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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 239 610

51 Int. Cl. : A61K 35/74

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A23L 1/308 A61P 1/00 A61P 31/00

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00953259 .9

86 Fecha de presentación: 19.07.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1194154

87 Fecha de publicación de la solicitud: 10.04.2002

54 Título: Utilización de bacterias priopiónicas para la producción de ácido propiónico y/o propinatos en el

colon. 30 Prioridad: 20.07.1999 FR 99 09385

73 Titular/es: Laboratoires Standa S.A.

68, rue Robert-Kaskoreff 14050 Caen Cédex, FR

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.10.2005

72 Inventor/es: Roussel, Edmond, Daniel;

Legrand, Charles, Gabriel; Legrand, Marc, Henri; Roland, Nathalie y Bougle, Dominique

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Ponti Sales, Adelaida

ES 2 239 610 T3

01.10.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 239 610 T3 DESCRIPCIÓN Utilización de bacterias priopiónicas para la producción de ácido propiónico y/o propinatos en el colon. 5

La presente invención se refiere a la utilización de bacterias propiónicas con objeto de optimizar la producción de ácido propiónico y/o de propionatos y, llegado el caso, de ácido acético y/o de acetatos a nivel del colon. Desde hace varios años, los especialistas en nutrición aconsejan a sus pacientes una alimentación rica en fibras, a las cuales les atribuyen efectos fisiológicos y metabólicos que pueden beneficiar la salud.

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Se sabe que las fibras alimentarias resisten la digestión enzimática en el intestino delgado y que sólo son degradadas y asimiladas a nivel de colon, es decir, en la parte terminal del intestino. Por tanto, el efecto beneficioso mencionado más arriba sólo se puede ejercer a condición de que esta degradación y esta asimilación sean tan completas como sea posible en este lugar pre-terminal: el colon. 15

Ahora bien, se ha podido establecer que estas reacciones biológicas son consecuencia de la fermentación anaeróbica de las fibras alimentarias bajo la acción de microorganismos en el colon. Esta fermentación conduce a la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC), de hidrógeno, de dióxido de carbono y de biomasa. 20

Estos ácidos grasos de cadena corta son esencialmente el ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico; en el organismo sano sólo se pueden producir a nivel de colon, puesto que es el único lugar del cuerpo humano en donde reinan las condiciones anaeróbicas estrictas que permiten la fermentación que hay en la base de su síntesis, con excepción del ácido acético, del cual puede producirse una pequeña cantidad a nivel hepático.

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Ahora bien, diferentes estudios han demostrado la importancia de estos ácidos grasos de cadena corta, los cuales son beneficiosos para la salud.

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A partir de la literatura, parecería que los papeles fisiológicos de estos tres ácidos grasos de cadena corta debieran ser diferentes los unos de los otros: en efecto, los ácidos acético y propiónico serán conducidos directamente al hígado, en donde la totalidad del ácido propiónico será metabolizado, entonces una parte del ácido acético será conducida inmediatamente a diferentes tejidos, mientras que el ácido butírico será utilizado más específicamente a nivel interno de la pared cólica.

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La síntesis de los ácido grasos de cadena corta implica, por tanto, la presencia en el colon, por una parte, de un sustrato a bases de fibras apropiadas, a aportar por la nutrición, y, por otra parte, de una flora bacteriana equilibrada y adaptada, presente de forma óptima y constante. Esta flora bacteriana puede provenir, bien de la flora endógena persistente de cada individuo, bien de la alimentación.

