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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 227 863

51 Int. Cl. : A61K 39/00

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A61K 39/12 C12N 5/08

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98935097 .0

86 Fecha de presentación: 03.07.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 1001806

87 Fecha de publicación de la solicitud: 24.05.2000

54 Título: Vesícula celular denominada “Exosoma”, preparación y utilización en la estimulación de una respues

ta inmunitaria. 30 Prioridad: 16.07.1997 FR 97 09007

06.02.1998 FR 98 01437

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.04.2005

73 Titular/es: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET

DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) 101, rue de Tolbiac 75013 Paris, FR INSTITUT GUSTAVE ROUSSY; CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) y INSTITUT CURIE 72 Inventor/es: Zitvogel, Laurence;

Raposo, Graça; Regnault, Armelle y Amigorena, Sebastian

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

ES 2 227 863 T3

01.04.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 227 863 T3 DESCRIPCIÓN Vesícula celular denominada “Exosoma”, preparación y utilización en la estimulación de una respuesta inmunitaria. 5

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La presente invención tiene por objeto un nuevo procedimiento de sensibilización de células presentadoras de antígeno, nuevos medios para la realización del procedimiento, y nuevas vesículas membranarias que tienen poder inmunógeno. Después de la demostración de la existencia de linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de antígenos tumorales presentados en el contexto de las moléculas de clase I (Rosenberg et coll., 1996; Boon, 1992), varios laboratorios han podido demostrar que la inmunoterapia antitumoral es una estrategia terapéutica eficaz en los modelos animales (Pardoll, 1995). El principio de la inmunoterapia es inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra unos antígenos específicos de tumores. Actualmente, esto ha podido ser efectuado de diferentes formas. En principio, unas células tumorales que expresan unas moléculas de coestimulación recombinantes y/o unas citoquinas inmunomoduladoras son capaces de estimular unas respuestas antitumorales capaces de erradicar unos tumores sólidos in vivo (Zitvogel et coll. 1996 [a]). Asimismo, unos péptidos derivados de antígenos tumorales (o antígenos exógenos expresados en las células tumorales) inyectados en diferentes formas químicas comprendida la utilización de liposomas o de virus (adenovirus o poxvirus por ejemplo) como vectores, son capaces de hacer regresar unos tumores. Finalmente, unas células presentadoras de antígenos profesionales, como las células dendríticas sensibilizadas con unos péptidos derivados de antígenos tumorales reinyectadas in vivo inducen unas respuestas antitumorales potentes, así como la regresión de tumores sólidos establecidos de la rata (Mayordomo et coll., 1995). Amirogena et al. (ver referencias página 59) han descrito la acumulación, en el compartimiento endocítico de los linfocitos B, de vesículas que expresan unas moléculas del CMH de clase II.

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La inmunoterapia basada en la utilización de las células dendríticas ha podido mostrar su eficacia en los estudios realizados en la rata. Por ello, esta terapia ha sido recientemente transpuesta a clínica. En los Estados Unidos, unos ensayos están actualmente en curso a fin de demostrar que unas células dendríticas cargadas de péptidos tumorales aumentan de manera significativa la frecuencia de células T citotóxicas específicas (CTL).

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Una primera limitación de esta aproximación es la sensibilización de las células dendríticas con unos péptidos derivados de antígenos tumorales. En efecto, en la mayoría de los tumores, no han sido identificados antígenos específicos. Unos antígenos específicos del tumor son solamente conocidos en unos casos de tumores inducidos por virus (carcinoma del cuello uterino), en los casos de melanoma (antígenos de sí mismo, antígenos mutados, antígenos de diferenciación) o en un pequeño porcentaje tumores del seno (oncógenos, o productos de genes supresores de tumor que han sufrido mutaciones). Sin embargo, la implicación directa de estos péptidos o antígenos tumorales en la eliminación de los tumores en el hombre queda por demostrar. Unos nuevos procedimientos de sensibilización de las células presentadoras de antígenos tales como las células dendríticas resultan por tanto necesarios. Estos procedimientos tienen por objetivo inducir unas respuestas antitumorales específicas en el contexto de moléculas de clase I y de clase II del CMH.

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La mayor parte de los procedimientos de sensibilización de células dendríticas utilizadas actualmente utilizan unos péptidos que corresponden a unos epítopos presentados en asociación con las moléculas de clase I e identificados en las células tumorales gracias a unos clones de CTLs específicos del tumor. Sin embargo, estos procedimientos no son verosímilmente óptimos puesto que no tienen en cuenta los epítopos reconocidos en el contexto de las moléculas de clase II que son críticos para la proliferación de los linfocitos T auxiliares, necesarios para la obtención de las respuestas citotóxicas óptimas. Además, unos epítopos presentados por las células tumorales y los presentados por las células presentadoras de antígenos (como por ejemplo las células dendríticas), no son probablemente los mismos. Finalmente, unos péptidos tumorales reconocidos por los CTL están solamente disponibles para un pequeño porcentaje de pacientes que tienen unas moléculas de clase I de haplótipo apropiado.

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El procedimiento de sensibilización ideal, de manera que pueda ser aplicado a cualquier tumor con un riesgo mínimo de inmunoselección, no debe estar restringido a un pequeño número de antígenos tumorales identificados. Asimismo, dicho procedimiento debería utilizar unos antígenos proteínicos intactos más bien que unos péptidos, a fin de permitir a la célula dendrítica prepararlos y presentar la combinación adecuada de péptidos en asociación con las moléculas de clase I y de clase II, y ello para cualquier individuo. Recientemente, Gilboa y colaboradores (Boczkowsky et coll., 1996) han podido demostrar que unos ARN mensajeros preparados a partir de biopsias de tumores cargados en las células dendríticas pueden tener un efecto antitumoral in vivo. Sin embargo, los ARN son muy inestables y la cantidad de ARN potencialmente interesante comparado con el ARN total es verosímilmente muy baja. Zitvogel et coll., (Zitvogel et coll., 1996 [b]) han demostrado que los péptidos tumorales preparados a partir de un eluido ácido de tumores (eluido peptídico ácido: EPA) pueden ser utilizados para cargar unas células dendríticas. Estas células así cargadas, una vez inyectadas, tienen la capacidad de hacer regresar unos tumores. Sin embargo, en el caso de tumores que no expresan moléculas de clase I (que representan la mayoría de los tumores humanos metastásicos), o en el caso de tumores que no pueden ser disociados en una suspensión celular, la aproximación que utiliza los eluidos ácidos no es muy eficaz y no es reproducible. Una segunda limitación de la inmunoterapia basada en el empleo de células dendríticas está ligada a los cambios fenotípicos que pueden sobrevenir cuando estas células son mantenidas en cultivo, o sometidas a diferentes tratamien2

ES 2 227 863 T3 tos. Esto puede en efecto conducir a unas poblaciones celulares poco homogéneas e insuficientemente caracterizadas para un uso terapéutico. 5

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Existe por tanto una necesidad real de mejorar los procedimientos de sensibilización de las células presentadoras de antígenos, a fin de aumentar la eficacia de estas aproximaciones y ensanchar sus aplicaciones, así como elaborar nuevos medios de vectorización de antígenos u otras moléculas. La presente invención aporta unas soluciones a estas cuestiones. La presente invención tiene en efecto por objetivo proporcionar nuevos procedimientos de sensibilización de células presentadoras de antígeno, en particular de las células dendríticas, así como la identificación, el aislamiento y la caracterización de las nuevas vesículas membranarias que tienen propiedades inmunógenas destacables. Uno de los aspectos de la invención es más particularmente proponer un nuevo procedimiento reproducible de sensibilización de células presentadoras de antígeno por unos antígenos tumorales.

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Uno de los otros aspectos de la invención es proponer un nuevo procedimiento reproducible de sensibilización de células presentadoras de antígeno por unos antígenos tumorales, en el cual no es necesario que los antígenos tumorales sean conocidos. 20

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Otro aspecto es proponer los medios que permitan establecer un banco de antígenos tumorales. Otro aspecto de la invención reside en unas vesículas membranarias, lipídicas producidas por las células dendríticas y dotadas de propiedades inmunógenas, así como su utilización para la producción de bancos de antígenos, la sensibilización de células presentadoras de antígenos o la vectorización de antígenos, en particular en el marco de aproximaciones inmunoterapéuticas. A este respecto, un aspecto referente a la utilización de una vesícula derivada de células tumorales que tienen las características siguientes:

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- está liberada de su entorno natural, - comprende una bicapa lipídica (designada por “superficie”) que rodea una fracción citosólica, y eventualmente,

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- presenta en su superficie unas moléculas de clase I del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) y/o de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) eventualmente cargadas con péptidos antigénicos y/o unas moléculas de adhesión y/o unas moléculas de coestimulación linfocitaria, y/o, 40

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- contiene en su fracción citosólica unas moléculas antigénicas tumorales y/o unos inmunomoduladores y/o chemoatractores y/o hormonas y/o unos ácidos nucleicos. La secreción de las vesículas por unas células es un fenómeno descrito en la técnica anterior (reticulocitos, linfocitos B, macrofagos). Estas vesículas son generalmente designadas por el término genérico “exosoma” que refleja su mecanismo de producción por exocitosis de vesículas internas. Son embargo, la función fisiológica de estas vesículas no ha sido verdaderamente establecida. Además, las características estructurales, las propiedades y las funciones de estas vesículas son variables según el tipo celular del cual han salido. De forma inesperada, los inventores han puesto ahora en evidencia que las células tumorales son capaces de segregar unas vesículas que presentan unas propiedades inmunógenas particularmente interesantes. Estas vesículas corresponden generalmente a una vesícula interna contenida en un endosoma de una célula tumoral y segregada por dicha célula tumoral a consecuencia de la fusión de la membrana externa del mencionado endosoma con la membrana citoplásmica de la mencionada célula tumoral. En razón de este mecanismo de formación, de su célula de origen y de sus características y propiedades funcionales originales, estas vesículas se designan en lo que sigue por el término “texosoma”. La expresión “liberada de su entorno natural” significa que la vesícula está separada físicamente de la célula de la cual ha salido, o también que está parcialmente aislada o purificada. Generalmente, la vesícula es por tanto producida por la célula por exocitosis, y después parcialmente aislada o purificada de manera que se obtenga una composición enriquecida. Esta expresión puede también significar que, no solamente la vesícula ha sido segregada por la célula cuando tiene lugar la fusión de los endosomas multivesiculares con la membrana plásmica, sino que no está ya rodeada de los elementos solubles que están en el lumen del endosoma, o que está desprovista de células intactas. La expresión “derivada de la célula tumoral” significa que la vesícula posee unos elementos estructurales de una célula tumoral. Esta vesícula es generalmente “derivada” de una célula tumoral en el sentido de que es producida, por lo menos en parte y después liberada por una célula tumoral, en una fase dada de su desarrollo. Según un modo de realización ventajoso, los texosomas presentan unas moléculas del CMH cargadas de péptidos multigénicos y/o expresan unas moléculas de adhesión y/o expresan unas moléculas de coestimulación linfocitaria, 3

ES 2 227 863 T3 pero están desprovistos, en su fracción citosólica, de moléculas antigénicas tumorales y de inmunomoduladores y de ácidos nucleicos. 5

Según otro modo de realización ventajoso, los texosomas son tales que las moléculas del CMH están “vacías”, es decir, no cargadas de péptidos antigénicos y los texosomas comprenden, en su fracción citosólica, unas moléculas antigénicas tumorales, unos inmunomoduladores y/o unos ácidos nucleicos. Unos texosomas que tienen unas moléculas del CMH vacías pueden ser obtenidos o bien a partir de células tumorales que presentan por ejemplo una deficiencia para el transportador de péptidos (TAP), o bien por lavado de texosomas o de células tumorales, a fin de eludir los péptidos asociados a las moléculas del CMH.

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Según un modo de realización ventajoso de la invención, los texosomas son tales que las moléculas del CMH están cargadas de péptidos antigénicos y/o expresan unas moléculas de adhesión y/o moléculas de coestimulación linfocitaria y los texosomas contienen en su fracción citosólica unas las moléculas antigénicas tumorales, unos inmunomoduladores y/o unos ácidos nucleicos. 15

El término “células tumorales” engloba de forma general cualquier célula que proviene de un tumor, por ejemplo un tumor sólido o líquido, así como las células transformadas o inmortalizadas in vitro. Se trata preferentemente de un tumor sólido, ascítico o hematopoyético. 20

Se pueden citar, a título de ejemplo, unas células de cáncer de tipo melanoma maligno (que provienen de progenies primarias establecidas “ex vivo” o bien de células disociadas que provienen de la pieza operatoria) que expresan en su superficie unos péptidos como MART-1/Melan-A, en el contexto CMH - clase 1, HLA-A 02-01, y que contienen el antígeno proteínico MART-1.

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Se pueden también citar unas células que provienen de cáncer del riñón (adenocarcinoma de células claras) o de leucemias cuya células expresan unos productos específicos de translocalización.

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Así, los péptidos antigénicos susceptibles de cargar las moléculas del CMH provienen por ejemplo de los antígenos siguientes: los que provienen de melanomas tales como: MART-1, tirosinasa, MAGE-1/2/3, P53 (en diferentes tumores) o Her2/Neu, PSA, CEA o también PSMA. Otros antígenos tumorales se citan por ejemplo en el artículo de Rosenberg (Immunology Today 18 (1997)175). Más generalmente, se pueden citar unos productos de fusión/translocalización, de oncógenos o de antioncógenos, o bien unos antígenos de diferenciación o unos péptidos de sí mismo o péptidos mutados.

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Por moléculas de coestimulación linfocitaria, se designan por ejemplo las moléculas que dan a los linfocitos T unas señales complementarias a las dadas cuando tiene lugar la interacción de los complejos Molécula de clase I y IIpéptido con el receptor de las células T. 40

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Se pueden citar, a título de ejemplo: CD80, CD86, ICAM, LFA, CD40, algunos miembros de la familia TNF R y unas moléculas de adhesión o de quemoatracción (que permiten el contacto entre la célula profesional presentadora de antígeno y los linfocitos afectores, o el transporte intracelular/localización específica (“trafficking/homing”) de otras células en el sitio vacunante o inflamatorio. Las moléculas antigénicas tumorales contenidas en el citosol o presentadas por los texosomas provienen de proteínas expresadas de forma selectiva y/o abundante por las células tumorales.

