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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 229 499
51 Int. Cl. : A61L 27/00
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C08L 89/00 C07K 17/06
ESPAÑA
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
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86 Número de solicitud europea: 98925574 .0
86 Fecha de presentación: 09.05.1998
87 Número de publicación de la solicitud: 0983095
87 Fecha de publicación de la solicitud: 08.03.2000
54 Título: Implantes recubiertos con péptidos y procedimiento para su fabricación.
30 Prioridad: 22.05.1997 DE 197 21 352
16.12.1997 DE 197 55 801 23.04.1998 DE 198 18 098
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.04.2005
73 Titular/es: Biomet Deutschland GmbH
Gustav-Krone-Strasse, 2 14167 Berlin, DE
72 Inventor/es: Kessler, Horst;
Finsinger, Dirk; Jonczyk, Alfred; Meyer, Jörg; Nies, Berthold y Kantlehner, Martin
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel
ES 2 229 499 T3
16.04.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 229 499 T3 DESCRIPCIÓN Implantes recubiertos con péptidos y procedimiento para su fabricación. 5
La invención se refiere a implantes de tipo general para el cuerpo humano y animal, recubiertos con péptidos, capaces de mediar de manera selectiva en la adhesión de células específicas en el entorno correspondiente del implante. En particular, la invención se refiere a implantes recubiertos con péptidos RGD y a un procedimiento para su fabricación.
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La invención se basa en el principio de la estimulación de la adherencia dirigida a las células de especies celulares seleccionadas sobre recubrimientos superficiales de biomateriales, en general, e implantes, en particular, para proporcionar una integración histoselectiva, acelerada y reforzada de los mismos tras la aplicación quirúrgica en el correspondiente tejido.
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De esta forma, resulta posible recubrir y poner a disposición diversas partes superficiales de un implante con diversos péptidos que fomentan la adherencia celular, en especial, péptidos RGD, que toman en consideración el entorno tisular específico en el que se incorporará el implante.
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Así, en lo que respecta a la “Ingeniería de los Tejidos”, resulta posible la generación de órganos biohídridos “inteligentes” gracias a su auto-organización, que portan la información biológica necesaria para una regeneración de órganos, mediante la activación dirigida de distintas especies celulares por medio de diferentes péptidos en diversas regiones de la superficie del implante. La expresión “péptidos según la invención” comprende, en lo sucesivo, cuando no se indique lo contrario o aspectos adicionales, todos los péptidos capaces de mediar en la adherencia celular. Entre ellos, se hace especial referencia a aquéllos que contienen los aminoácidos arginina (R), glicina (G) y ácido aspártico (D) de manera consecutiva (péptidos RGD). Más adelante, se mencionan ejemplos de péptidos RGD adecuados y de péptidos apropiados que no contienen RGD. Se incluyen, adicionalmente, los correspondientes péptidos que no contienen la secuencia RGD, pero que, no obstante, influyen sobre la adherencia celular. En el sentido más amplio, la invención comprende también compuestos no peptídicos que exhiben, cualitativamente, la misma actividad biológica que los citados compuestos peptídicos.
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Como biomateriales o implantes acordes con la invención se designan materiales que se pueden incorporar al cuerpo humano o animal con el fin de restaurar la función de un tejido natural que haya sufrido una lesión funcional. A los mismos pertenecen, por ejemplo, endoprótesis de cadera, articulaciones artificiales de la rodilla, implantes de mandíbula, sustitutos de dedos de los pies, sustitutos de la piel, prótesis vasculares, marcapasos cardiacos, válvulas cardiacas artificiales, implantes de mama, “stents”, catéteres y “shunts” (anastomosis o cortocircuitos). El comportamiento de integración de los implantes en el cuerpo sigue siendo problemático. La integración tisular de los materiales se produce, a menudo, de forma demasiado lenta e incompleta para lograr una estabilidad mecánica de la unión tejido/biomaterial suficiente para la funcionalidad. Responsable causal es, a menudo, la naturaleza de la superficie del implante que, debido a su insuficiente compatibilidad entre las superficies limítrofes o biotolerancia, impide un depósito activo de tejido o células sanas circundantes. Ello dificulta la formación de una capa de unión estable entre el tejido y el implante, conduciendo, por lo tanto, a una inadecuada integración tisular que tiene como consecuencia aflojamientos, resorción tisular, infecciones, inflamaciones, alergias, formación de microtrombos (reestenosis). Como consecuencia de estos problemas, son precisas nuevas intervenciones de revisión para cambiar el implante (por ejemplo, endoprótesis de cadera, implantes de mandíbula, catéteres o fijadores externos) y, por lo tanto, nuevas intervenciones quirúrgicas (Malchau y Herberts, 1996, Prognosis of the Total Hip Arthroplasty, 63, Annual Meeting of the American Academy of Orthopaedic Surgeons, Atlanta; Hadad et al., 1996, The Journal of Bone and Joint Surgery, 78-B: 546-549; Collinge et al., 1996, Pin Tract Infections). Adicionalmente, y principalmente en las endoprótesis de cadera, el denominado aflojamiento aséptico del implante se manifiesta como problemático, ya que en lugar de que se forme directamente un biomaterial compuesto por células óseas y, por lo tanto, tejido óseo, aparecen fibroblastos y tejido conjuntivo que actúan como elementos de interferencia. Como consecuencia, la prótesis está rodeada por tejido conjuntivo en lugar de tejido óseo, con lo que la unión de prótesis-tejido conjuntivo no alcanza la estabilidad necesaria como para satisfacer las demandas mecánicas de transferencia de fuerzas requerida en una articulación de cadera artificial. El resultado puede ser un aflojamiento definitivo de la prótesis (Pilliar et al., 1986, Clin. Orthop., 208:108-113) y exige, igualmente, una revisión. Un ejemplo adicional de la adherencia de tipos de células indeseados a los implantes está representado por las plaquetas, que pueden conducir a la formación de microtrombos y, por consiguiente, a una alteración de la integración del implante (Phillips et al., 1991, Cell, 65, 359).
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Especialmente complejo resulta el déficit de integración de los biomateriales o implantes en el cuerpo en el caso de órganos completos de sustitución, puesto que los distintos tipos de células entran en contacto con el implante y la integración necesaria debería estar dirigida a las células. Para evitar los costes extraordinariamente elevados de procedimientos de trasplante con ayuda de otros pacientes, se tiende, por ejemplo, a ejecutar la terapia del fallo funcional del hígado, páncreas, riñones y bazo por medio de los denominados órganos biohíbridos, en el marco de la “Ingeniería de Tejidos”. Estos órganos biohíbridos están formados por materiales portadores recubiertos con células vivas y se pueden implantar como unidades funcionales. Con mucha frecuencia, se incluyen o encapsulan in vitro, para este fin, células sanas y funcionales en membranas resorbibles o no resorbibles, que se trasplantan a modo de 2
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órganos biohíbridos artificiales u órganos huecos al paciente (por ejemplo, Lim et al., 1980, Science 210, 908-912; Altman et al., 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45; Zekorn et al., 1989, Transplantation Proceedings 21, 27482750; Altman et al., 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45; documento EP 0 504 781 B1). En general, también en este caso aparecen, con mucha frecuencia, problemas de separación fibrótica, con una reducción asociada del aporte de nutrientes al trasplante, reacciones inmunológicas de defensa por la liberación de células desde la cápsula, así como la formación de coágulos de sangre debido a trombogenicidad de las superficies del material. Se conoce la técnica de estimular la integración tisular de biomateriales/implantes por medio del recubrimiento de los mismos con péptidos que fomentan la adherencia celular. En este sentido, se conocen los péptidos que contienen la secuencia de aminoácidos tripeptídica de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), o sus análogos no peptídicos y, por otra parte, péptidos que fomentan la adherencia celular que no contienen la secuencia RGD (véanse los ejemplos más adelante), o sus análogos no peptídicos, que actúan, de manera conocida, como componentes integrales de muchas proteínas, entre otras, de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno tipo I, fibronectina, laminina, vitronectina, entactina, osteopontina, trombospondina), o de la cascada de la coagulación (fibrinógeno, factor de von Willebrand) como patrón central de reconocimiento para la adherencia de células eucarióticas (por ejemplo, Pierschbacher y Ruoslahti, 1984, Nature, 309:30-33; Yamada, 1991, J. Biol.. Chem., 266:12809-12812). La secuencia definida según la invención es reconocida y fijada por los correspondientes receptores de la superficie celular, las integrinas. Dado que la adherencia de células a las correspondientes proteínas está mediada por múltiples y diferentes integrinas, el patrón de expresión de las interinas para una especie celular actúa de forma decisiva para las propiedades de adherencia a estas proteínas. El diseño a medida y la síntesis de péptidos, a menudo de cadena corta, dotados de las correspondientes secuencias, capaces de fijarse de manera selectiva y específica sólo a determinadas integrinas, hacen posible la activación dirigida de solamente aquellas especies celulares que expresan dichas integrinas. De esta forma , se conocen, por ejemplo, péptidos RGD que se unen de manera selectiva a los receptores de integrinas alfav y, por tanto, son capaces de estimular, preferentemente, la unión (adhesión) de células portadoras de alfav beta3 / alfav beta5 (osteoblastos, osteoclastos, células endoteliales), sin potenciar simultáneamente la adhesión de especies celulares no deseadas, por ejemplo, plaquetas sanguíneas portadoras de αIIIb β3 (Haubner et al., 1996, Am. Chem. Soc., 118:7461). Otros péptidos RGD muestran, por el contrario, una acción inversa y fijan, de forma preferente, receptores de integrinas αIIIb β3 , de modo que muestran una selectividad, por ejemplo, para las plaquetas (Phillips et al., 1991, Cell, 65, 359). El recubrimiento de las superficies del implante con péptidos asequibles de forma sintética, definidos según la invención, es conocido. En este caso, los péptidos se fijan en mayor o menor medida a la superficie por adsorción, así como por enlaces covalentes. En el documento DE 1 97 06 667 se describen, por ejemplo, biomateriales que afectan a materiales de sustitución ósea, basados sobre un material polímero poroso, que muestran un recubrimiento de la superficie con péptidos portadores de la secuencia de aminoácidos RGD, fijada por adsorción. Por el documento WO 91-05036 se conocen, adicionalmente, prótesis metálicas, en particular de titanio o de aleaciones de titanio, que tienen péptidos que pueden mostrar, entre otras, también las secuencias RGD, unidos a la superficie por uniones covalentes. Valentín et al., (mayo 1997, Transactions of the 23rd Annual Meeting of the Society for Biomaterials, Nueva Orleáns, EE.UU.) describen la fijación covalente de péptidos RGD a tornillos de titanio provistos de una capa intermedia de etileno-propileno fluorado. Resana et al. informan sobre el mismo procedimiento en superficies de dióxido de silicio o de dióxido de titanio recubiertas, por fijación covalente, con organosilanos aminofuncionales y que, por medio de un reticulador transversal hetero-bifuncional estimulan la unión covalente de péptidos RGD que contienen grupos tiol. Estas soluciones técnicas no satisfacen, sin embargo, la demanda de poner a disposición implantes o biomateriales cuya superficie esté recubierta, de manera dirigida, con los péptidos definidos según la invención, adaptados de forma selectiva al correspondiente tipo de células del tejido que rodea el implante en cuestión. Sería, por lo tanto, deseable poder modificar los biomateriales de manera que estén dirigidos, de forma exclusiva o preferente, a aquellos tejidos o especies celulares con los que, tras la incorporación del implante en el cuerpo, deben establecer una función activa, es decir, por ejemplo, células óseas en las endoprótesis de cadera, o células epiteliales en el caso de sustituyentes de piel, cabello o piezas dentales, evitándose, a la vez, las especies celulares que interfieren en este proceso, tales como, por ejemplo, plaquetas sanguíneas o fibroblastos, que estimulan la formación de microtrombos o cápsulas de tejido conjuntivo, en una interacción selectiva con el implante. Adicionalmente, sería una estrategia deseable y atractiva recubrir los implantes con aquellos péptidos definidos según la invención (o con sus análogos no peptídicos) capaces de estimular de manera exclusiva o, por lo menos, preferente la adherencia de los tipos de células seleccionadas, portadoras de las correspondientes integrinas complementarias. De este modo, se podría lograr la síntesis in vivo acelerada del correspondiente tejido seleccionado. En relación con el desarrollo de órganos biohíbridos completos (piel, vasos sanguíneos, uréteres, vejiga, esófago, páncreas, hígado, bazo, riñones), sería un avance decisivo poder recubrir con diferentes péptidos definidos según la invención y selectivos para las células, diversas partes de la superficie del implante de manera dirigida para las especies de células deseadas para ese órgano definido. La organización de los diversos recubrimientos debería estar definida y coordinada en el espacio para poder activar diversos procesos celulares in vivo. La presente invención describe ahora la posibilidad de la biofuncionalización de biomateriales, en especial, de implantes para cualquier órgano concebible por medio de su recubrimiento con péptidos RGD cito- o histoselectivos, definidos según la invención, que estimulan in vitro la adherencia predominantemente de aquellas especies celulares que son responsables de la integración en el tejido del correspondiente biomaterial. Simultáneamente, no deben 3
ES 2 229 499 T3 estimular in vitro la adhesión de aquellas especies celulares que actúan en contra de este proceso. Con el uso de estos recubrimientos, se logra una integración acelerada y reforzada de los distintos biomateriales/implantes, con una estabilidad mejorada a largo plazo tras su incorporación en el cuerpo. 5
Adicionalmente, con este concepto de recubrimiento de diversas partes de la superficie del material de implante, con diferentes péptidos definidos según la invención, existe la posibilidad de desarrollar órganos biohíbridos “inteligentes” (“Ingeniería de Tejidos”), portadores de la información biológica para la activación selectiva de diversos tejidos o células diana, y que, por lo tanto, se integran en el cuerpo de manera auto-organizada, reforzando o permitiendo, por primera vez, la integración tisular.
