Apuntes de Laboratorio

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DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS BACTERIANAS

Horacio Lopardo Claudia Hernández Rolando Soloaga

1999 LABORATORIOS BRITANIA s.a. Los Patos 2175 C.P. (1283) Buenos Aires - Argentina Fax 0054-11-4304-1623 Tel.Fax 0054-11-4306-0041 email: [email protected]

Comité Editor Carlos Bantar Carlos A. Guardiano Horacio Lopardo

Editor Responsable Ronaldo J. L. Meda Propietario Lab. Britania s.a. Diagramación y Diseño Top Laser S.R.L. Todos los derechos reservados. Prohibida la reproducción total o parcial sin autorización previa del editor. Registro de la Propiedad Intelectual Nº 744.351

DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS BACTERIANAS Horacio Lopardo: Doctor en Ciencias Bioquímicas. Bioquímico Principal del Laboratorio de Microbiología. Hospital de Pediatría SAMIC " Prof Dr J. P. Garrahan", Buenos Aires. Profesor Titular de Bacteriología Clínica. Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata Claudia Hernández, Bioquímica. Bioquímica Asistente del Laboratorio de Microbiología. Hospital de Pediatría SAMIC " Prof Dr J. P. Garrahan", Buenos Aires Rolando Soloaga, Bioquímico. Microbiólogo de la Fundación Favaloro, Profesor Pro-titular de la Maestría en Microbiología Clínica, Universidad Católica Argentina. Profesor Asociado de la Cátedra de Microbiología. Carrera de Medicina. Universidad del Salvador

INTRODUCCION GENERAL Dentro de las infecciones que afectan al género humano, las que ocurren en el tracto respiratorio son las más frecuentes y por ende, las que originan el mayor número de consultas médicas. Aún haciendo abstracción de las de origen viral, que escapan al alcance de esta publicación, las infecciones respiratorias (IR) constituyen un motivo de frecuente preocupación dentro del equipo de salud. En especial, las complicaciones y gastos generados por las IR altas y la elevada morbimortalidad de las localizadas en el tracto respiratorio inferior,son objeto de numerosas publicaciones en revistas de la especialidad. En este fascículo trataremos de describir críticamente los métodos empleados para realizar el diagnóstico microbiológico de las IR. Las dificultades , como se sabe, derivan de que las vías aéreas superiores, al ser un punto de contacto entre el ser humano y el ambiente exterior, están fuertemente colonizadas con una flora conformada por más de 200 especies. Esto conspira contra una toma de muestra libre de agentes contaminantes, más aún teniendo en cuenta que algunos de los colonizantes, en ciertas oportunidades podrían transformarse en agentes etiológicos de algunas de estas infecciones. De esta manera, los métodos empleados no dan resultados de certeza, sino que casi siempre arrojan datos indicadores de mayor o menor probabilidad de que el o los microorganismos aislados sean los verdaderos causantes de las IR.

INFECCIONES RESPIRAT ORIAS ALTAS El tracto respiratorio superior está conformado por la naso y la orofaringe, las que se encuen-

tran conectadas a los senos paranasales y el oído medio. De este modo, en esta sección consideraremos el diagnóstico microbiológico de las faringitis, otitis y sinusitis. FARINGITIS Aproximadamente un 70-80% de las faringoamigdalitis (sindrome inflamatorio faríngeo) son de etiología viral y por su carácter autolimitado no requieren normalmente del estudio microbiológico. El 20-30% restante es de origen bacteriano y en su gran mayoría son producidas por S. pyogenes. También éstas generalmente curan sin necesidad de tratamiento. Sin embargo, debido a las posibles complicaciones supurativas y no supurativas es esencial su diagnóstico preciso y su tratamiento. Lamentablemente, excepto en algunos casos típicos de escarlatina, el diagnóstico basado sólo en parámetros clínicos no es confiable y debe recurrirse al estudio microbiológico. Habitualmente el objetivo del cultivo de un exudado de fauces es la búsqueda de estreptococos ß-hemolíticos del grupo A. No obstante, los pertenecientes a los grupos C y G de Lancefield (colonia grande) son capaces de producir cuadros similares y algunas de las complicaciones que origina S. pyogenes. Si bien es aún controvertido su rol en la faringitis, la tendencia actual es identificarlos para diferenciarlos de cepas ß-hemolíticas de estreptococos del grupo "milleri". Estas pueden aglutinar con antisueros C y G aunque más frecuentemente lo hacen con antisueros F. Constituyen además la mayoría de las cepas no serotipificables dentro de los estreptococos ß-hemolíticos y se han detectado muy pocas cepas que pueden dar aglutinación cruzada con estreptococos del grupo A. Los estreptococos ß-hemolíticos del grupo "milleri" pertenecen

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a la flora habitual de las vías aéreas superiores y hasta el momento no ha sido demostrada su participación en las faringoamigdalitis. Otros agentes etiológicos de faringitis poco frecuentes en nuestros tiempos son Arcanobacterium haemolyticum, Corynebacteriun diphteriae, Neisseria gonorrhoeae, hongos levaduriformes y la asociación fusoespirilar responsable de la angina de Vincent. En este fascículo sólo consideraremos al primero de ellos pues los otros microorganismos son responsables de entidades clínicas claramente definidas por síntomas y signos y/o por pautas epidemiológicas. De este modo la solicitud del estudio queda claramente dirigida y representa un abordaje diferente al rutinario por parte del microbiólogo. No obstante ellos son considerados en los algoritmos de trabajo. Para mayores precisiones sugerimos dirigirse a la bibliografía citada.

ficie de 3 x 2 cm , cercana al borde de la placa. Con el ansa se disemina en forma de tres o cuatro estrías cruzadas y se realizan otras estrías en profundidad en la zona cercana al punto de siembra. c) EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO: Sólo se justifica en casos de diagnóstico presuntivo de candidiasis orofaríngea, Angina de Vincent o difteria. La coloración de Gram en forma rutinaria no debe realizarse pues puede llevar a confusiones. d) INCUBACION: La incubación debe realizarse a 35°C en atmósfera normal. Aparentemente una incubación en atmósfera enriquecida en CO2 no aportaría demasiado ni resultaría perjudicial. La incubación debe prolongarse 48 horas en caso de que a las 24 no hubiera desarrollo de estreptococos ß-hemolíticos

1) FARINGITIS ESTREPTOCOCICA a) TOMA DE MUESTRA: Se coloca la cabeza del paciente en hiperextensión y se iluminan las fauces en forma conveniente. Con hisopo estéril se frotan ambas amígdalas (o ambos pilares en pacientes amigdalectomizados) . Si existiera un exudado visible se debería tratar de tocarlo con la punta del hisopo. En cualquier caso se deberá evitar el contacto del hisopo con el paladar o la lengua, es por ello que resulta imprescindible ayudarse con un bajalenguas. El hisopo se deberá colocar en un tubo con gotas de solución fisiológica estéril o con medio de transporte (Cary Blair , Stuart o similar). Como alternativa recomendada sólo ante una emergencia se puede conservar seco en un tubo de ensayo estéril. El hisopo seco puede conservar la viabilidad de los estreptococos ß-hemolíticos en un alto porcentaje de casos. La conservación de estas muestras se deberá efectuar a temperatura ambiente durante el menor tiempo posible. b) SIEMBRA: Se utiliza una placa entera de agar tripteína de soya o agar Columbia adicionada de 5% de sangre ovina. Si la siembra se realiza con cuidado, puede utilizarse media placa para cada muestra. Se frota el hisopo en una super-

e) RESULTADOS: El diagnóstico etiológico de la faringitis estreptocócica depende fundamentalmente de la observación de hemólisis en agar sangre de oveja. Las colonias ß-hemolíticas se estudian independientemente del número de ellas presentes en la placa. Las faringitis ya sea sintomáticas o subclínicas con frecuencia producen cultivos con recuentos muy altos de estreptococos ß-hemolíticos. Lo contrario sucede en cultivos faríngeos de portadores sanos. Sin embargo, estas apreciaciones no son consistentes, de modo que la cuantificación no permite discriminar en forma confiable la portación de la infección. Se deberá informar entonces sólo la presencia o la ausencia de estreptococos ß-hemolíticos. f) IDENTIFICACION DE LOS ESTREPTOCOCOS AISLADOS: Las colonias beta-hemolíticas deben ser identificadas según técnicas convencionales: coloración de Gram, pruebas de catalasa, bacitracina y PYR. Eventualmente y ante casos dudosos (ver esquema) o para trabajos epidemiológicos se puede completar la identificación con pruebas serológicas (látex, coaglutinación) , Voges-Proskauer, glucuronidasa y fermentación de azúcares. (ver tablas 1 y 2).