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Los inmunomoduladores que pueden estar presentes en el citosol de los texosomas son por ejemplo: - TNF-α, o - Interleucina 1, o

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- Interleucina 15, o - C-CR (quemoquinas). 60

Los ácidos nucleicos susceptibles de estar presentes en el citosol de los texosomas provienen de la célula tumoral misma. Estos ácidos nucleicos se encuentran en el citosol de los texosomas a consecuencia directa de su mecanismo de formación. Puede también tratarse de ácidos nucleicos heterólogos. Unas características más particulares de los texosomas son las siguientes:

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- son pequeñas vesículas membranarias de 60 a 100 nm aproximadamente, muy a menudo de 60 a 90 nm aproximadamente, en particular de 60 a 80 nm, segregadas por las células tumorales, 4

ES 2 227 863 T3 - poseen unas moléculas normalmente presentes en los endosomas, - contienen unos antígenos tumorales, como por ejemplo MART-1 en el caso de células de melanoma, 5

- están desprovistos de células muertas, y/o desechos celulares, - están desprovistos de contaminantes tales como contaminantes membranarios, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, mitocondrias o constituyentes de núcleos,

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- llevan en su membrana unas moléculas de clase I/II funcionales cargadas de péptidos antigénicos tumorales, - pueden estimular in vitro la proliferación de linfocitos T específicos,

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- pueden sensibilizar in vivo e in vitro unas células dendríticas capaces a continuación de activar unas células T específicas del tumor, - presentan la capacidad, cuando son inoculados in vivo, en particular en intradérmica, de hacer regresar unos tumores sólidos establecidos,

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- llevan unas moléculas de coestimulación linfocitaria tales como CD40 y CD80, y/o, - contienen la proteína (“heat-shock”) HSP70, - están desprovistos de la proteína gp96,

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- contienen unas interleucinas, o unos quemoatrayentes o unos inmunomoduladores.

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Otra característica interesante de los texosomas es que contienen fosfatidilserina en su hoja externa. La fosfatidilserina (PS) es uno de los componentes principales de las membranas celulares, normalmente presente muy mayoritariamente en la hoja interna de las bicapas lipídicas. En algunas circunstancias, como en las etapas precoces de la apoptosis, la PS es redistribuida hacia la hoja externa. La presencia de PS en la hoja externa de la membrana citoplásmica de las células apoptósicas constituye una señal de reconocimiento por los macrofagos. A fin de determinar si la PS está expuesta en la superficie de los texosomas, unas preparaciones de exosomas purificados a partir de sobrenadantes de las células de melanoma humano FON han sido analizadas por el procedimiento descrito por Aupeix et al. (J. Clin. Invest. 99: 1546-1554, 1997). El contenido de fosfatidilserina en la hoja externa de las muestras FON (que contienen 390 microg/ml de proteínas) es de 460 nM de PS. Los exosomas contienen por tanto cantidades importantes de PS en su hoja externa. Unas pruebas que permiten verificar que los texosomas poseen moléculas normalmente presentes en los endosomas consisten en la microscopía electrónica y la inmunomarca (Western Blot). Estas pruebas permiten demostrar que los texosomas expresan el receptor de la transferina, de las moléculas LAMP (“lysozome associated membrane protein”: proteína membranaria asociada al lisozoma), de las moléculas de clase I/II, de los antígenos tumorales.

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Una prueba que permite verificar que los texosomas están desprovistos de contaminantes es la microscopía electrónica y la inmunomarca con unos anticuerpos anticalnexina que está presente en el retículum endoplásmico.

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Una prueba que permite verificar que los texosomas llevan en su membrana unas moléculas de clase I/II funcionales cargadas de péptidos antigénicos tumorales consiste en una presentación antigénica a unos linfocitos T específicos de los antígenos del tumor interesado (pruebas de proliferación de clones T específicos de antígenos y CMH clase I restringidos). Se puede también utilizar una prueba de secreción de citoquinas (IFNγ, GMCSF, TNFβ) por los clones T antes citados.

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Una prueba que permite verificar que hay sensibilización in vivo e in vitro de las células dendríticas capaces de activar unas células T específicas del tumor se da en la figura 7 (prueba de proliferación y/o secreción de citoquinas por los clones T específicos de antígenos, por el procedimiento de sensibilización cruzada (“cross-priming”): texosomas de un tumor MART-1+, HLA-A2- cargados sobre una célula dendrítica MART-1-, HLA-A2+).

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Una prueba que permite verificar que los texosomas presentan la capacidad, cuando son inoculados, en particular por intradérmica, de hacer regresar los tumores sólidos establecidos se da en la figura 6.

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A título de ejemplo se practica una inyección de 10 a 40 µg de texosomas de tumor en intradérmica por el lado homolateral al tumor establecido desde 3 a 10 días; se observa el animal portador del tumor y la desaparición progresiva del tumor establecido en 7 a 10 días (en los roedores del tipo rata). Un texosoma ventajoso está constituido por un texosoma tal como el definido anteriormente y que presenta sobre su superficie unas moléculas de clase I y/o de clase II del CMH, eventualmente cargadas con péptidos antigénicos 5

ES 2 227 863 T3 y que contienen en su fracción citosólica unas moléculas antigénicas tumorales. Más particularmente, el texosoma preferido comprende también una o varias moléculas de coestimulación linfocitaria y/o la proteína HSP70. En un modo particular de realización, el texosoma está desprovisto de la proteína gp96. 5

10

Según un modo de realización ventajoso, la invención utiliza un texosoma tal como el definido anteriormente, - que expresa en su superficie unas moléculas de clase I y/o de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (CMH), y/o unos antígenos característicos de los tumores y/o unas moléculas de coestimulación linfocitaria/adhesión y/o unos inmunomoduladores y/o quemoatrayentes, exógenos con respecto a la célula tumoral de la que deriva el exosoma, o - que contiene unos antígenos tumorales y/o unos inmunomoduladores y/o unos ácidos nucleicos o unos agentes citotóxicos o unas hormonas exógenas con respecto a la célula tumoral de la que deriva el exosoma.

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Se describe un procedimiento de preparación de texosomas tales como los definidos anteriormente. Este procedimiento comprende ventajosamente una etapa de puesta a disposición de una muestra biológica y de una etapa de aislamiento de texosomas a partir de dicha muestra. La muestra biológica está ventajosamente constituida por fracciones membranarias, de sobrenadantes de cultivo o de lisados de células tumorales, o bien de suspensiones tumorales frescas. La muestra biológica puede provenir de piezas tumorales operatorias después de excisión quirúrgica (primer caso) o bien de órganos portadores de tumor (órgano extirpado quirúrgicamente) (segundo caso), que se trata por disociación mecánica (primer caso) o por perfusión prolongada (segundo caso).

25

La suspensión celular final es tratada de la misma manera que los sobrenadantes de cultivo. Puede también tratarse de células tratadas por congelación/descongelación en varios ciclos sucesivos. 30

Según un modo de realización ventajoso, la muestra biológica utilizada es: - una extracción de sangre aferente de la vena del órgano tumoral aislado, o - una extracción de suero o de plasma de la sangre que circula de un paciente, o

35

- el producto de drenaje (suero fisiológico que contiene eventualmente dexametasona, o agente citotóxico que estimula la exocitosis de los texosomas) de un órgano extirpado quirúrgicamente y tratado ex vivo por circuito aislado-perfundido para el drenaje del tumor que lleva, o también 40

- el sobrenadante de un explante tumoral disociado in vitro. La extracción de sangre aferente del órgano tumoral aislado corresponde a 20 a 50 ml de sangre de la vena principal aferente del órgano tumoral, extraída antes de la intervención de ablación quirúrgica.

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El producto de drenaje de un órgano extirpado quirúrgicamente y tratado ex vivo por circuito aislado-perfundido tiene lugar de la forma siguiente. En el caso de órgano que presenta una arteria aferente y una vena aferente, se cateteriza la arteria por un tubo plástico conectado a una bolsa proclive que contiene suero fisiológico con eventualmente otros agentes. Se drena el órgano y el líquido sale por otro tubo que cateteriza la vena, en declive (por ejemplo en el caso de cáncer de riñón o de un glioblastoma cerebral). La dexametasona, contenida eventualmente en el producto de drenaje, tiene por objetivo aumentar el estrés celular y la exocitosis de los texosomas fuera de la célula tumoral.

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El sobrenadante de un explante tumoral disociado in vitro se obtiene de la forma siguiente:

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- se procede a la disociación mecánica del tumor que conduce a una suspensión unicelular que contiene unas células tumorales y unas células del estroma tumoral y unas células del sistema inmunitario; esta suspensión puede ser irradiada y recuperada por las ultracentrifugaciones diferenciales.

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Como se ha indicado anteriormente, la muestra biológica puede ser tratada por uno o varios agentes que estimulan la producción de texosomas. Este tratamiento puede comprender la adición de agentes esteroides (dexametasona por ejemplo), agentes farmacológicos (por ejemplo unos agentes citotóxicos tales como taxanos, cisplatina, etc), de agentes susceptibles de aumentar la cantidad de endosomas multivesiculares y/o una irradiación de la muestra. Tratándose de la irradiación, la misma debe ser suficiente para provocar la acción citostática de las células tumorales. La irradiación de las células tumorales puede ser realizada antes de la puesta en cultivo de las células, o durante o 6

ES 2 227 863 T3 después de la puesta en cultivo de las células tumorales. Por otra parte, conviene irradiar cuando las células tumorales están vivas, es decir: - o bien sobre el órgano extirpado portador del tumor antes de la perfusión, 5

- o bien sobre las células en cultivo, - o bien sobre la suspensión celular disociada mecánicamente; pero, en todos los casos, antes de sufrimiento celular tumoral por causa de hipoxia/necrosis vascular/deshidratación. 10

Tratándose del tratamiento con la ayuda de esteroides, el mismo permite provocar una activación celular que conduce a la exocitosis de los texosomas. Tratándose del tratamiento con la ayuda de agentes farmacológicos, el mismo permite: 15

- modificar el citoesqueleto y reordenar los compartimientos intracelulares para desajustar los fenómenos de internalización de la exocitosis, - despolimerizar los microtúbulos. 20

25

Tratándose del tratamiento con un agente susceptible de aumentar la cantidad de endosomas multivesiculares, el mismo tiene lugar durante la puesta en cultivo de las células, como agente se puede citar el nocodazol, (droga que permite despolimerizar los microtúbulos), la bafilomicina (droga que inhibe los Atpases vaculares) (“Bafilomycins: A class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells” (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7972-7976). Un procedimiento de preparación de texosomas se efectúa: a) o bien a partir de cultivos celulares tumorales, y comprende:

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- una irradiación, con una intensidad suficiente para provocar la acción citostática de las células tumorales y que no sobrepasa de 15.000 rads, ventajosamente aproximadamente 10.000 rads, de las células tumorales antes, durante o después de su puesta en cultivo, o 35

- un tratamiento, durante el cultivo, de las células tumorales con la ayuda de esteroides, por ejemplo dexametasona, o de agentes citotóxicos, por ejemplo 5-fluoroacilo (5 Fu) o cisplatina, docetaxel, antraciclina, veneno del uso, antipirimídico o de interleucina por ejemplo IL10, IL2, IL15, GM-CSF, o

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- un tratamiento con un agente susceptible de aumentar la cantidad de endosomas multivesiculares, por ejemplo el nocodazol (Gruenberg J. et al., (1989) “Characterization of the Early Endosome and Putative Endocytic Carrier Vesicles In vivo and with an Assay of Vesicle Fusion In vitro” The Journal of Cell Biology 108: 1301-1316) y por tanto aumentar la producción de texosomas,

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b) o bien a partir de una extracción de suero fisiológico que drena un órgano extirpado quirúrgicamente y tratado ex vivo por circuito aislado-perfundido para el drenaje del tumor que lleva, o c) o bien a partir del sobrenadante de un explante tumoral disociado in vitro y que comprende:

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- un tratamiento con la ayuda esteroides, por ejemplo dexametasona, o de agentes citotóxicos, por ejemplo 5-fluoroacilo (5-Fu); cisplatina, taxanos o de interleucina por ejemplo IL-10, IL-2, GM-CSF. La etapa de aislamiento de los texosomas puede ser realizada según diferentes técnicas tales como la centrifugación, la cromatografía, la electroforesis, la nanofiltración, etc. Se trata por ejemplo de una centrifugación diferencial de fracciones membranarias de sobrenadantes de cultivo o de lisados de células tumorales o de suspensiones tumorales frescas y de recuperación de la o de las fracción(es) que contienen dichos exosomas (Raposo et al., J. Exp. Med. 1996, 183: 1161-1172). En este modo particular de realización, la fracción membranaria de sobrenadantes es la obtenida después de ultracentrifugación a 100.000 g. Puede tratarse ventajosamente de una electroforesis en fase fluida, que permite la separación de materiales biológicos después de su carga. Los ejemplos que siguen muestran que esta técnica puede ser ventajosamente utilizada para el aislamiento de texosomas con buenos rendimientos. Esta técnica es por otra parte particularmente ventajosa en el plano industrial. Un procedimiento de preparación de texosomas tal como el definido anteriormente comprende además:

65

- o bien la modificación genética de las células tumorales por unos genes exógenos que codifican para unas moléculas de clase I y/o de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (CMH), y/o unos genes que codifican para unos antígenos característicos de tumores y/o unos genes que codifican para unas moléculas de coestimulación/adhesión o unas quemoquinas atrayentes, pudiendo los productos de estos genes 7

ES 2 227 863 T3 exógenos encontrarse expresados en la superficie de los texosomas y/o estar secuestrados en el interior de los texosomas, 5

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- o bien la modificación in vitro de los texosomas producidos por las células tumorales, tal como la introducción (por electroporación, por fusión con un liposoma sintético, por virus recombinante o por procedimiento químico), de proteínas o de ácidos nucleicos o medicamentos farmacéuticamente definidos en y/o con los texosomas. Los texosomas de las células tumorales transfectadas como se ha indicado anteriormente son recogidos y utilizados como vacunas tumorales. Los texosomas modificados in vitro como se ha indicado anteriormente están destinados a suministrar el material exógeno a una célula diana in vitro o in vivo.

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Tratándose de la fusión con un liposoma sintético este procedimiento se realiza por ejemplo como se ha indicado en Nabel et al. (1996) o en Walker et al. (1997, Nature 387, páginas 61 y siguientes). La invención se refiere también a una vesícula membranaria liberada de su entorno natural, segregada por una célula dendrítica y que comprende unas moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y unas moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II y de antígeno cargadas de texosomas tales como los definidos anteriormente. Para obtener estas vesículas membranarias definidas anteriormente, se puede recurrir a un procedimiento que comprende:

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- una etapa de preparación de un texosoma tal como el definido anteriormente, - una etapa de incubación de un texosoma con unas células presentadoras de antígeno, 30

- una etapa de centrifugación diferencial de fracciones membranarias de sobrenadantes de cultivo o de lisados de las mencionadas células presentadoras de antígenos, cargadas de texosomas y - una etapa de recuperación de la fracción que contiene las mencionadas vesículas membranarias.

