B BENEMÉRI ITA UNIVERSIDAD AU UTÓNOMA A DE PUEBLA FA ACULTAD DE CIENCIIAS QUÍMIC CAS F LICENCIATURA: FARMACIA

ÁREA ESPECÍFICA E A DE:

ANÁLISIS A C CLÍNICOS

NOMBRE DE LA ASIGNATUR RA:

MANUAL M DE E LABORAT TORIO DE BIOLOGÍA A

CÓDIGO O:

BIO B 104 L

FECHA DE D ELABO ORACIÓN:

SEPTIEMBR S RE 2006

NIVEL EN EL MAPA A CURRICULAR:

BÁSICO B

TIPO DE E ASIGNAT TURA:

DISCIPLINA D ARIA

SORES QUE PARTICIPARON EN N SU ELAB BORACIÓN: PROFES

HORAS PRÁCTICA A. 2

1

PRÁCTICA 1. FUNDAMENTO FÍSICO, MANEJO Y CUIDADOS DEL MICROSCOPIO. APLICACIONES DEL MICROSCOPIO INTRODUCCIÓN.El microscopio es el aparato más importante e indispensable en un laboratorio de Biología, su función es permitir observar la imagen considerablemente aumentada de un objeto u organismo que a simple vista pasa desapercibido. La palabra microscopio proviene de dos raíces griegas: Micros ; que quiere decir pequeño y scopein ; que significa observar. En la actualidad existe toda una ciencia dedicada a estudiar las características de estos aparatos que cada vez son mas precisos y espectaculares, nos referimos a la creación de la microscopía; ésta es cada día mas importante, ya que el conocer las características de un microscopio nos permite sacar el mayor provecho de él, dándole una mayor aplicación. Existen dos tipos básicos de microscopio: el simple y el compuesto. El microscopio simple está formado tan solo por una lente convergente a la que también se le llama "lupa", la cual nos proporciona una imagen virtual y aumentada. El microscopio compuesto esta constituido por dos sistemas de lentes: 1.- El sistema que está constituido por los objetivos, que son las lentes quedan más cerca del objeto de observación. 2.- El sistema constituido por los oculares, que son las lentes que quedan más cerca del observador. Cada sistema proporciona un aumento independiente y el producto de estos aumentos parciales dados por oculares y objetivos, determina el aumento total del microscopio. Para manejar con mayor eficiencia un microscopio, es necesario conocer cómo está constituido. Las partes que lo constituyen se agrupan en tres sistemas: mecánico, óptico, y de iluminación. A) El sistema mecánico está formado por: una base, la columna, el tubo del microscopio, la platina, los tornillos para el enfoque y el revolver. B) El sistema óptico está representado por las lentes oculares y las lentes objetivos. C) El sistema de iluminación está representado por la fuente de luz (foco), el condensador y el diafragma. Debemos recordar que el objetivo y el ocular del microscopio funcionan como lentes convergentes biconvexas, por lo que la imagen final que nos proporciona el microscopio compuesto es virtual, aumentada e invertida. Toda imagen proporcionada por el sistema óptico de un microscopio, debe reunir tres características: poseer un buen poder de resolución, de penetración y de definición. El poder de resolución (P.R.): es la característica del microscopio que permite ver con claridad las estructuras finas y muy cercanas entre si; podemos ver que este poder de resolución es directamente proporcional a la longitud de onda media de la luz blanca -6 (550 nm) (1 nm= 10 mm ) e inversamente proporcional a la apertura numérica (A.N.) del objetivo. Esto es: P.R. = O.61 A.N. Donde P.R.: es la distancia mínima entre dos puntos de la muestra que permite verlos separados; 0.61 es una constante que representa la diferencia mínima en contraste que es detectable; es la longitud de onda de la luz empleada y A.N: la apertura numérica de la lente del objetivo.

