klenow. Mientras tanto, se digiri´ o el pl´ asmido pAT-03 que contiene un ADNc de la ATasa de la calabaza (Ishizaki, O. et al., FEBS Lett., 238:424, 1988) con la enzima de restricci´on EcoRI, y se aisl´o el fragmento de 1,4 kb que conten´ıa ADNc de la ATasa de la calabaza, insert´andose en la diana EcoRI de pUC19 (Takara Shuzo) para construir el pl´ asmido pUC19/AT03. Se linealiz´ o con NaeI y se hicieron los extremos romos con el fragmento Klenow.

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Se ligaron los dos fragmentos de ADN con la ligasa T4 del ADN, y se seleccion´o un pl´ asmido provisto de un fragmento de ADN del p´eptido se˜ nal del ADNc de la ATasa de la calabaza insertado en una orientaci´ on correcta, denomin´ andose pSQAR. El pSQAR codifica para, de 5’ a 3’, (m´ as probablemente una parte de) el p´eptido se˜ nal de la ATasa de la calabaza y el p´eptido se˜ nal de la ATasa de Arabidopsis, fusionados en pauta con la ATasa madura de la calabaza, entre las cuales se encuentran las dianas de clonaci´ on m´ ultiples derivadas de pARAT. Al ser expresada y transportada hasta los cloroplastos en las plantas transg´enicas, se procesar´ıa la prote´ına de fusi´ on id´entica a la ATasa madura de la calabaza, excepto para la sustituci´ on de Leu por Pro en la segunda posici´ on partiendo del terminal-N. Se separ´ o un fragmento EcoRI del pSQAR, que codifica para la prote´ına de fusi´ on, se hicieron los extremos romos con el fragmento Klenow, y se insert´ o en la diana SmaI del vector de transformaci´ on de plantas pBI121 (Clontech) para obtener el pBI121-35SSQAR. Este vector plasm´ıdico contiene la secuencia de ADN que codifica para la prote´ına de fusi´ on bajo el control del promotor 35S y el finalizador NOS, con el gen estructural del GUS insertado entre la regi´ on de la prote´ına de fusi´ on y la finalizadora.

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El tabaco se transform´ o con pBI121-35SSQAR como se describe en el ejemplo 1(2) y (3), para obtener plantas de tabaco transg´enicas que expresan la ATasa de la calabaza. Se extrajeron muestras de PG a partir de hojas de las plantas transg´enicas, y se analiz´ o la composici´on de sus a´cidos grasos como en el Ejemplo 2. El contenido de a´cidos grasos saturados (16:0 + 16:1t + 18:0) era del 72±1%, y se calcul´ o que el contenido de la especie molecular saturada era del 44%. Este valor era m´as alto que el valor de 36% para el tabaco no transformado (v´ease la tabla 2), lo que indica que la composici´ on de los ´acidos grasos del PG del tabaco transg´enico se desplaz´o hacia el tipo sensible al fr´ıo. Para comparar, el PG de hojas de la calabaza contiene el 64% de especies moleculares saturadas. Ejemplo 5 Efectos del tratamiento de baja temperatura en las actividades fotosint´eticas de las hojas de tabaco transg´enico.

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La fotos´ıntesis es uno de los procesos bioqu´ımicos m´as dominante e importante en las plantas superiores, y la p´erdida de su actividad deriva en el da˜ no en la actividad fisiol´ogica de toda la planta. La p´erdida de la actividad fotosint´etica debido a un tratamiento de baja temperatura es, por lo tanto, una 15

ES 2 083 732 T3 buena indicaci´ on de la sensibilidad al fr´ıo de la planta.