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Objeto de la invención es, por lo tanto, un implante adecuado para diferentes órganos humanos o animales, compuesto básicamente por una matriz portadora y un recubrimiento peptídico, el cual contiene péptidos diferentes o iguales para estimular la adherencia dirigida de células del cuerpo humano o animal. Los citados péptidos exhiben secuencias que reconocen los puntos de fijación en los receptores de integrinas responsables de la adhesión en células humanas o animales, de forma que la matriz portadora muestra en su superficie grupos reactivos capaces de fijarse y que son capaces de formar con los citados grupos funcionales reactivos de la capa peptídica una unión covalente estable, que se distingue porque los citados péptidos dispuestos sobre la superficie del implante se seleccionan y disponen localmente de tal forma que, gracias a su actividad estimuladora de la adherencia, determinada por su correspondiente estructura, se corresponden con los patrones de integrina complementarios naturales de las células limítrofes del tejido de la región en la que se incorpora el implante. De este modo, se establece un patrón de recubrimiento bioactivo, selectivo y localmente diferenciado en la superficie del implante. Objeto de la invención es, adicionalmente, un procedimiento para la fabricación de implantes adecuados para órganos/tejidos basados en una matriz portadora que posee una superficie recubierta con péptidos que estimulan la adherencia celular, en la cual los mencionados péptidos están dispuestos selectivamente en relación con el patrón de integrinas complementarias de las células tisulares inmediatamente limítrofes del implante. Este procedimiento se distingue porque, por medio de métodos en sí conocidos (i) se determina in vitro la estructura de los receptores de integrina de las células diana o del tejido diana en el que se incluirá, in vivo, el implante, (ii) se seleccionan o sintetizan los péptidos con la correspondiente estructura complementaria, y (iii) los citados péptidos se fijan a la superficie en cuestión del implante. En particular, son objetos de la invención los procedimientos e implantes/biomateriales con las siguientes características: los citados péptidos, en especial, péptidos RGD, están fijados por uniones covalentes, eventualmente a través de moléculas y/o anclajes moleculares ramificados, que amplían la superficie, a la molécula del implante; preferentemente, se utilizan péptidos RGD capaces de estimular células portadoras de alfav beta3 /alfav beta5 , es decir, en especial la adhesión de osteoblastos, osteoclastos y células endoteliales y que, simultáneamente, no estimulan la adhesión de plaquetas sanguíneas o fibroblastos; como matrices portadoras se utilizan piezas moldeadas o no moldeadas de cerámica, material polímero o metal, o bien un órgano u órgano huevo biohíbrido. Los péptidos definidos según la invención están concebidos, en el plano molecular, básicamente con los siguientes componentes: - un dominio portador de la secuencia de aminoácidos responsable de la adhesión (por ejemplo, la llamada secuencia RGD), que reconoce y fija de forma selectiva una especie celular seleccionada;
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- un espaciador, que presenta los dominios de reconocimiento celular y portador de la secuencia de reconocimiento de manera tal que resulte posible, por primera vez, una unión celular desde el punto de vista estérico; 50
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- un anclaje molecular, responsable de la fijación estable del correspondiente derivado peptídico a la superficie del biomaterial o del implante; - deforma opcional, la adhesión celular se puede potenciar por el acoplamiento adicional de los péptidos definidos según la invención a estructuras moleculares ramificadas (los llamados dendrímeros o tentáculos), que ejercen un efecto ampliador de la superficie, antes de que se produzca la unión a la superficie del biomaterial. Por superficie del biomaterial o del implante se debe entender no sólo la superficie inmediata de la matriz portadora, sino también un recubrimiento adicional, eventualmente presente, de, por ejemplo, un material polímero, materiales óseos naturales o artificiales, proteínas o derivados proteicos. Como matriz portadora resultan adecuados, sobre todo, materiales de cerámica, metal, materiales polímeros (por ejemplo, PMMA) o, preferentemente, materiales de sustitución ósea resorbibles. Especialmente adecuados son los materiales resorbibles o biodegradables, por ejemplo, de bio-lactidas, en particular compuestos de D,L-polilactida racémica, o mezclas resorbibles de fosfato cálcico o hidroxiapatita, que pueden determinar la restauración del estado original del tejido, y que son conocidos, por ejemplo, del documento WO 96/36562 o EP 0 543 765. En función del campo de aplicación, puede ser adecuado también como matriz portadora colágeno o agar. Por la expresión “órgano biohídbrido” se entiende, habitualmente, una matriz inorgánica que está recubierta o 4
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unida de alguna forma con células vivas (véase antes). De acuerdo con la invención, se entiende también una correspondiente disposición que está exenta de células y que posee solamente los diferentes péptidos definidos según la invención sobre las partes de la superficie del implante, capaces de activar selectivamente las células del entorno cuando se inserta en el tejido defectuoso. La ventaja de estos órganos biohíbridos acelulares es que se pueden fabricar de forma económicamente favorable y controlada implantes biocompatibles “inteligentes”, que soportan la información biológica para la regeneración de un órgano. La integración de estos órganos biohíbridos en el cuerpo se lleva a cabo, entonces, por procesos de regeneración propios del organismo por medio de una auto-organización, por lo que es posible evitar la aparición de reacciones inmunológicas de defensa como las que se manifiestan con frecuencia, por ejemplo, con el implante de células o proteínas ajenas.
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De acuerdo con la invención, los implantes se presentan en forma de cuerpos moldeados o prótesis, en los que el cuerpo moldeado debe estar adaptado al defecto óseo/tisular. En el caso de órganos biohíbridos, las prótesis pueden estar formadas únicamente por membranas o láminas recubiertas con o sin las células correspondientes y los péptidos definidos según la invención, o presentar disposiciones como las que se conocen, por ejemplo, por el documento EP 0 504 781.
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Como péptidos a utilizar según la invención, se contemplan todos los péptidos y sus compuestos con sustituyentes no peptídicos, que contienen los dominios o secuencia de aminoácidos responsables de la adherencia celular, y que se pueden fijar a las superficies de los implantes por medio de sus sustituyentes peptídicos y no peptídicos. En particular, se toman en consideración los correspondientes péptidos con una secuencia RGD. La siguiente relación de péptidos o compuestos peptídicos preferidos sólo debe tener carácter de ejemplo y no de limitación, utilizándose las siguientes abreviaturas:
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Asp (D) Gly (G) Arg (G) Tyr (Y) Ser (S) Phe (F) Lys (K) DPhe (f) Pro (P) Leu (L) Ile (I) Val (V) Glu (E) Thr (T) Ala (A)
= ácido aspártico = glicina = arginina = tirosina = serina = fenilalanina = lisina = D-fenilalanina = prolina = leucina = isoleucina = valina = ácido glutámico = treonina = alanina
(a) Ejemplos de péptidos adecuados que contienen RGD 45
RGD (Arg-Gly-Asp), GRGD (Gly-Arg-Gly-Asp), 50
GRGDY (Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr), RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), GRGDS (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser),
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RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe), GRGDF (Gly-Arg-Gly-Asp-Phe), 60
ciclo-RGDfK (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys), cicló-RGDfKG (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-Gly). (b) Ejemplos de péptidos adecuados que no contienen RGD
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LDV (Leu-Asp-Val),
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ES 2 229 499 T3 LGTIPG (Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly), REDV (Arg-Glu-Asp-Val), 5
IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val), YIGSRG (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly), LRE (Leu-Arg-Glu),
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PDSGR (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala), 15
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RYVVLPR (Arg-Tyr-Val-Val-Leu-Pro-Arg). Los péptidos definidos según la invención pueden ser tanto lineales como cíclicos. Los péptidos o secuencias de péptidos anteriormente mencionados pueden estar también presentes dentro de péptidos más largos con, en total, 4 a 20 aminoácidos, dependiendo del péptido seleccionado según la invención. Asimismo, se comprenden, de acuerdo con la invención, aminoácidos con configuración D- o L- o que están C- y/o N-alquilados. Por péptidos cíclicos se entiende, según la invención, aquellos péptidos que están cerrados a través de un enlace amida en forma de anillo, sin que en la molécula haya presentes, preferentemente, grupos carboxilo o amino libres. De acuerdo con la invención, se prefieren de manera especial péptidos RGD, en particular aquéllos de la relación anteriormente indicada y, de ellos, en especial el pentapéptido RGDfK, que es conocido en su forma cíclica por el documento DE-OS-1 95 38 741, y que es específico para osteoblastos, así como el hexapéptido RGDfKG, presente también en forma cíclica, y que es específico para trombocitos. Los correspondientes péptidos definidos según la invención, lineales y cíclicos, se describen, por ejemplo, en las siguientes solicitudes de patente: EP 0 632 053, EP 0 655 462, EP 0 578 083, EP 0 770 622, DE 1 95 38 741. De manera especial, resultan adecuados aquellos péptidos que se fijan selectivamente a las especies celulares que expresan las integrinas alfav beta3 / alfav beta5 (por ejemplo, osteoblastos, osteoclastos, células endoteliales), sin que se fijen, simultáneamente, a, por ejemplo, especies celulares portadoras de αIIIb β3 (por ejemplo, plaquetas de la sangre). Los péptidos, así como sus correspondientes derivados, se pueden sintetizar fácilmente según métodos convencionales, siempre que no se puedan obtener de alguna otra forma.