2

Si las estructuras que se desean precisar, están colocadas a una distancia menor una de otra, necesitaremos un objetivo de mayor apertura numérica. La apertura numérica (A.N.): es una medida del ángulo máximo con que los rayos provenientes del objeto inciden en la lente del objetivo del microscopio y de ahí son llevados al ojo del observador. Ahora bien, hay dos factores que determinan la apertura numérica: el ángulo que forman los rayos que penetran por el objetivo y el índice de refracción del medio que exista entre el objeto a observar y el objetivo, dicho de una manera matemática, la apertura numérica es el producto del seno del semi ángulo de abertura (que mide la capacidad de la lente para concentrar la luz) por el índice de refracción del medio que existe entre el objetivo y el objeto a observar. Todos los objetivos traen grabada la apertura numérica. El poder de penetración: es la característica que permite definir simultáneamente las estructuras existentes a diferentes niveles de la preparación; esto solo se puede lograr con objetivos de pequeño aumento, a medida que aumenta el poder del objetivo y la apertura numérica, es menor el poder de resolución. El poder de definición: es la característica que permite una imagen clara, precisa y con bordes definidos; para esto, el microscopio debe presentar lentes bien pulidas, con sus aberraciones cromática y de esfericidad, corregidas. El índice de refracción: es una medida de la velocidad comparativa de luz en un medio. Cuando existe aire entre la lente y el cubreobjetos, parte de la luz proyectada a través de la muestra es desviada (refractada), por lo que a medida que se usa un objetivo de mayor aumento, la pérdida de resolución tiene un efecto significativo sobre la calidad de la imagen. El uso de aceite de inmersión (que tiene el mismo índice de refracción que el vidrio) entre la muestra y la lente del objetivo de inmersión, evita el cambio del índice de refracción, y por lo tanto, mejora la resolución. OBJETIVO.- Que el alumno identifique cada uno de los componentes del microscopio y sepa qué función desempeña cada uno, que logre paso a paso un enfoque correcto y que aprenda a detectar los errores de manejo para corregirlos; además aprenderá a tener los cuidados correspondientes al microscopio. MATERIAL.- Microscopio óptico, portaobjetos, cubreobjetos y alguna muestra para observar al microscopio. PROCEDIMIENTO.- a) Señale cada componente del microscopio y anote su función y a qué sistema pertenece. b) Observe los grabados en los oculares y en los objetivos y anote su significado. c) Ensaye el enfoque una preparación, empezando con el objetivo de menor aumento, anotando el aumento total que logra de su imagen en cada caso. d) Indique cuál es el poder de resolución de cada objetivo. e) Mida el grosor, largo y ancho del portaobjetos y del cubreobjetos. f) Ensaye la iluminación Köhler AJUSTE.- en la actualidad casi todos los microscopistas practican la iluminación basada en los principios establecidos por Köhler, conocida como iluminación de Köhler. Su finalidad es obtener una distribución homogénea de la iluminación, sobre el espécimen a observar, a pesar de las irregularidades de la fuente de luz. Pasos a seguir para la iluminación de Köhler: 1. Prender la fuente de luz (foco). 2. Enfocar la preparación con el objetivo de menor aumento (10X) 3. Subir el condensador hasta el tope, con mucho cuidado. 4. Cerrar por completo el diafragma de la lámpara ( o diafragma de campo) colocado en la base del microscopio (de dónde sale la luz). 5. Cerrar por completo el diafragma de Iris. 6. Observar la figura geométrica que aparece en el campo (hexágono), y a la cual se le llama diafragma.

3

7. Bajar el condensador lentamente hasta lograr la máxima nitidez de los bordes de la figura geométrica o diafragma 8. Si no está centrado el diafragma en el campo, entonces: 9. Centrar el diafragma en el campo con los tornillos de centrado que están en el condensador, moviéndolos simultáneamente y lentamente, para evitar que el diafragma salga del campo. 10. Abrir el diafragma de campo luminoso (o de la lámpara) hasta obtener iluminada un área igual al campo visual. 11. Si el diafragma está centrado en el campo, ningún vértice debe salir del campo y los espacios que hay entre vértice y vértice, deben ser iguales. 12. Si no es el caso, debe cerrarse un poco el diafragma de campo luminoso y repetir los pasos 9, 10 y 11. 13. Abrir completamente el diafragma de campo luminoso. (Éste debe estar siempre, completamente abierto o ligeramente cerrado, sólo se cierra cuando se hace la iluminación Köhler). 14. Abrir poco a poco el diafragma de Iris, hasta obtener una iluminación que no lastime a los ojos. 15. Ajustar la intensidad de la luz con el tornillo de control de la intensidad, hasta donde no lastime a los ojos. 16. Ajustar la altura del condensador dependiendo del objetivo a utilizar. 17. Verificar el ajuste observando por el ocular, el campo debe estar iluminado total y homogéneamente.