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En efecto, es bien sabido que el contenido del tubo digestivo humano, que es específico de cada individuo y corresponde aproximadamente a de 1 a 1,5 kg de materias alimentarias en vía de transformación digestiva, contiene una importante población de microorganismos constituida por una mezcla de numerosas especies, pudiendo evaluarse en de 1011 a 1012 células por gramo en el colon; esta población constituye una masa bacteriana con un peso evidente, en donde el equilibrio bueno o malo difícilmente puede modificarse de forma radical y, sobre todo, duradera mediante el único recurso de la alimentación actual. Por contra, la alimentación que se ingiere a diario no es jamás estéril y está, por tanto, más o menos cargada de bacterias (leche, productos lácteos fermentados, queso, sidra, vino, cerveza, charcutería, etc.). Sin embargo, las modificaciones de la flora cólica a consecuencia de la absorción de estas bacterias no pueden ser más que temporales. Por otra parte, debe destacarse que ya se ha formulado la propuesta de intentar modificar la población microbiana del tracto intestinal mediante la administración, y en particular la ingestión voluntaria, de células bacterianas que se consideran benéficas para la salud (llamadas probióticas), en particular las bacterias lácticas o bacterias bífidas. La introducción en el organismo de una población importante de estas bacterias, bien mediante la orientación de una alimentación determinada, bien por la ingestión directa de estas células microbianas, ha sido propuesta más concretamente con el objetivo de limitar el desarrollo de las especies patógenas y putrefactivas: en efecto, se sabe que la flora endógena presente en el color está repartida entre diferentes grupos bacterianos, algunos de los cuales son inofensivos, incluso benéficos, mientras que otros, en particular los clostridios y los putrefactivos, conducen a la producción de sustancias tóxicas e influyen negativamente en la salud. La idea que hay en la base de la invención ha consistido en introducir regularmente en el organismo, por vía bucal, una cantidad importante de una flora microbiana probiótica apta para favorecer la síntesis regular de ácidos grasos de cadena corta a nivel cólico. Entre las especies microbianas que podrían utilizarse con este fin, las bacterias lácticas están poco adaptadas 2

ES 2 239 610 T3 debido a su naturaleza, producen sobre todo y antes que nada ácido láctico, y de forma muy secundaria un poco de ácido acético, pero ni ácido propiónico ni ácido butírico.

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Por contra, las bacterias de otro tipo, las bacterias propiónicas, son capaces de producir abundantemente ácido propiónico y ácido acético, es decir, los dos ácidos grasos de cadena corta que están llamados a irrigar las redes tisulares, y ésto por ejemplo, según un porcentaje de 2/3 de ácido propiónico para 1/3 de ácido acético. Estas bacterias están presentes en la alimentación humana desde hace siglos, en particular en los quesos de pasta prensada cocida; además, presentan la ventaja de estar mejor preparadas que las bacterias lácticas para tener una actividad en el colon, en donde la anaerobiosis es total, y por otra parte, de ser más resistentes al estrés tecnológico que las bacterias lácticas y las bacterias bífidas.

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Debe destacarse que ya se ha propuesto en la literatura hacer absorber bacterias propiónicas, en particular para estimular el desarrollo de bacterias bífidas en el intestino (documento WO-97/19689) o incluso para producir monóxido de nitrógeno en el tubo digestivo humano o animal (documento WO-98/27991). Hasta la fecha, jamás se había tenido la idea de utilizar estas bacterias para la producción de ácidos grasos de cadena corta a nivel de colon.

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La presente invención concierne por tanto a la utilización de bacterias propiónicas, seleccionadas en función de su carácter poco autolítico y de su aptitud para resistir las sales biliares, para obtener una composición de alimentación habitual o una composición de alimentación dietética o medicamentosa absorbible por el hombre o el animal, elaborada para que las bacterias estén protegidas, al menos parcialmente, con vistas a la acidez gástrica, que incluyen al menos 106 células/gramo de estas bacterias, susceptible de estimular y de aumentar de forma significativa la síntesis de ácido propiónico y/o de propionato, y llegado el caso de ácido acético y/o de acetato, a nivel de color mediante fermentación bacteriana anaeróbica. Para que estas bacterias puedan tener el efecto benéfico que se da por descontado, es indispensable escoger cepas poco autolíticas, aptas para alcanzar, sin daños, el colon, eventualmente para desarrollarse y producir cantidades suficientes de ácido propiónico. Es bien sabido que las dos dificultades principales, a las cuales están sometidas las bacterias ingeridas durante su pasaje por la parte alta del tubo digestivo, están relacionadas, por una parte, con la acidez del medio estomacal (pH de 4 a 1) y, por otra parte, con la presencia de sales biliares en el intestino delgado (del orden de 15 mmoles/l como máximo a nivel del duodeno). Ahora bien, se ha podido establecer que las bacterias que han estado expuestas a la acidez estomacal son frágiles y, en consecuencia, no son aptas para resistir las sales biliares, incluso si permanecen viables a la salida del estómago. En consecuencia, conforme a la invención, es indispensable someter las bacterias propiónicas a un tratamiento con objeto de permitirles no experimentar el estrés gástrico correspondiente, de forma general mediante una encapsulación, que puede ser voluntaria o involuntaria, por ejemplo, en el caso de un alimento del tipo queso.