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A este respecto, la invención se refiere a unas vesículas membranarias producidas por unas células dendríticas. De manera inesperada, los inventores han en efecto puesto en evidencia que las células dendríticas eran capaces de producir unas vesículas membranarias que tienen propiedades inmunógenas particularmente ventajosas. Dichas vesículas han sido en particular visualizadas, aisladas y caracterizadas a partir de sobrenadantes de cultivo de células dendríticas, en particularmente de células dendríticas humanas inmaduras. Contrariamente a las vesículas descritas hasta el presente, estas vesículas son totalmente ventajosas en la medida en que presentan, de forma importante y simultánea, unas moléculas de los complejos principales de histocompatibilidad de las clases I y II. Estas vesículas membranarias comprenden una bicapa lipídica que rodea una fracción citosólica, y son designadas en lo que sigue por el término “dexosoma” en razón de su origen y de sus propiedades bioquímicas y biológicas originales. Estas vesículas poseen en efecto propiedades inmunógenas destacables puesto que son capaces de estimular la producción y la actividad de linfocitos T citotóxicos, a la vez in vitro e in vivo, y permiten suprimir in vivo el crecimiento de tumores establecidos, de manera dependiente de los linfocitos T y restringida al tipo de MHC. Los dexosomas constituyen por tanto unos principios activos particularmente adaptados para unas aproximaciones no celulares de inmunoterapia. Unas vesículas membranarias en el sentido de la invención son por tanto unas vesículas susceptibles de ser producidas por unas células dendríticas, y que comprenden una o varias moléculas de complejo principal de histocompatibilidad de clase I y una o varias moléculas de complejo principal de histocompatibilidad de clase II. Los dexosomas comprenden ventajosamente unas moléculas de coestimulación linfocitarios, y en particular unas moléculas CD63 y/o CD82 y/o CD86, preferentemente por lo menos CD86. Los estudios presentados en los ejemplos muestran en efecto que los dexosomas están muy marcados por los anticuerpos dirigidos específicamente contra estas moléculas de coestimulación. Por otra parte, los análisis en microscopía electrónica muestran que los dexosomas son homogéneos y poseen un diámetro comprendido entre 60 y 100 nm aproximadamente, muy a menudo entre 60 y 90 nm aproximadamente.

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Una variante particularmente preferida de la invención está por tanto representada por un dexosoma que tiene el diámetro comprendido entre 69 y 90 nm aproximadamente, obtenido a partir de una célula dendrítica, y que comprende: 65

- una o varias moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I, - una o varias moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II, 8

ES 2 227 863 T3 - una o varias moléculas CD63, - una o varias moléculas CD86; y, 5

- una o varias moléculas CD82. En un modo de realización particular de la invención, los dexosomas comprenden además uno o varios péptidos antigénicos y/o se obtienen a partir de células dendríticas inmaduras.

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Siempre según un modo de realización particular, los dexosomas están desprovistos de los marcadores H2-M, cadena li, y calnexina (un marcador específico del retículo endoplásmico). Por otra parte, siempre según un modo de realización ventajoso, los dexosomas de la invención comprenden además de la fosfatidilserina (PS) en su hoja externa. Así, unas preparaciones de exosomas purificados a partir de sobrenadantes de células dendríticas derivadas de la médula ósea han sido analizadas por el procedimiento descrito por Aupeix et al. (J. Clin. Invest. 99: 1546-1554, 1997). El contenido de fosfatidilserina en la hoja externa de las muestras de BMDC (que contienen 35 microg/ml de proteínas), la misma es de 80 nM de PS. Los dexosomas contienen por tanto cantidades importantes de PS en su hoja externa. Los dexosomas pueden prepararse según una metodología que comprende una primera etapa de obtención de células dendríticas o de cultivo celular que comprende unas células dendríticas, una segunda etapa, facultativa, en el curso de la cual las células pueden ser sensibilizadas a unos antígenos de interés, y una tercera etapa que comprende la producción de dexosomas a partir de estos cultivos celulares. Estas diferentes etapas pueden ser realizadas ventajosamente según las metodologías descritas a continuación.

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Preparación de las células dendríticas

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La primera etapa del procedimiento comprende una puesta a disposición de un(os) cultivo(s) de células dendríticas. Puede tratarse de cultivos de células enriquecidas con células dendríticas, incluso de cultivos celulares que comprenden esencialmente células dendríticas. Ventajosamente, se trata evidentemente de células dendríticas humanas. La preparación de células dendríticas ha sido bien documentada en la literatura. Así, es conocido que estas células pueden ser obtenidas a partir de células cepas del sistema inmunitario o a partir de precursores monocitos, o también aisladas directa en forma diferenciada (Revue par Hart, Blood 90 (1997) 3245).

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La obtención de células dendríticas a partir de células cepas está ilustrada por ejemplo por Inaba et al., (J. Exp. Med. 176 (1992) 1693), Caux et al. (Nature 360 (1992) 258) o Bernhard et al. (Cancer Res. 55 (1995) 1099). Estos trabajos muestran en particular que unas células dendríticas pueden ser producidas por cultivo de médula ósea en presencia de Factor de Estimulación de las Colonias de Granocitos-Macrófagos (GM-CSF) o, más precisamente, a partir de células cepas hematopoyéticas (CD34+) por cultivo en presencia de una combinación de citoquinas (GMCSF + TNFα). La obtención de células dendríticas a partir de precursores monocitos está ilustrada por ejemplo por Romani et al. (J. Exp. Med. 180 (1994) 83), Sallusto et al. (J. Exp. Med. 179 (1994) 1109), Inaba et al. (J. Exp. Med. 175 (1992) 1157) o también Jansen et al. (J. Exp. Med. 170 (1989) 577). Estas metodologías descansan esencialmente en la extracción de células mononucleadas en la sangre y la puesta en cultivo en presencia de diferentes combinaciones de citoquinas. Un procedimiento particular consiste en tratar los precursores monocitos de la sangre en presencia de combinaciones de citoquinas tales como la Interleucina-4 + GM-CSF o Interleucina-13 + GM-CSF por ejemplo. Esta técnica está también ilustrada por Mayordomo et al., 1995. Por otra parte, es también posible tratar los precursores monocitos por unos agentes farmacológicos de diferenciación celular tales como unos activadores de canales cálcicos. Otra aproximación para la obtención de células dendríticas consiste en aislar, a partir de muestras biológicas, unas células dendríticas ya diferenciadas. Esta aproximación ha sido descrita por ejemplo por Hsu et al. (Nature Medicine 2 (1996) 52). La metodología descrita por este equipo consiste esencialmente en recolectar unas muestras de sangre periférica y en tratarlas por diferentes gradientes y centrifugaciones de manera que se extraigan de las mismas las células dendríticas. La metodología descansa en la producción de células dendríticas a partir de precursores monocitos o de médula ósea. Estas metodologías están ilustradas en los ejemplos. Más particularmente, se ha preferido utilizar en el marco de la presente invención unas células dendríticas obtenidas por tratamiento de precursores monocitos (contenidos en la sangre o en la médula) en presencia de una combinación GM-CSF+IL-4 ó GM-CSF+IL- 13). Por otra parte, para la realización de la presente invención, es muy particularmente ventajoso utilizar una población de células dendríticas que comprenden unas células dendríticas inmaduras. Ventajosamente, se utiliza una población de células dendríticas compuesta principalmente (es decir, por lo menos 60%, preferentemente 70%) de células dendríticas inmaduras. El estado inmaduro de las células dendríticas corresponde a una fase precoz de su desarrollo, en la cual presentan una gran actividad endocítica y expresan unos niveles bajos de moléculas de clase I y II del CMH y de moléculas de coestimulación linfocitaria en su superficie. De manera sorprendente, los inventores han encontrado en 9

ES 2 227 863 T3 efecto que solamente las células dendríticas inmaduras eran capaces de producir unas vesículas membranarias en cantidad significativa. Este descubrimiento es tanto más sorprendente puesto que las células dendríticas en fase inmadura son conocidas por su baja capacidad para estimular los linfocitos T, y por tanto por su baja actividad biológica (Cella, Nature, Londres, 388 (1997) 782). 5

La primera etapa del procedimiento de la invención puede por tanto comprender ventajosamente la preparación de una población de células dendríticas que comprenden unas células dendríticas inmaduras, en particular a partir de precursores monocitos, más particularmente por tratamiento con una combinación de citoquinas tales como GMCSF+IL-4 ó GM-CSF+IL-13. 10

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Por otra parte, es también posible utilizar en el marco de la presente invención, unas poblaciones de células dendríticas inmortalizadas. Puede tratarse de progenies de células dendríticas inmortalizadas (progenie D1 utilizada en los ejemplos, o cualquier otra progenie producida por ejemplo por introducción del oncógeno myc en las células dendríticas). Puede también tratarse de células dendríticas preparadas y después inmortalizadas in vitro. El interés de células dendríticas inmortalizadas reside en la constitución de bancos de células sensibilizadas para unos grupos de antígenos dados, utilizables industrialmente para preparar unos dexosomas susceptibles de ser administrados a unas familias enteras de pacientes. Cuando se preparan las células dendríticas, las mismas pueden ser mantenidas en cultivo, purificadas aún más, almacenadas o utilizadas directamente en las etapas siguientes del procedimiento. Sensibilización de las células dendríticas

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Los dexosomas de la invención pueden ser preparados a partir de células dendríticas no cargadas de antígenos, es decir, que no comprenden antígenos determinados en sus membranas o en su citosol. dichos dexosomas se designan entonces “nativos” o “vírgenes”. Según un modo preferido de realización, los dexosomas de la invención son sin embargo preparados a partir de células dendríticas sensibilizadas para un antígeno o para un grupo de antígenos. En este modo de realización, los dexosomas son, en efecto, a su vez portadores de dicho o de dichos antígenos y son así capaces de inducir una respuesta en contra de estos. Diferentes técnicas pueden ser utilizadas para sensibilizar las células dendríticas para unos antígenos. Estas técnicas han sido mencionadas más arriba y comprenden en particular:

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- la puesta en contacto de las células dendríticas con unos péptidos antigénicos (“peptide pulsing”). Esta aproximación consiste en incubar las células dendríticas, durante un tiempo variable (generalmente de 30 minutos a 5 horas aproximadamente) con uno o varios péptidos antigénicos, es decir, con un péptido salido de un antígeno, tal como podría resultar del tratamiento de dicho antígeno por una célula presentadora del antígeno. Este tipo de aproximación ha sido descrita por ejemplo para unos péptidos antigénicos del virus HIV, de la influenza o de HPV o para unos péptidos derivados de los antígenos Mut1, Mart, Her2 o Neu por ejemplo (Macatonia et al., J. Exp. Med. 169 (1989) 1255; Takahashi et al., Int. Immunol. 5 (1993) 849; Porgador and Gilboa, J. Exp. Med. 182 (1995) 255; Ossevoort et al., J. Immunother. 18 (1995) 86; Mayordomo et al., citado; Mehta-Damani et al., J. Immunol. (1994) 996). Es también posible incubar las células dendríticas con un eluido peptídico ácido de una célula tumoral según la metodología descrita por Zitvogel et al. (1996, citado); - la puesta en contacto de las células dendríticas con uno o varios antígenos (“antigen pulsing”). Esta aproximación consiste en incubar las células dendríticas no con uno o varios péptidos antigénicos, sino con el o los antígenos intactos. El interés de esta técnica reside en el hecho de que el antígeno será transformado en péptidos antigénicos por los mecanismos naturales de la célula dendrítica, de manera que los péptidos antigénicos que resultan y presentados por la célula dendrítica deberían proporcionar una mejor inmunogenicidad. Esta aproximación ha sido ilustrada por ejemplo por Inaba et al. (J. Exp. Med. 172 (1990) 631) o por Hsu et al., (Nature Medicine 2 (1996) 52).

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- La puesta en contacto de las células dendríticas con uno o varios complejos proteínicos antigénicos. Esta aproximación es similar a la anterior pero puede permitir mejorar la eficacia de transformación y/o de presentación del antígeno. En particular, el antígeno puede ser utilizado en forma soluble o complejada con unos elementos de apuntado, que permiten en particular apuntar unos receptores membranarios como los receptores de la mannosa o los receptores de inmunoglobulinas (Rfc). Es también posible hacer el antígeno particular de manera que mejore su penetración o también su fagocitosis por las células. - La puesta en contacto de las células dendríticas con unas células o membranas de células que expresan unos antígenos o péptidos antigénicos. Esta técnica descansa en la transferencia directa de antígenos o péptidos antigénicos por fusión de células o de membranas celulares. Esta aproximación ha sido ilustrada por ejemplo por la fusión entre unas células dendríticas y unas membranas de células tumorales (Zou et al., Cancer Immunol. Immunother. 15 (1992) 1). 10

ES 2 227 863 T3

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- La puesta en contacto de las células dendríticas con unas vesículas membranarias que contienen unos antígenos o péptidos antigénicos (en particular unos exosomas de células tumorales tales como los descritos anteriormente). Esta aproximación de sensibilización de las células dendríticas que utilizan unos exosomas, tal como la puesta en evidencia en la presente invención, es particularmente ventajosa en la medida en que no necesita el conocimiento de los antígenos particulares y en la que los péptidos antigénicos cargados están en una conformación nativa. Esta tecnología está ilustrada en los ejemplos. - La puesta en contacto de las células dendríticas con unos liposomas que contienen unos antígenos o péptidos antigénicos (Nair et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 609).

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- La puesta en contacto de las células dendríticas con unos ARNs que codifican para unos antígenos o péptidos antigénicos, (ver Boczkowsky et al., 1996, citado). 15

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- La puesta en contacto de las células dendríticas con unos ADNs que codifican para unos antígenos o péptidos antigénicos (eventualmente incorporados en unos vectores de tipo plasmídico, viral o químico). Así, un modo de sensibilización de las células dendríticas consiste por ejemplo en infectar las células dendríticas con un virus contra el cual se busca una protección. Este ha sido descrito por ejemplo para el virus de la Influenza (Bhardwaj et al., J. Clin. Invest. 94 (1994) 797; Macatonia et al., citado). Otra aproximación consiste en suministrar, por medio de un virus u otros vectores de transferencia de ácidos nucleicos, un ADN que codifica para el o los antígenos o péptidos antigénicos de interés. Dicha aproximación ha sido ilustrada por ejemplo por Arthur et al. (Cancer Gene Therapy, 1995) o por Alijagie et al. (Eur. J. Immunol. 25 (1995) 3100). Algunos virus tales como los adenovirus, los AAV o los retrovirus parecen poder ser utilizados a este fin para suministrar un ácido nucleico en una célula dendrítica.

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Unas técnicas preferidas en el marco de la presente invención son los procedimientos de sensibilización que utilizan unas vesículas membranarias (de tipo exosoma), unos péptidos antigénicos, unos vectores, unos ARNs o unos eluidos peptídicos ácidos de tumor (EPA). La utilización de vesículas membranarias así como el “peptide pulsing” y el procedimiento EPA están ilustrados en los ejemplos y son muy particularmente preferidos.