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En principio, los péptidos definidos según la invención pueden estar fijados a la superficie del biomaterial por adsorción o unión covalente. El método de adsorción resulta menos adecuado cuando se utilizan diversos péptidos unidos a un único y mismo implante, puesto que el revestimiento diferente y localmente selectivo, según la invención, de la superficie sólo resulta escasamente satisfactorio. 40
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El acoplamiento de los péptidos o de sus análogos no peptídicos a superficies portadoras por unión covalente, muy a menudo por medio del denominado anclaje molecular, es conocido en sí y ha sido suficientemente descrito, por ejemplo, por Singer et al. (1987, J. Cell Biol., 104: 573); Brandley, Schnaar (1989, Develop. Biol. 135: 74); Massia, Hubbell (1990, Anal. Biochem. 187: 292); Hirano et al. (1991, J. Biomed. Mat. Res. 25: 1523); Lin et al. (1992, Biomaterials 13: 905); Nicol et al. (1992, J. Biomed. Mat. Res. 26: 393); Dee et al. (1995, Tissue Engin. 1: 135), sin hacer referencia, en general, al recubrimiento de implantes ni, en particular, a método alguno. Objetos de la presente invención son nuevas aplicaciones de métodos de recubrimiento en sí conocidos para la fabricación de los implantes según la invención tales como, por ejemplo, el procedimiento Kevloc® (documento EP 0 712 621), que se utiliza por primera vez, según la invención, para el acoplamiento de los citados péptidos (o de sus análogos no peptídicos) a superficies que contienen componentes de anclaje de acriloílo o metacriloílo, o bien el procedimiento “Silicoated®” (documento DE-OS 42 25 106), utilizado, según la invención, para el acoplamiento de los correspondientes péptidos por medio de componentes de anclaje de acriloílo o metacriloílo normalmente a través de una capa intermedia de acriloílo/meracriloílo-derivado de silano (por ejemplo, 3-metacriloxipropil-trimetoxisilano) a las correspondientes matrices portadoras. Una posibilidad adicional de fijar los péptidos definidos según la invención a la superficie de la matriz portadora o del implante consiste en el uso análogo de un procedimiento de silanización, descrito en el documento DE-OS 43 21005, que originalmente se aplicó para el recubrimiento de pigmentos de brillo perlado para sistemas de lacas al agua para metales y materiales sintéticos de la industria del automóvil y de las materias sintéticas. Adicionalmente, resulta adecuado, según la invención, un procedimiento para el recubrimiento de superficies de oro con péptidos portadores de grupos tiol, descrito originalmente en otro contexto (Heuvel et al., 1993, Analytical Biochem. 215:223). Los procedimientos descritos no se han utilizado hasta la fecha para el recubrimiento de implantes para su bioactivación.
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El acoplamiento de los correspondientes péptidos definidos según la invención a la superficie del implante tiene lugar, de acuerdo con la invención, mediante las correspondientes moléculas de anclaje, es decir, el péptido no se fija, por lo general, inmediatamente a la superficie del implante por sí mismo. La introducción de una molécula de este 6
ES 2 229 499 T3 tipo, definida más detalladamente más adelante, tiene, sobre todo, la finalidad de satisfacer los requisitos estéricos del receptor biológico sobre las células diana en relación con la unión del correspondiente péptido. 5
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La superficie del implante debe contener, para ello, los correspondientes grupos funcionales o unidades reactivas que hacen posible una unión de los correspondientes grupos funcionales de la molécula de anclaje. Los grupos funcionales que se deben poner a punto en la superficie del implante están determinados por el estado de la matriz portadora, así como por sus diferentes requisitos (materiales metálicos, de materia sintética, óseo). En implantes metálicos, por ejemplo, se puede conseguir una capa superficial reactiva para los restos SH de la molécula de anclaje mediante la aplicación por vaporización de oro. La silanización de superficies metálicas según procedimientos conocidos (véase antes) da lugar, asimismo, a superficies reactivas que pueden formar compuestos con las moléculas de anclaje según la invención adecuadas, utilizando eventualmente adhesivos que contienen silanos (véase más adelante). Los implantes de hueso natural o materiales óseos similares a los naturales (por ejemplo, cementos de fosfato cálcico) pueden fijar moléculas de anclaje que contienen un grupo fosfonato reactivo (principio descrito por Chu, Orgel, 1997, Bioconjugates Chem. 8: 103). A los implantes de material sintético a base de acrilato (por ejemplo, PMMA), o de otros materiales con un correspondiente recubrimiento de material sintético se pueden acoplar moléculas de anclaje que presentan, por su parte, un resto acrilato reactivo propio. Moléculas de anclaje, en el sentido de la invención, son, por lo tanto, moléculas a base de cadenas de alquilo o cadenas de hidrocarburos modificadas o sustituidas, que poseen al menos dos grupos funcionales diferentes, en los que, por lo general, un grupo funcional es un resto carboxilo libre (grupo NH2 libre) que, con un grupo NH2 libre (grupo carboxilo libre) produce un enlace amida de una cadena lateral de un péptido definido según la invención, en especial, un péptido RGD, y el otro grupo funcional que, preferentemente, está localizado en el extremo opuesto de la cadena C de la molécula de anclaje y que produce una unión directa o indirecta con la superficie del implante es, en función de la estructura o requisitos de la superficie del implante, preferentemente, un resto que contiene (met)acrilo o un grupo mercapto. En principio, se pueden utilizar también otros grupos funcionales, capaces de reaccionar con los respectivos grupos reactivos inmediatamente en la superficie del implante, o en una capa intermedia adecuada, para formar una unión estable. Las moléculas de anclaje de la invención poseen, como se ha indicado anteriormente, simultáneamente la función de espaciador o “spacers”; por lo tanto, junto con las mencionadas opciones de acoplamiento, muestran una longitud correspondiente, eventualmente adaptada de manera específica, para permitir que los dominios responsables del estímulo de la adherencia celular tengan la distancia correcta frente a las células diana, de forma que se mejore la fijación celular desde el punto de vista estérico o, incluso, que se pueda realizar por primera vez.
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La función biológica de los dominios que reconocen las células y que portan la correspondiente secuencia de aminoácidos se ha comprobado, por ejemplo, en base a un péptido sintético que se une a las especies celulares que expresan una integrina alfav beta3 / alfav beta5 (por ejemplo, osteoblastos, osteoclastos, células endoteliales) (Haubner et al., 1996, J. Am. Chem. Soc., 118-7461-7472).
40
Las moléculas de anclaje de la invención poseen, preferentemente, las siguientes estructuras lineales, a las que los péptidos definidos según la invención se unen a través del grupo NH2 de una de sus cadenas laterales de aminoácidos, preferentemente, la cadena lateral de lisina, al extremo carboxilo libre de la correspondiente molécula de anclaje. (i) Derivados del ácido mercapto(amido)carboxílico
45
−CO − (CH2 )k − X − SH, en donde X es un enlace sencillo o -CO-NH-(CH2 )I -, 50
k significa 2 hasta 12 e I es 2 hasta 4. (ii) Derivados del ácido acrilamido-carboxílico
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−CO − (CH2 )m − [NH − CO − (CH2 )n ]p − NH − CO − CH = CH2 , en donde m y n significan 2 hasta 8; p = 0 hasta 2,
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(iii) Derivados del ácido acrilamido-amidotrietilen-glicólico −(CO − CH2 − O − CH2 − CH2 − O − CH2 − CH2 − NH)q − CO − (CH2 )r − NH − CO − CH = CH2 , en donde significan q = 1 hasta 3 y r = 2 hasta 8.
65
Se prefieren, en particular, los siguientes tipos de moléculas de anclaje especiales: (ia) -CO-CH2 -CH2 -SH (ácido mercapto-propiónico) 7
ES 2 229 499 T3 (ib) -CO-CH2 -CH2 -CO-N-H-CH2 -CH2 -SH (ácido mercapto- etilamido-succínico) (iia) -CO-(CH2 )5 -NH-CO-CH=CH2 (ácido acrilamida-hexanoico) 5
(iib) -CO-(CH2 )5 -NH-CO-(CH2 )5 -NH-CO-CH=CH2 (ácido acrilamida-hexanoico-ácido amidohexanoico), (iiia) -CO-CH2 -O-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -NH-CO-(CH2 )5 -NH-CO-CH=CH2 (ácido acrilamida-hexanoico-ácido amido-trietilenglicólico)
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(iiib) -(CO-CH2 -O-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -NH)2 -CO-(CH2 )5 -NH-CO-CH=CH2 (ácido acrilamida-hexanoico-diácido amido-trietilenglicólico) En general, se prefieren según la invención aquellas estructuras de moléculas de anclaje que tienen en la cadena C lineal al menos seis átomos de C. Sorprendentemente, se ha encontrado que esta longitud de la molécula de anclaje resulta especialmente favorable para alcanzar resultados óptimos en relación con la integración tisular acelerada y reforzada del implante. El dato de al menos seis átomos de C en la cadena lineal se refiere, de acuerdo con la invención, a la longitud total de la molécula entre el péptido y la superficie del implante. De esta forma, resultan también adecuadas moléculas de anclaje de las estructuras anteriormente definidas con cadenas más cortas (por ejemplo, tipo ia), en caso que no se hayan introducido otros componentes de acoplamiento no mencionados, prolongadores de la cadena, entre el péptido y la superficie del implante. Las moléculas de anclaje se fijan, en forma de amidas, con los péptidos definidos según la invención por métodos estándares, a través de la función carboxilo, formándose de este modo estructuras del tipo péptido-NH-CO-molécula de anclaje, que, como se ha mencionado antes, se fijan en el implante y se generan construcciones del siguiente tipo: péptido-NH-CO-molécula de anclaje-(superficie del) implante. Se prefieren las correspondientes construcciones de implante compuestas por alguno de los péptidos definidos anteriormente mencionados de forma aislada, en particular, péptidos RGD, una de las moléculas de anclaje mencionada anteriormente en general y especialmente definidas, y un correspondiente implante de superficie reactiva. Se prefieren de manera especial los siguientes implantes: ciclo-RGDfK NH-CO-derivados de tiol (tipo: i) - implante ciclo-RGDfK NH-CO-derivados de acrilato (tipo: ii) - implante ciclo-RGDfK NH-CO-derivados de acrilato-glicol (tipo: iii) - implante
35
ciclo-RGDfKG NH-CO-derivados de acrilato-glicol (tipo: iii) - implante, en los que la cadena C lineal de la molécula de anclaje total posee por lo menos seis átomos C. 40
Entre éstas, se prefieren especialmente: ciclo-RGDfK NH-CO-derivado de tiol (tipo: ib) - implante ciclo-RGDfK NH-CO-derivado de acrilato (tipo: iia) - implante
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ciclo-RGDfK NH-CO-derivado de acrilato (tipo: iib) - implante ciclo-RGDfK NH-CO-derivado de acrilato-glicol (tipo: iiia) - implante 50
ciclo-RGDfKG NH-CO-derivado de acrilato-glicol (tipo: iiia) - implante ciclo-RGDfK NH-CO-derivado de acrilato-glicol (tipo: iiib) - implante.