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TABLA 1 IDENTIFICACION DE ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLITICOS SEROGRUPO

ESPECIE

BAC

PYR

VP

GLU

A

S. pyogenes S. grupo milleri

S R (s)

+ -

+

+

B

S. agalactiae

R

-

-

-

C

S. dysgalactiae ss. equisimilis S. equi ss. equi S. equi ss. zooepidemicus S. grupo milleri

R (s) R (s) R (s) R (s)

-

+

+

G

S. dysgalactiae ss. equisimilis S. grupo milleri

R (s) R (s)

-

+

+

F

S. grupo milleri

R (s)

-

+

+

No agrupables

S. grupo milleri

R (s)

-

+

+

BAC= bacitracina, PYR= pirrolidonilarilamidasa, VP= Voges-Proskauer, GLU= Glucuronidasa

TABLA 2 IDENTIFICACION DE LOS ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO C (COLONIA GRANDE)

ESPECIE

THEHALOSA

SORBITOL

S. dysgalactiae ss. equisimilis S. equi ss. equi S. equi ss. zooepidemicus

+ -

+

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Algoritmo del procesamiento del exudado de fauces. EVALUACIÓN CLÍNICO/EPIDEMIOLÓGICA

A

B

C

Sospecha de Angina de Vincent*

Sospecha de Candidiasis orofaríngea*

Sospecha de Difteria**

Hisopado de la úlcera

Hisopado de los exudados blanquecinos

Toma de muestra: tomar parte de la seudomembrana con pinza o instrumento "ad hoc". Si no se pudiera arrancar la seudomembrana, tomar un hisopado faríngeo y otro nasofaríngeo. Transporte: en solución fisiológica.

Extendidos

Coloraciones de Gram y azul de metileno (30 seg.)

Observar la presencia de asociación fusoespirilar

Exámen en fresco con o sin el agregado de HOK al 20%

Cultivo

Hisopado o muestra de seudomembrana Agar Sabouraud con o sin antibióticos

Observar la presencia de células levaduriformes con o sin seudomicelios

Desarrollo de hongos levaduriformes

Identificación a nivel de especie (ver tratado de especialidad)

Coloración de Gram

Coloración de azul de metileno

Bacilos gram + difteromorfos dispuestos en V, letras chinas y/o empalizada

Observación de gránulos metacromáticos

Cultivo

A/sangre (procesar como en D)

Agar sangre con cistina y telurito (ASCT)

Medio de Loeffler

2 hs (sin valor diagnóstico)

*** GRUPO

VOGES-PROSKAUER

A

-

Repetir PYR y BAC

A

+

S. milleri (colonia chica)(no significativo)

G

-

S. dysgalactiae ss. equisimilis (col.grande)

G

+

S. milleri (col. chica) (no significativo)

C

-

S. dysgalactiae ss. equi o S. dysgalactiae ss. zooepidemicus S. dysgalactiae ss. equisimilis (col.grande)

C

+

S. milleri (col. chica) (no significativo)

B

-

S. agalactiae (no significativo)

F

+

S. milleri (col. chica) (no significativo)

No aglutinable

+

S. milleri (col. chica) (no significativo)

No aglutinable

-

Enviar a centro de referencia

18 hs

Extendidos

pase a ASCT

Gram y Azul de metileno

RESULTADO

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Incubar 24-48 hs

Informe preliminar

Colonias negro-grisáceas

Gram: bacilos gram + pleomórficos catalasa positivos

Coloración de azul de metileno

Pruebas bioquímicas

Prueba de toxigenicidad (enviar a centro de referencia)

D

E

Faringoamigdalitis con o sin rash cutáneo

Sospecha de faringitis gonocócica **

Cultivo

Coloración de Gram

D1 A/S de oveja (búsqueda de estreptococos betahemolíticos)

D2 A/S humana (búsqueda de Arcanobacterium haemolyticum)

Incubar 48 hs a 35 Cº al aire (1º lectura a las 18-24 hs)

Incubar 72 hs a 35ºC en 5-10% de CO2 (lecturas periódicas cada 24 hs)

Observar la presencia de diplococos gram negativos intra o extracelulares (no tiene valor diagnóstico)

ß-hemólisis

No ß-hemólisis

ß-hemólisis

No ß-hemólisis

Gram

Flora orofaríngea habitual

catalasa

Flora crofaríngea habitual

Cultivo

A/choc.

TM # o similar

72 hs en jarra c/vela o estufa con 10% de CO2

Coloración de gram de las colonias diplococos gram(-)

Oxidasa Cocos gram + catalasa -

Bacilos Gram + difteromorfos continuar como en C o D2 según el caso

+-+

+ Cocos Gram positivos

Bacitracina PYR

++ Informar S. pyógenes

Coloración de Gram

-• Aglutinar • Voges-Proskauer ***

Bacilos Gram positivos difteromorfos

Se descarta

Pruebas de oxidación de azúcares en medio base CTA, Nitratos (-) y DNAsa (-) (ver tratados de la especialidad) Glu+ Mal- Sac- Lac-

Camp invertida + Arcanobacterium haemolyticum (confirmar con pruebas bioquímicas; ver tratados de la especialidad)

Repetir

++

+-+

--

#

TM=

Thayer Martin.

*

No se recomienda efectuar esta búsqueda en forma rutinaria dado que al tratarse de microorganismos que son parte de la flora habitual orofaríngea, se corre el riesgo de sobrediagnosticar estas enfermedades.

** No se recomienda efectuar esta búsqueda en forma rutinaria por no ser costo-efectiva al tratarse de microorganismos excepcionalemente encontrados en pacientes sin factores de riesgo o clínica compatible.

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PRUEBA DE LA BACITRACINA Con las colonias aisladas en el primocultivo se efectúan estrías superpuestas en tres sentidos, cubriendo una superficie aproximada de un cuarto de una placa de agar sangre. En el centro de esta superficie se coloca un disco de 0,04 U de bacitracina . Se deja incubar 18-24 horas a 35°C y se observa la formación o no de un halo de inhibición alrededor del disco. PRUEBA POSITIVA: producción de un halo de inhibición de cualquier diámetro PRUEBA NEGATIVA: ausencia de halo de inhibición PRECAUCIONES: i) Verificar que la cepa produzca beta-hemólisis en sangre ovina. ii) Verificar que se trate de un aislamiento puro. iii) Verificar que los discos contengan 0,04U pues hay discos con otras concentraciones . iv) Verificar que se logre un desarrollo confluente pues el uso de inóculos bajos puede dar lugar a la producción de resultados falsamente positivos. PRUEBA DE LA PIRROLIDONILARILAMIDASA (PYR) Sobre un portaobjetos o sobre la tapa de una placa de Petri se coloca un disco de PYR comercial. Se lo humedece y se lo frota con un palillo cargado con varias colonias del microorganismo a ensayar. Se le agrega una gota del reactivo revelador, se deja unos 5 minutos y se efectúa la lectura. PRUEBA NEGATIVA: disco incoloro PRUEBA POSITIVA: disco rojo Otras alternativas pueden encontrarse en la bibliografía o en los prospectos de los reactivos comerciales. g) METODOS RAPIDOS DE DIAGNOSTICO DE FARINGITIS POR ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLITICOS DEL GRUPO A Existen más de 40 productos comerciales destinados al diagnóstico rápido de la faringitis estreptocócica. Estos equipos emplean técnicas de extracción del antígeno específico de grupo y el posterior revelado por coaglutinación, aglutinación con partículas de látex o enzimoinmunoensayo. Los detalles de técnica deberán tomarse de los prospectos de cada uno de los equipos. La secuencia de operaciones es:

1) Toma de muestra para cultivo de exudado de fauces. 2) Repetir la toma utilizando uno de los hisopos provistos por el equipo. Si el equipo no incluyera hisopos deberá disponerse de un hisopo de dacrón pues libera mejor los antígenos al medio durante la extracción. 3) Extracción del antígeno (habitualmente por método enzimático). 4) Reacción de aglutinación o enzimoinmunoensayo. Si el resultado es positivo: informar Si el resultado es negativo: efectuar un cultivo convencional con el primer hisopo e informar de acuerdo a éste. NOTA: estos métodos resultan de utilidad cuando su sensibilidad es de alrededor del 90% y la comunicación médico-microbiólogo puede realizarse rápidamente h) PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS PARA ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLITICOS AISLADOS DE FAUCES Aún no ha sido detectada la resistencia a penicilina o cefalosporinas de tercera generación en S. pyogenes por lo que no se considera necesario efectuar rutinariamente ningún tipo de ensayo que involucre a estas drogas. De todos modos, los puntos de corte para establecer su sensibilidad o resistencia fueron contemplados por la NCCLS tanto para difusión como para dilución. Por el contrario, el conocimiento de la sensibilidad a eritromicina y clindamicina ya es necesario dado que en muchos países y algunas regiones de la Argentina los niveles de resistencia a macrólidos se han elevado en forma considerable. Por otra parte el uso de nuevos macrólidos ha sufrido también un aumento importante. Por ello, para el caso de exudados de fauces se recomienda efectuar una prueba de sensibilidad de difusión en agar Mueller Hinton con sangre ovina al 5% utilizando discos de clindamicina y eritromicina separados 20 mm. De este modo se podrá apreciar el achatamiento del halo de clindamicina (mecanismo MLS inducible) o no (mecanismo de eflujo) cuando la cepa es de sensibilidad intermedia o resistente a eritromicina y sensible a clindamicina. En el primer caso se deberá informar como clindamicina resistente y en el segundo como clindamicina sensible.