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En consecuencia, se compar´ o la evoluci´on del ox´ıgeno fotosint´etico de las plantas transg´enicas de los Ejemplos 1 y 4, as´ı como aquellas transformadas con el vectADNor pBI121, antes y despu´es de un tratamiento de baja temperatura. Se midi´ o la evoluci´on del ox´ıgeno de las hojas con un electrodo de ox´ıgeno del tipo-Clark montado para la medida de la fase-gas. Se cort´o, de una hoja intacta, un disco de hoja de unos 8,5-10 cm2 y se coloco sobre una esponja h´ umeda mat en la c´amara de temperatura controlada de la unidad de electrodo de disco de hoja (Hanzatech, LD2). Se utiliz´ o luz blanca de una l´ ampara de tungsteno de 100 W (Hanzatech, LD2) como la luz act´ınica para la evoluci´on del ox´ıgeno fotosint´etico (1.000 µE/m2 /seg), que se pas´ o a trav´es de un filtro corta-calor (Hoya, HA-50). Se reemplaz´ o la fase de gas de la c´amara con aire o continuamente la evoluci´ on del ox´ıgeno del disco de compuesto de CO2 al 5% cada 7 minutos. Se midi´ o la temperatura de la c´amara a 1◦ C. El disco hoja a 27◦C, durante unos 90 minutos, entonces se baj´ de hoja se mantuvo a esta baja temperatura, bajo la misma iluminaci´ on, durante 4 horas, despu´es de las cuales se subi´o la temperatura a 27◦ C otra vez, y se midi´o la evoluci´on del ox´ıgeno tal como se ha descrito anteriormente. La figura 2 muestra los resultados que se obtuvieron con el tabaco transg´enico de los Ejemplos 1 y 4, y del tabaco control transformado con el vector pBI121, lo cual es, con respecto a la sensibilidad al fr´ıo, id´entico al tabaco no transformado.

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En ambas medidas, antes y despu´es del tratamiento por fr´ıo, la evoluci´ on de las actividades del ox´ıgeno se incrementaron gradualmente hasta llegar a un estado estacionario despu´es de un tiempo. Las actividades en este momento se tomaron como actividades anterior y posterior del tratamiento, respectivamente, y su relaci´on se calcul´o como un indicador de la sensibilidad al fr´ıo, tal como se muestra en la tabla 3. TABLA 3 Da˜ no a la Fotos´ıntesis a 1◦ C en plantas transg´enicas de tabaco

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Planta de tabaco transformada con

Actividad despu´es del tratamiento a 1◦ C (relativo a la de antes del tratamiento)

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pBI121 #1 #2 #3 ATasa ADNc Arabidopsis #1 #2 #3 #4 ATasa ADNc calabaza #1 #2

0,86 0,70 0,73 0,91 0,96 0,93 0,90 0,53 0,41

Mientras que la evoluci´on de la actividad del ox´ıgeno fotosint´etico de las plantas control, transformadas con el pBI121, baj´ o a un 70-86% del nivel original debido al tratamiento de baja temperatura a o poco y mantuvo un 1◦C durante 4 horas, la de las plantas transg´enicas con ATasa de Arabidopsis baj´ 90-96% del nivel original despu´es del tratamiento. Esto muestra que la evoluci´ on la actividad del ox´ıgeno fotosint´etico de las plantas transg´enicas con la ATasa de Arabidopsis es m´as resistente a baja temperatura que el control. Por lo tanto, se puede concluir que las plantas transg´enicas con ATasa de Arabidopsis son m´as resistentes al fr´ıo que el control. Por otra parte, la evoluci´ on la actividad del ox´ıgeno fotosint´etico de las plantas transg´enicas con la ATasa de la calabaza se baj´o a un 41-53% del nivel original debido al tratamiento de baja temperatura a 1◦ C durante 4 horas, siendo esta reducci´on significativamente m´as grande que el control, lo que indica que las plantas transg´enicas con la ATasa de la calabaza se hicieron m´as sensibles al fr´ıo que el control.

