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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 206 918

51 Int. Cl. : A61L 24/00

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A61L 27/00 A61L 31/00 A61K 6/033 A61P 19/00

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

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86 Número de solicitud europea: 98918533 .5

86 Fecha de presentación: 21.04.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 0984795

87 Fecha de publicación de la solicitud: 15.03.2000

54 Título: Injertos y prótesis óseos recubiertos con fosfatasa ácida resistente al tartrato.

30 Prioridad: 22.04.1997 US 44033 P

73 Titular/es: Washington Research Foundation

2815 Eastlake Avenue East, Suite 300 Seattle, Washington 98102, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.05.2004

72 Inventor/es: Lee, Minako, Y.;

Eyre, David, R. y Weis, Mary, Ann, E.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

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16.05.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCIÓN Injertos y prótesis óseos recubiertos con fosfatasa ácida resistente al tartrato. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) es un potente factor de diferenciación para los osteoclastos. La invención proporciona, en la forma de realización reivindicada actualmente, injertos óseos recubiertos con TRAP y prótesis ortopédicas y dentales implantables permanentes. TRAP, también conocida como uteroferrina (12; véanse las citas adjuntas), fosfatasa ácida púrpura (13) o fosfatasa ácida de tipo 5 (14-16) es una glucoproteína catiónica que contiene hierro con un peso molecular de aproximadamente 35 kDa. Una variedad de órganos incluyendo huesos, bazo, pulmones, placenta, el útero de la cerda preñada y determinadas células leucémicas expresan esta enzima (12-17). La actividad de la enzima TRAP se detecta en la sangre y una concentración alta de enzima refleja la remodelación ósea activa (18, 19). En el hueso, la enzima se expresa en gran medida mediante osteoclastos multinucleares y células mononucleares que se cree que son osteoclastos o percursores de osteoclastos (15). El alto nivel de expresión por los osteoclastos y la concentración de TRAP en las vacuolas citoplásmicas, los canales extracelulares, los límites rizados en la interfase célula-hueso han implicado a la enzima en la degradación de la matriz ósea (20). Se desconoce, sin embargo, todavía la función de TRAP. Un anticuerpo bloqueante para la uteroferrina porcina inhibió de forma notable tanto la actividad de la enzima como la reabsorción ósea in vitro por los osteoclastos (21). Varios informes apuntan hacia un papel de TRAP en la remodelación del hueso. Ratones inconscientes que carecen de TRAP, generados por la técnica de recombinación homóloga, presentaron osificación endocondrial anormal de los huesos y una forma inusual de osteopetrosis leve (22). Numerosos estudios han demostrado que M-CSF desempeña un papel crítico tanto en la maduración como en la función de los macrófagos y osteoclastos (3). Los osteoclastos, células que reabsorben el hueso, son esenciales para el crecimiento y la remodelación esquelética normal. Proceden de células madre/progenitoras hematopoyéticas del linaje granulocito/macrófago, pero el punto exacto de su divergencia es controvertido (1, 2). Aunque los estudios recientes han dado a conocer varios factores implicados en las interacciones célula a célula en el desarrollo de la función de los osteoclastos (3, 4), la regulación de la diferenciación del progenitor de osteoclastos y la regeneración en una superficie ósea para la reabsorción se comprende poco todavía. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares de la diferenciación y regeneración de los osteoclastos podría conducir a nuevos diagnósticos y productos terapéuticos para su utilización en la prevención y tratamiento de la osteoporosis, una enfermedad común que procede de un desequilibrio neto entre la reabsorción ósea y la formación ósea en el esqueleto del adulto. Este desequilibrio puede extenderse cuando se acelera la reabsorción después de la menopausia asociada a un aumento del número de osteoclastos y a la actividad reabsorbente. También es sabido que determinados carcinomas son propensos a la metástasis del hueso y/o pueden liberar factores localmente o de for2