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Esta situación se ha sacado a la luz gracias a un ensayo mediante el cual se ha evaluado la influencia del pH ácido y de las sales biliares, sucesiva o individualmente, sobre la viabilidad de dos cepas de bacterias propiónicas lecheras pertenecientes a la colección TL del LRTL (Laboratorio de Investigaciones de Tecnología Lechera - INRA, Rennes), a saber, las cepas TL 162 y TL 24 pertenecientes a la especie P. freudenreichii subsp. shermanii. 45

Los resultados de este ensayo se describen a continuación. Las bacterias se han cultivado a 30ºC sobre medio YEL durante 2 días (inicio de la fase estacionaria). La densidad óptica a 650 nm era respectivamente de 2,28 y 2,64 para TL 162 y TL 24. 50

- Estrés ácido

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Los cultivos se han diluido a 1/10 en medio S (triptona-lactato) a pH 2,5 (pH final de 3,0). Después de una incubación a 37ºC durante 45 minutos, se han centrifugado los cultivos y las bacterias se han resuspendido en el mismo volumen de YEL. Al final de la incubación se han efectuado recuentos, y la reanudación del crecimiento se ha seguido mediante mediciones de la DO durante 5 días a 37ºC. - Estrés biliar

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Se han centrifugado los cultivos iniciales y las bacterias se han resuspendido en un volumen 10 veces superior de YEL que contenía 0,3% de bilis de buey (con aproximadamente un 50% de sales biliares). Después de una incubación a 37ºC durante 90 minutos, se han centrifugado los cultivos y las bacterias se han resuspendido en el mismo volumen de YEL. Los recuentos se han efectuado al final de la incubación, y la reanudación del crecimiento se ha seguido mediante mediciones de la DO durante 5 días a 37ºC.

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ES 2 239 610 T3 - Estrés ácido y biliar sucesivos

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Las bacterias han experimentado un estrés ácido como se ha descrito previamente, pero después de la centrifugación, las células se han resuspendido en YEL que contenía 0,3% de bilis de buey. Después de una segunda incubación a 37ºC durante 90 minutos, se han centrifugado los cultivos y las bacterias se han resuspendido en el mismo volumen de YEL. Los recuentos se han efectuado al final de la incubación, y la reanudación del crecimiento se ha seguido mediante mediciones de la DO durante 5 días a 37ºC.

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Los resultados obtenidos se mencionan, por una parte en la Tabla 1 siguiente, que menciona la influencia del estrés ácido y/o biliar sobre la viabilidad de las bacterias, y, por otra parte, en la Figura 1, la cual es un esquema que representa la reanudación del crecimiento después de los diferentes estreses. TABLA 1

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De igual forma, se ha podido establecer que: 45

- la acidez comporta una mortalidad importante de las bacterias (96,8% para TL 162 y 97,5% para TL 24), lo que explica el retraso bastante largo para la reanudación del crecimiento (Figura 1). - la bilis no comporta ninguna mortalidad para las bacterias, de donde una reanudación muy rápida del crecimiento.

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- una vez se someten las bacterias a la bilis, después de un estrés ácido previo, se produce una mortalidad casi total de las bacterias. Este resultado, totalmente inesperado, indica, por tanto, que las bacterias, las cuales han experimentado un estrés ácido y las cuales en cualquier caso permanecen viables, devienen totalmente sensibles a la bilis, mientras que sin estrés ácido previo, estas mismas bacterias son totalmente resistentes a las sales biliares.