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Producción de los dexosomas Cuando las poblaciones de células se han obtenido y eventualmente sensibilizado para uno o varios antígenos, pueden prepararse los dexosomas.

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Esta preparación comprende una primera etapa, facultativa, de tratamiento de las células, seguida de una segunda etapa de aislamiento de los dexosomas. La primera etapa de tratamiento de las células resulta de la puesta en evidencia por los inventores de que la producción de los dexosomas por las células dendríticas es un fenómeno regulado. Así, en ausencia de tratamiento las cantidades de dexosomas producidas son relativamente bajas. En particular, cuando se utiliza una población de células dendríticas maduras no previamente estimuladas, la producción de dexosomas es prácticamente indetectable. Los inventores han demostrado por tanto que la producción de dexosomas era esencialmente dependiente del tipo de células dendríticas y de la utilización de un tratamiento de estas células. Son estos elementos previos que permiten obtener unos dexosomas que tienen propiedades ventajosas, en cantidades significativas para un uso industrial. Un tratamiento de las células dendríticas es por tanto ventajosamente realizado de manera que se estimule la producción de dexosomas por estas células. Este tratamiento estimulante puede ser realizado o bien por cultivo de las células en presencia de ciertas citoquinas, o bien por irradiación de las células, o bien disminuyendo el pH del cultivo, o bien combinando estos diferentes tipos de tratamiento. En el primer modo de realización, las células dendríticas son incubadas en presencia de una citoquina elegida preferentemente entre el interferón gamma (IFNγ), la interleucina-10 (IL-10) y la interleucina-12 (IL-12), preferentemente el interferón gamma y la IL-10. Como se ha ilustrado en los ejemplos, estas citoquinas parecen ejercer un efecto estimulante bastante pronunciado sobre la producción de dexosomas (factor 3 a 5). Además, de forma sorprendente, ningún efecto estimulante ha sido observado en presencia de las citoquinas siguientes: IL-1β, IL-2, IL-4, IL6 e IL-15, y un efecto inhibidor ha sido incluso observado en presencia de lipopolisacárido (LPS) o de TNFα, que se describen por tanto como que estimulan la maduración de las células dendríticas. Estos resultados muestran por tanto (i) el carácter regulado de la producción de dexosomas y (ii) el efecto específico de ciertas citoquinas sobre esta producción. Estos resultados ilustran además el interés sorprendente de utilizar unas células dendríticas inmaduras, y la utilización, en la etapa de estimulación, de citoquinas que inducen un estado inmaduro de las células, tales como la IL-10 en particular. En este modo de realización las citoquinas se utilizan a unas dosis adaptables por el experto en la materia en función (i) de la citoquina, (ii) de la población celular y (iii) de la realización eventual de otros tratamientos. Queda entendido que las citoquinas son preferentemente utilizadas a unas dosis subtóxicas. Las dosis de interleucina están generalmente comprendidas entre 1 y 100 ng/ml, preferentemente entre 1 y 50 ng/ml. El interferón puede ser utilizado a unas dosis comprendidas entre 1 y 500 UI/ml, preferentemente entre 5 y 200 UI/ml. En el segundo modo de realización, las células dendríticas son sometidas a una irradiación. Los resultados presentados en los ejemplos muestran en efecto que una irradiación de las células permite también aumentar los niveles de 11

ES 2 227 863 T3 producción de dexosomas. La irradiación se efectúa generalmente entre 1000 y 5000 rads, preferentemente entre 2000 y 4000 rads, ventajosamente alrededor de 3000 rads. 5

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La segunda etapa comprende el aislamiento de los dexosomas. Esta etapa tiene por objeto separar los dexosomas de las células dendríticas y/o del medio de cultivo. Esta etapa permite en particular obtener una composición enriquecida en dexosomas y esencialmente desprovista de células intactas. Preferentemente, esta etapa conduce a una composición que comprende 70% por lo menos de dexosomas, preferentemente 85% por lo menos. El aislamiento de los dexosomas puede realizarse según diferentes técnicas de separación de materiales biológicos. Como se ha descrito anteriormente para los dexosomas de células tumorales, esas técnicas pueden estar basadas en las diferencias de tamaño, de masa, de carga o de densidad de los dexosomas. Así, los dexosomas pueden ser aislados por centrifugación del medio de cultivo o del sobrenadante de cultivo o de fracciones membranarias o de lisados de células dendríticas. Puede tratarse por ejemplo de una centrifugación diferencial y/o de una centrifugación en gradiente de densidad, seguido(s) de una recuperación de la o de las fracción(es) que contiene dichos dexosomas. Este tipo de metodología descansa en la separación, por centrifugaciones sucesivas, de las vesículas membranarias por una parte y de las células, residuos celulares, vesículas internas, etc, por otra parte. En este modo particular de realización, la fracción que comprende los dexosomas es generalmente obtenida después de ultracentrifugación a 100.000 g. Este procedimiento está ilustrado en particular en los ejemplos 1 y 8.

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La etapa de aislamiento de los dexosomas puede también ser realizada por cromatografía, electroforesis y/o nanofiltración. 25

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Puede tratarse ventajosamente de una electroforesis en fase fluida y/o en gradiente de densidad. La electroforesis en fase fluida, que permite la separación de materiales biológicos según su carga, es totalmente ventajosa. El ejemplo 11 que sigue muestra en efecto que esta técnica puede ser ventajosamente utilizada para el aislamiento de exosomas con buenos rendimientos. Esta técnica es por otra parte particularmente ventajosamente en el plano industrial. Puede también tratarse de una purificación por cromatografía. Se pueden citar en particular las cromatografías de intercambio de iones, de permeación de gel (o de exclusión) o la cromatografía hidrófoba. Teniendo en cuenta la naturaleza lipídica de los exosomas, la cromatografía de intercambio de iones es particularmente interesante. La nanofiltración de intercambios de iones es particularmente interesante. La nanofiltración puede ser realizada según las técnicas conocidas, a partir de un sobrenadante de células. El recurso a unas técnicas de la cromatografía y/o de la electroforesis y/o de nanofiltración constituye otro aspecto importante de la presente invención, puesto que permite, con respecto a las tecnologías corrientes, una producción de calidad mejorada, en cantidades adaptadas a un uso industrial (en particular farmacológico). A este respecto, la invención se refiere también a un procedimiento de preparación de vesículas membranarias que comprende por lo menos una etapa de separación por electroforesis, cromatografía o nanofiltración. Este procedimiento está más particularmente adaptado para la preparación de vesículas membranarias de tipo exosoma, tales como los texosomas o los dexosomas. En este procedimiento, la etapa de separación por electroforesis o cromatografía puede ser realizada directamente sobre un sobrenadante de cultivo, un lisado celular, o una preparación prepurificada. La electroforesis es más preferiblemente una electroforesis en fase fluida.

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Los dexosomas presentan unas propiedades destacables que están ilustradas en los ejemplos. Así, los dexosomas estimulan la proliferación de linfocitos T citotóxicos in vitro. Además, in vivo, los dexosomas son capaces de bloquear el crecimiento tumoral. Estas vesículas son por tanto capaces de presentar de forma muy eficaz, en asociación con unas moléculas del CMH de clase I y de clase II, unos antígenos de interés. Los dexosomas presentan por tanto numerosas aplicaciones, en el campo del cáncer, de las enfermedades infecciosas o parasitarias por ejemplo. Además, a unas dosis elevadas (susceptibles de inducir una tolerancia), los dexosomas pueden también ser utilizados en el tratamiento de patologías tales como la alergia, el asma o las enfermedades autoinmunes. Además, los dexosomas “nativos” pueden también ser utilizados como adyuvante para estimular y/o modular una respuesta inmunitaria. La invención tiene también por objeto la utilización: - de dexosomas tales como los definidos anteriormente,

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para la estimulación y eventualmente la amplificación in vitro de linfocitos T específicos de antígenos contenidos en los mencionados texosomas, células presentadoras de antígenos o de dexosomas, - o de linfocitos B, y en particular para la estimulación y la amplificación in vitro de linfocitos T. La invención se refiere también a la utilización de dexosomas tales como los definidos anteriormente, para la selección ex vivo de un repertorio de linfocitos T, susceptibles de reconocer unos antígenos específicos contenidos en los mencionados texosomas, células presentadoras de antígeno, o dexosomas. La invención tiene también por objeto un medicamento que comprende, a título de sustancia activa, por lo menos un texosoma tal como el definido anteriormente, una célula presentadora de antígeno tal como la definida anteriormente, 12

ES 2 227 863 T3 y/o un dexosoma tal como el definido anteriormente, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ventajosamente, la invención se refiere a un medicamento tal como el definido anteriormente para una utilización en el tratamiento de los cánceres, enfermedades infecciosas o parasitarias. 5

Más preferentemente, el medicamento comprende unos dexosomas tales como los definidos anteriormente. Según otro modo de realización, la invención se refiere a un medicamento tal como el definido anteriormente para una utilización en el tratamiento de las patologías de tipo alergia, asma o enfermedad autoinmune. 10

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Como forma galénica apropiada, los dexosomas pueden estar contenidos en un suero fisiológico, en una ampolla o cualquier otro medio apropiado (jeringa, bolsa, etc.). Pueden ser preparados extemporáneamente o almacenados, por ejemplo en forma congelada a -80ºC. Las soluciones utilizadas pueden estar compuestas por soluciones salinas, eventualmente suplementadas con agentes estabilizantes y/o adyuvantes. Los agentes estabilizantes pueden ser en particular unas proteínas o moléculas de alto peso molecular. Se puede citar más particularmente unas proteínas tales como la suero-albúmina humana, o unas moléculas tales como el dextrano o el polaxamero por ejemplo. Las composiciones de la invención pueden también comprender o ser utilizadas en asociación con uno o varios adyuvantes. El adyuvante puede ser más particularmente cualquier agente farmacológico inmunoestimulante, tal como por ejemplo una citoquina (en particular interleucina-12). Dichos agentes son clásicamente utilizados en los protocolos clínicos o en composiciones de vacunas. Por otra parte, el adyuvante según la invención puede también ser un agente capaz de estimular la producción de células dendríticas in vivo. Se puede citar a título de ejemplo el compuesto Flt3. La utilización combinada de este tipo de agente permite aumentar el número de células dendríticas, y por tanto mejorar potencialmente la eficacia de las composiciones de la invención. Otro objeto de la invención se refiere por tanto a una asociación de dexosomas y de un adyuvante, en vista a una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo.

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Un modo de administración apropiado de los medicamentos de la invención está constituido por unas inyecciones, y en particular unas inyecciones intradérmicas o subcutáneas. Este modo de administración está particularmente adaptado cuando la sustancia activa del medicamento está constituida por unas células dendríticas cargadas de texosomas o por unos dexosomas. Las posologías apropiadas son de 0,01 a 10, y en particular 0,10 a 5, aún más particularmente de 0,15 a 2 µg/kg de peso corporal, y de 10 µg para las pruebas de reacción intradérmicas. Los medicamentos de la invención pueden también ser utilizados a razón de 100 µg para los tratamientos de vacunaciones profilácticas.

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Los objetivos previstos por la utilización de los medicamentos de la presente invención son: - la hipersensibilidad retardada (pruebas en los cancerosos), o 45

- la terapia profiláctica, o - la utilización en el marco de la detección de la frecuencia de los precursores linfocitarios específicos citotóxicos o secretores de interferón por la técnica de dilución límite.

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Se trata de utilizar las células dendríticas autólogas o alogénicas preincubadas con unos texosomas de la invención, como dianas de linfocitos periféricos de sujetos portadores del tumor, antes, durante y después del tratamiento antitumoral (tratamiento clásico o inmunización activa específica). La invención se refiere también a la utilización de un dexosoma tal como el definido anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores, en particular sólidos, ascíticos y hematopoyéticos. Como tumores sólidos, se pueden citar: el cáncer de riñón, de seno, de colon, de pulmón, de estómago, de hígado, los melanomas, sarcomas, etc.

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Como tumores hematopoyéticos, se pueden citar: las leucemias, los linfomas malignos hodgkinianos o no hodgkinianos. Como se ha indicado anteriormente, las composiciones de la invención, en particular las composiciones que comprenden unos dexosomas, son también utilizables para el tratamiento de las enfermedades infecciosas o parasitarias. Para este tipo de aplicación, los dexosomas son cargados de antígenos o péptidos del agente infeccioso (virus) o del parásito. La invención se refiere también a la utilización de un dexosoma tal como el definido anteriormente, en el marco 13

ES 2 227 863 T3 de una prueba de hipersensibilidad retardada del cáncer o también como herramienta de diagnóstico de búsqueda de frecuencia de precursores específicos CTL citotóxicos. 5

La invención se refiere también a la utilización de un dexosoma tal como el definido anteriormente, para la transferencia de material biológico a una célula in vitro o in vivo. Está prevista la creación de bancos de texosomas derivados de células tumorales de tipo histológico común o diferente.

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Estas están compuestas por mezclas de texosomas realizados a partir de progenies de células tumorales para un tipo de cáncer dado. Estos bancos de texosomas pueden permitir sensibilizar unas células presentadoras de antígeno, en particular unas células dendríticas, contra todos los tumores de este tipo. Se pueden citar unas mezclas de texosomas para unos tumores genéticamente ligados (cáncer de seno y de ovarios) o que presentan unas mutaciones p53, p16 conocidas (cáncer de seno, sarcoma). Se pueden también mencionar unas mezclas de texosomas tumorales con unas vesículas que provienen de células inmortalizadas y transfectadas para expresar unas moléculas de coestimulación, unas moléculas de adhesión, unas quemoquinas atrayentes (diferentes de las expresadas sobre los texosomas).