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ES 2 083 732 T3 Ejemplo 6 Efectos del tratamiento de baja temperatura en plantas de tabaco transg´enicas 5

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Se examinaron los efectos del tratamiento de baja temperatura sobre la planta entera de las plantas de tabaco transg´enicas del Ejemplo 1, y plantas de control no transformadas, y plantas de tabaco transformadas con el pBI121. astico transparentes. Se cortaron Se cultivaron las plantas de tabaco in vitro en contenedores de pl´ las partes superiores de las plantas as´ı cultivadas y se transfirieron a un medio de MS libre de hormonas que conten´ıa 250 ppm de Claforan en los contenedores de pl´astico y se cultivaron durante 2 semanas a on de 16 h luz/ 8 h oscuridad. Dentro de este per´ıodo, los explantes enraizaron y se 25◦C bajo la condici´ desarrollaron hasta pl´ antulas con tres a cuatro hojas totalmente expandidas. Se pusieron las plantas de tabaco en una c´ amara de cultivo (Koito Kogyo Co.: KPS-2000) que se fij´o a on de una l´ ampara fluorescente de 100 µE/m2 /seg. 1◦C, y se dejaron all´ı durante 10 d´ıas bajo la iluminaci´ Entonces se transfirieron las plantas a 25◦ C (16 h luz/ 8 h oscuridad) durante 2 d´ıas y se observaron los da˜ nos por el fr´ıo. La Figura 3 muestra una de las plantas de tabaco transg´enicas, que expresa la ATasa de Arabidopsis, y una planta de tabaco de control transformada con pBI121, antes y despu´es del tratamiento de fr´ıo. Las plantas de tabaco de control transformadas con el pBI121, as´ı como las plantas no transformadas, desarrollaron puntos blancos en sus hojas, despu´es del tratamiento de fr´ıo, que era el resultado de la descomposici´on de los cloroplastas (clorosis) debido al tratamiento (Fig. 3, placas superiores). Por otra parte, las plantas transg´enicas con la ATasa de Arabidopsis sufrieron poco da˜ no debido al tratamiento (Fig. 3, placas inferiores), lo que indica que son m´ as resistentes al fr´ıo que las plantas de control. Los Ejemplos anteriores demuestran, de manera concluyente, la aplicaci´on de la presente invenci´ on a la ingenier´ıa de la resistencia al fr´ıo en las plantas superiores sensibles al fr´ıo mediante la introducci´ on y expresi´on de una ATasa de plantas resistentes al fr´ıo en la planta sensible al fr´ıo y, de esta manera, reducir la especie molecular saturada en su PG. El hecho de que las plantas que se construyeron para contener una cantidad m´ as elevada de especie molecular saturada de PG eran m´ as sensibles al da˜ no por fr´ıo, demuestra a´ un m´ as la relaci´on entre la sensibilidad al fr´ıo y la composici´ on de la especie molecular de PG, lo que indica que el proceso para dar resistencia al fr´ıo a las plantas superiores de acuerdo con la presente invenci´on se puede aplicar ampliamente a variedad de plantas de cultivo. Este es el primer caso de ingenier´ıa gen´etica en planta para la resistencia al fr´ıo, lo cual contribuir´ a incalculablemente a la producci´ on agr´ıcola en a´reas de clima fr´ıo. Listado de Secuencia

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(1) Informaci´on general (i) Inventor/solicitante (solamente para los USA): Nishizawa Osamu 45

(ii) T´ıtulo de la invenci´on: Plantas resistentes al fr´ıo y su producci´ on (iii) N´ umero de secuencias: 1 (vii) Datos de la solicitud previa:

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(A) N´ umero de solicitud: JP 3-15883 (B) Fecha del expediente: 16 Enero, 1991 55

(2) Informaci´ on para SEQ ID N0:1: (i) Caracter´ısticas de la secuencia (A) Longitud: 1445 pares de bases

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(B) Tipo: a´cido nucleico

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ES 2 083 732 T3 (C) Cadena: doble (D) Topolog´ıa: lineal 5

(ii) Tipo molecular: ADNc a ARNm (iv) Fuente original (A) Organismo: Arabidopsis

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(B) L´ınea: Lansberg (ix) Caracter´ıstica: 15

(A) Nombre/Clave: 5’UTR (B) Localizaci´on: 1..15 (C) Procedimiento de identificaci´on: P

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(A) Nombre/Clave: CDS (B) Localizaci´on: 16..1395 25

(C) Procedimiento de identificaci´on: P (A) Nombre/Clave: p´eptido se˜ nal (B) Localizaci´on: 16..285