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La fabricación de estas estructuras tiene lugar según métodos convencionales, o se describe en la solicitud paralela, presentada el mismo día por la solicitante, que tiene como objeto las estructuras de anclaje de péptidos como tales. Como se ha indicado ya anteriormente, para el anclaje de los derivados peptídicos cito- o histoselectivos a la superficie del biomaterial según la invención, se siguen básicamente tres vías alternativas, en las que el patrón de reconocimiento molecular de los dominios selectivos, portadores de las respectivas secuencias RGD, puede permanecer inalterado para un tipo determinado de célula, así como el separador, en tanto que el anclaje molecular se puede variar en función de las variantes mencionadas de acoplamiento, por ejemplo, por: - acoplamiento de derivados de péptido de tiol en superficies de biomaterial recubiertas con oro (por ejemplo, con moléculas de anclaje de tipo (i));
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- acoplamiento de derivados de (met)acriloílo-péptido en superficies de biomateriales recubiertas con acrilato o metacrilato (por ejemplo, con moléculas de anclaje de los tipos (ii) o (iii)); 8
ES 2 229 499 T3 - acoplamiento de derivados de (met)acriloílo-péptido sobre superficies de biomateriales recubiertas con silano (por ejemplo, con moléculas de anclaje del tipo (ii) o (iii)), con un derivado de (met)acrilato-silano como agente adhesivo o capa intermedia (por ejemplo, 3-metacriloxipropil-trimetoxisilano). 5
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La formación de la longitud media crítica de la molécula de anclaje para las diversas variantes de acoplamiento de los péptidos a las superficies de los biomateriales tiene lugar por síntesis de los péptidos definidos según la invención con las moléculas de anclaje definidas según la invención, de una longitud de cadena con, preferentemente, 6 a 24 átomos C y diferentes propiedades de hidrofobia / hidrofilia a elegir (por ejemplo, mediante el uso de unidades cuantitativamente diferentes de -CH2 - y/o ácido amido-hexanoico o etilenglicol según métodos convencionales en sí conocidos, y posterior ensayo de la eficacia biológica por determinación de la adherencia celular in vitro tras el recubrimiento de las correspondientes superficies de biomateriales). De la forma descrita, resulta posible seleccionar, en función de las propiedades del material del implante, un procedimiento de recubrimiento adecuado para el acondicionamiento de las superficies antes del acoplamiento con los derivados peptídicos de la invención. Adicionalmente, dependiendo del tipo de tejido o de célula en el que se debe llevar a cabo la integración del biomaterial/implante, también es posible el recubrimiento con otros péptidos, también dirigidos a activar las integrinas de la especie celular diana tales como, por ejemplo, la integrina alfa6 beta4 de las células epiteliales (por ejemplo, para la aplicación de implantes de hueso, mandíbula, piel o cabello), o la integrina alfaIIb beta3 de las plaquetas sanguíneas. Los péptidos RGD alfav beta3 -específicos exhiben selectividad frente a las células endoteliales y osteoblastos, por lo que serían adecuados, por ejemplo, para el recubrimiento de prótesis vasculares o implantes óseos. De esta manera, se puede llevar a cabo una recubrimiento de superficie bioactivador adecuado para implantes en el campo del tejido óseo, vasos sanguíneos, dientes, piel y cabello, así como para prácticamente cualquier órgano.
25
Antes de poder poner a punto los implantes u órganos biohíbridos según la invención, los péptidos adecuados para los correspondientes tipos celulares se debe analizar y calcular en un sistema de ensayo in vitro su eficacia biológica, para poder emprender, posteriormente, un recubrimiento dirigido y selectivo del implante que se debe aplicar en el tejido investigado.
30
El análisis necesario para ello de la estructura de integrina-receptor del tejido diana o de las células diana en el que se debe incorporar el implante, tiene lugar por medio de procedimientos inmuno-histológicos actuales y conocidos tales como, por ejemplo, por inmunofluorescencia o por la inmuno-histoquímica de muestras de tejidos. Los anticuerpos contra diversos receptores de integrina o sus subunidades, necesarios para estos análisis, son entretanto conocidos y se encuentran disponibles o se pueden generar por medio de métodos convencionales tales como, por ejemplo, inmunizaciones adecuadas.
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Los péptidos definidos según la invención se acoplan de forma covalente en distintas concentraciones sobre superficies de cultivo, por ejemplo, de poliestireno recubierto con albúmina de suero bovino (BSA). El material del soporte para este ensayo no juega en la determinación de los péptidos adecuados ningún papel esencial. Igualmente, el método de acoplamiento utilizado también es de escasa importancia. Por motivos prácticos, el acoplamiento en estas determinaciones también se puede realizar por incubación y adsorción de los citados péptidos sobre el soporte de ensayo. A continuación, se investiga la adhesión de los cultivos celulares y tisulares (por ejemplo, osteoblastos) en las células que deben ser activadas in vivo en el tejido natural, analizando sus propiedades adherentes frente a las superficies correspondientemente recubiertas. El criterio para la selección de los cultivos celulares adecuados para los ensayos de adhesión consiste en patrones de expresión de integración con respecto a las células diana in vivo tras el implante, por ejemplo, su expresión de alfav beta3 / alfav beta5 o alfaIIIb beta3 , que se verifica por medio de anticuerpos, marcados por fluorescencia, contra las integrinas alfav beta3 , alfav beta5 o alfaIIIb beta3 , o contra las subunidades alfav , alfaIIIb , beta3 o beta5 del receptor de integrinas en base a un “Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)” (“Clasificados de células activadas por fluorescencia”). En otras especies de células diana, in vivo, con diferentes patrones de receptores de integrinas, se deben utilizar, de manera correspondiente, otros anticuerpos. Éstos son conocidos entretanto y se encuentran disponibles o se pueden generar mediante métodos convencionales conocidos, por ejemplo, por inmunización adecuada.
55
Las diferentes especies celulares seleccionadas se recubren con los péptidos analizados, se siembran en superficies de cultivo de poliestireno pretratadas con BSA y se incuban. Seguidamente, se eliminan por lavado las células que no se han adherido. 60
El comportamiento de fijación de las diversas especies celulares seleccionadas a las superficies de ensayo recubiertas con los distintos péptidos definidos según la invención se corresponde en caso positivo, es decir, cuando existe una especificidad suficiente, con una curva de titulación con un índice máximo de adsorción de aproximadamente 60 hasta 100% de las células sembradas, así como con una unión semi-máxima de células con una concentración de péptidos RGD en la solución de recubrimiento de aproximadamente 5 nM hasta 5 µM.
65
De forma similar a la descrita para el acoplamiento de péptidos adecuados a superficies de poliestireno previamente recubiertas con BSA, es posible llevar a cabo estrategias de anclaje a superficies de biomateriales modificadas o acondicionadas, utilizando diferentes capas intermedia que fomentan la adherencia. 9
ES 2 229 499 T3 En resumen, se puede afirmar lo siguiente: Los implantes del estado de la técnica muestran los siguientes inconvenientes: 5
- integración lenta e incompleta del implante en el tejido; - aceptación tisular limitada; - estabilidad funcional insuficiente del implante/capa limítrofe del tejido
10
- acción estimulante deficitaria del implante sobre la neogénesis del tejido; - propiedades no fisiológicas de la superficie del implante. 15
Como consecuencia de estas desventajas, se producen los siguientes problemas: - aflojamientos asépticos del implante (por ejemplo, formación de cápsula fibrosa); - formación local de microtrombos;
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- infecciones; - inflamaciones; 25
- resorción tisular; - revisiones.
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Estos problemas se pueden resolver en gran medida por el procedimiento puesto a punto por la invención o mediante los implantes producidos mediante el mismo. Los objetos de la invención se caracterizan por: - diseño a medida de péptidos de adhesión, que son complementarios al patrón de expresión de integrinas del tejido / células diana;
35
- estimulación selectiva de la adherencia celular de las células diana que deben llevar a cabo la neogénesis de tejido, sin potenciar simultáneamente la adherencia de células que afectan negativamente al proceso; - recubrimientos de mayor estabilidad por medio de moléculas de anclaje de péptidos de nueva generación;
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45
- aceleración y refuerzo del proceso de integración del implante en el tejido. Se ha podido demostrar que la distancia mínima absoluta, crítica y estérica, entre la secuencia de reconocimiento celular sobre el péptido y la superficie del material no recubierto es de entre 2,0 y 3,5 nm, preferentemente, entre 2,5 y 3,5 nm. Los índices máximos de revestimiento (80-100%) se pueden alcanzar con una distancia mínima de 3,0 hasta 5,0 nm. Breve descripción de los dibujos
50
Fig. 1: Análisis de la composición de integración de osteoblastos humanos primarios por FACS (Clasificador de Células Activadas por Fluorescencia) por medio de anticuerpos conjugados con fluorescencia contra integrinas alfav beta3 y alfav beta5 . Eje X: intensidad de la fluorescencia (cuentas)
55
Eje Y: número de células M21: controles positivos de alfav beta3 y alfav beta5 M21: controles negativos de alfav beta3 y alfav beta5
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HOB: cultivo de osteoblastos humanos primarios ROB: cultivo de osteoblastos de rata primarios 65
Fig. 2: Adherencia de osteoblastos MC3T3 H1 a diversos péptidos RGD en superficies de ensayo de poliestireno recubiertas con BSA. Eje X: concentración de péptidos RGD en la solución de recubrimiento (µM) 10
ES 2 229 499 T3 Eje Y: grado de distribución celular (%) Curva superior: ciclo-RGDfK NH-CO-CH2 -CH2 -S-(sulfo-SMPB) (“derivado 1-SMPB de péptido de tiol”), SMPB = 4-(p-maleimido-fenil)-butirato de succinimidilo; 5
Curva superior media: ciclo-RGDfK NH-CO-CH2 -CH2 -CO-NH-CH2 -CH2 -S-(sulfo-SMPB) (“derivado 2-SMPB de péptido de tiol”) 10
Curva inferior media: ciclo-RGDvE CO-NH-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -CO-NH-CH2 -CH2 -S (sulfo SMPB) (“derivado 3-SMPB de péptido de tiol”) Curva inferior: controles de péptido de tiol: ciclo-RβAdfK-NH-CO-CH2 -CH2 -S-(sulfo-SMPB)
15
Fig. 3: Adherencia de osteoblastos a superficies de ensayo recubiertas con derivado 1-SMPB de péptido de tiol (véase Fig. 2) Eje X: concentración de péptidos en la solución de recubrimiento (µM), Eje Y: grado de distribución de células (%),
20
Curva superior: osteoblastos de ratón MC3T3 H1; Curva superior media: células osteo-progenitoras humanas primarias 25
Curva media: osteoblastos humanos primarios; Curva inferior media: controles negativos de alfav beta3 M21L Curva inferior: osteoblastos de rata primarios
30
Fig. 4: Adherencia de osteoblastos a superficies de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de péptido de tiol (10 µM en la solución de recubrimiento) Eje X: concentración de RGDfK disuelto (sin anclaje molecular) en medio adhesivo (µM), 35
Eje Y: grado de distribución de células (%); Curva superior: osteoblastos de ratón MC3T3 H1; 40
Curva media: osteoblastos humanos primarios; Curva inferior: osteoblastos de rata primarios.