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Teniendo en cuenta esta situación, se han efectuado ensayos de preadaptación con objeto de aumentar la resistencia de las bacterias. En efecto, se sabe que un pre-estrés ácido (pH 4,5-5) protege eficazmente las células contra un estrés ácido (pH 2). 60

De este modo, se han efectuado tres ensayos de adaptación con TL 162: - pre-estrés ácido: incubación preliminar de las células a 37ºC durante 30 minutos a pH 5, - pre-estrés biliar: incubación durante 30 minutos en presencia de 0,08% de bilis,

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- pre-estrés ácido y biliar: incubación durante 30 minutos a pH 5 y en presencia de 0,08% de bilis.

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ES 2 239 610 T3 Se ha aplicado el mismo protocolo que antes, y se han obtenido los resultados recogidos en la Tabla 2 siguiente: TABLA 2 5

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De este modo se ha podido establecer que una preadaptación ácido fragiliza aún más las células, mientras que una preadaptación biliar no tiene efecto alguno. 30

Por tanto, estos resultados han permitido poner en evidencia la necesidad de tratar los estreses sucesivamente, y no de forma separada como describen la mayor parte de los estudios que se han realizado en este campo. 35

No obstante, se puede suponer que in vivo las condiciones son menos drásticas para las bacterias (efecto tamponante del alimento dentro del estómago, efecto bactericida menor de las sales biliares en forma micelar con los fosfolípidos. Teniendo en cuenta lo que precede, para aumentar la cantidad de bacterias viables, no es eficaz una mejora de su resistencia al pH ácido porque las bacterias permanecen sensibles al efecto de las sales biliares.

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Por contra, protegiendo las bacterias del estrés ácido, en particular ingiriéndolas pre-acondicionadas dentro de cápsulas gastroresistentes, se pueden reencontrar en las heces bacterias resistentes naturalmente a la bilis, y éstas con un nivel elevado de viabilidad. 45

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Teniendo en cuenta estos resultados, se ha efectuado un ensayo complementario para comparar la aptitud de diferentes cepas de bacterias propiónicas para producir cantidades importantes de ácido propiónico después de haberlas puesto en contacto con sales biliares. En este ensayo, se han comparado 33 cepas de bacterias propiónicas lecheras pertenecientes a la colección TL del LRTL (INRA, Rennes) según su aptitud para sobrevivir en presencia de bilis y para producir a continuación ácido propiónico: - 20 cepas pertenecientes a la especie P. freudenreichii subsp. shermanii,

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- 6 cepas pertenecientes a la especie P. freudenreichii subsp. freudenreichii, - 20 cepas pertenecientes a la especie P. acidipropionici. El protocolo operativo ha sido el siguiente:

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Los cultivos en el inicio de la fase estacionaria (de 2 a 3 días de cultivo en medio YEL incubado a 30ºC) se han diluido a 1/10 en medio YEL que contenía el 0,6% de bilis de buey (aproximadamente 7-8 mmoles/l de sales biliares). Esta concentración de bilis se ha escogido para discriminar óptimamente las cepas entre ellas, y constituye unos contenidos en sales biliares del mismo orden que los hallados en el duodeno.

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ES 2 239 610 T3 Las diluciones se han incubado a 37ºC durante 90 minutos, a continuación se han centrifugado. Las bacterias se han resuspendido en medio YEL (volumen inicial) y se han vuelto a incubar a 37ºC. 5

Después de 24 horas de incubación, se ha medido la DO a 650 nm para evaluar la reanudación del crecimiento. El sobrenadante se ha recogido y después se ha congelado para obtener los ácidos grasos. Para ciertas cepas, se ha repetido el experimento con objeto de confirmar los resultados.

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Los valores de las densidades ópticas a 650 nm antes del estrés biliar y 24 horas después del final del estrés se mencionan en la Tabla 3 siguiente: TABLA 3

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ES 2 239 610 T3 TABLA 3 (continuación)

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Debe destacarse que para ciertas cepas, la DO final es superior a la DO inicial, lo que puede explicarse por la reanudación del crecimiento a 37ºC y no a 30ºC como inicialmente. En función de los resultados obtenidos, se pueden distinguir esquemáticamente tres grupos de cepas:

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- las cepas que se distinguen por una reanudación rápida del crecimiento, indicando una mortalidad baja de las células debida a la bilis (entre éstas, TL 34, TL 160, TL 63, TL 33, TL 15, TL 3, TL 162),