Pasos a seguir para enfocar el espécimen o muestra: 1) Con los tornillos macrométricos, bajar con cuidado la platina hasta el tope. 2) Con el revolver, colocar el objetivo de menor aumento (seco débil) en dirección del orificio de la platina. 3) Colocar el portaobjetos que contiene la muestra, en la platina, centrándolo en el área del orificio de la platina. 4) Asegurar el portaobjetos con las pinzas que hay en la platina. 5) Con los tornillos macrométricos, sin ver por los oculares, subir lentamente la platina hasta que llegue al tope (actualmente la mayoría de los microscopios compuestos tienen un tope sólo para el objetivo seco débil, se recomienda verificar esto antes de colocar un portaobjetos). 6) Sin ver todavía por los oculares, verificar hacia que sentido (si es hacia mi, o hacia fuera) se tienen que mover los tornillos macrométricos para bajar la platina. 7) Prender la fuente de luz (lámpara o foco). 8) Con los tornillos macrométricos, bajar la platina lentamente hasta obtener una imagen del espécimen. 9) Afinar la imagen con los tornillos micrométricos. 10) Ajustar la altura del condensador. 11) Ajustar la cantidad de luz con el diafragma de iris. 12) Ajustar la intensidad de luz con el tornillo de control de la intensidad. 13) Observar la muestra. Si se va a observar con los otros objetivos: 14) Con el revolver cambiar primero al objetivo seco fuerte y seguir los pasos 9 a 13. 15) Con el revolver cambiar al objetivo de inmersión y seguir los pasos 9 a 13 16) Antes de colocar el objetivo de inmersión en dirección de la muestra, debe siempre colocarse una gotita de aceite de inmersión. 4

Recomendaciones para el uso de los objetivos: Objetivo

Objetivo

Objetivo de

Seco débil

Seco fuerte

Inmersión

Altura del condensador

Aproximadamente de 1- 2 cm por debajo de la platina

Aproximadamente de 1- 2 cm por debajo de la platina

Condensador pegado a la platina

Cantidad de luz (Diafragma de Iris)

Poca X

Media XX

Mucha XXX

Intensidad de luz (Tornillo de control de intensidad)

Baja X

Media XX

Alta XXX

Característica

X: significa una medida cualitativa a manera de comparación.

MICROSCOPIO COMPUESTO Y SUS COMPONENTES PRINCIPALES

5

OCULARES CABEZAL REVOLVER OBJETIVOS

PLATINA

BRAZO DESPLAZAMIENTO PLATINA MACROMÉTRICO MICROMÉTRICO

FOCO

CONDENSADOR

BASE

6

PRÁCTICA 2 MEDICIONES EN EL MICROSCOPIO INTRODUCCIÓN.- La medición de objetos microscópicos es relativamente sencilla, aunque implica el empleo de los siguientes medios auxiliares o accesorios: ocular de medición, micrómetro objetivo y micrómetro ocular. El micrómetro objetivo: es un portaobjetos de 76 x 25.5 mm, en cuyo centro se halla grabada una escala. La escala es por lo general, de 1 a 2 mm de longitud, y presenta de 100 o 200 divisiones, respectivamente, cada una de las cuales mide 10 micras. El micrómetro ocular: es un disco de vidrio de 12 mm de diámetro o bien un ocular especial, ambos presentan grabada una escala de 5 mm, cada milímetro tiene 10 divisiones de 100 micras cada una. En el caso del disco, éste se coloca sobre el diafragma de cualquier ocular. Y en el caso del ocular éste debe ser del mismo modelo del microscopio. Coeficiente micrométrico: es una cifra que expresa la equivalencia en micras de una división de la escala del micrómetro ocular, al emplear cada objetivo del microscopio. Suele denominarse factor y la operación para obtenerlo, calibración del microscopio. El coeficiente micrométrico es inversamente proporcional al poder de amplificación de los objetivos utilizados. Usualmente se obtienen tres coeficientes micrométricos para cada microscopio, uno para cada tipo de objetivo (10X, 40X y 100X). Una vez que ha sido calibrado el microscopio, no deben intercambiarse ni el ocular micrométrico ni los objetivos del mismo con los oculares micrométricos u objetivos de otro microscopio. Aplicación de las mediciones en el microscopio: en algunas áreas y/o disciplinas es muy importante hacer la medición de ciertas estructuras, por ejemplo en Parasitología médica para diferenciar un parásito de otro, hay que medirlos, ya que producen enfermedades diferentes y su tratamiento y complicaciones difieren. En Hematología la medición de células permite diferenciar cierto tipo de anemias. En el árae de Farmacia se requiere de cierto de tamaño de las partículas de las suspensiones, para que éstas cumplan con su función. En el área de alimentos por ejemplo los corpúsculos de grasa deben tener cierto tamaño para que puedan ser absorbidos a nivel intestinal. OBJETIVO.- Que el alumno aprenda a tomar medidas microscópicas y las distintas aplicaciones que se tienen en diversas disciplinas. MATERIAL.- Microscopio, micrómetro ocular, micrómetro objetivo, preparaciones biológicas-