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2) BUSQUEDA DE ARCANOBACTERIUM HAEMOLYTICUM Esta bacteria es un agente reconocido de faringitis y se la aisla frecuentemente de exudados de fauces de adolescentes sintomáticos. Frecuentemente se acompaña de rash escarlatiniforme. Es sensible in vitro a la penicilina, pero este antibiótico suele fracasar en los tratamientos probablemente debido a la localización intracelular de estos microorganismos . Por ello el antibiótico de elección es la eritromicina u otro macrólido. Esta diferencia respecto de S. pyogenes aumenta el interés de su búsqueda en los exudados de fauces. Se trata de cocobacilos gram positivos que pueden aparecer arracimados, en V o con ramificaciones rudimentarias. Desarrollan producien-

do hemólisis en sangre humana pero no tan evidente en sangre ovina. Su crecimiento se produce entre las 24 y 72 horas por lo que se sugiere incubar las placas hasta 3 días a 35°C en atmósfera con 5-10% de CO2 . Su identificación se basa en las siguientes pautas: dan negativas las pruebas de catalasa, movilidad, gelatinasa, ureasa, xilosa, manitol y esculina; dan positivas las pruebas de fermentación de glucosa y maltosa y las pruebas de reducción de nitratos y fermentación de sacarosa son variables. La prueba de CAMP se realiza del mismo modo como se efectúa para Streptococcus agalatiae. A diferencia de esta bacteria, en lugar de reforzar la hemólisis producida por la cepa ATCC 25923 de S. aureus, la anula.

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OTITIS MEDIA AGUDA La otitis media aguda ( OMA ) se define como un proceso inflamatorio de la mucosa de revestimiento de las cavidades que constituyen el oído medio, caja del tímpano, celdas mastoideas y membrana timpánica. La patogenia de la OMA es compleja y multifactorial. Las bacterias responsables de la OMA colonizan primero el epitelio nasofaríngeo y llegan luego al oído medio a través de las trompas de Eustaquio por aspiración o inyección directa al soplar, estornudar o bostezar. La infección ocurre cuando el inóculo alcanzado es grande o cuando los mecanismos de defensa específicos e inespecíficos están alterados. Diagnóstico microbiológico 1 ) Toma de muestra La única muestra válida para el estudio microbiológico es la punción del contenido del oído medio por tímpanocentesis. En este procedimiento se realiza una punción aspiración, con aguja, de la membrana timpánica para obtener material retenido en el oído medio. Es realizado por un otorrinolaringólogo o pediatra entrenado. Las indicaciones de tímpanocentesis son: a- OMA con retención de exudado en niños seriamente enfermos o con signos y síntomas tóxicos. b- Respuesta insatisfactoria al tratamiento antibiótico y persistencia del exudado. c- Otitis media con exudado en pacientes con síndrome meníngeo. d- Otitis media con exudado con complicaciones supurativas intrapetrosas o endocraneales. e- Otitis media con exudado en menores de tres meses, en huéspedes inmunocomprometidos y en cualquier caso que se sospeche de un microorganismo causal inusual. Técnica de la tímpanocentesis: el procedimiento puede ser realizado sin anestesia general, con adecuada inmovilización del paciente, bajo visión con otomicroscopio binocular. El instrumental utilizado ( cánulas de aspiración, espéculos óticos , etc. ) debe ser estéril. 1- La piel del conducto auditivo externo presenta microorganismos saprófitos como S. aureus y P. aeruginosa, por tal motivo es indispensable la limpieza del mismo con alcohol al 70 % boricado

a saturación por más de un minuto (el alcohol crea un medio desfavorable para la proliferación bacteriana y el ácido bórico es bacteriostático para Pseudomonas). Se elimina el mismo mediante succión. 2- Punción timpánica con aguja Butterfly n° 19 a 23, sin alas, adosada a una jeringa de 5 cc. cargada con 1 cc. de solución fisiológica estéril. La punción de la membrana se realiza en el cuadrante posteroinferior ya que es la zona que presenta más declive y de esta manera se asegura el drenaje completo de la caja. 3- Aspiración de la efusión del oído medio. 4- Colocación del material en frascos de transporte adecuado para el cultivo. 5- Se envía inmediatamente al laboratorio de Microbiología. Posteriormente se indican los cuidados locales de todo tímpano que presenta perforación espontánea o provocada para evitar contaminación por gérmenes presentes en la piel del conducto. Esto consiste en a ) impedir la entrada de agua con tapón de algodón seco con una capa de vaselina sólida por fuera del mismo para impermeabilizarlo; b ) instilación de alcohol al 70 % boricado a saturación varias veces por día para limpieza de las cavidades del oído medio a través de la perforación y de la piel del conducto. 2 ) Medio de transporte El material puede ser enviado al laboratorio en la jeringa del procedimiento, en tubo seco o en frascos con atmósfera apropiada como el TAB (transporte anaeróbico) (Laboratorios Britania, Buenos Aires). Los dos primeros tienen el inconveniente de una mala preservación de los anaerobios, lo cual es importante en las OMA supuradas y en las OMC (otitis media crónica). El envío del material en la jeringa no cumple además con las normas de bioseguridad requeridas para el manipuleo de materiales biológicos. Por ésto, el medio de transporte ideal para este material es el frasco TAB. 3 ) Procesamiento Al material se le efectúa una coloración de Gram y se siembra en agar sangre , agar chocolate y caldo tioglicolato. Se incuba 48 hs. en atmósfera con un 5 % de CO2 (sistema de jarra y vela).

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En el caso de OMA supurada y OMC se debe agregar medios de cultivo para el aislamiento de anaerobios como placas de agar sangre con vitamina K y caldo sellado con parafina . En el caso de pacientes HIV ( + ) con OMC se deben agregar medios para el estudio micológico como un tubo de agar Sabouraud.

Si bien el tratamiento antibiótico previo inmediato o simultáneo disminuye la recuperación de los cultivos, el porcentaje de positividad en estos pacientes justifica su siembra. Pacientes con ATB. ______________________________ Positivos 71.7 % ______________________________ Negativos 28,3 %

Positividad de los cultivos: La recuperación de microorganismos a partir de muestras obtenidas por timpanocentesis varía según la población incluída ( con o sin antibiótico, distintas edades, tipo de otitis: aguda, aguda supurada o crónica, tipo de huésped ) pero en general se encuentran entre un 60 – 85 %. En el Hospital Garrahan en el año 1998 se estudiaron 539 punciones de OMA provenientes de 444 pacientes y se obtuvieron los siguientes resultados

Pacientes sin ATB. ______________________________ Positivos 87.6 % ______________________________ Negativos 12.4 % 4 ) Identificación bioquímica

Pacientes 444 ______________________________

Los principales agentes etiológicos de las OMA son S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, M. catarrhalis y estreptococos ß-hemolíticos del grupo A.

Positivos 342 77 % ______________________________ Negativos

102

23 %

Microorganismos aislados de OMA ( huésped normal )

Cultivos 539 ______________________________ Positivos 476 70 % ______________________________ Negativos

163

N° DE CEPAS

30 %

En caso de tratarse de una otitis bilateral se debe cultivar el material obtenido de ambos oídos, ya que sólo el 64 % tendrán el mismo microorganismo. Por ejemplo, en el año 1998 se estudiaron 195 pacientes con OMA bilateral. CULTIVOS ______________________________ Pacientes 195 ______________________________ Iguales 64,6% ______________________________ Positivo/Negativo 12,8% ______________________________ Positivo/Positivo+otro 15,9% ______________________________ Distinto 6,7% BRITANIA 9

%

______________________________ S. pneumoniae 141 35.4 ______________________________ H. influenzae 194 48.6 ______________________________ M. catarrhalis 25 6.3 ______________________________ S. aureus 24 6 ______________________________ S. ß hemolítico (grupos A , C y G ) 8 2 ______________________________ P. aeruginosa 5 1.2 ______________________________ Candida sp. 2 0.5 ______________________________ Totales 399 100

A ) Streptococcus pneumoniae Los neumococos son diplococos gram positivos que pueden presentar cápsula o estar desprovistos de ella. Su forma más característica es lanceolada aunque también pueden formar cadenas cortas o estar aislados. En medios líquidos, la mayor parte de las cepas capsuladas presentan un crecimiento difuso, mientras que las no capsuladas muestran un crecimiento granular En agar sangre crecen presentando α hemólisis. Las cápsulas se observan cuando las colonias son tratadas con el anticuerpo específico de tipo, el cual, al combinarse con el polisacárido capsular, lo vuelven refráctil (reacción de Quellung). Los neumococos son gérmenes exigentes que generalmente requieren un medio enriquecido y una atmósfera de 5 % de CO2 para crecer. Se han diferenciado más de 75 tipos serológicos de neumococos, por la existencia de polisacáridos inmunológicamente diferentes en sus cápsulas.

ta prueba controla la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en un tiempo y a una temperatura específica. Las sales biliares utilizadas son el desoxicolato de sodio o el taurocolato de sodio. Las sales biliares hacen descender la tensión superficial en la interfase medio-membrana, provocan una descomposición de la membrana celular y aceleran el proceso autolítico natural del neumococo activando las enzimas por combinación de las sales biliares con el neumococo. Método: Se prepara 1 ml de una suspensión densa en solución fisiológica de un cultivo puro. Se divide en dos partes iguales en tubos separados. A uno de ellos se le agregan 0,5 ml de una solución de desoxicolato de sodio al 10 % y al otro 0,5 ml de solución fisiológica. Se incuba hasta 3 hs y se observa cada 15 minutos. Interpretación: Positiva cuando se observa un aclaramiento del tubo con desoxicolato respecto al de solución fisiológica. Negativo, cuando no hay diferencia de turbidez entre ambos tubos.