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(C) Procedimiento de identificaci´on: S (A) Nombre/Clave: p´eptido mat 35

(B) Localizaci´on: 286..1392 (C) Procedimiento de identificaci´on: S (A) Nombre/Clave: 3’UTR

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(B) Localizaci´on: 1396..1445 (C) Procedimiento de identificaci´on: P 45

(xi) Descripci´ on de la secuencia: SEQ ID N0:1

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18

ES 2 083 732 T3

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ES 2 083 732 T3

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ES 2 083 732 T3 REIVINDICACIONES

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1. Planta superior transg´enica caracterizada por la presencia de al menos una de sus clases de l´ıpidos de una proporci´ on m´ as elevada de ´acidos grasos no saturados que los inherentemente presentes en especies de dicha planta y por la presencia en sus c´elulas de una secuencia de ADN ex´ogena que codifica para un polip´eptido con una actividad glicerol 3-fosfato aciltransferasa provista de una selectividad de sustrato m´as elevada para el oleoil -(acil-prote´ına-portadora) que para el palmitoil-(acil -prote´ına-portadora).

10

2. Planta superior transg´enica seg´ un la reivindicaci´ on 1, en la cual el polip´eptido es una glicerol 3-fosfato aciltransferasa de una planta resistente al fr´ıo o una derivada de la misma funcionalmente equivalente a la enzima. 3. Planta superior transg´enica seg´ un la reivindicaci´ on 2, en la cual la planta resistente al fr´ıo es la espinaca, el guisante, o Arabidopsis.

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4. Procedimiento para incrementar el contenido de ´acidos grasos no saturados en los l´ıpidos de una especie de planta superior que incluye la introducci´ on, en las c´elulas de la planta, de una secuencia de ADN ex´ogena que codifica para un polip´eptido con una actividad glicerol 3-fosfato aciltransferasa provista de una selectividad de sustrato m´ as elevada para el oleoil-(acil-prote´ına -portadora) que para el palmitoil-(acil-prote´ına -portadora). 5. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 4, en el cual el polip´eptido es una glicerol 3-fosfato aciltransferasa de una planta resistente al fr´ıo o una derivada de la misma funcionalmente equivalente a la enzima.

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6. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 5, en el cual la planta resistente al fr´ıo es la espinaca, el guisante, o Arabidopsis.

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7. Planta superior transg´enica caracterizada por tener una temperatura cr´ıtica para el da˜ no por fr´ıo m´ as baja que la inherente a las especies de dicha de planta y por contener en las biomembranas de sus c´elulas una proporci´ on disminuida de especies moleculares de fosfatidil-glicerol saturadas y por la presencia en sus c´elulas de una secuencia de ADN ex´ogena que codifica para un polip´eptido con una actividad glicerol 3-fosfato aciltransferasa provista de una selectividad de sustrato m´ as elevada para el oleoil-(acil-prote´ına-portadora) que para el palmitoil-(acil-prote´ına-portadora).

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8. Planta superior transg´enica seg´ un la reivindicaci´ on 7, en la cual el polip´eptido es una glicerol 3-fosfato aciltransferasa de una planta resistente al fr´ıo o una derivada de la misma funcionalmente equivalente a la enzima. 9. Planta superior transg´enica seg´ un la reivindicaci´ on 8, en la cual la planta resistente al fr´ıo es la espinaca, el guisante, o Arabidopsis. 10. Procedimiento para reducir la temperatura cr´ıtica para el da˜ no por fr´ıo de una especie de planta superior que incluye la reducci´ on del contenido de especies moleculares de fosfatidil-glicerol saturadas en las biomembranas de sus c´elulas y la introducci´ on en sus c´elulas de una secuencia de ADN ex´ogena que codifica para un polip´eptido con una actividad glicerol 3-fosfato aciltransferasa provista de una selectividad de sustrato m´ as elevada para el oleoil-(acil-prote´ına-portadora) que para el palmitoil-(acilprote´ına-portadora). 11. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 11, en el cual la planta resistente al fr´ıo es la espinaca, el guisante, o Arabidopsis. NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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