45
Fig. 5: Adherencia de osteoblastos a superficies de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de péptido de tiol (10 µM en la solución de recubrimiento), Eje X: número de células sembradas / cm2 Eje Y: número de células adheridas / cm2
50
Curva superior: osteoblastos de rata primarios; Curva superior media: osteoblastos de ratón MC3T3-H1; 55
Curva inferior media: osteoblastos humanos primarios; Curva inferior: recubrimiento negativo con BSA
60
Fig. 6: Adherencia de osteoblastos a superficies de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de péptido de tiol (10 µM en la solución de recubrimiento), (véase Fig. 2), Eje X: número de células sembradas / cm2 Eje Y: requisito de superficie calculado / células (µm2 )
65
Curva superior: osteoblastos humanos primarios; Curva media: osteoblastos de ratón MC3T3-H1; 11
ES 2 229 499 T3 Curva inferior: osteoblastos de rata primarios. Fig. 7: Adherencia de osteoblastos a superficies de ensayo recubiertas con el derivado 1-SMPP de péptido de tiol (10 µM en la solución de recubrimiento), (véase Fig. 2), 5
Eje X: tiempo (min) Eje Y: grado de distribución de células (%) 10
Curva superior: osteoblastos de ratón MC3T3-H1; Curva media: osteoblastos humanos primarios; Curva inferior: osteoblastos de rata primarios.
15
Fig. 8: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1 a superficies PMMA de cemento óseo recubiertas con diversos péptidos RGD: Eje X: Concentración de péptido RGD en la solución de recubrimiento (µM) 20
Eje Y: grado de distribución de células (%) Curva superior: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido de acrilato 3); 25
Curva superior media: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iib, péptido de acrilato 2); Curva inferior media: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iiib, péptido de acrilato 4); Curva inferior: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iia, péptido de acrilato 1);
30
Fig. 9: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1 a las superficies porosas de PMMA/PHEMA recubiertas con diversos péptidos RGD: Eje X: concentración de péptido RGD en la solución de recubrimiento (µM), 35
Eje Y: grado de distribución de células (%) Curva superior: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo iiia, péptido de acrilato 3); 40
Curva media: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo iiib, péptido de acrilato 4); Curva inferior: derivado de ciclo-RGDfK CO-NH-acrilato (tipo iib, péptido de acrilato 2),
45
Fig. 10: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1 a superficies porosas de PMMA/Plex Y7H recubiertas con diversos péptidos RGD: Eje X: concentración de péptido RGD en la solución de recubrimiento (µM), Eje Y: grado de distribución de células (%)
50
Curva superior: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo iiia, péptido de acrilato 3); Curva media: derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo iiib, péptido de acrilato 4); 55
Curva inferior: derivado de ciclo-RGDfK CO-NH-acrilato (tipo iib, péptido de acrilato 2). Fig. 11: Adherencia máxima de osteoblastos MC3T3-H1 a superficies de cemento óseo PMMA o poliestirenoBSA-SMPB recubiertas con diferentes péptidos RGD de diversa longitud molecular:
60
Eje X: longitudes moleculares de los péptidos RGD (nm) Eje Y: grado de distribución máximo (%).
65
Fig. 12: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1 a superficies de acero fino V4A recubiertas con el péptido RGD derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido de acrilato 3). Las superficies de acero fino se han recubierta previamente, por su parte, con diversos procedimientos. Eje X: concentración de péptido RGD en la solución de recubrimiento (µM), 12
ES 2 229 499 T3 Eje Y: grado de distribución de células (%); Curva superior: recubrimiento Kevloc®; 5
Curva media: recubrimiento Silicoater®; Curva inferior: recubrimiento con pigmento.
10
Fig. 13: Proliferación de osteoblastos MC3T3-H1 a superficies de cemento óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido de acrilato 3). Eje X: duración del cultivo (días), Eje Y: número de células,
15
Curva superior: péptido 100 µM en la solución de recubrimiento; Curva superior media: péptido 1 µM en la solución de recubrimiento;
20
Curva inferior media: péptido 0,1 µM en la solución de recubrimiento; Curva inferior: controles no recubiertos.
25
Fig. 14: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1 y trombocitos a superficies de cemento óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido de acrilato 3). Eje X: osteoblastos solos y trombocitos solos sembrados sobre superficies con diversas concentraciones de péptidos en la solución de recubrimiento de 100 µM, 10 µM y 1 µM.
30
Eje Y: número de células (absorción a 405 nm). Fig. 15: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1 y trombocitos a superficies de cemento óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de ciclo RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido de acrilato 5).
35
Eje X: osteoblastos solos y trombocitos solos sembrados sobre superficies con diversas concentraciones de péptidos en la solución de recubrimiento de 100 µM, 10 µM y 1 µM. Eje Y: número de células (absorción a 405 nm).
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Fig. 16: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1, trombocitos y una mezcla de osteoblastos y trombocitos a superficies de cemento óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de ciclo-RGDfK-acrilato (tipo: iiia, péptido de acrilato 3). Eje X: osteoblastos solos, trombocitos solos y mezcla de osteoblastos y trombocitos sembrados sobre las superficies con la concentración de péptidos en la solución de recubrimiento de 100 µM. Eje Y: número de células (absorción a 405 nm).
50
Fig. 17: Adherencia de osteoblastos MC3T3-H1, trombocitos y una mezcla de osteoblastos y trombocitos a superficies de cemento óseo-PMMA recubiertas con el péptido RGD derivado de ciclo RGDfK NH-CO-acrilato (tipo: iiia, péptido de acrilato 5). Eje X: osteoblastos solos, trombocitos solos y mezcla de osteoblastos y trombocitos sembrados sobre la superficie, con una concentración de péptidos en la solución de recubrimiento de 100 µM.
55
Eje Y: número de células (absorción a 405 nm). Los siguientes Ejemplos explican adicionalmente la invención, sin limitarla en ningún sentido. 60
Ejemplo 1
65
(a) Se llevó a cabo la síntesis del péptido ciclo-RGD (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) con el anclaje de ácido mercaptopropiónico (→ derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-tiol tipo: ia) de acuerdo con el procedimiento del documento DE 1 95 38 741. De manera análoga, se llevó a cabo la síntesis del correspondiente derivado ciclo-RβAdfK inactivo desde el punto de vista biológico, así como del derivado ciclo-RGDfK sin molécula de anclaje. (b) Se obtuvo ciclo-(R(Pbf)GD(tBu)fK(Z) (Pbf = pentametil-benzofuran-sulfonilo; tBu = terc-butilo) por síntesis peptídica de fase sólida (Merrifield, Angew. Chem. 1985, 97:801) y subsiguiente ciclación (por ejemplo, según Zimmer 13
ES 2 229 499 T3 et al., 1993, Liebigs Ann. Chem: 497). Tras la separación selectiva del grupo protector Z según métodos convencionales se puede prolongar la cadena lateral de lisina por reacción de 0,1 mmol de ciclo (R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]) con 0,2 mmol de anhídrido de ácido succínico (bsa) en 5 ml de dimetilformamida en ciclo (R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]). 5
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(c) La síntesis del péptido ciclo-RGD (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) con el anclaje de ácido mercapto-etil-amidosuccínico (→ derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-tiol tipo: ib = ciclo(RGDf[tiol-bsa-K]) se llevó a cabo de la forma siguiente: se disolvieron 10 mmol de hidrocloruro de cisteamino y una cantidad equimolar (eq.) de trifenil-metanol a 60ºC en acético glacial y se mezclaron, bajo agitación, con 1,1 eq. de eterato de BF3 . Después de agitar durante 50 minutos, se neutralizó con una solución saturada de NaHCO3 y se extrajo con éster acético. El aceite remanente del extracto se disolvió en terc-butanol para convertirlo en el hidrocloruro, se llevó a pH = 2 con ácido clorhídrico diluido y se liofilizó, rendimiento 99%. El componente obtenido de esta forma se acopla según métodos convencionales con EDCl x HCl a ciclo(R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]) y se separan los grupos protectores laterales. (d) La síntesis del péptido ciclo-RGD (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) con el anclaje ácido acril-amido-hexanoico (→ derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilo tipo: iia = ciclo(RGDf[acril-ahx-K]) se llevó a cabo de la forma siguiente: El sistema de anclaje acrílico se sintetizó de modo separado y se acopló como éster alquílico de la cadena lateral del péptido. Adicionalmente, se suspendieron 10 mmol de ácido 6-amino-hexanoico y 1,8 eq. de hidróxido de calcio en agua y se agregaron a 0ºC, 1,2 eq. de cloruro ácido de acrilo. El hidróxido de calcio insoluble se separó por filtración y el filtrado de acidificó con ácido clorhídrico concentrado a pH = 2. El producto precipitado de recristalizó a partir de éster acético. Rendimiento: 65%. 10 mmol del ácido 6-acrilamido-hexanoico cristalino se suspendieron en 50 ml de diclorometano, se mezclaron con 1 eq. de 1-hidroxi-succinimida y, a 0ºC, se agregaron 1,2 eq. de CDClxHCl. Después de agitar durante una hora, se detuvo la reacción por la adición de 10 µl de acético glacial. Se extrajo múltiples veces con una solución fría y saturada de carbonato sódico y agua y, a continuación, se secó sobre sulfato sódico. Rendimiento: 52%. El éster activo presente ahora se acopló en DMF a ciclo(R(Pbf)GD(tBu)fK) y se separaron los grupos protectores de las cadenas laterales según métodos convencionales. (e) La síntesis del péptido ciclo-RGD (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) con el anclaje de ácido acril-amino-hexanoicoácido amido-hexanoico (→ derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilo tipo: iib = ciclo(RGDf[acril-ahx-ahx-K]) se llevó a cabo de la forma siguiente: para la síntesis del sistema de anclaje acrílico se disuelven 10 mmol de ácido aminohexanoico en tampón acuoso de fosfato sódico (pH 8) y se enfría a 0ºC. Se disolvieron 2 mmol de éster activo del ácido acril-amido-hexanoico (véase (d)) en etanol/CHCl3 y se agregaron lentamente. El valor de pH se mantuvo constante en 8 con NaOH diluido. Después de la separación por destilación del disolvente orgánico, se acidificó la fase acuosa con ácido clorhídrico concentrado a pH 2,6 y se separó por filtración el sólido que precipitó, se lavó con agua y se secó sobre pentóxido de fósforo. Rendimiento: 70%. El sistema de anclaje acrílico presente ahora se acopla con EDClxHCl según métodos en sí conocidos a la cadena lateral del péptido y se separan los grupos protectores. (f) La síntesis del péptido ciclo-RGD (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) con el anclaje ácido acril-amido-hexanoico-ácido amido-trietilenglicólico (→ derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilo tipo: iiia = ciclo(RGDf[acril-ahx-tEG-K]) se llevó a cabo de la forma siguiente: el sistema de anclaje acrílico se efectuó por síntesis peptídica de fase sólida (véase antes). Como último componente se acopló el ácido acril-amido-hexanoico (véase antes). Rendimiento: 97%. El sistema de anclaje acrílico ahora presente se acopla con EDClxHCl según métodos en sí conocidos a la cadena lateral peptídica y se separan los grupos protectores.