Diagnóstico de laboratorio: B ) Haemophilus influenzae I – Prueba de la optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y otras especies de estreptococos α hemolíticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es una medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el clorhidrato de etilhidrocupreína, se utiliza en una dilución acuosa de 1 / 4000 para impregnar los discos, quedando en éstos 5 µg de la droga. Método: se toma una suspensión de colonias puras en caldo Mueller Hinton o tioglicolato y con un hisopo se estría una placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la estría se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmósfera de CO2 al 5 % ( jarra con vela ). durante 24 hs. a 35° C. Interpretación: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del disco. Se considera como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben resolverse por acumulación de pruebas a favor o en contra. II – Prueba de la solubilidad en bilis: Se utiliza esta prueba para diferenciar entre S. pneumoniae, soluble, en bilis y otras especies de estreptococos alfa hemolíticos, “ insolubles ” en bilis. Es-

Son bacilos pequeños gram negativos, inmóviles, no esporulados y pleomórficos, anaerobios facultativos que producen la energía ya sea por oxidación o por fermentación. Su crecimiento óptimo se obtiene incubando las placas en atmósfera de 5 % de CO2 a 35 – 37 ° C. Son bacterias fastidiosas y crecen solamente en medios enriquecidos (agar chocolate o agar chocolate suplementado) o con una fuente exógena de los nutrientes esenciales (satelitismo alrededor de una estría de S. aureus). Estos nutrientes esenciales son el factor V (NAD) y el factor X (hemina). Forman colonias pequeñas, translúcidas y ciertos biotipos presentan un olor característico por producción de indol a partir de triptofano. Estas bacterias pueden poseer cápsula (cepas serotipificables a, b, c, d, e, f) o no (cepas no serotipificables). Diagnóstico de laboratorio I – Requerimiento de los factores V y X: se basa en la necesidad de H. influenzae de requerir ambos factores para su crecimiento. Método: con ansa, se prepara una suspensión de las colonias aisladas en solución fisiológica. Se hisopa una placa de agar tripticasa soja y se colo-

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can tres discos. Uno impregnado en factor V, otro en factor X y el tercero con los dos factores . Se incuba a 35-37° C en atmósfera de CO2 Se observa crecimiento alrededor de los discos.

firinas. Eso indica que el microorganismo no requiere factor X. A las 24 hs. puede revelarse con reactivo de Kovacs ( rojo en fase acuosa = positivo presencia de porfirinas) . C ) Moraxella catarrhalis

Identificación de Haemophilus spp.. ESPECIE PRUEBA ________________________________________

DEPENDENCIA DE FACTORES

X V HEMÓLISIS LACTOSA MANOSA _____________________________________________________ H.influenzae H.haemolyticus H.parainfluenzae H.parahaemolyticus H.aphrophilus H.paraphrophilus H.segnis H.ducreyi

+ + +

+ + + + + + -

+ + -

+ + -

+ + + -

II ) Prueba de las porfirinas: el ácido delta amino levulínico es convertido enzimáticamente a porfirinas produciendo una fluorescencia roja. Mide la independencia del factor X. La reacción bioquímica es la siguiente: Porfobilinógeno sintetasa δ amino levulínico---------------porfobilinógeno uroporfirinógeno uroporfirinógeno sintetasa I decarboxilasa -------------------uroporfirinógeno------------------coproporfirinógeno oxidasa -coproporfirinógeno-----------protoporfirina IX ferroquelatasa ----------------------hemina Fe++ Método: se prepara una suspensión bien cargada en un buffer fosfato 0.1 M ( pH 6.9 ) que contenga 2 mM de ácido δ aminolevulínico y 0.8 mM de MgSO4 . Se incuba 4 horas a 37° C. El tubo se ilumina con luz ultravioleta observando una fluorescencia roja (presencia de porfobilinógeno). Interpretación: la fluorescencia roja indica una conversión del ácido δ-aminolevulínico a por-

Son diplococos gram negativos, oxidasa y catalasa positivas, inmóviles y no producen esporos . Son aeróbicos y su temperatura óptima de crecimiento es de 35 a 37 ° C , aunque crece también a menores temperaturas. (28° C). Crecen bien en agar sangre y en agar chocolate, como así también en medios líquidos. No producen oxidación de azúcares en medio CTA y dan positivas las pruebas de reducción de nitratos y DNAsa Diágnostico de laboratorio I ) Producción de ácido a partir de carbohidratos: determina la capacidad de producir ácido a partir de un hidrato de carbono específico incorporado a un medio base. Utilizando un indicador de pH puede determinarse si la bacteria ha degradado el hidrato de carbono en varios productos terminales observando un cambio de color. Los azúcares estudiados son glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa. Método: El medio base utilizado es el CTA. Se evalúa con una concentración del 1% del carbohidrato en el medio base. Se inoculan los tubos y se incuban a 37 ° C. Interpretación: Una reacción positiva es aquella en la cual se produce un cambio de color (amarillo). Una reacción negativa es aquella en la que el medio permanece rojo rosado . II ) Reducción de nitratos: determina la capacidad del microorganismo de reducir el nitrato en nitritos. Método: Se utiliza caldo nitrato que es caldo infusión cerebro corazón (BHI) al 2.5 % y NO3K al 0.1 %. A las 24 hs. de incubación a 37 ° C los caldos inoculados se revelan con 3 gotas del reactivo A (ácido sulfanílico (0.8 g), ácido acético glaciar (30 ml) y agua destilada (100 ml) y 3 gotas del reactivo B ( dimetil α naftilamina (0.5 g) , ácido acético glaciar ( 30 ml ) y agua destilada (100 ml). Interpretación: la aparición de un color rojo fuerte vinoso indica una prueba positiva. Si no hay desarrollo de color, es negativa.

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III ) Prueba de la DNAsa: determina la presencia de una enzima capaz de clivar el ADN incorporado al medio. Método: se utiliza el medio comercial. Se realiza una estría y se incuba 24 hs. a 37 ° C. Se revela con el agregado de ClH 1 N. Interpretación: es positiva cuando aparece un halo transparente alrededor del crecimiento bacteriano. En ausencia de halo se interpreta como negativa. Características diferenciales de Neisseria y Moraxella ___________________ D N G M S L _______________________________________ ESPECIE

Método: con un ansa recoger una colonia de un cultivo puro de 24 hs. y colocarla sobre un portaobjetos. Agregar una gota de H2O2 al 30 %. Observar la formación inmediata de burbujas. Interpretación: una prueba positiva corresponde a la formación de burbujas bien visibles (formación de O2 ) . II ) Prueba de la coagulasa: comprueba la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por acción de la coagulasa. coagulasa Plasma-------------------cóagulo de fibrina

FORMACIÓN DE ÁCIDO

N.gonorrhoeae + - N.meningitidis + + - N.lactamica + + + - N.cinerea - N.subflava + + v - N.sicca + + + - N.mucosa + + + - + M.catarrhalis + + ________________________________________

Método: incubar 0.5 ml de cultivo puro con igual volumen de plasma de conejo o humano. Observar a las 4 horas. Si al cabo de ese tiempo no hay coágulo visible, dejar incubando 24 horas. Interpretación: prueba positiva, se forman coágulos o filamentos de fibrina bien visibles. La coagulación puede ser completa o parcial. La prueba es negativa si no hay formación de coágulos y la suspensión se mantiene homogénea .

D= DNasa. N= NITRATOS. G= Glucosa. M= Maltosa. S= Sacarosa L= Lactosa

III ) Prueba de la DNAsa : Ver Moraxella catarrhalis . F ) Otros patógenos

D ) Estreptococo ß hemolítico grupo “A” Ver sección anterior: exudado de fauces E ) Staphylococcus aureus Son cocos gram positivos que se disponen en pares, tetradas o racimos. Son microorganismos inmóviles que no forman esporos. Son catalasa positivos y la mayor parte de las cepas fermentan el manitol, producen pigmento amarillo en medios con sangre, hemolisina y coagulasa. Diagnóstico de laboratorio I ) Prueba de la catalasa: determina la presencia de la enzima catalasa. Esta enzima descompone el peróxido de hidrógeno que se forma como producto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares.

Otros patógenos como Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae u hongos son excepcionales como causa de OMA, Sin embargo, en un estudio reciente Block y colaboradores recuperaron un 8 % de clamidias de 101 muestras de tímpanocentesis de pacientes con OMA utilizando técnicas de PCR y cultivo. Los agentes más controvertidos son los virus. Por lo general, se los acepta como agentes predisponentes de la infección bacteriana más que como agentes etiológicos. Las bacterias anaerobias se consideran que pueden ser flora de contaminación y no agentes causales de la OMA. En el Hospital Garrahan no se aislaron anaerobios de 371 muestras de OMA con tímpano conservado en 1996. Estas bacterias tienen importancia en las OMA supuradas y en OMC.