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ES 2 239 610 T3 - las cepas muy poco resistentes a la bilis, que presentan una reanudación del crecimiento muy baja o nula (TL 148, TL 4, TL 64, TL 47), 5

- las cepas intermedias, caracterizadas por una mortalidad moderada debida a la bilis (TL 146, TL 147, TL 167, TL 168, TL 14, TL 17, TL 22, TL 24, TL 61, TL 40, TL 54). Sólo las cepas que poseen un cociente [(DO a 24 h/DO inicial) × 100] superior al 60% (límite máximo escogido arbitrariamente) se han seleccionado para la medición del lactato, del acetato, y del propionato mediante HPLC en los sobrenadantes congelados. El contenido inicial del medio YEL en lactato era de 11,4 g/l.

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Las concentraciones en lactato, acetato y propionato de los sobrenadantes recuperados después de 24 horas de incubación, se reúnen en la Tabla 4 siguiente. TABLA 4 15

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ES 2 239 610 T3 Esta tabla muestra que, de manera previsible, la cantidad de propionato producida está correlacionada con el grado de utilización del lactato. 5

De forma general, las cepas pertenecientes a la especie P. acidipropionici producen menos ácido propiónico que las cepas de la especie P. freudenreichi en 24 horas. A la vista de los resultados mencionados más arriba, ciertas cepas se evidencian como las mejores candidatas en materia de producción de propionato después de la acción de la bilis. Se trata de las cepas que producen al menos 2 g/l de propionato en las condiciones descritas más arriba:

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TL 134, TL 50, TL 3, TL 19, TL 33, TL 249 y preferiblemente más de 4 g/l de propionato: 15

TL 160, TL 144, TL 34, TL 63, TL 142. Por otra parte, se ha realizado un experimento con voluntarios sanos, con objeto de verificar la influencia benéfica de las cápsulas gastroresistentes para mejorar la supervivencia en el intestino de una cepa de bacterias propiónicas queseras ingeridas en forma liofilizada (TL 162).

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El experimento se ha realizado con 7 individuos en total, con 3 períodos de tratamiento de 4 semanas, separados por 3 semanas de intervalo. 25

El tratamiento 1 consistía en ingerir durante 2 semanas 5 × 109 cfu/día de bacterias, acondicionadas en cápsulas no gastroresistentes. El tratamiento 2 consistía en ingerir durante 2 semanas 5 × 10\10 cfu/día de bacterias, acondicionadas en cápsulas no gastroresistentes.

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El tratamiento 3 consistía en ingerir durante 2 semanas 5 × 109 cfu/día de bacterias, acondicionadas en cápsulas gastroresistentes. Para cada tratamiento, se han realizado 4 tomas de heces para buscar las bacterias propiónicas con ayuda de un medio selectivo (Palpropiobac®, Standa-Industrie, suplementado con 4 mg/ml de metronidazola). Los datos de las tomas fueron: - S1: justo antes del período de ingestión, - S2: 1 semana después del inicio de la ingestión,

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- S3: 2 semanas después del inicio de la ingestión, - S4: 1 semana después del fin del período de ingestión, 45

- HP (para el período 3): 3 semanas después del fin del período de ingestión. Durante todo el experimento, los voluntarios no podían consumir queso que contuviera bacterias propiónicas en cantidad importante (Emmental, Comté, Leerdammer, Gruyéres suizos, ...), con excepción de los quesos fundidos.

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La Tabla 5 indica los resultados de viabilidad de las bacterias propiónicas en las heces. Con las cápsulas clásicas, la dosis de 5 × 109 cfy/día (Período 1) aparece como insuficiente para reencontrar bacterias propiónicas viables en cantidad importante en todos los voluntarios. Por contra, con la dosis de 5 × 10\10 cfu/día (Período 2), todos los voluntarios albergaron más de 5 log cfu/g de bacterias propiónicas viables en las heces, desde la primera semana de tratamiento. No obstante, los niveles máximos de viabilidad observados con las dosis no son diferentes (∼7 log). La utilización de cápsulas gastroresistentes (Período 3) mejora la viabilidad de las bacterias propiónicas en las heces, principalmente en los voluntarios en los que se hallaron pocas después del 1er tratamiento (vol. 1, 2 y 6). De hecho, en relación al Período 2, los niveles de viabilidad obtenidos son en promedio equivalentes. - sobre la base de 5 × 109 cfu/día, la utilización de cápsulas gastroresistentes se justifica, por tanto, para cierto número de individuos (vol. 1, 2 y 6), para los otro, ellas no mejoran en absoluto o poco la viabilidad (vol. 3, 4 y 5),