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La presente invención será descrita más en detalle con la ayuda de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos. Leyendas de las figuras 25

Tabla 1. Las células de progenies tumorales han sido incubadas durante 24 horas a una densidad de un millón de células por mililitro. Los texosomas han sido preparados a continuación (ver ejemplo) a partir de los medios de cultivo por ultracentrifugación diferencial. La concentración de proteínas texosomiales es medida por el test de Bradford (Bio Rad Protein Assay [BioRad]. 30

MZ-2 se describe en Traversari et al., (1992) Los * significan que las diferentes progenies primarias han sido establecidas y caracterizadas en el laboratorio de biología clínica del Institut Gustave Roussy y son accesibles bajo demanda. 35

Figuras 1A y 1B Morfología de los endosomas multivesiculares y de los texosomas derivados de las células TS/A 40

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A. Secciones ultrafinas de las células TS/A analizadas por microscopía electrónica. Detalle del citoplasma que muestra un compartimiento endosomial que contiene vesículas de 60-80 nm de diámetro. B. Preparación de texosomas de células TS/A analizadas en microscopía electrónica por la técnica sobre vesícula intacta (Raposo et al. (1996)). Las preparaciones de texosomas contienen una población mayoritaria de vesículas de 60-80 nm de diámetro, de tamaño y morfología similares a las vesículas internas de los endosomas multivesiculares mostrados en A. Figura 2

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Presencia de diferentes marcadores en los texosomas de células tumorales A. Dos microgramos de proteínas texosomiales (Exos) o 2 x 105 células tumorales han sido analizadas por Western Blot con la ayuda de anticuerpos monoclonales específicos de: moléculas de clase I del CMH (Machold Robert P. et al. (1995) “Peptide Influences the Folding and Intracellular Tansport of Free Major Histocompatibility Complex Class I Heavy Chains” J. Exp. Med. 181: 1111-1122), receptor de la transferina (TfR) (estando el anticuerpo correspondiente H68.4 descrito en Biochimica et Biophysica Acta (1992) 1136(1): 28-34), Lamp 1 y 2 (rat antimouse monoclonal antibodies, Pharmigen) y Calnexine (Hebert Daniel N. et al. (1995) “Glucosa Trimming and Reglucosylation determine Glycoproteine Association with Calnexin in the Endoplasmic Reticulum” Cell 81: 425433). B. Diez microgramos de proteínas texosomiales de una progenie de células de melanoma (FON) o 10 µm de proteínas totales de las mismas células han sido analizados por Western Blot con la ayuda de un anticuerpo antiMART-1 (Marincola F. et al. (1996) “Analysis of expression of the melanoma associated antigens MART-1 and gp100 in metastatic melanoma cell lines and in situ lesions” Journal of Immunotherapy 19:192-205.

65

C. Las proteínas texosomiales de una progenie de células de melanoma (FON) o las proteínas totales de las mismas células han sido analizadas por Western Blot con la ayuda de un anticuerpo anti-HSP70. 14

ES 2 227 863 T3 D. Las proteínas texosomiales de una progenie de células de melanoma (FON) o de la progenie MZ-2 han sido analizadas por Western Blot con la ayuda de un anticuerpo anti-gp96. Figura 3 5

Los texosomas derivados de una progenie tumoral MART-1 positiva (FON) estimulan un clon T específico de MART1 10

Veinte mil células del clon T LT8 (o LT12, resultados no representados) han sido incubadas con unos texosomas derivados de FON (progenies de células MART-1 y HLA-A2 positiva), o de GIAM (células de una progenie de nefroma, MART-1 negativo) como control negativo durante 48 h. La producción de TNFβ por las células del clon T ha sido medida por ensayo biológico con las células WEHI (Espavik et al.). Los texosomas inducen la producción de IFNγ por el clon T, revelando así la presencia de complejos HLA-A2/péptido derivados de MART-1 en la superficie de los texosomas.

15

- “LT8 + TexGIAM” corresponde a unos clones T LT8 incubados en presencia de texosomas derivados de células tumorales GIAM; - “LT8 + TexFON” corresponde a unos clones T LT8 incubados en presencia de texosomas derivados de células tumorales FON;

20

- “LT8 + TumFON” corresponde a unos clones T LT8 incubados en presencia de texosomas derivados de células tumorales FON; 25

En abscisas, se han representado las células acondicionadas y en ordenadas la cantidad producida de TNFβ (pg/ml). Figura 4

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Los texosomas de células P815 que expresan el βGal estimulan unos esplenocitos de ratas inmunizadas por unos adenovirus βGal recombinantes Unos esplenocitos (105 ) de ratas BALB/c inmunizadas 2 meses antes con 106 pfu adenovirus recombinante βGal han rechazado un tumor que expresa βGal han sido incubados con los texosomas derivados de las células P815 (rombos vacíos ♦) o unas células P815-βGal (cuadrados llenos ). Los esplenocitos no incubados en texosomas dan el ruido de fondo simbolizado por unos puntos macizos (•). Después de 5 días de cultivo, 1 µCi de timidina tritiada ha sido añadido por cavidad de cultivo. La incorporación de tritio en el ADN celular ha sido medida 18 h más tarde. Los resultados significativamente diferentes según el procedimiento exacto de Fisher están marcados *. En abscisas, se ha representado la cantidad de texosomas derivados de las células tumorales P815 (µg/ml) y en ordenadas los golpes por minuto (CPM). Figura 5

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El antígeno tumoral MART-1 contenido en unos texosomas puede ser presentado a los linfocitos T por unas células dendríticas Unos texosomas con dosis crecientes derivadas de las progenies de células tumorales FON (MART-1+, HLAA2+, A1-) y MZ2 (MART-1+, HLA-A2-, A1+) han sido incubadas con los clones (20.000 células por cavidad de 96 microplacas) T LT12 (específico de HLA-A2/péptido de MART-1) en presencia de células dendríticas HLA-A2+ derivadas de macrófagos circulantes (DCA2) (Sallusto, F. y Lanzavecchia A., 1994, Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by GMCSF et IL-4 and down regulated by TNFα. J. Exp. Med. 179:1109-1118). La secreción de IFNγ representada en ordenadas (pg/ml) ha sido medida en los sobrenadantes de cultivo después de 2 días. Los texosomas derivados de FON, así como los derivados de MZ2, han inducido la secreción de IFNγ por LT12 y LT8 (resultados no representados). Las células FON han inducido también una fuerte secreción de IFNγ por los clones T, mientras que las células MZ2, que no expresan el haplotipo de molécula HLA adecuado (HLA-A2) no han inducido producción de IFNγ. - “LT12+DCA2” corresponde a unos clones T LT12 incubados en presencia de células dendríticas HLAA2+;

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- “LT12+DCA2+TexFON” corresponde a unos clones T LT12 incubados en presencia de células dendríticas cargadas de texosomas derivados de células tumorales FON. 65

- “LT12+DCA2+TexMZ2” corresponde a unos clones TL12 incubados en presencia de células dendríticas cargadas de texosomas derivados de células tumorales MZ2.

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ES 2 227 863 T3 Figuras 6A y 6B Efectos antitumorales de los texosomas in vivo 5

Cien mil células tumorales TS/A han sido inyectadas por rata BALB/c (A) o Nude (B). Tres días más tarde, cada rata ha recibido dos inyecciones sucesivas, con 24 h de intervalo (representadas por J3 y J4 en la figura), de 20 µg a 30 µg de texosomas en intradérmica. El tamaño de los tumores ha sido medido a continuación dos veces por semana. Los análisis estadísticos se han realizado por el procedimiento exacto de Fisher (la significatividad al 95% está indicada por *).

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A. Dos grupos de 5 ratas han recibido unos texosomas derivados de TS/A (triángulos macizos) o de MCA38 (triángulos vacío ∆) (una progenie de células de adenocarcinoma de colon derivado de una rata C57BL/6), como control negativo. Solamente los texosomas derivados de TS/A tienen un efecto antitumoral in vivo. 15

B. Dos grupos de ratas Nude han recibido en paralelo las mismas dosis de las mismas preparaciones de texosomas (: exosomas de TS/A; : exosomas de MC38). No se ha observado ningún efecto antitumoral sobre las ratas Nude. Los linfocitos T son por tanto necesarios a los efectos antitumorales de los texosomas in vivo.

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En abscisas, se han indicado los días y en ordenadas el tamaño medio del tumor (mm2 ). Figura 7 25

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Unas células dendríticas derivadas de médula ósea sensibilizadas por los texosomas derivados de células tumorales inducen la erradicación total in vivo de tumores sólidos establecidos Quinientas mil células tumorales P815 han sido inyectadas en el flanco derecho de las ratas DBA/2 10 días antes del tratamiento. El tratamiento ha consistido en una sola inyección de texosomas (10 µg/rata) en el mismo flanco, pero a distancia del tumor. Otro grupo ha sido inyectado en intravenoso por unas células dendríticas (derivadas de médula ósea por tratamiento durante 5 días en GM-CSF+IL4 (Mayordomo et al., 1995), incubadas previamente durante 3 h con los texosomas de P815. Los tumores han sido medidos y los resultados analizados como se ha descrito en la figura 6. Los texosomas de P815 han sensibilizado las células dendríticas para inducir el rechazo de los tumores establecidos. Los microsomas no han tenido efecto significativo sobre el crecimiento tumoral. La inserción muestra el porcentaje de rata sin tumor (en ordenadas), la barra maciza corresponde únicamente a los grupos de animales de tipo cuadrados macizos, la abscisa corresponde a los días. Estas ratas no han desarrollado tumor después de reinyección del doble de la dosis tumoral mínima, que muestra que habían desarrollado una inmunidad antitumoral. Los símbolos utilizados en la figura son los siguientes: m: células dendríticas incubadas con unos texosomas testigos, : células dendríticas incubadas con unos texosomas P815, triángulos macizos: texosomas P815 en intradérmica,

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X: animales no tratados. En abscisas, se han indicado los días y en ordenadas el volumen medio del tumor. 50

Figuras 8A, 8B y 8C Unos agentes quimioterapéuticos/citotóxicos y la irradiación pueden estimular la exocitosis de los texosomas tumorales

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La leucemia murina L1210 y la progenie de cáncer de riñón primitivo humano GIAM han sido utilizadas (figura 8C). Dos millones de células tumorales han sido incubadas en presencia de cantidades crecientes de 5 Fu (para L1210) o de cisplatino (CDDP) (para GIAM) por ml durante 16 horas. El sobrenadante ha sido recuperado, y después ha constituido el objeto de ultracentrifugaciones diferenciales como se ha descrito en la Tabla I. GIAM ha sido también incubado en IL-2 1000 Ui/ml, o en dexametasona (10−6 M), o irradiada a 10.000 rads.

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Las altas dosis de quimioterapia y la irradiación son buenos ejemplo de regulación positiva de exocitosis de los texosomas en estos modelos tumorales. Los resultados han sido encontrados de nuevo en otros tumores también (figuras 8A y 8B); en particular, la irradiación parece ser el estímulo de exocitosis más potente.

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ES 2 227 863 T3 La figura 8A corresponde al melanoma FON antes descrito y la figura 8B corresponde a un linfoma murino designado por EL4 (J. Nat. Ins. (1972) 48: 265-271). En la figura 8A, se han representado las células FON incubadas en diferentes condiciones: 5

1) CM: medio de cultivo de base (RPMI que contiene 10% de suero de ternera fetal), 2) DXM = en presencia de dexametasona, 10

3) Irradiación: irradiado a 10.000 rads, 4) sin suero, 5) IL-10 = en presencia de IL-10, a razón de 10 ng/ml.

15

Las irradiaciones anteriores son válidas también para las células EL4, L1210 y GIAM. Figuras 9A, 9B y 9C 20

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Las vesículas membranarias (dexosomas) producidas por las células dendríticas sensibilizadas para unos antígenos tumorales de melanomas son eficaces para estimular los linfocitos T específicos de estos melanomas, y su producción está regulada por las citoquinas. - LY8 (CM) corresponde a los clones T LT8 incubados en medio de cultivo de base como se ha definido en la figura 8A, - DexTexNUN corresponde al dexosoma derivado de células dendríticas cargadas de texosoma que proviene de células tumorales NUN,

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- DexTexFon corresponde al dexosoma derivado de células dendríticas cargadas de texosoma que proviene de células tumorales FON, - TumFON corresponde a las células tumorales FON.

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A. Ensayos de proliferación: los texosomas Fon (utilizados figura 3) han sido incubados con unas células dendríticas HLA-A2 durante 3 horas, después lavados en solución salina al 9%, y después incubados en medio ácido pH6.3 durante 18 horas. Las vesículas membranarias de células dendríticas (dexosomas) son así recuperadas del sobrenadante de cultivo de las mencionadas células dendríticas HLA-2.

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Las vesículas membranarias que provienen de células dendríticas cargadas con unos texosomas (DexTex) son entonces incubadas con los clones LT8 específicos de MART-1 presentados en el contexto HLA-A2 (los texosomas Fon contienen el antígeno MART-1). Como control negativo, han sido utilizados los texosomas Nun (progenie de cáncer del riñón HLA-A2 negativo, MART-1 negativo). Como control positivo, se ha utilizado la progenie tumoral irradiada FON (TumFON) o el anticuerpo anti-CD3, preabsorbido sobre plástico (anti-CD3Ab). La incubación de los DexTex con los clones LT8 dura 48 horas, y después 1 µCi de timidina tritiada es añadido por cavidad de 200 µl. Las proliferaciones linfocitarias LT8 son medidas 18 horas más tarde.

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En ordenadas, se han representado los golpes por minuto. 50

B. Las mismas manipulaciones, pero el IFNγ es medido en el sobrenadante de cultivo a 48 horas, por ELISA. En ordenadas, se ha representado el contenido de IFNγ (pg/ml). C. Los dexosomas han sido aislados a partir de sobrenadantes de células dendríticas después de 48 horas de incubación en presencia o en ausencia de LPS (20 µg/ml, IFNγ (100 Ul/ml) o IL-10 (10 µ g/ml).

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Figura 10

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Imágenes en microscopía inmuno-electrónica de dexosomas. Los dexosomas poseen un diámetro homogéneo comprendido entre 50 y 90 nm y están marcados de forma intensa por unos anticuerpos anti-CD63 (Figura 10A). la mayor parte de estos dexosomas está también marcada por unos anticuerpos anti-MHC-I (Página 15, Figura 10B) y antiMCH-II (Página 15, Figura 10C): Barras: 250 nm. Figura 11

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Medición de los niveles de interferón gamma segregados por los linfocitos T incubados en presencia de dexosomas cargados de péptidos o de dexosomas controlados. Las células dendríticas (2 x 106 /ml) han sido incubadas durante 3 a 12 horas, o bien en presencia de 10 µg/ml del péptido antigénico MART-1/MelanA(27−35) , o bien en presencia de 10 µg/ml de péptido gp100(280−288) (control) en suspensión en el ácido cítrico a pH 3,7, y después los dexosomas han sido 17

ES 2 227 863 T3 aislados. Las células del clon LT12 (clon de CTL HLA-A2 restringido, MART-1(27-35) específico) han sido entonces incubadas (100.000 CTL por cavidad) con unas dosis crecientes de dexosomas o de péptidos gp100 (control) en unas placas de 96 cavidades durante 5 días. La secreción de interferón gamma por las células ha sido medida a continuación por ELISA (Genzyme). 5

Figura 12

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Análisis en Western Blot de los marcadores presentes en los dexosomas (1,4 y 10 µg) producidos por unas células dendríticas derivadas de médula ósea: H-2K (MHC-I), I-Aα (MHC-II), CD86, CD63, TfR (receptor de transferina), Clx (Calnexina), li p31 (cadena invariable). Figura 13

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Efecto antitumoral in vivo de los dexosomas sobre un modelo de tumor de mastocitoma (P815). Dex-H2d-AEPP815: Dexosomas derivados de células dendríticas de médula ósea cargadas de eluido peptídico ácido del tumor P815. Dex-H2d-AEP-Spleens: Dexosomas derivados de células dendríticas de médula ósea cargadas de eluido peptídico de ácido del bazo. Figura 14

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Efecto antitumoral in vivo de los dexosomas derivados de células dendríticas de médula ósea cargadas de eluido peptídico ácido de tumor sobre un modelo de tumor mamario (TS/A). Leyendas: ver Figura 13. (A) Experiencia realizada sobre unas ratas inmunocompetentes. (B) Experiencia realizada sobre unas ratas Nude. 25

Figura 15 Test de liberación del cromo radioactivo (51 Cr). Este test permite mostrar que los dexosomas de la invención disparan una respuesta CTL específica in vivo. Células diana: P815, progenie leucémica L1210, progenie YAC insensible a las células NK.