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5 ) Pruebas de sensibilidad a los antibióticos A ) Streptococcus pneumoniae Se determina la sensibilidad a la penicilina , cefotaxima (o ceftriaxona), eritromicina, co-trimoxazol y opcionalmente a vancomicina, aunque no estén descriptas cepas resistentes a este antibiótico. & Penicilina a ) por difusión: I- se utiliza un método de “screening” que emplea discos de oxacilina de 1 µg. Se hisopa una placa de agar Mueller Hinton suplementado con 5 % de sangre de carnero. Se coloca el disco de oxacilina y se incuba 24 horas en atmósfera con 5 % de CO2. Interpretación: Halos > ó = a 20 mm ⇒ sensible < ó = a 19 mm ⇒ resistente o intermedio II- E–test: sobre una placa de las mismas características que en el caso anterior, se coloca una tira reactiva que está impregnada de concentraciones crecientes de penicilina. Luego de la incubación se observa la zona de inhibición que tiene forma elíptica y se determina la CIM leyendo la línea en donde esa zona de inhibición intercepta la tira reactiva . b ) por dilución: se siguen las normas para micro o macrodilución. Las cepas sensibles tienen una CIM < ó = a 0.06 µg / ml, las intermedias entre 0.12 y 1 µg / ml y las resistentes > ó = a 2 µg / ml. & Cefotaxima. ceftriaxona y cefuroxima: se determina solamente por el método de dilución en las condiciones antes descriptas para penicilina. (ver normas de NCCLS ). Pueden emplearse también las tiras de E-test en las mismas placas utilizadas para penicilina. & Eritromicina, co-trimoxazol. cloranfenicol y vancomicina: su sensibilidad está normatizada para los métodos de difusión y de dilución en las condiciones antes descriptas para penicilina. La sensibilidad y resistencia a azitromicina y claritromicina pueden ser extrapoladas de los resultados observados con eritromicina.

B ) Haemophilus influenzae Se debe determinar la sensibilidad a ampicilina, ampicilina – sulbactam , cloranfenicol, co-trimoxazol, cefuroxima y cefaclor. No se han detectado aislamientos resistentes a cefotaxima, cefixima, ceftibuten, ceftriaxona , ciprofloxacina ni azitromicina. La sensibilidad a los distintos antimicrobianos puede determinarse por difusión o por dilución siguiendo las normas de la NCCLS. & Ampicilina: además del método de difusión se debe realizar una prueba rápida para detectar las ß lactamasas. Existen tres pruebas rápidas: La acidimétrica , la iodométrica y la cromogénica. Las dos primeras utilizan un indicador colorimétrico para detectar la presencia del ácido peniciloico producido como consecuencia de la hidrólisis de la penicilina por las ß lactamasas. El método acidimétrico usa como sustrato penicilina en un buffer citratado con rojo de fenol como indicador. Una disminución del pH debido a la presencia de ácido peniciloico da como resultado un cambio de color del rojo al amarillo. El sustrato en el método iodométrico es penicilina en un buffer fosfatado con el agregado de yodo y almidón. El ácido peniciloico reduce al yodo e impide que éste se una al almidón (reacción negativa , incolora). Si no se produce la hidrólisis de la penicilina el yodo y el almidón forman un complejo violáceo. (reacción positiva) . El tercer método usa nitrocefin que es una cefalosporina cromogénica que exhibe un rápido cambio de color del amarillo al rojo cuando el enlace amida del anillo beta lactámico es hidrolizado por una beta lactamasa. Método: añadir una gota de nitrocefin a un portaobjetos limpio. Utilizando un ansa estéril, tomar una colonia de la placa y emulsionarla en la gota de nitrocefin. El resultado es positivo si se produce el cambio de color a los 30 minutos (hay que proteger el portaobjetos de la desecación durante el período de espera). También se pueden usar discos comerciales. & Cloranfenicol: la resistencia a cloranfenicol puede ser mediada por una enzima, la cloranfenicol acetil transferasa. Para detectarla se hisopa media placa de agar chocolate con una suspensión de H. influenzae. Se hacen dos estrías, una sobre la media placa hisopada y otra sobre la media placa

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no hisopada, con una cepa patrón de S. aureus ATCC 25923. En la mitad de dichas estrías se coloca un disco de cloranfenicol. Se incuba a 37 ° C durante 24 horas y se miden los halos de inhibición del crecimiento de la cepa de S. aureus alrededor de los discos. Una disminución de dicha zona, en la mitad de la placa hisopada con el aislamiento de H. influenzae, indica destrucción enzimática del antibiótico. Una prueba similar puede servir para determinar por método microbiológico la presencia de ß lactamasa. Para ese fin se usa la misma cepa patrón de S. aureus y un disco de ampicilina C ) Moraxella catarrhalis Para determinar la sensibilidad a penicilina, ampicilina y amoxicilina es suficiente la realización de una prueba de detección de beta lactamasa, pero sólo es aceptable el método del nitocefin. M. catarrhalis es sensible a cefalosporinas, ampicilina / sulbactam, amoxicilina / clavulánico, imipenem y eritromicina. Se han detectado cepas resistentes a cotrimoxazol por lo que su sensibilidad deberá determinarse por pruebas de difusión con discos. Se usa agar Mueller Hinton y se incuba a 35 ° C siguiendo las normas del NCCLS . D ) Streptococcus pyogenes Ver sección de exudados de fauces

(CLDE) y anaerobios (placas con vitamina K y caldo anaerobio). En el caso de OMC se deberá agregar también medios para el aislamiento de hongos como agar Sabouraud. En un estudio realizado en el Hospital Garrahan en el año 1996, se cultivaron 67 materiales provenientes de oídos con otitis media crónica de huéspesdes normales. El 97 % de los mismos fueron positivos y un 41.5 % de ellos correspondieron a flora polimicrobiana. Los principales microorganismos fueron Pseudomonas aeruginosa (20.2 %), Proteus spp. (15 %), Staphylococcus aureus (8 %), anaerobios (24 %), otros bacilos gram negativos fermentadores y no fermentadores, Haemophilus influenzae (12 %), y en menor proporción S.pneumoniae y M.catarrhalis. Dentro de los anaerobios, en nuestra experiencia, los más frecuentes fueron las especies de Bacteroides del grupo “fragilis” y los cocos gram positivos (aproximadamente 30 % de cada uno). Les siguieron los bacilos gram negativos pigmentados (especialmente Porphyromonas spp. (13 %), Fusobacterium spp. (10 %), Veillonella spp. (9 %), Clostridium spp. (8 %), bacilos gram positivos no esporulados (7 %) y otros bacilos gram negativos (5 %). —————————— ________________________________________ ________________________________________

HUESPED NORMAL OMA

E ) Staphylococcus aureus La sensibilidad a los distintos antimicrobianos se determina por el método de difusión siguiendo las normas de NCCLS

OTITIS MEDIA AGUDA SUPURADA Y OTITIS MEDIA CRÓNICA Diagnóstico microbiológico Se debe cultivar el material obtenido por punción aspiración del mismo previa limpieza y desinfección del conducto auditivo externo con alcohol boricado al 70 %. El material se coloca en medio de transporte TAB. Además de los medios utilizados para el material proveniente de OMA, en el caso de OMA supurada se debe agregar medios para el aislamiento de bacilos gram negativos

OMA supurada

OMC

Material de tímpanocentesis ( punción ) TAB ________________________________________ OMA OMA OMC supurada ________________________________________ Gram + + + ________________________________________ Agar sangre + + + ________________________________________ Agar chocolate + + + ________________________________________ BHI + + + ________________________________________ CLDE + + ________________________________________ Vitamina K + + ________________________________________ Caldo anaerobio + + ________________________________________ Agar Sabouraud +

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Otitis externa

SINUSITIS AGUDA

Es la infección del conducto auditivo externo. Puede ser localizada, difusa, crónica o maligna. Los gérmenes colonizantes de la piel como Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Corynebacterium spp y en menor proporción, anaerobios como Propionibacterium acnes y bacilos gram negativos, principalmente Pseudomonas aeruginosa, en determinadas ocasiones de gran humedad y temperatura pueden invadir la piel y producir inflamación y / o supuración. Otitis externa localizada: se presenta como pústula o forúnculo asociada a folículo piloso. Los gérmenes responsables son Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. El tratamiento es local, drenaje y antibióticos sistémicos. Cultivo: sólo tiene valor el cultivo del material obtenido por punción del absceso. Otitis externa difusa: ocurre en ambientes húmedos y calurosos. La piel del conducto auditivo externo se edematiza e inflama. Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram negativos pueden tener un papel patógeno. El tratamiento consiste en una limpieza de la zona con alcohol boricado a 70%. Cultivo: no se cultivan Otitis externa crónica: es debida a irritación local producida por el material purulento proveniente del oído medio en una otitis crónica supurada. El tratamiento está dirigido a curar la otitis media. Cultivo: sólo se debe cultivar el material obtenido de oído medio por aspiración transtimpánica. Otitis externa maligna: es una infección del conducto auditivo externo que se disemina a partes blandas adyacentes, vasos sanguíneos y hueso. Pseudomonas aeruginosa es el patógeno responsable. El tratamiento consiste en limpieza del tejido , instilación de gotas con esteroides y antibióticos antipseudomonas locales y sistémicos. Cultivo: se debe cultivar la secreción y realizar hemocultivos .