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- ellas aportan resultados aproximadamente equivalentes a los de las cápsulas clásicas conteniendo 5 × 10\10 cfu. 9

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Los AGCC se han medido en las heces mediante cromatografía en fase gaseosa. Las cantidades de propionato en las heces se indican en la Tabla 6. Para el análisis estadístico, se han comparado 2 grupos de valores 2 a 2: los valores correspondientes a las muestras de heces en las que no se detectaron las bacterias propiónicas (< 4 log), para todos los tratamientos y períodos confundidos, y los valores correspondientes a las muestras de heces en las que las bacterias propiónicas se han constado en más de 6 log cfu/g. En el primer caso, la cantidad media de propionato es de 5,06 ± 2,56 µmol/g (n = 25) y en el segundo caso, es de 7,19 ± 3,18 µmol/g (n = 30). Estos 2 valores son significativamente diferentes con p < 0,02 (test de Student). Para los otros AGCC, no hay diferencias significativas. Este experimento muestra, por tanto, que la presencia de cantidades importantes (> 6 log cfu/g) de bacterias propiónicas en el colon, a consecuencia de la ingestión de TL 162, aumenta significativamente la cantidad de propionato en las heces. No obstante, la cepa TL 162 no se revela como la mejor candidata para optimizar la producción de ácido propiónico en el colon (cf criterios de selección in vitro), es creíble que los resultados se puedan mejorar con una cepa seleccionada según los criterios citados previamente. TABLA 5

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Recuento de bacterias propiónicas en las heces después de 3 períodos de tratamiento (resultados en log cfu/g de heces frescas)

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ES 2 239 610 T3 TABLA 6 Concentración en propionato en las heces frescas (en µmoles/g) 5

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Teniendo en cuenta lo que precede y de conformidad con una característica preferencial de la invención, las bacterias propiónicas utilizadas se escogen entre las cepas productoras de ácido propiónico en cantidad fisiológicamente significativa, y en particular, entre las cepas que producen al menos 2 g/l de ácido propiónico y/o de propionatos y, preferiblemente, más de 4 g/l de ácido propiónico y/o de propionatos después de haber sido cultivadas a 30ºC, en medio YEL, conteniendo aproximadamente 11,4 g/l de lactato, durante de 2 a 3 días, diluidas después a 1/10 en un medio YEL que contiene 0,6% de bilis de buey, incubadas a 37ºC durante 90 minutos, centrifugadas, resuspendidas en medio YEL y vueltas a incubar de nuevo a 37ºC durante 24 horas. Otro criterio de selección que podría tenerse en cuenta de conformidad con la invención corresponde a las propiedades de adhesión de las cepas sobre los colonocitos: las cepas dotadas de buenas propiedades de adhesión presentan, en efecto, la ventaja de permanecer más tiempo en el color, los que las deja más tiempo para sintetizar el ácido propiónico; además, las cepas que se fijan, pueden quitarles el lugar a los agentes patógenos. Debe destacarse que para obtener el efecto buscado, no es posible hacer absorber el ácido propiónico por sí mismo, dado que desde el punto de vista de la cadena metabólica humana no podría llegar al colon, y que, además, se ha demostrado que es nocivo para el estómago en dosis elevadas. Entre los efectos benéficos atribuidos a los ácidos grasos de cadena corta sintetizados a nivel de color, y en particular al ácido acético y sobre todo al ácido propiónico, se puede destacar su rol a nivel de la asimilación de los principales minerales y principalmente del calcio, del hierro, del zinc, o aún del magnesio; en efecto, se ha podido establecer que el ácido propiónico y, en menor medida, el ácido acético puede favorecer la absorción cólica de estos minerales y la utilización por parte del organismo de la fracción absorbida. Se trata de un efecto particularmente interesante dado que la asimilación de los minerales está acompañada por efectos funcionales tales como, a título de ejemplo, la corrección de la anemia para el hierro o la mineralización ósea para el calcio.