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ma generalizada que activan la osteolisis (reabsorción ósea). Las bases moleculares y celulares de dichas propiedades tumorales no se comprenden totalmente. La presente invención se refiere a composiciones y aparatos adecuados para la implantación ortopédica o dental en el hueso, caracterizados por la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito. Dichos implantes incluyen los trasplantes óseos autólogos, los alotrasplantes óseos cadavéricos, los cementos óseos que contienen hidroxiapatito, los aparatos protésicos tales como articulaciones y dientes postizos con superficies de unión al hueso recubiertas de hidroxiapatito y aparatos de fijación ortopédicos tales como grapas y placas con superficies de contacto al hueso recubiertas de hidroxiapatito. En el momento de la implantación, el recubrimiento de TRAP sirve para regenerar o atraer células progenitoras de osteoclastos desde la médula ósea o el torrente sanguíneo hasta el implante óseo o la superficie de hidroxiapatito del aparato o accesorio protésico. La población de osteoclastos regenerados graba la superficie mineral del hueso o de hidroxiapatito del implante y de este modo proporciona las señales naturales para regenerar los osteoblastos para depositar hueso nuevo que se apoyará y se integrará en el injerto o en la superficie protésica simulando el proceso natural de deposición ósea en una superficie ósea reabsorbida por osteoclastos. La estimulación producida por TRAP de la recuperación de osteoclastos produce la osteointegración y la unión mejorada del injerto o de la prótesis en el hueso del paciente. Esto reduce el tiempo de recuperación de la operación y prolonga la vida de los implantes, reduciendo su tendencia bien documentada a desprenderse durante varios años. Los injertos de hueso también se integran mecánica y biológicamente con más eficacia en el hueso vivo en la zona del implante. En un aspecto, por consiguiente, la presente invención proporciona una composición adecuada para la implantación médica que comprende una fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito. En otro aspecto, la presente invención proporciona un aparato protésico, p. ej.: una articulación postiza o un diente postizo, con una superficie externa de unión al hueso que comprende una fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato de hidroxiapatito. En otro aspecto, la presente invención proporciona un aparato de fijación ortopédico, p. ej.: seleccionado de entre un tornillo, una grapa, un clavo, un perno o una placa, con una superficie de contacto al hueso que comprende una fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito. En otro aspecto, la presente invención proporciona fosfatasa ácida resistente al tartrato adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito para su utilización como producto farmacéutico. En otro aspecto, la presente invención proporciona la utilización de fosfatasa ácida resistente al tartrato adsorbida en un sustrato poroso de hidroxiapatito para la preparación de un medicamento para producir la estimulación de la regeneración de osteoclastos o como factor de diferenciación de los osteoclastos. Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas relacionadas de la presente invención se apreciarán