La sinusitis es una afección frecuente que complica el 5 % al 10 % de las infecciones del tracto respiratorio superior , y a la cual ningún grupo de edad es inmune. Resuelve espontáneamente en más del 40 % de los casos. El revestimiento mucoso de los senos paranasales es similar al de la nariz, con el cual se continúa. El epitelio es de tipo cilíndrico con células caliciformes , y tiene una cubierta de moco , que es barrido por las cilias hacia el ostium de cada seno paranasal, y luego a la nasofaringe .La disquinesia ciliar, el edema de la mucosa y las alteraciones en la calidad y cantidad de las secreciones son las causas fundamentales de la alteración de la función normal de los senos paranasales. La infección viral y la inflamación alérgica de la mucosa son las causas más frecuentes de la obstrucción fisiológica del ostium. La presión negativa intrasinusal que sucede a la obstrucción del ostium permite la invasión bacteriana. En adultos y adolescentes, los síntomas de sinusitis incluyen obstrucción nasal, rinorrea, dolor facial, cefalea y fiebre. En los niños pequeños los síntomas son menos específicos y se superponen con los del resfrío común. En los pacientes con infección de las vías aéreas superiores debe sospecharse sinusitis cuando los síntomas perduran por más de 10 días. Diagnóstico clínico El exámen otorrinolaringológico incluye la rinoscopía anterior y la nasofibroscopía, que permite visualizar el origen de la rinorrea y descartar cuerpos extraños, alteraciones anatómicas endonasales y presencia de masas tumorales. El método convencional para el diagnóstico de sinusitis utiliza radiografías planas de los senos paranasales, en planos anteroposterior, lateral, submento - vértice y de Water. La presencia de nivel hidroaéreo o la opacificación total de un seno se correlaciona con identificación de bacterias en el 64 % al 70 %. El engrosamiento de la mucosa debe correlacionarse con la clínica para diferenciar sinusitis aguda de crónica. La tomografía computada se indica en aquellos casos que presentan complicaciones, cuando se sospecha patología tumoral o infecciones específicas y en los pacientes en los cuales se contem-

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pla la posibilidad de cirugía. Los hallazgos radiológicos y tomográficos deben ser siempre correlacionados con la clínica antes de tomar decisiones. Diagnóstico microbiológico Las características bacteriológicas de las sinusitis agudas en niños son similares a las descriptas en adultos. Los patógenos de los senos paranasales son similares en tipo y frecuencia a los hallados en otitis media aguda. La mayoría de las infecciones son causadas por Strptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae y en menor número por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Moraxella catarrhalis. Son escasos los trabajos que muestran la frecuencia de los distintos agentes etiológicos de la sinusitis aguda. Yousimies-Somer y cols. en 1988, describieron 339 aislamientos bacteriológicos de senos paranasales obtenidos por punción. Los patógenos más frecuentes entre los aerobios son los enunciados más arriba. Entre los anaerobios (2 % del total), los más frecuentemente aislados fueron Propionibacterium acnes (de dudoso significado clínico), Peptostreptococcus spp. y Prevotella spp. El aislamiento de virus es bajo y no está claro si la infección viral precede a la bacteriana o si es una invasión simultánea de ambos organismos. Entre los virus los más frecuentes están Rhinovirus, Influenza, Parainfluenza y Adenovirus . El rol de Chlamydia pneumoniae como agente etiológico de sinusitis aguda no está bien documentado aunque se ha aislado de pacientes con esta patología. En el caso de sinusitis intrahospitalarias, por ejemplo las sinusitis asociadas a respirador, tienen importancia los bacilos gram negativos y anaerobios. En pacientes inmunosuprimidos se debe investigar la presencia de hongos.

Toma de muestra El estudio microbiológico debe ser realizado con material obtenido por punción aspiración del contenido del seno. Los cultivos obtenidos de las fosas nasales y nasofaringe no poseen valor predictivo en las sinusitis. En los casos que se sospeche micosis debe obtenerse, ya sea por vía endoscópica o a cielo abierto, muestra de la mucosa del seno para su estudio. Punción antral: indicaciones y técnica En los niños es extremadamente rara la necesidad de indicación de punción de los senos paranasales. Al no haberse completado el desarrollo, los ostium de drenaje no son tan estrechos como en el adulto y evolucionan favorablemente con el tratamiento aún en los casos que presentan complicaciones. Por este motivo se indica punción en adultos y niños sólo cuando no hay respuesta al tratamiento médico. El seno afectado con mayor frecuencia es el maxilar en el adulto y el etmoidal en el niño. La punción del seno maxilar se realiza con aguja gruesa o trocar “ad hoc” ya en el meato inferior de la fosa nasal, donde la pared interna del seno es más delgada o en la pared anterior del mismo, por arriba de la arcada dentaria. En las punciones de senos etmoidales y senos frontales se utiliza la vía externa, previa incisión de piel. También pueden obtenerse muestras para el estudio bacteriológico por vía endoscópica siempre y cuando pueda asegurarse la obtención del material del interior del seno involucrado, habiendo sorteado el ostium. Medio de transporte y procesamiento El material obtenido es colocado en frascos TAB y remitido al laboratorio. La siembra y el procesamiento es igual que el proveniente de oído medio.

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INFECCIONES RESPIRAT ORIAS BAJAS NEUMONIA EXTRAHOSPITALARIA Es la sexta causa mas común de muerte en USA y la causa mas frecuente de mortalidad relacionada con infección. El desarrollo de infección pulmonar aguda indica un defecto en las defensas del huésped, ingreso de gérmenes particularmente virulentos o inóculos elevados. Los agentes infecciosos acceden al tracto respiratorio inferior a través de la aspiración de la flora residente de vías aéreas superiores (S.pneumoniae, H.influenzae, M.catarrhalis, S.aureus, anaerobios, bacilos gram negativos y S.pyogenes), inhalación de micropartículas (M. tuberculosis, H.capsulatum, P.brasiliensis, C.immitis, C.neoformans, Aspergillus spp, Brucella spp, L.pneumophila, C.psittaci, B.anthracis); con menor frecuencia puede producirse una siembra hematógena a partir de un foco a distancia (Candida spp, S. aureus) o por contiguidad (ej: absceso subdiafragmático). Los factores que interfieren con las defensas normales del huésped son alteración de la conciencia, humo de cigarrillo, hipoxemia, acidosis, alcoholismo, inhalaciones tóxicas, edema de pulmón, desnutrición, infecciones virales previas, uremia, obstrucción mecánica, utilización de agentes inmunosupresores (corticoides y drogas citotóxicas), edad avanzada. También puede asociarse con enfermedades de base como diabetes, fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad cardíaca congestiva y enfermedades inmunosupresoras como el SIDA. Estos datos son fundamentales para orientar al laboratorio de microbiología hacia la búsqueda de determinados agentes, por ejemplo: Fibrosis quística: P. aeruginosa, S. aureus, H. influenzae y en menor medida B. cepacia y otros bacilos gram negativos. Infecciones virales previas: S.aureus Contacto con aves: C. psittaci. Viajes a áreas endémicas: C. immitis, P. brasiliensis, L. pneumophila, F. tularensis.

Riesgo ocupacional y/o contacto con animales: C. burnetti, B. anthracis, Brucella spp, Y. pestis. Antecedente de macroaspiración: anaerobios Epidemias de influenza: Influenza, S.pneumoniae, S.aureus, S.pyogenes, H.influenzae. Condiciones socioeconómicas pobres: M. tuberculosis. Alcoholismo: S. pneumoniae, anaerobios, bacilos Gram negativos. Pacientes infectados con HIV: P. carinii, M. tuberculosis, S. pneumoniae, H. influenzae. EPOC/fumadores: S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, Legionella spp. Exposición a murciélagos o materia fecal de los mismos: H. capsulatum. Exposición a conejos: F. tularensis. También resulta crítico conocer si la neumonía es de adquisición intrahospitalaria o ambulatoria, como así también si el huésped es inmunocompetente o no. PRESENTACION CLINICA. CLASIFICACION Si bien sirve como orientación tiene ciertas limitaciones y no se puede aplicar en los extremos de la vida ni a pacientes inmunocomprometidos A) Aguda: I) Típica: S.pneumoniae, H.influenzae, M.catarrhalis, bacilos gram negativos, S. aureus, S. pyogenes. II) Atípica: IIa) Sin eosinofilia: viral, M.pneumoniae, C.burnetti, Legionella spp, Chlamydia spp IIb) Con eosinofilia: parasitaria: Ascaris lumbricoides, Strongyloides stercoralis, Toxoplasma gondii, Paragonimus westermani; drogas; idiopática. B) Crónica: M. tuberculosis y otras micobacterias, Nocardia spp, P. pseudomallei, anaerobios, Actinomyces spp, H. capsulatum, P. brasiliensis, C. immitis, B. dermatitidis, Sporothrix schenckii, C. neoformans, E. hystolítica, parásitos y causas no infecciosas (neoplasias, sarcoidosis, vasculitis, granulomatosis linfomatoidea, sustancias químicas, radiación, neumoconiosis, neumonitis por hipersensibilidad, etc.).