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Los estudios experimentales y clínicos, que se han efectuado, proporcionan un conjunto de argumentos concordantes que apoyan un efecto favorable del ácido propiónico y de los propionatos y, en menor medida, del ácido acético y de los acetatos, sobre el metabolismo de estos minerales; este efecto es verdaderamente más importante cuando las condiciones de digestión son malas, lo que conduce a obtener una cantidad importante de minerales no absorbidos por el intestino delgado a nivel cólico, y cuando las necesidades son elevadas. La existencia de relaciones entre los ácidos grasos de cadena corta y el metabolismo de los minerales ha sido sugerida principalmente por los estudios que han utilizado fibras solubles. De este modo, se ha podido establecer que los polisacáridos u oligosacáridos no digeridos por los enzimas digestivos, y que han sido fermentados en ácidos grasos de cadena corta (principalmente en propionatos) por la flora cólica, aumentan la absorción de minerales tales como el calcio, el hierro o el zinc, y que este aumento es tanto más neto cuando las condiciones son patológicas (carencias, gastrectomía, ...). Los estudios de perfusión cólica, y por contra, la ausencia de efecto en los sujetos colectomizados, a permitido confirmar la localización del sitio de acción a nivel cólico. Por otra parte, se ha constatado que estas acciones están acompañadas por un descenso del pH y por una síntesis de ácidos grasos de cadena corta; lo que sugiere la intervención de estos ácidos a causa de la tendencia de una fermentación, tanto más cuando se ha verificado que las fibras insolubles no fermentables no tienen efecto alguno. Además, se ha establecido que el ciego está hipertrofiado y que el caudal sanguíneo cólico aumenta, lo que confirma un efecto trófico. Los estudios clínicos efectuados sobre este tema son poco numerosos, pero permiten confirmar que los efectos de las fibras solubles se obtienen por fermentación cólica y mostrar directamente el efecto de los ácidos grasos de cadena corta sobre la absorción de los minerales. De entre estos estudios, se puede mencionar la publicación Trinidad, T.P., Wolever, T.M.S., Thompson, L.U., Effect of acetate and propionate on calcium absorption from the rectum and distal colon of humans. Am. J. Clin. Nutr. 63:574-578 (1996), que rinde cuentas de ensayos en los cuales se ha perfundido directamente el colon distal de sujetos sanos con ácido acético, ácido propiónico, o su asociación, a concentración fisiológica; también se ha establecido que la desaparición del calcio de la luz cólica era aumentada por los ácidos gasos de cadena corta, pero de forma significativamente más importante por el ácido propiónico; este estudio a mostrado igualmente un efecto de dosis con la ayuda de un sistema de absorción no saturable. Los autores han sugerido que la mayor lipofilia del ácido propiónico comparado con el ácido acético podría favorecer su absorción y la liberación dentro del colonocito de protones, de ahí que el pasaje dentro de la luz digestiva favoreciera la absorción del calcio. Teniendo en cuenta lo que precede, la invención concierne igualmente a la utilización de bacterias propiónicas, seleccionadas en función de su carácter poco autolítico y de su aptitud para resistir a las sales biliares, para la obtención de una composición de alimentación habitual o de una composición dietética o medicamentosa absorbible por el hombre o el animal, elaborada para que las bacterias estén protegidas, al menos parcialmente, del contacto con la acidez gástrica, que contienen al menos 106 células/gramo de estas bacterias, susceptible de favorecer la asimilación de los principales minerales, en particular, del calcio y/o del hierro y/o del zinc y/o del magnesio a nivel de colon. Según una variante de la invención, se propone igualmente aplicar esta utilización a la obtención de una composición que tenga propiedades antifúngicas a nivel de colon y, en particular, que sea susceptible de reducir el desarrollo de micodermos patógenos del tipo candida/muguet. Esta utilización conduce, de hecho, a obtener provecho de las excelentes propiedades antifúngicas del ácido propiónico, principalmente para el tratamiento de las candidiasis debidas a los antibióticos.