PROCEDIMIENTO.-

7

I) 1.- Se coloca el micrómetro objetivo sobre la platina y se enfoca como cualquier preparación con el objetivo seco débil, con cuidado se localiza la escala y se enfoca hasta que las líneas de la escala se vean claramente. 2.- Se coloca el micrómetro ocular en el ocular de medición Si el microscopio es biocular, se elige uno de ellos). Si se trata del disco micrómetro, se desenrosca primero la parte inferior del ocular y después se inserta la plaquita del micrómetro (con la división hacia arriba y evitando tocar la escala con los dedos), dejándolo caer suavemente y se vuelve a enroscar la parte inferior del ocular. Si se trata del ocular especial, se sustituye por el ocular normal. 3.- Se corrige el enfoque de ambas escalas (del objetivo y del ocular) hasta que aparezcan igualmente nítidas. 4.- Luego se colocan paralelas las escalas, muy próximas entre sí o superpuestas, ayudándose con el movimiento de la platina y girando el ocular . 5.- Es necesario hacer coincidir o superponer exactamente dos líneas de ambas escalas empezando por las líneas de cero de ambas escalas, 6.- Luego busque hacia la derecha de las líneas de cero que otra línea coincide de una escala con la otra. 7.- Cuente el número de divisiones que hay para cada escala entre las dos líneas coincidentes (entre el cero y la línea de la derecha). 8.- Aplique la siguiente fórmula matemática para obtener el coeficiente micrométrico:

C.M. = NDMOB x 10 / NDMO En donde NDMOB = número de divisiones del micrómetro objetivo; NDMO = número de divisiones del micrómetro ocular y 10 son las micras que mide exactamente cada una de las divisiones del micrómetro objetivo y C.M. = es el número de micras de una división de la escala del micrómetro ocular. Ejemplo: Se hacen coincidir las dos escalas de los micrómetros como en la figura siguiente, cuando la línea 0 del micrómetro objetivo coincide con la línea 0 del ocular, luego la línea 27 del ocular coincide con la línea 20 del objetivo, por lo tanto, sustituyendo en la fórmula: C.M. = 20 x 10 / 27 = 7.4 micras Recuerde: El valor micrométrico encontrado de esta manera, vale únicamente para el objetivo con el cual se ha efectuado la calibración. 9.- Retire el micrómetro objetivo de la platina. II) Repita los pasos del 1-9 para el objetivo seco fuerte y luego para el objetivo de inmersión. III) Coloque en la platina alguna muestra que le proporcione su profesora-or, enfoque y mida una célula con la escala del micrómetro ocular, con el objetivo seco débil, contando el número de divisiones que ocupa o abarca la célula de interés y aplique la siguiente expresión matemática: NDMOM X C.M. = Talla de la estructura medida expresada en micras

8

Donde NDMOM: es el número de divisiones de la escala del ocular que ocupó o abarcó la célula o estructura de interés; C.M.: es el factor que obtuvo para ése objetivo dónde midió la estructura. IV) Repita el anterior proceso con la misma célula pero con el objetivo seco fuerte y luego con el objetivo de inmersión. V) Anote sus resultados en la siguiente hoja y haga un análisis de los mismos. 1.- Con el objetivo 10X (seco débil), el número de divisiones coincidentes con el micrómetro objetivo fueron: _________ y el número de divisiones coincidentes con el micrómetro ocular fueron:________

.

Por tanto sustituyendo en la fórmula el

Coeficiente Micrométrico para éste objetivo fue: ___________________________

2.- Con el objetivo 40X (seco fuerte), el número de divisiones coincidentes con el micrómetro objetivo fueron: _________ y el número de divisiones coincidentes con el micrómetro ocular fueron:________

.

Por tanto sustituyendo en la fórmula el

Coeficiente Micrométrico para éste objetivo fue: ___________________________

3.- Con el objetivo 100X (inmersión), el número de divisiones coincidentes con el micrómetro objetivo fueron: _________ y el número de divisiones coincidentes con el micrómetro ocular fueron:________

.

Por tanto sustituyendo en la fórmula el

Coeficiente Micrométrico para éste objetivo fue: ___________________________

4.- El tamaño de la estructura que medí con el objetivo seco débil fue de _________ micras.

5.- El tamaño de la estructura que medí con el objetivo seco fuerte fue de _________ micras.

6.- El tamaño de la estructura que medí con el objetivo seco de inmersión fue de _________ micras.

9

b) Ameba, aumeento 1000 veces.