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ETIOLOGÍA En general la incidencia de S. pneumoniae se encuentra en el rango del 15-47%, H. influenzae 6-10%, S. aureus 3-22%, M. catarrhalis 5-6%, P. aeruginosa 3-5%, otros bacilos gram negativos 4-25%, M. pneumoniae 1/256, antígeno urinario positivo o coloración fluorescente para L. pneumophila. Factores asociados al bajo diagnóstico microbiológico en neumonías extrahospitalarias - Antibióticos previos. - Muestras de esputo no representativas (>50%). - Bajo rendimiento del hemocultivo (20-30% en neumonías del adulto por S. pneumoniae y 12-15% en pediatría). - Valor nulo del esputo para aislamiento de anaerobios en la neumonía aspirativa. - Detección de antígenos capsulares es inespecífica en muestras de esputo de pacientes con

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EPOC, bronquitis crónica altamente colonizados. - Baja sensibilidad de coloraciones fluorescentes en esputo para Legionella spp. - Muestras invasivas exponen al paciente a riesgos adicionales y no estan disponibles en todos los hospitales. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL Utilidad del cultivo de esputo y del lavado bronquial - Neumonía extrahospitalaria. - Adultos o niños mayores que pueden expectorar. - Pacientes sin tratamiento antibiótico previo - Pacientes con fibrosis quística. - Pacientes con exacerbaciones agudas de la bronquitis crónica. - Búsqueda de M. tuberculosis, Legionella spp, H. capsulatum, C. immitis, P. brasiliensis, C. pneumoniae (patógenos indudables). - Aislamiento de S. pneumoniae, M. catarrhalis, H. influenzae, S. aureus, S. pyogenes, bacilos gram negativos, M. pneumoniae deben ser analizados en el contexto de los datos clínicos, radiología, exámen citológico y predominio de flora. Rendimiento del cultivo de esputo Aproximadamente 60-70% en personas con neumonía y sin tratamiento antibiótico previo y 30-40% en personas con tratamiento antibiótico previo.

- Coloración de Gram: recuento de neutrófilos, células epiteliales escamosas, predominio de bacterias indicativo de: diplococos gram positivos lanceolados: S. pneumoniae. cocobacilos gram negativos pleomórficos: H. influenzae. diplococos gram negativos: M. catarrhalis. - Coloración de Ziehl Neelsen o de Kinyoun: visualización de bacilos ácido alcoholresistentes o ácidoresistentes. (micobacterias, Nocardia spp) - Coloración de Giemsa: celularidad, elementos micóticos. - Azul de o-toluidina, metenamina plata, Gram Weigert, coloración fluorescente con anticuerpos monoclonales: P. carinii. Cultivo a) Cultivo para gérmenes comunes - Sembrar en 4 estrías en agar sangre y agar chocolate (5-10% de CO2), McConkey o CLDE (aerobiosis) b) En pacientes fibroquísticos adicionar manitol salado (aumenta la recuperación de S. aureus) y OFB (medio selectivo con polimixina B para B. cepacia). c) Ante sospecha clínica o epidemiológica y en pacientes inmunocomprometidos Mycobacterium spp: Lowestein Jensen y Stonebrink (previa homogeneización) Hongos: Agar Sabouraud con antibióticos y agar cerebro corazón con antibióticos. Interpretación del esputo y lavado bronquial

Procesamiento del esputo Exámen directo Debe procesarse dentro de los 30’-2 horas de recogido o conservarse a 4ºC para evitar el sobrecrecimiento de la flora acompañante. Es conveniente seleccionar las porciones purulentas, evitando tocar las partes salivosas, Para facilitar ésto puede volcarse la muestra en una placa de Petri vacía. Exámen directo

- Muestra representativa: 25 leucocitos (10x), germen predominante. Este criterio de restricción no es válido para M. tuberculosis ni para hongos de micosis sistémicas. - Muestras no representativas: >10 células escamosas y/o 10 >10

5

5

Tabla 3 CRITERIOS DE INFORME PARA EL ESPUTO. Coloración de Gram CEECs (10x)

PMN (10x)

Germen Predominante (1000x)

>10 10

>25 >25 >25

X

>10 10 neutrófilos/1000x) con /sin bacterias en el examen directo A) Unico microorganismo: tipificación y antibiograma B) Dos o tres microorganismos: tipificación y antibiograma de cada uno, informe del recuento individual y del Indice Bacteriano. 2) Recuentos "Borderline" (103 y 102 ufc/ml respectivamente) A) Con respuesta inflamatoria: tipificación y antibiograma del o los microorganismos. B) Sin respuesta inflamatoria: probable contaminación (quedan excluídos de esta consideración los pacientes neutropénicos) Evaluar factores que afectan los recuentos bacterianos, especialmente el tratamiento antibiótico instaurado dentro de las 24 horas de realizada la fibrobroncoscopía. Sugerir nueva muestra dentro de las 48 horas.

LAVADO BRONQUIAL Tiene las mismas limitaciones que el cultivo de secreciones traqueales para gérmenes comunes, por lo tanto su principal utilidad en pacientes intubados reside en la búsqueda de micobacterias, micosis sistémicas, Nocardia spp y Rhodococcus equi. BIOPSIA TRANSBRONQUIAL Se obtiene con forceps que se pasan a través del canal de trabajo del broncoscopio y se toma muestra de alveólo y/o de tejido peribronquial. Es importante para la realización de técnicas histopatológicas en el diagnóstico de neoplasias, sarcoidosis. Tambien en pacientes con SIDA para el diagnóstico de P. carinii y tuberculosis. Permite observar invasión de tejidos por hongos y herpes virus. Debido al problema potencial de contaminación con secreciones respiratorias superiores, la especificidad para el cultivo de gérmenes comunes puede ser baja, como así tambien la sensibilidad debido al pequeño tamaño de la muestra. El procesamiento se discutirá junto con el de biopsia de pulmón a cielo abierto.

3) Recuentos bajos (102 y 103 UFC/ml)

CATETER PARA DUODENOGRAFIAS

NO

100-150

CLINICA

SI (>104 UFC/ml)

BAL-Cath

SI

25-100

CEP-BAL

SI (>104 UFC/ml)

SWANZ-GANZ

NO

150

H

NO

CATETERES DE SUCCION

NO

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CLINICA

SI

H/PMC Diagnóstico histológico post morten.

MUESTRAS ADICIONALES BIOPSIA DE PULMÓN A CIELO ABIERTO Si bien se considera el "gold standard", cuando esta muestra es demasiado pequeña puede tener falsos negativos en aproximadamente un 25% de los casos si se compara con el pulmón entero. Proporciona un diagnóstico definitivo y

exacto, pese a esto raramente se indica en el manejo de pacientes ventilados puesto que ha sido relegado a un segundo lugar por las técnicas broncoscópicas; se la utiliza para aquéllos pacientes que no evolucionan de acuerdo a lo esperado y/o en los que no se ha podido llegar al diagnóstico por métodos menos invasivos. Los resultados de este procedimiento han sido superiores a los de la biopsia transbronquial y a los de

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la punción pulmonar percutánea, debido a que en general se puede tomar una muestra de tamaño suficiente y bajo visualización directa. El procesamiento microbiológico de rutina, previa homogeneización con mortero o Stomacher, debería contemplar la mayor cantidad de posibilidades (gérmenes comunes, anaerobios,

micobacterias, nocardia, Legionella, hongos y P.carinii) y también debería remitirse una porción de la muestra para estudios histopatológicos. En pacientes sin tratamiento antibiótico se deben jerarquizar recuentos superiores a 104 ufc/g de tejido.

Tabla 10 Procesamiento rutinario de biopsias de pulmón CULTIVO • CULTIVO CUANTITATIVO EN AGAR SANGRE Y

EXAMEN DIRECTO • EXAMEN EN FRESCO COLORACIONES DE: • GRAM • GIEMSA • ZIEHL NEELSEN • KINYOUN • COLORACION FLUORESCENTE CON ANTICUERPOS POLICLONALES PARA LEGIONELLA • AZUL DE O-TOLUIDINA

AGAR CHOCOLATE EN 5-10% DE CO2 • CLDE EN AEROBIOSIS • AGAR BHI SUPLEMENTADO CON VITAMINA K, HEMINA Y SANGRE LACADA, EN ANAEROBIOSIS • LOWENSTEIN- JENSEN Y STONEBRINK Y/O SIEMBRA EN FRASCOS DE BACTEC O BACTALERT PARA MICOBACTERIAS • AGAR SABOURAUD Y AGAR BHI CON ANTIBIOTICOS

HEMOCULTIVOS Aproximadamente un 10% de los pacientes con neumonía asociada a respirador tienen hemocultivos positivos relacionados a este foco. En este grupo de riesgo la especificidad de esta muestra es baja, puesto que 60-70% de los hemocultivos positivos se producen a partir de un foco distinto al pulmonar. De todas formas es una muestra complementaria importante, sobre todo cuando se analiza en conjunto con el cultivo cuantitativo de BAL o CEP y puede ayudar a clarificar la interpretación de recuentos "borderline" en estas muestras. Tambien es necesario analizar en paralelo el cultivo de otros potenciales focos como ser urocultivo, catéteres, punción de heridas quirúrgicas, de senos paranasales , muestras intraabdominales, etc. Situaciones especiales Legionella spp Se aisló en 2-6% de los casos de neumonía de la comunidad en USA. La población en riesgo,

está constituído por personas expuestas a fuentes contaminadas, gerontes, fumadores, y huespedes comprometidos en la inmunidad celular (transplantados). Se han identificado 15 serogrupos de L. pneumophila y 33 especies adicionales. El serogrupo 1 es responsable de cerca del 80% de las infecciones causadas por L. pneumophila. El resto de los casos corresponde a los serogrupos 4 y 6. Otras especies como L. micdadei, L. longbeache, L. durmoffii y L. bozemanii producen menos del 20% de los casos. Las indicaciones para su búsqueda son enfermedades severas que requieren internación en UCI, evidencias de adquisición en áreas endémicas o epidémicas, falta de respuesta al tratamiento con beta lactámicos, neumonía en inmunocomprometidos y sospecha clínica en base a fiebre alta, hiponatremia, manifestaciones a nivel de SNC, niveles de LDH mayores a 700 U/ml y enfermedad severa. Las muestras que presentan mejor rendimiento para su aislamiento son el BAL y la biopsia de pulmón, aunque también se ha recuperado de esputo, líquido pleural, secreciones traqueales, la-