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(g) La síntesis del péptido ciclo-RGD (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) con el anclaje de ácido acril-amido-hexanoicoácido amido-trietilenglicólico-ácido amido-trietilenglicólico (→ derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilo tipo: iiib = ciclo-(RGDf[acril-ahxEG-tEGK]) tuvo lugar de forma análoga a (f). Rendimiento: 85%. 50
(i) La síntesis del péptido ciclo-RGD (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) con el anclaje de ácido acril-amido-hexanoicoácido amido-trietilenglicólico (→ derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilo tipo: iiia = ciclo- (RGDf[acril-ahx-tEGKG]) tuvo lugar de forma análoga a (f). Rendimiento: 81%. Ejemplo 2
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De acuerdo con el procedimiento establecido por Singer et al, 1987, J. Cell Biol., 104:573, o por Ruoslahti et al. (1982, Methods Enzymol., 32: 803-831), se llevó a efecto el acoplamiento covalente de los péptidos según la invención con 4-(p-maleimidofenil)-butirato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-SMPB) sobre superficies de cultivo de poliestireno previamente recubiertas con albúmina de suero bovino (BSA). 60
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Para ello, se recubrieron 48 pocillos (Costar, “non-tissue culture treated”, Art, nº 3547) con sendos 2450 µl de PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH = 8,3, 2% de BSA por pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche con el fin de generar una capa de BSA sobre el poliestireno. Seguidamente, se lavó con 250 µl de PBS, pH = 8,3, por pocillo y se incubaron con sendos 250 µl de una solución con 100 µg/ml de SMPB en PBS, pH 8,3, durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, tuvo lugar un lavado triple de los pocillos con sendos 250 µl de PBS, pH 8,3. Para la preparación de las soluciones de recubrimiento, se péptido tiol-RGD se aplicó a las siguientes concentraciones finales en PBS, pH 8,3: 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM, 100 µM y 1 mM. Tras la adición de sendos 250 µl de solución de recubrimiento/pocillo se incubó durante la noche a temperatura ambiente y, 14
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a continuación, se lavó tres veces con PBS, pH 8,3. Mediante la adición de sendos 250 µl de una solución al 5% de BSA en PBS, pH 7,4, la subsiguiente incubación durante 2 horas a temperatura ambiente y el lavado con PBS, pH 7,4, se bloquearon puntos de fijación celulares inespecíficos. Como controles de recubrimiento negativo se utilizaron superficies de poliestireno, que se trataron, a partir del recubrimiento con una solución de BSA al 5%, de manera idéntica a las muestras positivas. A continuación se analizó la adherencia de cuatro cultivos celulares, obtenidos a partir de tres especies diferentes, a las superficies recubiertas con péptido RGD anteriormente mencionadas: - osteoblastos humanos primarios de la esponjosa de la cabeza del fémur de pacientes adultos (Siggelkow et al., 1997, Bone, 20: P231);
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- células osteo-progenitoras humanas primarias de la médula ósea de pacientes adultos (Vilamitjana-Amedee et al., 1993, In vitro Cell Dev. Biol., 29: 699); 15
- osteoblastos primarios del cráneo de ratas recién nacidas, cuya preparación y cultivo se efectuó de acuerdo con los métodos de Yagiela y Woodbury (1977, The Anatomical Record, 188: 287-305); - línea celular de osteoblastos MC3T3-H1, obtenida del cráneo de ratones recién nacidos (Heermeier et al., 1995, Cells and Materials, 5:309-321), y
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- línea celular del melanoma humano M21L como controles negativos de la integrina alfav beta3 /alfav beta5 .
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Antes de utilizar estas especies celulares en los experimentos de adherencia, se verificó su expresión de integrinas por medio de anticuerpos marcados con fluorescencia contra los receptores alfav beta3 o alfav beta5 , así como contra las subunidades de integrinas alfav , beta3 y beta5 , por medio de un Clasificador de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) de Becton-Dickenson. De esta forma, se demostró una fuerte expresión de las citadas integrinas (Fig. 1).
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Las especies celulares descritas se sembraron con una densidad de siembre a 48.000 células/cm2 , como se ha descrito anteriormente, con placas de 48 pocillos Costar recubiertas con péptido RGD y, seguidamente, se incubaron durante 1 hora a 37ºC, 95% de humedad relativa del aire y 5% de CO2 . Subsiguientemente, se separaron dos veces por lavado con PBS, pH 7,4, las células no adheridas durante el ensayo. La cuantificación de las células adheridas tuvo lugar de manera indirecta durante la determinación de actividad de la enzima celular N-acetil- hexosaminidasa, utilizando una curva estándar correspondiente, según el método de Landegren (1984, J. Immunol. Methods, 67: 379-388).
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El recubrimiento de superficies de cultivo celular de poliestireno pretratadas con BSA con los 1- y 2-derivados (sulfo-SMPB)de péptido de tiol alfav beta3 o alfav beta5 -selectivos conduce a una estimulación potente y dependiente de la dosis de la adherencia de los osteoblastos cultivados de ratón MC3T3-H1 (véase la Fig. 2). Por el contrario, el control de péptido de tiol biológicamente inactivo carece de efecto significativo, con lo que se demuestra la alta selectividad y la elevada especificidad de la interacción integrina-péptido RGD. También el péptido de tiol 3 escasamente alfav beta3 /alfav beta5 -selectivo (sulfo-SMPB) (ciclo-RGDvE-aminocisteína-ácido amido-hexanoico; Delforge et al., 1996, Anal. Biochem. 242, 180) muestra un efecto claramente más débil que los correspondientes 1- y 2-derivados del péptido de tiol. El comportamiento de unión de las diferentes especies celulares a las superficies de poliestireno, pretratadas con BSA, recubiertas con el derivado de péptido de tiol 1-(sulfo-SMPB) o con el derivado de péptido de tiol 2-(sulfoSMPB), se corresponde un una curva de titulación con un índice máximo de adsorción de aproximadamente 70% (osteoblastos de rata primarios), aproximadamente 80% (osteoblastos humanos primarios y células osteo-progenitoras humanas primarias) y de aproximadamente 90-100% (osteoblastos de ratón MC3T3-H1) de las células sembradas, así como una fijación celular semi-máxima con una concentración de péptido RGD en la solución de recubrimiento de 50-1000 nM (Fig. 3). Los controles negativos de alfav beta3 / alfav beta5 (M21L) no muestran, por el contrario, ninguna adherencia celular significativa. Los índices de adsorción celular descritos se encuentran elevados en aproximadamente 20-40 veces con respecto a superficies recubiertas con BSA al 5%, que no conducen a adherencia celular significativa alguna con ninguno de los cultivos de osteoblastos utilizados. El comportamiento similar de los citados cultivos de osteoblastos confirma que el efecto estimulante de la adhesión es específico para los osteoblastos, pero independiente de la especie usada.
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La unión de los anteriormente citados cultivos de osteoblastos a superficies de poliestireno pretratadas con BSA recubiertas con el derivado de tiol-péptido 1-sulfo-SMPB se puede inhibir por completo mediante la adición de RGDfK cíclico disuelto en medio de adhesión (Fig. 4). Este resultado pone de manifiesto que los fenómenos de adherencia celular observados sólo pueden ser mediados por los péptidos RGD. 65
La dependencia de la adherencia celular de los osteoblastos humanos primarios o de las células MC3T3-H1 sobre las mencionadas superficies de poliestireno, pretratadas con BSA, y recubiertas con el péptido de tiol 1,2 (sulfoSMPB), del número de células sembradas proporciona una curva de siembra (Fig. 5). Sobre el recubrimiento negativo 15
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de BSA, por el contrario, no se produce ninguna adhesión significativa de células. La superficie media por célula adherida, calculada con una densidad máxima de siembra celular, de aproximadamente 200 hasta 500 µm2 indica en esta superficie una distancia media entre células de aproximadamente 15 hasta 25 µm (Fig. 6). Dado que el diámetro celular de los osteoblastos es de aproximadamente 10 a 15 µm, resulta evidente que el recubrimiento peptídico de las posiciones de adherencia celular se encuentra en valores tales que se puede generar una superficie densamente ocupada con osteoblastos, en la que las células adyacentes están estrechamente dispuestas unas junto a otras. La evolución en el tiempo del proceso de adhesión celular sobre la citada superficie muestra una rápida adhesión de las células, que, en función del tipo celular, finaliza después de aproximadamente 45 a 60 minutos (Fig. 7). Las líneas celulares (por ejemplo, MC3T3-H1) muestran, en este caso, una cinética de adherencia más rápida que los cultivos celulares primarios (humano, de rata). En este ensayo, no se reconocen diferencias significativas entre los dos derivados de péptido de tiol utilizados. Ejemplo 3
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Para investigar la influencia de diversas longitudes de las moléculas de anclaje y, con ella, la distancia entre la secuencia RGD de reconocimiento celular y la superficie del material sobre el grado de adhesión de los osteoblastos, se prepararon cuatro péptidos de acrilato-RGD diferentes (derivado de ciclo-RGDfK NH-CO-acrilato (tipos: iia, iib, iiia, iiib), con diferentes longitudes de espaciadores moleculares.
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Las síntesis de los ciclo-RGD-péptidos se llevaron a cabo como se muestra en el Ejemplo 1 o de acuerdo con el procedimiento de Pless et al. 1983, J. Biol. Chem. 258: 2340-2349, o de Gurrath et al., 1992, Eur. J. Biochem., 210: 911-921.
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Las correspondientes longitudes de anclaje de estos péptidos ascienden a aproximadamente 2,6 nm (péptido de acrilato 1, tipo iia), 3,5 nm (péptido de acrilato 2, tipo iib), 3,7 nm (péptido de acrilato 3, tipo iiia) ó 4,2 nm (péptido de acrilato 4, tipo iiib). Para el acoplamiento covalente de estos péptidos sobre superficies PMMA (poli(metacrilato metílico) polimerizadas, se prepararon los correspondientes cuerpos moldeados de diversa porosidad (diámetro: 10 mm; altura: 2 mm) a partir de tres diferentes componentes de PMMA. - Cemento óseo a base de PMMA (Cía. Merck KgaG, Alemania, Aut. nº 5181.00.00), conformes con la descripción de producto (40 g de polvo + 20 ml de líquido);
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- Se mezclaron 10 g de granulado de PMMA/PHEMA (metacrilato de polihidroxietilo), tamaño de partícula 0,5-0,6 mm (Cía. Biomet) con 1,3 ml de una solución de HEMA (68,6% de HEMA, 29,4% de TEGMA [dimetacrilato de trietilenglicol], 2% de tBPB (peroxibenzoato de terc-butilo), adhiriéndolo de esta forma a un material de soporte poroso.
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- Se mezclaron 10 g de granulado de PMMA (Plex Y7H, Röhm, Alemania), fracción de grano 0,7-2 mm, con 1,5 ml de una solución de metacrilato de metilo (MMA) (68,6% de MMA, 29,4% de TEGMA, 2% de tBPB), adhiriéndolos de esta forma a un material de soporte poroso.
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Para el acoplamiento covalente de los péptidos de acrilato a los cuerpos moldeados de PMMA pre-polimerizados, se prepararon soluciones madre de los péptidos de acrilato 1, 2, 3 y 4 en una concentración final de, respectivamente, 100 µM en DMSO/0,2% de canfor-quinona (peso/volumen). A continuación, y mediante dilución con isopropanol/0,2% de canfor-quinona (p/v) se prepararon series de dilución con concentraciones de péptidos de, respectivamente, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM y 10 µM. Los cuerpos moldeados se incubaron durante 2 horas a luz solar y a temperatura ambiente y, seguidamente, se almacenaron bajo condiciones de sequedad a 4ºC. Antes de su uso, las muestras se lavaron tres veces con PBS, pH 7,4, para retirar los péptidos no fijados, y se almacenaron durante una noche en PBS, pH 7,4, a 4ºC. Por la adición de sendos 250 µl/cuerpo moldeado de una solución de BSA al 5% en PBS, pH 7,4, y subsiguiente incubación durante 2 horas a temperatura ambiente y un lavado único con PBS, pH 7,4, se bloquearon las posiciones de unión celular inespecíficas. A modo de controles negativos, se utilizan cuerpos moldeados de PMMA tratados con una solución de isopropanol/canfor-quinona al 0,2% (p/v) en lugar de las soluciones de péptidos.