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Figura 16

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Eficacia comparada de los dexosomas y de las células dendríticas. Esta figura muestra que los dexosomas son más potentes que las células dendríticas inmaduras de las cuales derivan para erradicar unos tumores establecidos in vivo. 5 millones de células dendríticas cargadas de eluido peptídico ácido del bazo (rombos vacíos) o del tumor P815 (triángulos vacíos) han sido administradas por vía intravenosa o intradérmica a unas ratas que presentan unos tumores establecidos P815 el día 8 a 10. En paralelo, el sobrenadante de estas células ha sido recolectado después de incubación 18 h con los péptidos del bazo (rombos vacíos) o del tumor P815 (triángulos llenos), ultracentrifugado y caracterizado para su contenido en dexosomas. 5 millones de células dendríticas han permitido obtener de 5 a 10 µg de dexosomas, que han permitido la inmunización de 5 ratas por administración intradérmica en el flanco ipsilateral. Una administración única de dexosoma ha sido realizada en el día 8-10. El tamaño de los tumores ha sido medido dos veces por semana y está representado en la figura. Los (*) representan unos resultados significativos al 95% según el procedimiento exacto de Fisher, en comparación con las inyecciones de solución salina (cuadrados vacíos) o de células dendríticas pulsadas. En el encarte están representados los porcentajes de ratas inmunizadas contra P815 que muestran la ausencia total (desaparición) de tumor durante (día 21) y al final (día 60) de la experiencia, en los diferentes grupos de 5 ratas. Figura 17

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Purificación de los dexosomas por electroforesis en fase fluida. Ejemplos 1. Producción de texosomas por unas progenies de células tumorales humanas y murinas

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Este ejemplo ilustra la capacidad de las células tumorales para producir vesículas lipídicas.

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Las células tumorales murinas o humanas que provienen de leucemias o de tumores sólidos (riñón o melanoma del colon) (ver tabla 1) han sido incubadas durante 24 h a una densidad de un millón de células por mililitro. El medio de cultivo (RPMI que contiene 10% de suero de ternera fetal) ha sido a continuación liberado de las células por centrifugación a 300 g durante 10 minutos. Los desechos celulares han sido a continuación eliminados por dos centrifugaciones sucesivas de 15 min, cada uno a 800 g (y una centrifugación eventual de 30 minutos a 10.000 g). Los texosomas son finalmente recogidos por centrifugación de 60 minutos a 100.000 g, y después lavados con PBS en las mismas condiciones. La concentración de proteínas en las preparaciones de texosomas ha sido medida por el procedimiento de Bratford (BioRad Protein Assay [BioRad]). Todas las progenies tumorales ensayadas, humanas y murinas (sólidas o hematopoyéticas, primarias o establecidas en cultivo o que provienen de tumores frescos disociados), producen unos texosomas (Tabla 1). Sin embargo, las 18

ES 2 227 863 T3 eficacias de producción son variables entre diferentes progenies. Las progenies de células tumorales murinas producen entre 100 y 200 microgramos de proteínas de texosomas por 50 millones de células en 24 horas. Las progenies humanas de melanoma y de nefroma producen entre 10 y 100 microgramos de proteínas de texosomas por 20 millones de células en 24 horas. 5

2. Las vesículas producidas por las células tumorales son de origen endocítico

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A fin de determinar si las vesículas purificadas a partir de los sobrenadantes de las progenies de células tumorales son de origen endocítico, se ha realizado un estudio morfológico por microscopía electrónica de una de estas progenies tumorales, TS/A (progenie de carcinoma mamario de rata) (Nanni P. et al. (1983) “TS/A: a new metastasizing cell in the originate from a BALB/c sponteneous mammary adenocarcinoma” Clin. Exp. Metastasis 1:373-380). Las células tumorales han sido fijadas y aprestadas para la microscopía electrónica como se ha descrito anteriormente. Los texosomas han sido directamente depositados sobre las rejillas y analizados. La figura 1A muestra unos ejemplos compartimientos intercelulares de aspecto multivesicular observados en las células tumorales. Estos compartimientos endocíticos tienen un diámetro de 200-300 nm (la barra en la parte baja de los paneles A y B representa 200 nm) y están compuestos por una membrana externa que rodea múltiples vesículas internas de 68-80 nm de diámetro. Las preparaciones de texosomas contienen una población mayoritaria de vesículas 60-80 nm de diámetro (figura 1B) , algunas veces agregadas, y de morfología parecida a las vesículas internas de los endosomas multivesiculares observados en el interior de las células (Figura 1A). Estos resultados sugieren que los texosomas son secretados en el medio extracelular después de fusión de la membrana externa de los endosomas con la membrana citoplásmica. En efecto, dichos perfiles de exocitosis se observan en estas células (datos no representados). A fin de determinar si los texosomas son efectivamente de origen endocítico, se ha efectuado a continuación un análisis por Western Blot de los marcadores presentes definidos a continuación en los texosomas derivados de progenies tumorales, TS/A y P815 (mastocitoma datos por T. Boon, Ludwig Institute, Bruxelles, Bélgica) (mastocitoma murino). Para ello, se han separado dos microgramos de proteínas de texosomas o el lisado celular de 200.000 células TS/A por gel de poliacrilamida, y después transferidas sobre una membrana de Nylon (Amersham). La presencia eventual de diferentes marcadores ha sido revelada a continuación con ayuda de anticuerpos específicos. Los texosomas de TS/A y de P815 contienen unas moléculas de clase I del CMH, así como diferentes marcadores de la vía endocítica (el receptor de la transferina, las glicoproteínas lisomiales Lamp 1 y 2) (figura 2A). Por el contrario, un marcador característico del Reticulum Endoplásmico (RE), la calnexina, no está presente en las preparaciones de texosomas, demostrando que unas membranas del RE no contaminan los texosomas.

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3. Los texosomas producidos por una progenie de melanoma contienen un antígeno tumoral citosólico

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Estos resultados muestran que los texosomas secretados por las células tumorales corresponden a las membranas internas de los endosomas multivesiculares. Ahora bien, estas vesículas intraendosomiales se forman por invaginación, y después abotonado de la membrana externa de los endosomas hacia el interior del endosoma. Estas vesículas intraendosomiales, y en consecuencia los texosomas deberían contener una fracción de citosol. Esto es particularmente importante en el marco de la inmunoterapia antitumoral puesto que en cierto número de antígenos tumorales, comprendido MART-1 (uno de los más estudiados), son unas proteínas citosólicas. Se ha probado por tanto la presencia de MART-1 en los texosomas.

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Para ello, diez microgramos de proteínas de texosomas o el lisado celular de 200.000 células de una progenie de melanoma humano (M10) (T. Boon, Ludwig Institute, Bruxelles, Bélgica) han sido analizados por Western Blot, como anteriormente. La eventual presencia de MART-1 ha sido a continuación revelada con la ayuda de anticuerpos específicos anti-MART-1 (S. Rosenberg, NCI, Bethesda, U.S.A.). Los texosomas secretados por la progenie tumoral FON (melanoma del paciente FON que proviene de F. Faure, Institut Pasteur, Paris, Francia) contienen el antígeno tumoral MART-1. Unas experiencias de protección con la proteinasa K (Sigma) han demostrado que el epítopo de MART-1 reconocido por este anticuerpo monoclonal está en el interior de los texosomas (resultados no representados). Esta primera parte del trabajo demuestra que:

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- las células tumorales producen y secretan unas vesículas, - que estas vesículas son unas vesículas de origen endosomial y comprenden una membrana externa donde se encuentran diferentes moléculas membranarias (clase I del CMH, diferentes marcadores de los endosomas),

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- que estas vesículas contienen una fracción de citosol, comprendidos unos antígenos tumorales citosólicos, como MART-1. Estos resultados han conducido a verificar las actividades biológicas siguientes de las vesículas, designadas texosomas.

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4. Los texosomas pueden estimular unos linfocitos T CD8 in vitro Puesto que los texosomas llevan unas moléculas de clase I en su superficie, se ha probado si son capaces de 19

ES 2 227 863 T3

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estimular unos linfocitos T CD8. Se han utilizado dos clones T, LT8 y LT12 dados por Faure F., Institut Pasteur, Paris, Francia, que reconocen un péptido derivado de MART-1 en asociación con HLA-A2 (Dufour et al., 1997). A este fin, puesto que las células tumorales FON son HLA-A2, se han incubado las células de los clones T LT8 o LT12 con unos texosomas preparados a partir de los sobrenadantes de FON, o, a modo de control positivo, unas células FON intactas. La activación de los linfocitos T ha sido medida por la secreción de TNFβ. Los texosomas de FON han inducido la secreción de TNFβ por LT8 y LT12 de una forma dosis dependiente (Figura 3). Las células FON han inducido también una secreción de TNFβ, mientras que unos texosomas derivados de células tumorales que no expresan MART-1 no lo hacen (figura 3). Por tanto, unos complejos HLA-A2/péptido de MART-1 están presentes en la superficie de los texosomas. Unos resultados similares se han obtenido en la rata con unos linfocitos T de bazo de una rata inmunizada por la β-galactosidasa (β-gal).

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Se han producido unos texosomas a partir de sobrenadantes de células de mastocitoma P815 o de células P815 que expresan la β-gal (progenies de A. Albina, Institut Gustave Roussy, Villejuif, Francia), o de células de otro tumor (L1210) leucemia murina (H2α) que no expresan la β-gal, L210. Unas concentraciones crecientes (0,3 µg/ml a 20* g/ml) de estas diferentes preparaciones de texosomas han sido a continuación incubadas durante 4 días con unas células esplénicas de ratas inmunizadas por la β-gal expresada en un adenovirus recombinante. Solamente los texosomas de células P815 (a la mayor concentración de 20 µg/ml) que expresan la β-gal han inducido una proliferación significativa (ver figura 4) (medida por la incorporación de timidina tritiada), aunque poco fuerte, de las células esplénicas. Estos resultados muestran que los texosomas producidos por las células P815 que expresan la β-gal llevan en su superficie unos complejos H2α /péptidos derivados de β-gal que son capaces de activar unos linfocitos T murinos. 5. Los texosomas pueden suministrar unos antígenos citosólicos que contienen unas células presentadoras de antígenos para ser presentados a los linfocitos T A este fin, se han utilizado los clones T LT8 y LT12 que reconocen específicamente un péptido derivado de MART1 (MART-127−25= AAGIGILTV, Dufour E. et al., Diversity of the cytotoxic melanoma-especific immune response. J. Immunol. 1997, 158: 3787-3795) en asociación con HLA-A2. Se ha demostrado que los texosomas producidos por la progenie de melanoma humano FON (que es HLA-A2) contienen el antígeno tumoral MART-1 (ver figura 2) y son capaces de activar los clones LT8 y LT12. A fin de disponer de texosomas que contienen también MART-1, pero incapaces de estimular directamente los clones LT12 y LT8, se ha utilizado la progenie de melanoma MZ2 (T. Boon, Ludwig Institute, Bruselas, Bélgica), MART-1 positivo pero que expresa otro elemento de restricción que HLA-A2 (HLA-A1 en el ejemplo). En efecto, las células MZ2, así como los texosomas derivados de estas células, no activan los clones LT8 y LT12 (resultados no representados), contrariamente a las células FON y a los texosomas derivados de estas células (Figura 3). Por el contrario, cuando estos mismos texosomas derivados de MZ2 son incubados en presencia de células dendríticas que expresan HLA-A2, se observa una estimulación de los clones T LT12 y LT8, como en el caso de los texosomas derivados de FON (figura 5).

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En el caso de los texosomas derivados de MZ2, la activación de los clones T no puede ser debida a unos complejos HLA-A2/péptido derivados de MART-1 preexistentes, puesto que no expresan el elemento de restricción adecuado (HLA-A2). Por consiguiente, sólo puede tratarse del antígeno contenido en los texosomas que ha sido tomado de nuevo por las células presentadoras de antígenos, degradado en péptidos que se han a continuación asociado a las moléculas HLA-A2 de la célula presentadora. Los texosomas permiten por tanto la transferencia de un antígeno entre una célula tumoral y una célula presentadora de antígenos. Los texosomas tienen por tanto una función parecida a la de los “liposomas naturales”. 6. Los texosomas inducen la regresión de tumores sólidos establecidos in vivo

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Finalmente, puesto que los texosomas son capaces de estimular unos linfocitos T in vitro y de sensibilizar unas células dendríticas para la activación de linfocitos T específicos de tumores, se ha comprobado la actividad antitumoral de los texosomas in vivo. 55

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Para analizar dicha actividad antitumoral, se han inyectado unas ratas con dos veces (105 ) la dosis tumorígena mínima de células tumorales de un tumor mamario (células TS/A de haplotipo H2d , singénicas de células BALB/c) en el flanco. Después de 3 a 4 días, los animales que tienen unos tumores establecidos han sido inyectados dos veces (días 3 y 4) con unos texosomas preparados a partir de sobrenadantes de células TS/A o como control negativo unos texosomas de células MC38 (S. Rosenberg, NCI, Bethesda, U.S.A.) (célula tumoral de haplotipo H2b ) o un volumen similar de PBS. El tamaño medio de los tumores en el grupo de ratas inoculadas con unas preparaciones de texosomas de TS/A está muy disminuido en comparación con los grupos de ratas control. Este efecto antitumoral es dependiente de las células T, puesto que unas ratas Nude (ratas mutantes desprovistas de linfocitos T) que llevan el tumor e inoculadas de forma similar con unas preparaciones de texosomas, no muestran disminución de la masa tumoral (Figura 6B).