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vado bronquial, hemocultivo y otros materiales. Para el diagnóstico se puede recurrir a coloraciones fluorescentes con anticuerpos monoclonales, cultivos en medios selectivos suplementados con carbón, extracto de levadura y alfa ceto-

glutarato (BCYE), detección de antígeno urinario para L. pneumophila serotipo 1 por RIA o ELISA, serología por inmunofluorescencia indirecta y PCR. (Tabla 11)

Tabla 11 Sensibilidad y especificidad para las distintas metodologías de diagnóstico para Legionella spp. Metodo Cultivo

Muestra

Sensibilidad

Especificidad

Esputo, BAL

75-90

100

Biopsia de pulmón

90-99

100

Hemocultivo

10-30

100

Serología (IFI)

Suero

75

Coloración fluorescente con anticuerpos monoclonales

Esputo, BAL Biopsia de pulmón

Antígeno urinario

PCR

Tiempo

Observaciones

2-7 días

SF utilizada en el BAL puede inhibir el desarrollo.

95-99

6-9 semanas

Se requiere suero agudo y convalesciente.

25-75

95-99

1 día

Detecta serogrupo1. No es sensible para otras especies. Reacciones cruzadas con B.pertussis.

Orina

80-90

99

1 día

Específica para serogrupo 1 Puede ser positivo, meses despues del tratamiento.

Esputo, BAL, Hisopados nasofaríngeos

>90

>90

2 días

No disponible comercialmente.

Mycoplasma spp y Chlamydia spp En un estudio sobre neumonía de la comunidad realizado en el Hospital de Clínicas de Bs. As. se documentó durante el año 1997, una incidencia de M. pneumoniae del 8% y C. pneumoniae de 6.8%. El diagnóstico de estos agentes se basa principalmente en demostrar la seroconversión. Ambos microorganismos pueden ser cultivados de muestras respiratorias como esputo, hisopado o aspirados nasofaríngeos, BAL, etc, pero

esto es dificultoso y escapa a las posibilidades de la mayoría de los laboratorios clínicos. El diagnóstico utilizando PCR constituirá en el futuro una importante herramienta. C. pneumoniae es un importante agente etiológico de neumonía en la población general y en pacientes inmunocomprometidos, C. psittaci produce neumonía en pacientes que tuvieron contacto con aves y C. trachomatis en recién nacidos que adquieren el microorganismo de madres con infección genital.

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Tabla 12 Diagnóstico de laboratorio de M.pneumoniae. Comparación de técnicas Método

Muestra

Sensibilidad

Especificidad

Tiempo

Observación

Cultivo

Esputo, BAL

>90

50-90

7-10 días

Serología F.de C*

Suero

75-80

80-90

4-9 semanas

Se requiere suero agudo y convalesciente. Si solo se dispone del último considerar: >1/64

33-75

1/16 o IgG>1/512

F de C*

Suero

30-40

85

2 días

Rhodococcus equi Este microorganismo inicialmente fue aislado de caballos, pero recientemente empezó a adquirir relevancia en huéspedes inmunocomprometidos, principalmente en pacientes infectados con

Observaciones

Reacciones cruzadas con C.psittaci y C.trachomatis

No disponible comercialmente

el virus del HIV, enfermedades malignas y tratamiento inmunosupresor. El cuadro clínico incluye fiebre, tos y neumonía necrotizante, frecuentemente acompañada de bacteriemia . Debe realizarse el diagnóstico diferencial con M. tuberculosis, Nocardia spp y hongos.

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Se han realizado aislamientos de muestras como esputo, lavado bronquial, líquido pleural, biopsia de pulmón, hemocultivos, abscesos cerebrales, pelvianos, subcutáneos, paraespinales, muestras óseas, senos paranasales, LCR, etc. Se presenta como cocobacilos gram positivos y puede observarse en los cultivos frescos una débil ácido resistencia con la coloración de Kinyoun. Esta propiedad se pierde con el envejecimiento de los mismos. Si bien las colonias presentan característicamente un pigmento rosa salmón, algunos aislamientos pueden ser de color crema o amarillentos. Debe realizarse la diferenciación bioquímica con los géneros Gordona, Tsukamurella y otros difteroides; para ello se recurre a la hidrólisis de la caseína, hipoxantina, tirosina, xantina, gelatina, urea y a la reducción del nitrato a nitrito. Nocardia spp Las infecciones por este germen son generalmente oportunistas y ocurren en pacientes con condiciones predisponentes como neoplasias, desórdenes pulmonares crónicos y en personas bajo tratamiento inmunosupresor. Otros grupos de riesgo son los pacientes con disgamaglobulinemia, enfermedad granulomatosa crónica, transplante renal y cardíaco. El sitio primario de infección suele ser el pulmón y de allí puede producirse la diseminación a otros focos. Las especies más frecuentemente aisladas en el ser humano son N. asteroides, N. brasiliensis y N. otitidis caviarum. Las mejores muestras para su aislamiento son el BAL, lavado bronquial, biopsia de pulmón. Es rara su recuperación a partir de muestras de esputo. En el exámen directo, la coloración de Kinyoun permite poner en evidencia a los bacilos o cocobacilos ácido resistentes. Los medios con carbón y extracto de levadura son útiles para su aislamiento, aunque tambien puede recuperarse de Lowenstein Jensen y agar Sabouraud Micobacterias Para su detección, el esputo sigue siendo la muestra de primera elección, pero en pacientes que no expectoran puede recurrirse al lavado

gástrico, esputo inducido o bien a muestras tomadas por fibrobroncoscopía (BAL, lavado bronquial o biopsia transbronquial). Se recomienda tomar tres muestras sucesivas de esputo , preferentemente las primeras de la mañana, dada la liberación intermitente del bacilo. Algunos autores documentan una mejor sensibilidad con el lavado bronquial que con BAL, pero estas muestras pueden ser complementarias. También puede obtenerse esputo post broncoscopía. Para el exámen directo puede recurrirse a la coloración de Ziehl Neelsen o a la de auraminarodamina, con sensibilidad y especificad comparables. En el caso del cultivo puede recurrirse a técnicas de precipitación o de centrifugación, utilizando agentes decontaminantes como el NaOH al 4% o N- acetilcisteína con NaOH al 2%, luego se siembra en Lowenstein Jensen y medio de Stonebrink y/o en medios 7H9, 7H10, 7H11. El tiempo de aislamiento se encuentra entre 4-8 semanas. Los métodos de cultivo radiométricos (BACTEC) permiten disminuir el tiempo de detección en forma considerable . En la actualidad se encuentran en evaluación medios no radiopmétricos tanto para el sistema BACTEC como para el Bact-Alert. Estas técnicas pueden combinarse con sondas de DNA. Otras metodologías empleadas son PCR y ELISA. Las micobacterias atípicas producen enfermedad en pacientes inmunocomprometidos, y también en menor proporción en personas inmunocompetentes. Para jerarquizar su aislamiento se debe considerar evidencia clínica, radiológica e histopatológica; aislamiento repetido con alto número de colonias o de muestras "estériles" y ausencia de otras causas de enfermedad. Anaerobios Se los aisla en 85-95% de los abscesos de pulmón, 62-100% de las neumonías aspirativas, y en 22-33% de las neumonías de la comunidad. En los pacientes con asistencia respiratoria mecánica que desarrollan neumonía se recuperan con poca frecuencia, menos del 10%. Las muestras válidas para cultivo son la pun-

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ción transtraqueal, punción pulmonar percutánea, biopsia de pulmón a cielo abierto, cepillo protegido (punto de corte de >103 ufc/ml) y BAL protegido (punto de corte de > 104 ufc/ml). Los especímenes deben ser sembrados en agar sangre lacada suplementada con vitamina K y hemina, con y sin antibióticos (aminoglucósidos) y caldo cerebro corazón suplementado , Los medios sólidos se incuban por 48 horas como mínimo y los caldos por 7 días, ambos en atmósfera de anaerobiosis. P. carinii Las mejores muestras para su detección son el BAL y la biopsia transbronquial, (sensibilidad >90%)aunque la sensibilidad del esputo induci-

do con solución hipertónica se encuentra en el rango de 50-90%. En los pacientes que reciben pentamidina aerolizada como profilaxis, la sensibilidad del BAL y del esputo inducido se ve afectada, debiendo realizarse múltiples lavados que incluyan a los lóbulos medios y superiores o recurrir a la biopsia transbronquial. El diagnóstico se realiza a través de coloraciones dirigidas a la pared del quiste como azul de o-toluidina y metenamina plata o bien aquéllas dirigidas contra trofozoítos o esporozoítos intraquísticos como las de Giemsa y Diff Quik. También puede realizarse inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales. Recientemente se ha aplicado la metodología de PCR con excelentes resultados.

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