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A continuación, se investigó la adhesión de osteoblastos de la línea MC3T3-H1, obtenidos del cráneo de ratones neonatos (Heermeier et al., 1995, Cells and Materials 5: 309-321) sobre las superficies recubiertas de péptidos anteriormente mencionadas. Los osteoblastos MC3T3-H1 se sembraron, con una densidad de siembre a 48.000 células/cm2 , de la forma anteriormente descrita, en el interior de placas de 48 pocillos de Costar, sobre cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido RGD y, seguidamente, se incubaron a 37ºC durante 1 hora con 95% de humedad relativa del aire y 5% de CO2 . A continuación, se retiraron con dos lavados con PBS, pH 7,4, las células no adheridas durante el experimento. 16
ES 2 229 499 T3 La cuantificación de las células adheridas tuvo lugar de manera indirecta durante la determinación de actividad de la enzima celular N-acetil- hexosaminidasa, utilizando una curva estándar correspondiente, según el método de Landegren (1984, J. Immunol. Methods, 67: 379-388). 5
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El comportamiento de fijación de los osteoblastos MC3T3-H1 a diferentes cuerpos moldeados de PMMA, recubiertos con los citados péptidos RGD de acrilato 1 (tipo iia), 2 (tipo iib), 3 (tipo IIIa) y 4 (tipo iiib) se corresponde, respectivamente, con una curva de titulación. Los índices máximos de adsorción ascienden a aproximadamente 20% para el péptido de acrilato 1 y a aproximadamente 80-100% para los péptidos de acrilato 2, 3 y 4. Los fijaciones celulares semi-máximas tienen lugar con una concentración de péptidos RGD en la solución de recubrimiento de aproximadamente 1-10.000 nM para los péptidos de acrilato 2, 3 y 4. Los índices de adsorción celular descritos sobre cuerpos moldeados de cemento óseo recubiertos con péptidos RGD están aumentados con respecto a las superficies no recubiertas en aproximadamente 1,5 veces (péptido de acrilato 1) y en aproximadamente 5-15 veces (péptidos de acrilato 2, 3 y 4) (Fig. 8).
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Los índices de adsorción celular descritos sobre cuerpos moldeados porosos de PMMA/granulado de PHEMA, recubiertos con el péptido RGD están aumentados con respecto a las superficies no recubiertas en 2-5 veces (péptidos de acrilato 2, 3 y 4) (Fig. 9). 20
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Los índices de adsorción celular descritos sobre cuerpos moldeados porosos de granulado de Plex Y7H, recubiertos con el péptido RGD están aumentados con respecto a las superficies no recubiertas en 2-3 veces (péptidos de acrilato 2, 3 y 4) (Fig. 10). Para las muestras de PMMA/PHEMA o para las muestras de PMMA-Plex Y7H se observa tanto un mayor ancho de fluctuación de los valores de adherencia celular como una adhesión más intensa de los osteoblastos sobre muestras de control no recubiertas, manteniéndose invariables los índices máximos de adsorción sobre muestras recubiertas con péptidos RGD, que para los cuerpos moldeados de cemento óseo de PMMA. Para los péptidos de acrilato 2, 3 y 4 se observan, tanto en la comparación entre sí, como en comparación con los péptido de tiol 1 y 2 usados en los controles de BSA-ensayo, estimulaciones muy similares de la adhesión celular. Por el contrario, el péptido más corto, el péptido de acrilato 1, es casi inactivo. De aquí puede deducirse que es necesaria una distancia mínima crítica entre la secuencia de reconocimiento celular RGD y la superficie del material de aproximadamente 2,5-3,5 nm para poder alcanzar una adherencia celular estéricamente eficaz (Fig. 11). La superior actividad del péptido de acrilato 3 sobre el soporte de cemento óseo-PMMA indica una estructura molecular óptima para la adhesión celular en lo que se refiere tanto a la longitud de la molécula como, eventualmente, a la distribución y comportamiento de hidrofilia/hidrofobia en el espaciador. Ejemplo 4
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Para analizar la adhesión celular de osteoblastos a superficies metálicas recubiertas con péptidos, se dotaron cuerpos moldeados de acero fino V4A (7x7x1 mm3 ) con tres diferentes variantes de recubrimiento, recubriéndolas respectivamente y a continuación con péptidos RGD. A tal efecto, los cuerpos moldeados de acero fino se incubaron, con objeto de purificarlos, durante 15 min a 60ºC en un baño de ultrasonidos, se enjuagaron con agua VE, se incubaron durante 30 min en acetona, se volvieron a enjuagar con agua VE y se incubaron durante 24 horas a 60ºC para secarlos. A continuación, las placas de acero fino de recubrieron por medio de tres variantes:
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a. Procedimiento Kevloc® (Cía. Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Alemania) Se aplicó la solución Kevloc®-Primer en una capa delgada y se incubó durante 3 min a temperatura ambiente. Seguidamente, se aplicó también la solución Kevloc®-Bond en capa delgada y se activó durante 20 min en un horno de calcinación a 180ºC. Puesto que esta variante de recubrimiento dispone directamente restos acrilato libres sobre la superficie metálica, fue posible acoplar seguidamente el péptido de acrilato 3, tipo iiia, directamente de forma covalente, del modo descrito en el Ejemplo 3 para el cemento óseo de PMMA polimerizado. b. Procedimiento Silicoater® (Cía. Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Alemania)
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Se aplica la solución Siliseal® en una capa delgada y se seca durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se aplica también la solución Sililink® y se activa durante 3 min a 320ºC en un horno de calcinación. Para la disposición de restos acrilato sobre las superficies metálicas, los cuerpos moldeados de acero fino pretratados se sumergieron en agua VE calentada a 75ºC y ajustada a pH aproximadamente 8,00 con NaOH. Seguidamente, se añadió durante el espacio de una hora una solución al 1% de 3-metacriloxi-propil-trimetoxisilano (Cía. Hüls AG, Alemania) bajo agitación, hasta alcanzar un valor de pH de aproximadamente 6,50. Se continuó agitando durante una hora a 75ºC y el valor de pH descendió en ese momento a aproximadamente 6,35. 17
ES 2 229 499 T3 La unión del péptido de acrilato 3, tipo iiia, tuvo lugar de la forma descrita en el Ejemplo 3 para el cemento óseo PMMA polimerizado. c. Recubrimiento con pigmento (Cía. Merck KgaG, Darmstadt, Alemania): 5
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Esta variante de recubrimiento tuvo lugar de forma correspondiente con un procedimiento de silanización, descrito en el documento DE-OS 43321005, y que se refirió originalmente a la práctica técnica del recubrimiento de pigmentos con brillo perlado para sistemas de laca en agua para metales y materias sintéticas en la industria del automóvil y de las materias sintéticas. Para ello, los cuerpos moldeados de acero fino se sumergieron en agua VE calentada a 75ºC y ajustada a pH aproximadamente 8,00 con NaOH y, durante un período de dos horas se agregó una solución de AlCl3 bajo agitación. A continuación, se agregó, también con agitación y durante dos horas, una solución al 5% de silicato sódico. Seguidamente, se añadió, bajo agitación, una solución al 1% de metacriloxi-propil-trimetoxisilano (Cía. Hüls AG, Alemania) durante una hora. Entonces, se agitó durante una hora a 75ºC y el valor de pH estuvo en ese momento en aproximadamente 6,40.
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La fijación del péptido de acrilato 3, tipo iiia, tuvo lugar de la forma descrita en el Ejemplo 3 para el cemento óseo de PMMA polimerizado. 20
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Después de haber recubierto los cuerpos moldeados de acero fino con el péptido de acrilato 3, tipo iiia, según los tres procedimientos diferentes, se investigó la adhesión de osteoblastos de la línea MC3T3-H1.Para ello, se procedió de la forma descrita en el Ejemplo 3. El comportamiento de unión de los osteoblastos MC3T3-H1 a los cuerpos moldeados de acero fino V4A pretratados con tres procedimientos diferentes y recubiertos con el citado péptido de acrilato 3, se corresponde, respectivamente, con una curva de titulación (Fig. 12). Los índices máximos de adhesión ascienden a aproximadamente 60% para el recubrimiento de pigmento y a aproximadamente 80% para los procedimiento Kevloc® y Silicoater®. Las uniones celulares semi-máximas tienen lugar con una concentración de péptido RGD en la solución de recubrimiento de aproximadamente 1-100 nM para todas las variantes de recubrimiento. Los índices de adsorción celular descritos sobre cuerpos moldeados de acero fino recubiertos con péptido RGD se encuentran elevados, con respecto a los controles no recubiertos, en aproximadamente 3-8 veces. Para los procedimientos Kevloc® y Silicoater® se prepararon, respectivamente, recubrimientos adicionales, utilizando únicamente una solución de recubrimiento (Kevloc®-Primer solo, Kevloc®-Bond solo, Siliseal® solo, Sililink® solo). No se encontraron diferencias significativas de la adhesión celular en comparación con los correspondientes dobles recubrimientos (Kevloc®-Primer/Bond, Siliseal®/Sililink®). Ejemplo 5 Como investigación complementaria, no sólo de la adhesión de osteoblastos, sino también de su proliferación sobre superficies recubiertas con péptidos RGD, se procedió del modo siguiente:
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En relación con el acoplamiento covalente del péptido de acrilato 3, tipo iiia, sobre un cuerpo moldeado de cemento óseo PMMA, se seleccionó un procedimiento de recubrimiento descrito en el Ejemplo 3. A continuación, se adhirieron osteoblastos de ratón MC3T3-H1, de la forma descrita también en el Ejemplo 3, sobre este cuerpo moldeado de cemento óseo recubierto con el péptido RGD, pero con dos diferencias: se sembraron 12.000 células/cm2 en lugar de 48.000 células/cm2 y el tiempo de adhesión ascendió a dos horas en lugar de una. Adicionalmente, sólo se analizaron tres concentraciones de péptidos diferentes en la solución de recubrimiento: 0,01 µM, 1 µM y 100 µM. Después de retirar por lavado las células no adheridas, los osteoblastos MC3T3-H1 se cultivaron en medio de cultivo que contuvo suero (al 10%), durante un período de 15 días, a 37ºC bajo 95% de humedad relativa del aire y 5% de CO2 . Se cambió el medio dos veces a la semana y se determinó el número de células después de 1, 2, 3, 4, 5, 10 y 15 días por medio del Ensayo WST-1 de Boehringer Mannheim, Alemania. Se demostró, respectivamente, una evolución típicamente exponencial de la proliferación celular de los osteoblastos cultivados (Fig. 13). El número máximo de células alcanzado dependió, de forma directa, de la concentración del péptido RGD en la solución de recubrimiento. De esta forma, después de 15 días de cultivo se determinaron por cm2 aproximadamente 1.000.000 células (péptido 100 µM ), aproximadamente 550.000 células (péptido 1 µM), aproximadamente 300.000 células (péptido 0,01 µM) o aproximadamente 230.000 células (controles sin péptido). Con la concentración máxima de péptido, de 100 µM, se logró, por consiguiente, un incremento de 4-5 veces de la proliferación celular en comparación con las muestras no recubiertas.