10 0

11

PRÁCTICA 3. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS. INTRODUCCIÓN.- Las células vivas son entidades dinámicas, que cambian y se mueven constantemente. Las células fijadas y teñidas son estables, y ya no cambian. Cuando mucho, las imágenes obtenidas con material fijado solo pueden ser "instantáneas" de las células dinámicas. A menudo es necesario reconstruir una cadena de acontecimientos por el estudio cuidadoso de muchas de estas instantáneas a intervalos diversos. Las células procarióticas por su tamaño no pueden ser observadas tan fácilmente sin fijar y teñir En cambio las células eucarióticas pueden observarse en movimiento como algunos seres unicelulares, por ejemplo; los protozoarios, si es que se cuida de conservarlos bajo las condiciones de su medio natural. Pero la célula vegetal es más fácil de observar debido a su tamaño y a la pared celular que recubre a la membrana plasmática. Puede teñirse para contrastar sus estructuras más importantes, tales como núcleo y plástidos. El uso de colorantes adecuados para resaltar determinadas estructuras es frecuente, tomando en cuenta la composición química de tales estructuras. OBJETIVO.- Que el alumno identifique algunos organismos unicelulares (protozoarios) como ejemplo de célula viva, obtenidos de medios adecuados, y que observe células vegetales para identificar en ellas características que las hacen tan diferentes de las células procarióticas. Además de que conozca e identifique mohos, como ejemplo de hongos. MATERIAL.- Microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, pipetas Pasteur con chuzo, navaja, alfileres o agujas. Como material biológico: agua estancada (de florero con agua "podrida"), células de cebolla o pétalos de flor, pan o tortilla con moho. PROCEDIMIENTO.- A) Con la pipeta Pasteur tome una gota de agua estancada y colóquela en un portaobjetos; cúbrala inmediatamente con un cubreobjetos y observe a seco débil. Una vez enfocada la muestra, puede pasar a mayor aumento. Bajo el microscopio podrá ver muchas especies de organismos unicelulares nadando activamente en la gota de agua. Estos organismos son protozoarios que han estado viviendo en el medio adecuado para su crecimiento y proliferación. Trate de identificarlos con ayuda de los esquemas anexos. B) Tome ahora la cebolla o el pétalo de una flor y haga una incisión que le permita separar una capa delgada para obtener un trocito y extenderlo perfectamente sobre el portaobjetos. A la célula de la cebolla puede agregarle una gota de colorante como el verde de metilo. Con éste se teñirán los núcleos. Al corte de flor no es necesario teñirla pues las células poseen una vacuola de pigmento coloreado que las hace muy visibles con su contorno bien delimitado por la pared celular. C) Con la punta de un alfiler o de una aguja, tome una porción muy pequeña del moho del pan o de tortilla, colóquelo en un portaobjetos que previamente tendrá una gota de agua destilada, luego agregue una gota de colorante azul de metileno. Identifique las partes que constituyen al moho.

12

PRÁCTICA 4 OBSERVACIÓN DE CÉLULAS PROCARIÓTICAS Y SUS CARACTERÍSTICAS TINTORIALES INTRODUCCION.- La fijación de las células o tejidos puede ser definida como el procedimiento que permite la preservación selectiva de su organización morfológica y de su composición química para ser observados al microscopio. Los mejores fijadores contienen una o más sustancias que precipitan las proteínas de las células, o que las hacen insolubles sin llegar a precipitarlas. Según cual sea el fijador y las condiciones bajo las cuales se lo utilice, la fase sólida de protoplasma se separa de la acuosa en forma de fibrillas, gránulos, redes o vacuolas. La separación de la fase sólida se produce esencialmente debido a las uniones entre las moléculas proteicas, aumentando de esta manera su estabilidad para los tratamientos posteriores y la observación El fijador usado debe ser seleccionado de acuerdo a su actividad química específica, de manera que aquellas estructuras que se deseen conservar, sean preservadas con exclusión de otros materiales que podrían interferir con el efecto deseado. Es necesario también evitar toda destrucción del material que va a ser estudiado y distribuir el efecto del fijador uniformemente en toda la célula. Por otro lado, la selección de un colorante para el estudio de las células por medio del microscopio óptico, depende de distintos factores, que incluyen la naturaleza del material a estudiar, el tipo de fijador utilizado y la reactividad química del colorante. La tinción de las bacterias por el método de Gram, permite clasificar a las bacterias selectivamente en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Las primeras retienen el colorante cristal violeta sin decolorarse por los reactivos diferenciadores que se aplican en la técnica de tinción. Las bacterias Gram positivas aparecen en visión microscópica teñidas de un color morado intenso, por el cristal violeta, debido a la capa gruesa de peptidoglicanos Las bacterias Gram negativas, aparecen en visión microscópica teñidas de un color sonrosado débil, por la Safranina., debido a la capa fina de peptidoglicanos. OBJETIVO.- Que el alumno conozca a las bacterias como el principal ejemplo de células procarióticas y que aprenda a emplear la técnica de tinción de Gram para bacterias, como introducción a la identificación morfológica y afinidad de las células a los colorantes. MATERIAL BIOLÓGICO.- Un yakult o yogurt natural, y una muestra de raspado de lengua, mucosa oral o de dientes. REACTIVOS.- alcohol de 96° o alcohol etílico-acetona 1:1, cristal violeta, lugol, safranina, agua destilada, aceite de inmersión y xilol. PROCEDIMIENTO.-