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En esta misma serie de experiencias, se ha observado un efecto antitumoral de los texosomas preparados a partir de células de mastocitoma P815 de haplotipo H2d lo que permite pensar que estos dos tumores expresan unos antígenos comunes. Se han obtenido unos resultados similares con otro modelo tumoral muy inmunogénico, el mastocitoma 20

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P815 (singénico de rata DBA/2 y de haplotipo H2d ). En este modelo, se ha demostrado que unos texosomas inyectados en intradérmica en el flanco de una rata que lleva un tumor (P815) establecido al 10º día (tumor que mide 80-100 mm2 ) tiene capacidad de conducir a la erradicación del tumor en más del 60% de los casos. Además, estas ratas muestran una inmunidad antitumoral a largo plazo (resultados no representados). En esta serie de experiencias, se han observado unos efectos antitumorales de texosomas preparados a partir de linfocitos L1210 aislados a partir de una leucemia murina de haplotipo H2d y de células TS/A, lo que indica que existen también unos epítopos comunes entre estos tres tumores (entre P815 y TS/A, p53 mutada es común a los dos tumores). Dos mecanismos podrían ser la base del efecto antitumoral de los texosomas.

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En principio, una vez inyectados, los texosomas podrían activar directamente los linfocitos T del huésped, específicos del tumor. De esta manera, podría tener lugar una expansión clonal de linfocitos T específicos del tumor o un “cebado” de células. Una segunda hipótesis implica una interacción directa de los texosomas inyectados con las células dendríticas del huésped. Esto podría entonces estimular la respuesta antitumoral. A fin de probar esta segunda hipótesis, se ha seguido el crecimiento de tumores en unas ratas inyectadas en intravenosa con unas células dendríticas derivadas de la médula ósea cargada con unos texosomas de células tumorales. Unas ratas DBA/2 (IFFA CREDO, Orléans, Francia) han sido así inyectadas con dos veces (50 x 105 ) la dosis tumorígena mínima de células de mastocitoma P815. Diez días después, cada animal ha sido inyectado con 5 x 105 células dendríticas cargadas, y por ello sensibilizadas, con 9 µg de texosomas. El tamaño medio de los tumores en estas condiciones disminuye de forma significativa en comparación con unos grupos de ratas inyectadas con PBS o con unas células dendríticas cargadas de texosomas de células de un tumor control MC38. En efecto, más del 60% de los animales tratados no presentan ya tumor al final de la experiencia. Además, no han sido observadas recidivas a largo plazo (en 80% a 100% de los casos). Es interesante constatar que dicha dosis subóptima de texosomas inyectada en intradérmica no tiene efecto, lo que sugiere que las células dendríticas pueden preparar unos texosomas que contienen los antígenos tumorales de forma mucho más eficaz que las células dendríticas de la dermis o las células de Langerhans. Se han obtenido resultados similares con el modelo de células del tumor del seno TS/A. Los resultados obtenidos muestran que los texosomas sensibilizan las células dendríticas de forma eficaz. Estas células, así sensibilizadas, tienen la capacidad de inducir unas respuestas antitumorales potentes in vivo, y ello en el caso de diferentes tumores. Estos resultados sugieren que los efectos antitumorales observados después de la inoculación directa de texosomas in vivo son debidos a la sensibilización de las células dendríticas del huésped. De una manera destacable, el efecto es observado después de una sola inyección de células dendríticas sensibilizadas. La mayoría de las ratas tratadas muestran una regresión tumoral completa o una supervivencia prolongada (de 60 días contra 20 días en el control) debida la regresión tumoral.

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El procedimiento de sensibilización de las células presentadoras posee diferentes ventajas con respecto a los procedimientos de la técnica anterior: 40

i) no necesita el conocimiento previo de antígenos tumorales: esto es particularmente importante puesto que unos antígenos tumorales no son conocidos en la mayor parte de los tumores; ii) el procedimiento puede ser aplicado a cualquier tumor que produzca unos texosomas; en más de 15 progenies de células tumorales ensayadas hasta el presente, una sola no produce texosomas (una de las seis progenies de melanoma ensayadas);

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iii) este procedimiento no depende del haplotipo del CMH del paciente y de las células tumorales, puesto que los antígenos tumorales presentes en los texosomas son reaprestados y presentados a los linfocitos T por unas moléculas del CMH de las células presentadoras de antígenos del paciente; 50

iv) el procedimiento puede en principio ser eficaz entre tumores de orígenes diferentes, puesto que existen unos antígenos tumorales comunes no solamente para un tipo particular de tumor (MART-A por ejemplo en el melanoma), sino también unos antígenos comunes a unos tumores completamente diferentes (como las moléculas implicadas en la tumorigénesis, p53 por ejemplo);

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v) la utilización de texosomas puede también resultar eficaz en el tratamiento de tumores que expresan bajos niveles de moléculas de clase I del CMH, o que no expresan (estos tumores representan 40-50% de los cánceres metastásicos humanos). En efecto, los texosomas permiten la transferencia de antígenos intactos entre células tumorales y células dendríticas, siendo estos antígenos a continuación presentados a los linfocitos T por las moléculas de CMH de la célula dendrítica. Los resultados preliminares muestran que los texosomas permiten inducir el rechazo de tumores murinos que expresan bajos niveles de moléculas de clase I del CMH (como MCA101, S. Rosenberg, NCI, Bethesda, U.S.A.). Esto es probablemente debido al hecho de que los niveles de expresión de moléculas del CMH necesarios para la inducción de una respuesta inmunitaria eficaz son mucho más elevados que los necesarios cuando tiene lugar la fase efectora (citotoxicidad celular);

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vi) los texosomas solos constituyen en sí mismos, por su poder inmunógeno, una modalidad de vacunación profiláctica o terapéutica nueva y eficaz. 21

ES 2 227 863 T3 7. Las células dendríticas producen unas vesículas membranarias inmunógenas (dexosomas)

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Este ejemplo demuestra que las células dendríticas producen unas vesículas membranarias y que estas vesículas constituyen unas vesículas inmunógenas potentes para la inmunización antitumoral. Estas vesículas son particularmente ventajosas puesto que permiten evitar la etapa de inyección in vivo de las células dendríticas enteras de las cuales provienen. La terapia celular dendríticas no ofrece la certidumbre del fenotipo estable de la célula inyectada, ni de la homogeneidad de las composiciones celulares utilizadas. Administrando un producto estable secretado por estas células, es decir, las vesículas membranarias antes descritas, se ofrece al huésped portador de tumores una garantía de eficacia y de poder inmunizante. En este ejemplo, unas células dendríticas derivadas de médula ósea por tratamiento durante 5 días en GM-CSF+IL4 (Mayordomo et al., 1995) han sido incubadas durante 3 horas con unos exosomas de células tumorales. Las células así sensibilizadas han sido a continuación cultivadas en medio ácido durante 18 horas (a fin de estimular la producción de vesículas), y después unas vesículas han sido observadas y recolectadas según la metodología descrita en el ejemplo 1. A fin de determinar su poder inmunógeno, estas vesículas han sido a continuación incubadas in vitro con unos linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno MART1. Los resultados presentados en la figura 9 muestran que 0,6 µg de estas vesículas membranarias, denominadas DexTex FON (es decir dexosoma que proviene de células dendríticas incubadas con unos texosomas que provienen de células tumorales FON), permiten estimular directamente la proliferación y la secreción de IFNγ de clones LT8 específicos de MART-1 y es esto lo que no pueden hacer 0,6 µg de dexosomas que provienen de células dendríticas incubadas con unos texosomas de células tumorales NUN: DexTexNUN (siendo NUN un tumor del riñón, HLAA2 negativo, MART-1 negativo). Estos resultados muestran por tanto (i) que las células dendríticas producen unas vesículas membranarias y que estas vesículas membranarias constituyen un inmunógeno potente. Además, los resultados presentados en la figura 9C muestran que, de forma inesperada, la producción de dexosomas para las células dendríticas es un fenómeno regulado, que puede ser estimulado en presencia de ciertas citoquinas tales como IFN-γ y la IL-10. Así, los resultados presentados muestran que el IFN-γ o la IL-10 aumentan de manera significativa (factor 5 aproximadamente), la producción de dexosomas. Unos resultados comparables han sido observados con la IL-12. 8. Caracterización de las vesículas membranarias producidas por las células dendríticas

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La capacidad de las células dendríticas de producir vesículas membranarias ha sido en principio confirmada sobre unas células dendríticas producidas a partir de precursores monocitos humanos y sobre la progenie de células dendríticas murinas D1. La progenie celular D1 y las condiciones de maduración de esta progenie han sido descritas por Winzler et al. (J. Exp. Med. 185 (1997) 317. Las células dendríticas derivadas de precursores monocitos humanos han sido obtenidas a partir de la fracción adherente de células mononucleadas, extraídas a partir de sujetos sanos, incubadas 7-8 días en medio AIMV que contiene L-Glu, unos antibióticos, 1.000 UI/ml de rhGM-CSF y de rhIL-4 (Schering Plough, Kenilworth, NJ, USA). Después de 8 días de cultivo, las células débilmente adherentes y las células en suspensión presentan una morfología típica de células dendríticas, que expresan unos niveles elevados de moléculas CMH I y II, así como CD40 y CD86. La mayor parte de estas células es positiva para CD1a y CD11b y negativa para CD2, CD3, CD14, CD19 y CD83. Los análisis microscópicos de estas células han hecho aparecer la presencia de vesículas membranarias ricas en moléculas del CMH I y II. Estas vesículas han sido aisladas por centrifugaciones y analizadas en microscopía inmunoelectrónica. Más particularmente, los sobrenadantes de cultivo de las células dendríticas han sido recolectados, centrifugados a 300 g durante 20 minutos y después a 10.000 g durante 30 minutos a 4ºC, para eliminar las células y los desechos celulares. Los dexosomas han sido a continuación aislados por una centrifugación a 100.000 g durante 1h a 4ºC seguida de un lavado con PBS en las mismas condiciones (centrifugación a 100.000 g durante 1h a 4ºC). La concentración de proteínas en las preparaciones de dexosomas ha sido medida por el procedimiento de Bradford (BioRad Protein Assay [BioRad]). Los resultados obtenidos muestran (Figura 10) una población homogénea de vesículas que tienen un diámetro comprendido entre 60 y 90 nm aproximadamente. Por otra parte, más de 95% de los dexosomas están marcados por unos anticuerpos anti-CD63, anti-CD82, anti-MHC-I y anti-MHC-II. Estos resultados confirman que las células dendríticas producen unas vesículas membranarias que presentan unas moléculas de presentación de los antígenos así como unas moléculas de coestimulación linfocitaria.

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9. Los dexosomas presentan los antígenos en un contexto MHC-I restringido Una de las características ventajosas de los dexosomas reside en la presencia de moléculas del CMH de clase I. estas moléculas son en efecto necesarias para la generación de una respuesta celular eficaz, y en particular para la 22

ES 2 227 863 T3 activación y para la expansión de las células CTL. La capacidad de los dexosomas para estimular los linfocitos CD8+ y el carácter específico de los linfocitos obtenidos han sido por tanto probados. 5

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Para ello, las células dendríticas obtenidas a partir de precursores monocitos humanos (de sujetos HLA-A2) han sido en principio sensibilizadas por “peptide pulsing” para un antígeno particular. A este fin, las células (2 X 106 /ml) han sido incubadas durante 3 a 12 horas, o bien en presencia de 10 µg/ml del péptido antigénico MART-1/MelanA(27−35) , o bien en presencia de 10 µg/ml de péptido gp100(280−288) (control) en suspensión en ácido cítrico a pH 3,7. Después de esta etapa de sensibilización, los dexosomas han sido aislados como se ha descrito en el ejemplo 1. Las células del clon LT12 (clon de CTL HLA-A2 restringido, MART-1(27-35) específico) han sido entonces incubadas (100.000 CTL por cavidad) con unas dosis crecientes de dexosomas o de péptidos gp100 (control) en unas placas de 96 cavidades durante 5 días. La secreción de interferón gamma por las células ha sido a continuación medida por ELISA (Genzyme). Como se ha representado en la figura 11, los dexosomas que llevan el péptido MART-1 son capaces de estimular la producción de interferón gamma por el clon LT12, de manera dosis dependiente. Por el contrario, los dexosomas producidos a partir de las células dendríticas pulsadas con el péptido control gp100 no ejercen ningún efecto estimulante sobre este clon. Estos resultados confirman que las moléculas del CMH-I expresadas por los dexosomas de la invención son funcionales. 10. Los dexosomas bloquean el crecimiento tumoral in vivo

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Este ejemplo demuestra la capacidad de los dexosomas para inducir una respuesta inmunitaria in vivo y más particularmente para inducir la proliferación de células T específicas de un tumor. Unas células dendríticas obtenidas a partir de médula ósea han sido cargadas con un eluido ácido de tumor que comprende diferentes péptidos antigénicos tumorales. La tecnología de preparación y de sensibilización de las células dendríticas ha sido descrita por Zitvogel et al. (1996). La figura 12 presenta los marcadores expresados por los dexosomas producidos por estas células dendríticas. Como se ha indicado anteriormente, esta figura muestra la presencia abundante de moléculas del CMH de clase I y de clase II así como los marcadores CD86 y el receptor para la transferina. Por el contrario, aunque aparecen en los lisados celulares, los marcadores H2-M, li y calnexine son indetectables en las preparaciones exosomiales. Se han elegido dos modelos experimentales de tumores para ensayar las propiedades antitumorales in vivo de los dexosomas de la invención. El primer modelo, P815, es un mastocitoma agresivo singénico de DBA/2 (H2d ) para el cual muy pocas inmunoterapias eficaces han sido referidas sobre unos tumores establecidos al día 10. El modelo TSA es un carcinoma mamario espontáneo débilmente inmunógeno que expresa unos niveles muy bajos de moléculas del CMH de clase I, singénico de BALB/c (H2d ). los péptidos tumorales de los tumores P815 o TS/A eluidos por tratamiento ácido han sido cargados sobre las células singénicas dendríticas, derivadas de la médula ósea, como se ha descrito anteriormente. Los dexosomas han sido a continuación preparados a partir de los sobrenadantes de estas células dendríticas y utilizadas para la inmunización in vivo. Ratas y progenies celulares tumorales

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Las ratas hembras DBA/2J (H2d ) y BALB/c (H2d ) de una edad de seis a ocho semanas han sido compradas al Laboratoire Iffa Credo, Lyon, Francia y mantenidas en unas condiciones desprovistas de patógenos. Las ratas nude han sido mantenidas en un microentorno protegido. Las células P815 han sido proporcionadas por T. Boon (Ludwig Institute, Bélgica). El modelo TS/A ha sido proporcionado por Guido Forni (Immunogenetic and Histocompatibility Center, Turín, Italia). Todas las progenies tumorales han sido conservadas en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal desprovisto de endotoxina (Gibco BRL), 2 mM de L-Glutamina, 100 Unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, ácidos aminados esenciales y piruvato. Este medio es también designado en lo que sigue: medio CM. Protocolo y resultados Dos veces la dosis tumorígena mínima de células tumorales (5 X 105 P815, 105 TS/A) han sido inoculadas en intradérmica en la zona superior del flanco derecho de la ratas DBA/2 y BALB/c respectivamente. Los animales que presentan unos tumores TS/A establecidos de tres a cuatro días o unos tumores P815 establecidos de seis a diez días han sido a continuación inmunizados por una inyección intradérmica única de 3 a 5 µg de dexosomas en la parte inferior del flanco ipsilateral. Estos procedimientos han sido efectuados de forma similar a la vez en los animales inmunocompetentes y en las ratas nude. Una sola inyección terapéutica ha sido realizada para cada rata. El tamaño de los tumores ha sido controlado dos veces por semana y las ratas han sido sacrificadas cuando llevaban unos tumores ulcerados o de un tamaño demasiado importante. Cada serie de experiencia ha sido realizada dos a tres veces utilizando unos grupos de cinco ratas para cada tratamiento individual. Los resultados obtenidos están representados en la figura 13. Como muestra la figura 13B, el tratamiento de tumores P815 establecidos el día 10 (que tiene un tamaño de 50 a 90 mm2 ) ha podido ser realizado por una sola administración intradérmica de 3 a 5 µg de dexosomas por rata. En una semana, el crecimiento tumoral se ha parado en los grupos que han recibido los dexosomas derivados de células 23

ES 2 227 863 T3 dendríticas cargadas con el péptido tumoral autólogo, y en 40 a 60% de las ratas, los tumores habían desaparecido completamente al día 60. 5

Estos animales presentan por otra parte una respuesta inmune duradera y han rechazado una inyección suplementaria de P815 normalmente letal para unas ratas no tratadas. En contrapartida, estas ratas no están protegidas contra una inyección del clon leucémico singénico L1210, lo que muestra bien el carácter inmunoespecífico del efecto obtenido. Finalmente, los grupos de ratas inmunizadas con unos dexosomas controles (cargados con unos péptidos del bazo de la rata) no presentan ningún efecto antitumoral así como las ratas no tratadas. Estos resultados muestran por tanto que los dexosomas cargados con péptido tumoral según la invención son capaces de inducir una regresión tumoral in vivo.