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Ejemplo 6
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Como modelo del recubrimiento de material con péptidos RGD de diferentes selectividad celular para la obtención de implantes con patrones de recubrimiento bioactivo localmente diferenciados, que deben estimular la adhesión de diversas especies celulares, se utilizaron cuerpos moldeados de cemento óseo PMMA polimerizado, a los cuales se acoplaron de forma covalente dos péptidos RGD de distinta selectividad celular. En este caso, se fijaron al cuerpo moldeado de PMMA el péptido de acrilato 3, tipo iiia, con selectividad para osteoblastos portadores de la integrina 18
ES 2 229 499 T3 alfav beta3 /alfav beta5 , y el péptido de acrilato 5, tipo iiia, con selectividad para trombocitos alfaIIb beta3 -positivos, como se han descrito en el Ejemplo 3. 5
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a. En el primer ensayo parcial, se recubrieron cuerpos moldeados de PMMA con los péptidos de acrilato 3 y 5, en concentraciones en la solución de recubrimiento de, respectivamente, 100 µM, 10 µM y 1 µM. Acto seguido, estos materiales recubiertos con péptidos RGD se inocularon paralelamente con osteoblastos y trombocitos y se determinó su adhesión celular. Tanto sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 3 como sobre los recubiertos con el péptido de acrilato 5 se sembraron, de manera paralela, osteoblastos MC3T3-H1 (350.000 células/cm2 ) o trombocitos humanos (50 millones de células/cm2 ) y se determinó su adherencia celular, de la forma descrita en el Ejemplo 3. Los trombocitos humanos se prepararon de acuerdo con el procedimiento de Shattil y Brass (J. Biol. Chem. 262: 992-1000, 1987).
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Con este experimento se pudo demostrar la selectividad celular de los dos péptidos RGD. Sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 3 (alfav beta3 /alfav beta5 -selectivo) se adhirieron, preferentemente, los osteoblastos alfav beta3 /alfav beta5 -positivos, en comparación con los trombocitos alfav beta3 /alfav beta5 -negativos (Fig. 14). En este caso, se encontraron para los osteoblastos Abs calculadas (405 nm) de aproximadamente 6,0 (para el péptido 100 µM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 2,0 (para el péptido 10 µM) o aproximadamente 1,8 (para el péptido 1 µM). Por el contrario, para los trombocitos se encontraron valores de adhesión celular significativamente menores de aproximadamente 3,0 Abs (para el péptido 100 µM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 1,5 Abs (para el péptido 10 µM), o aproximadamente 0,2 Abs (para el péptido 1 µM). Por el contrario, sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 5 (alfaIIb beta3 -selectivo), se encontró el efecto inverso. En este caso, se adhirieron, preferentemente, los trombocitos alfaIIb beta3 -positivos, en comparación con los osteoblastos alfaIIb beta3 -negativos (Fig. 15). En este caso, se encontraron Abs calculadas para los trombocitos (405 nm) de aproximadamente 4,0 (para el péptido 100 µM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 0,5 (para el péptido 10 µM) o aproximadamente 0,2 (para el péptido 1 µM). Para los osteoblastos, por el contrario, se encontraron valores de adhesión celular significativamente menores de aproximadamente 1,5 Abs (para el péptido 100 µM en la solución de recubrimiento), aproximadamente 1,0 Abs (para el péptido 10 µM) o aproximadamente 0,2 Abs (para el péptido 1 µM).
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b. En el segundo ensayo parcial se recubrieron también cuerpos moldeados de PMMA con los péptidos de acrilato 3 y 5, pero con sólo una concentración en la solución de recubrimiento de 100 µM. A continuación, estos materiales recubiertos con péptidos RGD se inocularon paralelamente con osteoblastos, trombocitos o una mezcla de osteoblastos y trombocitos, determinando su adhesión celular. Tanto en los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 3 como en los recubiertos con el péptido de acrilato 5, se sembraron, de forma paralela, osteoblastos MC3T3-H1 (350.000 células/ cm2 ), trombocitos humanos (50 millones de células/cm2 ) o una mezcla celular (350.000 osteoblastos/cm2 o 50 millones de trombocitos/cm2 ) y se determinó su adherencia celular de la forma descrita en el Ejemplo 3.
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En los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 3 se adhirieron, preferentemente, osteoblastos alfav beta3 /alfav beta5 -positivos (aproximadamente, 6,0 Abs), en comparación con los trombocitos alfav beta3 / alfav beta5 -negativos (aproximadamente 3,0 Abs) (Fig. 16). Al sembrar las dos especies celulares en forma de mezcla, se obtuvo un resultado correspondiente al de los osteoblastos solos (aproximadamente 6,5 Abs).
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Sobre los cuerpos moldeados de PMMA recubiertos con el péptido de acrilato 5 (alfaIIb beta3 -selectivo), por el contrario, se encontró el efecto inverso. En este caso, se adhirieron, preferentemente, los trombocitos alfaIIb beta3 positivos (aproximadamente 4,0 Abs), en comparación con los osteoblastos alfaIIb beta3 -negativos (aproximadamente 1,5 Abs) (Fig. 17). Al sembrar ambas especies celulares en forma de mezcla, se obtuvo un resultado correspondiente, aproximadamente, a la suma de los valores individuales para trombocitos y osteoblastos (aproximadamente 6,5 Abs).
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Estos resultados confirman que los recubrimientos de las superficies de implantes con diferentes péptidos RGD cito-selectivos se pueden utilizar para generar implantes que medien en la adherencia preferida de especies celulares seleccionadas. En este caso, la comparación entre osteoblastos y trombocitos demuestra que: 60
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- el recubrimiento superficial con péptidos RGD selectivos para las integrinas puede estimular claramente la adhesión de aquellas especies celulares que disponen de una configuración de integrina complementaria, frente a las células que no poseen, o sólo lo hacen en grado reducido, estas integrinas especiales; - este efecto se mantiene también en caso de utilizar mezclas de células, lo que se aproxima esencialmente más al estado real in vivo.
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ES 2 229 499 T3 REIVINDICACIONES 5
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1. Implante, adecuado para diferentes órganos humanos o animales, compuesto esencialmente por una matriz portadora y un recubrimiento peptídico que reviste a esta matriz, que comprende, para la estimulación dirigida de la adherencia de células del cuerpo humano o animal, péptidos idénticos o diferentes que poseen secuencias que reconocen puntos de unión en los receptores de las integrinas responsables de la adhesión, en células humanas o animales, en el que la matriz portadora tiene en su superficie grupos reactivos capaces de fijación que, adicionalmente, son capaces de formar con los correspondientes grupos reactivos funcionales de dicha capa peptídica, una unión covalente, caracterizado porque los mencionados péptidos dispuestos en la superficie del implante se seleccionan y se disponen localmente de manera que, gracias a su actividad estimulante de la adhesión celular, relacionada con las estructuras correspondientemente diferentes, se corresponden de forma específica con el patrón de integrina complementario, diferente y natural de las células del tejido que le son adyacentes en las respectivas regiones, en las cuales se debe introducir el implante, lo que tiene como consecuencia la presencia de un patrón de recubrimiento bioactivo, selectivo y localmente diferenciado de la superficie del implante. 2. Implante según la reivindicación 1, caracterizado porque los citados péptidos se fijan en la superficie del implante con la ayuda de moléculas de anclaje.
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3. Implante según la reivindicación 2, caracterizado porque las moléculas de anclaje están compuestas por una de las siguientes estructuras: −CO − (CH2 )k − X − SH,
(i)
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en donde X es un enlace sencillo o -CO-NH-(CH2 )I -, k significa 2 hasta 12 e I = 2 hasta 4; 30
−CO − (CH2 )m − [NH − CO − (CH2 )n ]p − NH − CO − CH = CH2 ,
(ii)
en donde m, n significan 2 hasta 8; p = 0 hasta 2; 35
−(CO − CH2 − O − CH2 − CH2 − O − CH2 − CH2 − NH)q − CO − (CH2 )r − NH − CO − CH = CH2
(iii)
en donde q significa 1 hasta 3 y r = 2 hasta 8. 40
4. Implante según la reivindicación 3, caracterizado porque la molécula de anclaje se selecciona de una de las siguientes estructuras: −CO − CH2 − CH2 − SH;
(ia)
−CO − CH2 − CH2 − CO − NH − CH2 − CH2 − SH;
(ib)
−CO − (CH2 )5 − NH − CO − CH = CH2 ;
(iia)
−CO − (CH2 )5 − NH − CO − (CH2 )5 − NH − CO − CH = CH2 ;
(iib)
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−CO − CH2 − O − CH2 − CH2 − O − CH2 − CH2 − NH − CO − (CH2 )5 − NH − CO − CH = CH2 ; (iiia) −(CO − CH2 − O − CH2 − CH2 − O − CH2 − CH2 − NH)2 − CO − (CH2 )5 − NH − CO − CH = CH2 (iiib)
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5. Implante según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque los péptidos están unidos a través del grupo carboxilo de la molécula de anclaje por enlaces de amida, y la molécula de anclaje está unida a la superficie del implante a través de los grupos mercapto o acrilato. 65
6. Implante según la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de anclaje-péptido de este tipo se fija a la superficie del implante, de modo que se establece una distancia mínima absoluta y estéricamente crítica entre los dominios de reconocimiento celular del péptido y una superficie recubierta del material de 2,5 hasta 3,5 nm. 20
ES 2 229 499 T3 7. Implante según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los péptidos son capaces de fijarse a células que expresan αv β3 /αv β5 . 5
8. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque posee péptidos con la secuencia de aminoácidos RGD. 9. Implante según la reivindicación 8, caracterizado porque posee péptidos de la secuencia ciclo-RGDfK.
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10. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque tiene entre los citados péptidos o moléculas de anclaje-péptidos y la superficie de la matriz portadora, una capa intermedia que fomenta la adhesión y/o moléculas ramificadas que ejercen un efecto amplificador de la superficie. 11. Implante según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la matriz portadora es una pieza moldeada de cerámica, material polímero o metal, o representa una estructura de estos materiales que puede estar formada como órgano biohíbrido por medio de la colonización con células in vivo o in vitro. 12. Procedimiento para la fabricación de implantes según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque
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(i) se determina por un sistema de ensayo in vitro la estructura del receptor de integrina del tejido diana, en el que se debe incorporar in vivo el implante, (ii) se seleccionan o sintetizan los citados péptidos con la correspondiente estructura complementaria, y
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(iii) los citados péptidos se fijan de forma covalente directamente, o a través de las mencionadas moléculas de anclaje, sobre la respectiva superficie, eventualmente modificada del implante, en donde la disposición local de los diferentes péptidos sobre la superficie del implante debe corresponderse con la respectiva disposición local, previamente determinada, de las células diana con el patrón de integrinas complementario, en el que se debe incorporar el implante. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque la determinación in vitro de la estructura de los receptores de integrina del tejido diana se lleva a cabo por medio de anticuerpos inmuno- histológicamente activos. 14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el acoplamiento de los citados péptidos, o de la molécula de anclaje-péptido, se realiza sobre la superficie del implante por medio de otros procedimientos conocidos para otros tipos de recubrimiento.
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