13

A) Con un abatelengua raspe con cuidado y con vigor, la cara interna de un cachete o bien la parte media superior de la lengua, o con un cepillo de dientes raspe la lengua, o con una lanceta raspe el borde inferior de los dientes, luego disuelva una pequeña porción del raspado en una gota de agua sobre un portaobjetos, luego haga una extensión o frotis delgado, seque a la llama del mechero, pasando rápidamente y en varias ocasiones el frotis por en medio de la flama azul, y colocando el portaobjetos en el dorso de la mano después de cada pase, para evitar que se queme la muestra (si le quema la mano el portaobjetos, éste preparado no servirá), se repite esto hasta que seque el preparado. Se coloca el portaobjetos en el soporte de tinciones y se tiñe según la técnica de Gram. Ya seca la preparación se observa al microscopio con el objetivo de inmersión. B) Con una pipeta Pasteur se toma una pequeña gota de yakult o de yogurt y se coloca en el portaobjetos en el que previamente se depositó una gota de agua destilada, se mezcla y se hace una extensión delgada y se seca a la llama del mechero (igual que con la muestra de la boca). Lavar la preparación con xilol por escurrimiento, para eliminar la grasa que contiene el yogurt y dejar que se seque al aire. Se coloca el portaobjetos en el soporte de tinciones y se tiñe según la técnica de Gram. Ya seca la preparación se agrega aceite de inmersión y se observa al microscopio con el objetivo de inmersión.

TECNICA DE TINCIÓN DE GRAM 1.. Coloque la laminilla en el soporte de la tina de tinción, cuidando que quede completamente horizontal. 2.. Agregue unas gotas del colorante cristal violeta, cubriendo la extensión; el tiempo de actuación del colorante es de dos minutos. 3.. Lave con agua destilada para arrastrar el colorante, se hace por goteo con una pipeta Pasteur, sin exceder el lavado y nunca directamente sobre el extendido para evitar el arrastre del mismo. 4.. Vuelva a colocar la laminilla en el soporte de la tina de tinción. 5.. Agregue solución de lugol, cubriendo el frotis y deje actuar durante un minuto. 6.. Lave nuevamente con agua destilada. 7.. Agregue unas gotas de alcohol etílico al 96° o alcohol etílico-acetona 1:1, cubriendo el frotis y deje actuar de 30 segundos a un minuto, para arrastrar el colorante que queda libre y decolorar. 8.. Lave cuidadosamente con agua destilada. 9.. Agregue unas gotas de safranina cubriendo el frotis y deje actuar durante un minuto. 10.. Lave con agua destilada. 11.. Seque al aire, perfectamente . 12..Agregue una “gotita” de aceite de inmersión y observe a 100 X.

14

Identifiq que en cad da muestra a la forma de las bac cterias y, po or el color cuáles son n Gram negativvas y cuále es son Gra am positiva as.