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Unos efectos antitumorales similares han sido obtenidos sobre el modelo de tumor TS/A que comprende unos tumores establecidos en los días 3/4. En esta serie de experiencias, todas las ratas presentaban un retardo de crecimiento tumoral estadísticamente significativo que prolongaban su supervivencia (figura 14). Este efecto antitumoral no ha sido observado en las ratas atímicas Nu/Nu como se ha indicado en la figura 14B, lo que demuestra que la presencia de células T es necesaria para la expresión del efecto antitumoral de los texosomas de la invención. Además, la experiencia siguiente muestra que los dexosomas estimulan directamente una respuesta CTL específica en los animales que presentan el tumor P815. Los esplenocitos de ratas que han rechazado los tumores P815 después de inmunización con unos dexosomas han sido recogidos al día 90 y cultivados durante cinco días en presencia de células P815 irradiadas que expresan el antígeno B7.1 para aumentar la frecuencia de precursores específicos. Estas células efectoras han sido probadas en un ensayo de liberación de cromo contra (i) las células tumorales autólogas P815 (H2d ), (ii) las células no emparentadas L1210 y (iii) las células YAC. Una actividad citolítica específica significativa ha sido observada contra las células P815 en los esplenocitos de ratas inmunizadas con los dexosomas (figura 15). De manera interesante, ninguno de los bazos de ratas que rechazan espontáneamente el tumor P815 o presentan unos tumores P815 no presentan esta actividad citolítica en las mismas condiciones. Estos resultados muestran que una inyección única de dexosomas según la invención derivados de células dendríticas sensibilizadas con un antígeno o unos péptidos antigénicos correspondientes, es capaz de disparar de forma eficaz una respuesta específica antitumoral CTL in vivo. Para determinar si la respuesta inmunitaria y antitumoral inducida por los dexosomas está restringida a los MHC y no simplemente debida a un efecto directo de los péptidos tumorales, unas células dendríticas derivadas de las ratas H2d (DBA/2) o H2b (C57BL/6) han sido cargadas en paralelo con unos péptidos tumorales eluidos del tumor P815. Los dexosomas producidos por estas células dendríticas de rata han sido a continuación aislados y utilizados separadamente para unas inyecciones intradérmicas directas en las ratas DBA/2 que llevan unos tumores P815 establecidos el día 6/10.

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Como muestra la figura 13B, solamente los dexosomas que llevan los péptidos tumorales singénicos son unas vacunas antitumorales eficaces (que inducen en el 60% de las ratas una desaparición del tumor) mientras que los dexosomas de las células dendríticas alogénicas no inducen prácticamente ningún efecto antitumoral. Estos resultados indican que los dexosomas según la invención inducen una respuesta antitumoral in vivo restringida al MHC.

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Unas experiencias similares a las descritas anteriormente han sido realizadas procediendo a unas inyecciones no intradérmicas sino intravenosas. Los resultados obtenidos están representados en la figura 16. Muestran en principio una regresión tumoral consecutivamente a la inyección intravenosa de dexosomas. Además, estos resultados muestran que los dexosomas son más potentes que las células dendríticas de las cuales derivan para erradicar los tumores in vivo. Estos resultados ilustran por tanto las propiedades destacables e inesperadas de los dexosomas.

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Los resultados presentados más arriba muestran por tanto que las células dendríticas inmaduras humanas o murinas secretan unos dexosomas, que estos dexosomas presentan unas moléculas no solamente del CMH de clase II sino también del CMH de clase I así como unas moléculas coestimulantes, y finalmente que estos dexosomas son inmunógenos e inducen una regresión tumoral in vivo. 50

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Los dexosomas pueden ser obtenidos en cantidades relativamente elevadas (1 µg por millón de células dendríticas por dieciocho horas, según el test Bradford) a partir del medio de cultivo de células dendríticas (células dendríticas derivadas de médula ósea en presencia de GM-CSF + IL4, progenies de células dendríticas D1 o células dendríticas derivadas de precursores monocitos humanos, aisladas de células mononucleadas de la sangre periférica). Los dexosomas han sido caracterizados en el plano morfológico y bioquímico. Las vesículas membranarias analizadas por microscopía inmunoelectrónica representan una población homogénea de vesículas que tienen un diámetro de aproximadamente 60-90 nanómetros. Las preparaciones dexosomiales están aparentemente desprovistas de retrovirus, membranas plásmicas, constituyen microsomiales o cuerpos apoptósicos. Los dexosomas sobreexpresan de forma abundante las moléculas del CMH de clase II, CD63 y CD86 comparativamente a las membranas plásmicas. Ningún compartimiento derivado del reticulum endoplásmico ha sido detectado en los dexosomas por Western Blotting, utilizando los anticuerpos anticalnexine. Una muerte celular programada no ha podido ser puesta en evidencia en estos cultivos utilizando diferentes condiciones. De manera interesante, la producción de estas vesículas aparece como un fenómeno regulado. La cantidad de vesículas parece poder ser disminuida induciendo una maduración de las células dendríticas, como se ha determinado por el test Bradford, Western Blotting, y microscopía inmunoelectrónica. Además, el nivel de secreción de estas vesículas puede ser mejorado de forma significativa disminuyendo el pH del medio de cultivo, o incubando las células en presencia de ciertas citoquinas, o también tratando las células dendríticas por irradiación. Este fenómeno es particularmente inesperado en la medida en que las células dendríticas inmaduras son generalmente consideradas como que tienen un bajo poder de presentación de antígeno y por tanto una baja activi24

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dad inmunológica. Los resultados presentados demuestran que son las células dendríticas en esta fase inmaduras que poseen la propiedad de producir unos dexosomas de forma eficaz. Los resultados presentados demuestran finalmente que estos dexosomas son capaces de disparar una respuesta por unas células T eficaces a la vez in vitro e in vivo y que son también capaces de inducir la regresión del tumor in vivo. Estas vesículas constituyen por tanto unos candidatos particularmente atractivos para unas aproximaciones inmunoterapéuticas en sistema no celular. 11. Purificación de exosomas por electroforesis en fase fluida

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Este ejemplo describe la utilización de un procedimiento original de purificación de exosomas basada en la electroforesis en fase fluida. La electroforesis en fase fluida es un procedimiento preparativo de separación de compuestos biológicos según su carga. Este procedimiento ha sido utilizado para separar unas proteínas por isoelectroenfocado. Este procedimiento puede presentar las ventajas siguientes:

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- es un procedimiento preparativo que permite una inyección continua de material, y por tanto la purificación de grandes cantidades de vesículas, 20

- este procedimiento permite la purificación de los dexosomas en una o dos etapas, eliminando potencialmente las etapas de centrifugación. A fin de determinar si este procedimiento es aplicable a la purificación de exosomas, se ha realizado la experiencia siguiente:

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Una preparación de dexosomas aislados a partir de un sobrenadante de células dendríticas murinas por ultracentrifugación diferencial ha sido inyectada en la electroforesis en fase fluida, en las condiciones habituales descritas por Amirogena et al. (Nature, 369 (1994), 113). Han sido recolectadas 40 fracciones y la concentración proteínica en cada una de estas fracciones ha sido determinada por el test de Bradford (BioRad), a fin de detectar la presencia de los dexosomas. Como muestra la figura 17, 90% de los dexosomas han sido encontrados concentrados en cuatro fracciones de EPF. La emigración de los dexosomas en un pico estrecho según esta tecnología demuestra la realizabilidad de la electroforesis como procedimiento de aislamiento de los dexosomas. Referencias

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15

Texosomas (µg/2 x 107 células/18 H)

Progenies de células tumorales Murinas 20

25

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35

MCA101

172

P815

163

MC38

120

L1210

150

TS/A

160

Humanas (melanomas) VIO∗

80

FON

90

MZ2-2

18

Humanas (nefromas) 40

45

RCC NUN∗

120

RCC JOUA∗

18

RCC MEG*

10

RCC GIAM*

100

50

55

60

65

26

ES 2 227 863 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Vesícula membranaria liberada de su entorno natural, caracterizada porque es secretada por una célula dendrítica y porque comprende unas moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y unas moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II. 2. Vesícula membranaria según la reivindicación 1, caracterizada porque es secretada por una célula dendrítica sensibilizada para un antígeno.

10

3. Vesícula membranaria según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende uno o varios péptidos antigénicos. 4. Vesícula membranaria designada dexosoma, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque deriva de una célula dendrítica humana.

15

5. Vesícula según la reivindicación 4, caracterizada porque comprende una o varias moléculas CD63. 6. Vesícula según la reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque comprende una o varias moléculas CD82 y/o CD86. 20

7. Vesícula según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizada por un diámetro comprendido entre 60 y 90 nm. 8. Vesícula según una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizada porque deriva de una célula dendrítica inmadura. 25

30

35

40

9. Vesícula según una de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizada porque deriva de una célula dendrítica portadora de uno o varios péptidos antigénicos. 10. Vesícula según la reivindicación 9, caracterizada porque deriva de una célula dendrítica incubada con una vesícula derivada de una célula tumoral, liberada de su entorno natural, que comprende una bicapa lipídica que rodea una fracción citosólica, presentando dicha vesícula tumoral en su superficie, unas moléculas de clase I del complejo principal de histocompatibilidad o CMH, en unas condiciones que permiten la sensibilización de la célula dendrítica con las vesículas de origen tumoral, y la recuperación de una vesícula que presenta unas moléculas de clase I del CMH y unas moléculas de clase II del CMH. 11. Vesícula según la reivindicación 9, caracterizada porque deriva de una célula dendrítica inmortalizada. 12. Procedimiento de preparación in vitro de una vesícula según una de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende una primera etapa de obtención de células dendríticas o de cultivo celular que comprende unas células dendríticas, una segunda etapa de sensibilización de células dendríticas para un antígeno o para un grupo de antígenos, y una tercera etapa que comprende la recuperación de vesículas producidas por las células dendríticas a partir de estos cultivos celulares. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque la primera etapa comprende la obtención de células dendríticas a partir de precursores monocitos o de médula ósea.

45

14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque la primera etapa comprende la obtención de células dendríticas inmaduras. 50

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque las células dendríticas inmaduras son humanas. 16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque las células dendríticas son sensibilizadas por puesta en contacto con unos péptidos, unos antígenos, unas células o membranas o vesículas que expresan unos antígenos o unos péptidos antigénicos, unos liposomas o unos ácidos nucleicos.

55

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque los ácidos nucleicos están incorporados en unos vectores químicos o virales. 60

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque comprende una primera etapa, facultativa, de tratamiento de las células. 19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque las células dendríticas son tratadas por cultivo en presencia de citoquinas que favorecen el estado inmaduro, por irradiación, o disminuyendo el pH del cultivo, o combinando estos diferentes tipos de tratamiento.

65

20. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el aislamiento de las vesículas se realiza por centrifugación, electroforesis, cromatografía y/o nanofiltración. 27

ES 2 227 863 T3 21. Utilización de vesículas según una de las reivindicaciones 1 a 11, para la estimulación in vitro de linfocitos T específicos de antígenos contenidos en las mencionadas vesículas o de linfocitos B. 5

22. Utilización según la reivindicación 21, caracterizada porque dichas vesículas son utilizadas para la estimulación y la amplificación in vitro de linfocitos T específicos de antígenos contenidos en dichas vesículas. 23. Utilización de vesículas según una de las reivindicaciones 1 a 11, para la selección ex vivo de un repertorio de linfocitos T, susceptibles de reconocer unos antígenos específicos contenidos en las mencionadas vesículas.

10

24. Medicamento que comprende, a título de sustancia activa, una o varias vesículas según una de las reivindicaciones 1 a 11, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 25. Medicamento según la reivindicación 24, para el tratamiento de los cánceres, de las enfermedades infecciosas o de las enfermedades parasitarias.

15

26. Medicamento según la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque comprende además un agente estabilizante. 20

27. Medicamento según una de las reivindicaciones 25 a 26, caracterizado porque comprende un adyuvante inmunoestimulante. 28. Medicamento según la reivindicación 25, para el tratamiento de un tumor sólido.

25

29. Medicamento según la reivindicación 28, caracterizado porque el tumor sólido se selecciona de entre el cáncer del riñón, del seno, del colon, del pulmón, del estómago, del hígado, el melanoma y el sarcoma. 30. Medicamento según la reivindicación 25, para el tratamiento de un tumor hematopoyético.

30

31. Medicamento según la reivindicación 30, caracterizado porque el tumor hematopoyético se selecciona de entre las leucemias y los linfomas malignos hodgkinianos o no hodgkinianos. 32. Utilización de una vesícula según una de las reivindicaciones 1 a 11, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres, de las enfermedades infecciosas o de las enfermedades parasitarias.

35

33. Utilización del interferón gamma, de la interleucina 10 y/o de la interleucina 12 para la producción en cultivo de vesículas según una de las reivindicaciones 1 a 11. 40

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