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Debe destacarse que la composición utilizada conforme a la invención puede, llegado el caso, contener otras bacterias, en particular bacterias lácticas y/o bacterias propiónicas con objeto de aumentar los efectos arriba mencionados, al proporcionar lactato en tanto que sustrato fermentable. 55

La composición utilizada conforme a la invención puede estar formada por una preparación seca o hidratada, presentándose bajo la forma de fracciones individuales de aproximadamente de 100 mg a 1 g, preferiblemente de 200 a 500 mg, conteniendo preferiblemente al menos 108 células; en concreto, puede presentarse ventajosamente en forma de cápsulas o de cápsulas gastroresistentes.

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Según otra característica de la invención, esta composición puede estar constituida igualmente por una preparación elaborada, habiéndose añadido las bacterias propiónicas o estando asociadas a un sustrato fermentable, principalmente las fibras alimentarias, o aún añadidas o incorporada en alimentos líquidos, pastosos o sólidos.

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En una preparación tal, las bacterias propiónicas pueden jugar un doble papel, a saber, tecnológico en un primer momento, a través de la fermentación de alimentos, y funcional en un segundo momento, puesto que, una vez ingeridas, son capaces de alcanzar el colon y de jugar el papel probiótico mencionado más arriba, en particular a nivel de la optimización de la síntesis del ácido propiónico y de la optimización de la asimilación de los minerales. 12

ES 2 239 610 T3 REIVINDICACIONES

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1. Utilización de bacterias propiónicas pertenecientes a cepas poco autolíticas y seleccionadas por su capacidad para producir al menos 2 g/l de ácido propiónico y/o de propionatos y, preferiblemente, más de 4 g/l de ácido propiónico y/o de propionatos después de haber sido cultivadas a 30ºC, en un medio YEL que contiene aproximadamente 11,4 g/l de lactato, durante de 2 a 3 días, diluidas a continuación a 1/10 en medio YEL adicionado con 0,6% de oxgall (bilis de buey), incubadas a 37ºC durante 90 minutos, centrifugadas, resuspendidas en medio YEL, y siendo incubadas de nuevo a 37ºC durante 24 horas, para la obtención de una composición de alimentación habitual o de una composición dietética o una composición medicinal, absorbible por el hombre o el animal, elaborada para que las bacterias estén protegidas, al menos parcialmente, del contacto con la acidez gástrica, que contienen al menos 106 células por gramo de estas bacterias, susceptible de estimular y de aumentar de manera significativa la síntesis de ácido propiónico y/o de propionatos, y de ácido acético y/o de acetatos, si es necesario a nivel de colon mediante fermentación bacteriana anaeróbica. 2. Utilización según la reivindicación 1 para la obtención de una composición susceptible de favorecer la asimilación de sustancias minerales, en particular del calcio y/o del hierro y/o del zinc y/o del magnesio, a nivel del colon. 3. Utilización según la reivindicación 1 para la obtención de una composición que tiene propiedades antifúngicas a nivel del colon y, en particular, susceptible de reducir el desarrollo de micodermos patógenos del tipo candida/muguet. 4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada en que las bacterias propiónicas pertenecen a cepas dotadas de propiedades de adhesión sobre los colonocitos.

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5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada en que la composición está constituida por una preparación seca o hidratada que se presenta bajo la forma de fracciones individuales de aproximadamente de 100 mg a 1 g, preferiblemente de 200 a 500 mg, que contiene preferiblemente al menos 106 células. 6. Utilización según la reivindicación 5, caracterizada en que la composición se presenta bajo la forma de cápsulas o de cápsulas gastroresistentes. 7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada en que la composición está constituida por una preparación elaborada, habiéndose añadido las bacterias propiónicas o estando asociadas a un sustrato fermentable, principalmente a fibras alimentarias.

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8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada en que la composición está constituida por una preparación elaborada, habiéndose añadido o incorporado las bacterias propiónicas en alimentos tales como los alimentos líquidos, pastosos o sólidos. 9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada en que la composición contiene bacterias lácticas y/o bacterias bífidas.

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