15

PRÁCTICA 5. PERMEABILIDAD CELULAR INTRODUCCION.- El paso a través de las membranas celulares es esencial para la absorción, distribución, biotransformación y excreción de varios materiales (por ejemplo fármacos). Tal pasaje se realiza ya sea por un transporte pasivo (presión hidrostática, presión osmótica, difusiones cuasilaminar y electrónica), ya sea por un transporte activo (bombeo, difusión facilitada, pinocitosis) y lo que es mas frecuente, por mecanismos mixtos. Como fenómeno fisicoquímico, la presión osmótica es conocida desde los trabajos de Abate Nollet (1748) y especialmente los de Dutrochet que la bautizó (ósmosis, del griego: impulso). Pero en las investigaciones de De Yries y Pffefer, hacia fines del siglo antepasado, las que evidenciaron las inferencias biológicas de ella. Colocando células vegetales en soluciones de concentración variable, observaron que se hinchaban o se contraían según fuera esa concentración. Pffefer reconoció el fenómeno como osmótico y con él dio prueba visual de la existencia de la membrana celular, la que pasó en esta forma a ser un hecho aceptado. Usando el criterio de forma y volumen de las células y su modificación frente a soluciones de diversas concentraciones, el mismo investigador demostró que la misma actividad osmótica de la sacarosa 0.3 M equivalía a la de una solución 0.15 M de NaCI y a una O.1 M de CaCI2. Cualquiera de las tres, puestas frente a las células vegetales, no modificaba ni su forma ni su tamaño, eran osmóticamente equivalentes. Estos hallazgos intrigaron a Arrheníus y contribuyeron al nacimiento de su teoría de la disociación electrolítica: surgía así una importante teoría química, de una constatación biológica. En 1883, Hamburger inició una larga serie de experiencias semejantes a las descritas, usando eritrocitos humanos y de animales. Verificaba así experimentalmente las presiones osmóticas relativas de las soluciones, comparando al mismo tiempo sus efectos biológicos. En ese sentido el glóbulo rojo de mamífero es un material bastante adecuado. En presencia de soluciones acuosas de débil actividad osmótica se hincha, toma forma esférica (volumen máximo para la misma superficie) por ingreso de agua; ulteriormente si el ingreso de agua continúa, termina por provocar la apertura de la membrana; la hemoglobina difunde hacia el exterior, quedando la membrana prácticamente en estado "puro" (estroma o "sombra"). La mezcla de hematíes en suspensión y solución en estudio, de turbia que era por los elementos en suspensión, se transforma en una solución límpida roja, de Hb, con un depósito de estromas. Este es el fenómeno llamado de hemólisis o laqueado. El experimento se ha utilizado reiteradamente con el fin de aislar la membrana al

16

estado puro y poder realizar estudios sobre su constitución química, así como también para determinar el potencial osmótico de las soluciones farmacéuticas. Inversamente, los hematíes puestos en presencia de soluciones de gran actividad osmótica (concentradas), reducen su volumen y toman un aspecto dentado particular (crenado) debido a la migración de agua hacia fuera; en el caso de las células vegetales y otras células animales se produce retracción del protoplasma (plasmólisis). Al igual que en las experiencias de Pffefer, se encontró que para determinadas concentraciones de sales (NaCl 0.9%) no se producía cambio alguno ni en la forma ni en el volumen. A las soluciones que se comportan como queda relatado frente a los glóbulos rojos de mamífero, se les denomina respectivamente: hipotónicas (dan hemólisis), hipertónicas (dan crenación) e isotónicas (no modifican al hematíe). OBJETIVO.- Que el alumno compruebe la función de permeabilidad de la membrana citoplasmática en células animales y el carácter que representa la membrana, como una estructura que separa dos medios (intracelular y extracelular), así como observar los efectos que sobre la célula ejercen sustancias diferentes al medio intracelular. MATERIAL BIOLOGICO.- Sangre venosa con anticoagulante (para observar eritrocitos). REACTIVOS.- Anticoagulante, soluciones isotónicas, hipotónicas e hipertónicas. PROCEDIMIENTO 1- Con una pipeta Pasteur deposite una gota de sangre en un portaobjetos, colóquele el cubreobjetos y observe al microscopio con objetivo seco fuerte, la morfología de los eritrocitos. 2-Aparte enumere tubos de ensaye del 1 al 4; con la pipeta Pasteur agregue 3 gotas de sangre a cada tubo, luego agregue 10 gotas de solución isotónica en el tubo 1, 10 gotas de solución hipotónica en el tubo 2, 10 gotas de solución hipertónica en el tubo 3, y 10 gotas de agua destilada en el tubo 4. 3- Mezcle agitando cada tubo suavemente (para no romper los eritrocitos). Deje reposar de un minuto. 4- Luego con una pipeta Pasteur tome una gota de la mezcla del tubo 1 y colóquela en un portaobjetos, coloque un cubreobjetos y observe con seco fuerte. Anote sus resultados, haga lo mismo con una gota de la mezcla del tubo 2 y luego del tubo 3 y del tubo 4. Acuérdese que tipo de solución agregó en cada tubo, para hacer la comparación. 5- Explique el resultado de cada observación.

17

18

19

PRÁCTICA 6 DIVISIÓN CELULAR INTRODUCCIÓN.- Todas las células proceden de otras células preexistentes. Las células vegetales crecen debido sobre todo a la toma de agua. Cuando alcanzan un tamaño determinado se dividen, formando cada una de ellas dos células hijas idénticas. Las diversas partes de la célula a menudo están distribuidas asimétricamente y han de repartirse entre las células hijas de tal modo que las nuevas células sean copias exactas de la célula materna original. En los eucariontes, el material hereditario forma parte de cromosomas complejos. La repartición equitativa de este material requiere, por tanto, un mecanismo mas complicado mediante el cual los cromo sornas se dupliquen, se separen y se distribuyan de una manera precisa entre las dos células hijas. Este mecanismo es la MITOSIS. La mitosis, o división celular, apareció evolutivamente como una solución al problema de asegurar una repartición equitativa del material nuclear entre las células hijas, en los organismos eucarióticos. Es un proceso continuo que convencionalmente se divide en cuatro fases principales: (Profase. metafase. anafase y telofase. En el tiempo antes y después de la mitosis, la célula esta en interfase. En la mitosis, los cromosomas aparecen como largas fibras estiradas, que se van acortando a medida que avanza su enrollamiento y que se dirigen hacia el centro de la célula cuando se ha contraído completamente. Entonces se escinden longitudinalmente en dos mitades idénticas, las cuales son llevadas a los polos opuestos de la célula mediante una serie de microtúbulos. En estos dos grupos equivalentes genéticamente, los cromosomas se desenrollan y se establecen en los núcleos de las dos células hijas. Una planta conserva la mayoría de las células que se forman durante su vida y va produciendo otras nuevas en regiones de activa división celular, localizadas en los ápices de las ramas y de las raíces. En los ápices se localizan áreas especializadas de división celular activa, llamadas merístemas (del griego meristos, dividido). En el extremo de cada tallo hay meristema apical, que produce un flujo continuo de células hijas a medida que el tallo alarga más y más. Este alargamiento es el resultado, no solo de la división celular, sino también de que las células nuevas absorben agua y aumentan de tamaño. Luego, las células se diferencian en formas adaptadas a la función que desempeñan en la planta adulta. El meristema apical de la raíz produce células hijas hacia delante y hacia atrás. Hacia delante origina la "pilorriza", una cubierta dura de células que se desgasta continuamente a medida que la raíz avanza a través del suelo y que es regenerada desde atrás por división celular en el meristema apical. OBJETIVO.- Que el alumno observe en células vegetales las diferentes etapas de la mitosis, así como, la morfología de los cromosomas.

20

MATERIAL.- Microscopio, tubos pyrex chicos, portaobjetos, cubreobjetos, bisturí o navaja de un filo nueva y 2-4 agujas largas, aplicadores de madera, pinzas para los tubos, mechero Bunsen, caja de petri. MATERIAL BIOLOGICO.- Un bulbo de cebolla tierna (de cambray). REACTIVOS.- Solución de acetocarmín o carmín-acético en frascos goteros, esmalte para uñas transparente. PROCEDIMIENTO .1 Con tres días de anticipación a la práctica, coloque un bulbo de cebolla (fresca y que tenga raíces largas de más de 3 cm) en un recipiente con agua, para estimular el crecimiento de las raíces. 2. Elija la parte final de una raíz de 4 cm de longitud, córtela por la base con un bisturí y colóquela sobre un portaobjetos. 3. Sujétela por la base y con el bisturí elimine perfectamente la cofia (cubierta protectora cuyas células no están en división). 4. Inmediatamente por debajo de la cofia se encuentran ya las células meristemáticas, corte con el bisturí una porción de 0.5 cm de la parte apical y colóquela dentro de un tubo de ensaye pyrex. Es recomendable procesar de 2 a 3 raíces, para asegurar el obtener células en división. 5. Agregar la solución carmín-acético a que cubra la porción de raíz (aproximadamente 2 ml). 6. Se calienta el tubo hasta que la solución carmín-acético entre en ebullición y se mantiene durante 15 segundos. Tenga cuidado de que no se bote el contenido del tubo. 7. Transcurrido este tiempo se pasa el contenido a una caja Petri y se coloca la raíz con una pinza sobre un portaobjetos. 8. Coloque sobre el portaobjetos que contiene la-s raíces otro portaobjetos y presione firmemente para lograr el aplastamiento y por lo tanto la separación de las capas celulares. 9. Retire con mucho cuidado el portaobjetos de encima de la raíz, coloque un cubreobjetos y presione nuevamente, cuidando de no romperlo. 10. Selle los bordes del cubreobjetos con el esmalte para uñas, transparente. (Para evitar que se seque la muestra y que al enfocar con los objetivos se vaya a mover el cubreobjetos y las capas celulares) 11. Examine al microscopio con objetivo de inmersión, colocando una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos, para observar células meristemáticas en mitosis 12. Tenga paciencia para revisar célula por célula en busca de las diferentes fases de la división celular.

21

22

23