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más fácilmente a medida que las mismas se comprendan mejor en relación con la siguiente descripción detallada, cuando se consideren conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que: La Figura 1 presenta los resultados de la purificación del medio CESJ inicial por cromatografía con heparina-sefarosa, tal como se describe en los Ejemplos. En esta presentación gráfica de los datos, tanto la actividad biológica (barras sombreadas) desde el punto de vista de las células TRAP positivas por pocillo como el contenido de proteínas (línea de puntos) medido por absorbancia a 280 nm, se representan en ordenadas; y las fracciones eluídas de la columna se presentan en abscisas; la Figura 2 presenta la purificación adicional de la actividad positiva a TRAP en una columna de hidroxiapatito. Los datos se representan en ordenadas y abscisas aquí como en la Figura 1; y la Figura 3 presenta el aislamiento final de TRAP por HPLC en columna de exclusión por tamaño. Aquí, tanto la actividad biológica (barras sombreadas) desde el punto de vista de las células TRAP positivas por pocillo como el contenido en proteínas (trazo continuo) se mide por absorbancia a 220 nm, se representa en ordenadas del gráfico superior (Figura 3A) y la actividad de la enzima TRAP, se mide por escisión de pnitrofenilo con fosfato, se representa en ordenadas del gráfico inferior (Figura 3B) en función de mUnidades de TRAP/ml (línea de puntos); el volumen de elución (ml) se presenta en la abscisa común. Se describe aquí el aislamiento y la caracterización del único factor responsable principalmente de las potentes propiedades de regeneración de los osteoclastos de una línea celular de carcinoma de mama murino, CESJ. Se aisló la actividad biológica por afinidad secuencial con heparina, hidroxiapatito y cromatografía de tamices moleculares. La molécula demostró ser de forma inesperada la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) por análisis de la secuencia N-terminal y de la actividad de la enzima. Se preparó TRAP recombinante y demostró favorecer la formación de la colonia de osteoclastos in vitro de las células madre de la médula del ratón, similares a las observaciones para la molécula aislada del medio acondicionado con células tumorales CESJ. Se llega a la conclusión de que TRAP, mediante su actividad enzimática como fosfatasa o generador de radicales libres derivados del oxígeno, actúa quizás como un potente factor de diferenciación para los osteoclastos. Se propone un papel para TRAP en la biología ósea normal en la regeneración de los osteoclastos en determinadas superficies óseas direccionadas para la reabsorción y también para continuar la regeneración local de nuevos osteoclastos para activar zonas de reabsorción por los osteoclastos existentes. Informes anteriores sobre una asociación no explicada de TRAP con los osteocitos en el tejido óseo, en el hueso medular transitorio de los pájaros que incuban huevos y en la matriz de las zonas óseas y de cartílago calcificadas destinadas a la reabsorción están en concordancia con un papel como agente de regeneración de osteoclastos. Se deposita hueso medular en los ejes largos del hueso de los pájaros que incuban huevos como una fuente de calcio fácilmente disponible para la formación de cáscara de huevo (Roach, H.I. (1997) J. Bone Miner. Res. 12, 795-805). Este hueso se forma y se reabsorbe rápidamente en fase con el ciclo de incubación del huevo. Las hembras de pájaros

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(codorniz) a las que se administra estrógenos también depositarán hueso medular. La matriz del hueso medular se tiñe positivamente con TRAP a diferencia del hueso permanente (Yamamoto, T y Nagai, H. (1992) J. Bone Miner. Res. 7, 1267-1273 y (1994) 9, 11531157). Se llegó a la conclusión de que los osteoblastos están implicados en esta acumulación de TRAP aún cuando las propias células no se tiñan por TRAP. Estas observaciones están en concordancia con el presente descubrimiento en el que TRAP es un potente factor de diferenciación para los osteoclastos y con el papel propuesto para TRAP como agente de regeneración local para dirigir los osteoclastos a reabsorber una zona determinada de tejido óseo. Se prevé que los osteocitos y los osteoblastos en determinadas zonas locales del hueso puedan dirigir el tejido a la reabsorción y remodelación expresando TRAP que llega a estar unido a la fase mineral de hidroxiapatito de la matriz. La afinidad de TRAP para la unión observada al hidroxiapatito podría tener importancia biológica en este papel propuesto de regenerar los osteoclastos localmente en zonas mineralizadas del tejido dirigidas a la reabsorción. Los presentes descubrimientos ponen de manifiesto que TRAP tiene un papel directo como factor local en la regeneración de osteoclastos de las células madre hematopoyéticas. Así pues, en fisiología ósea normal, la TRAP segregada por los osteoclastos puede actuar localmente para regenerar osteoclastos adicionales para diferenciarse de las células madre en la médula o de las células progenitoras en circulación en el linaje macrófago/osteoclasto. Esta acción de señalización puede estar mediada por la molécula TRAP que actúa como un ligando a través de un mecanismo receptor de la superficie ligando/célula o más probablemente como consecuencia de la actividad catalítica de TRAP, ya sea la actividad de la fosfatasa o la generación de radicales de oxígeno u otras especies de oxígeno reactivo. Se indicó anteriormente que los radicales libres derivados del oxígeno pueden estimular la generación de osteoclastos en cultivos óseos, pero TRAP no estaba implicado como fuente. La afinidad para la unión observada o la adsorción de TRAP al hidroxiapatito presenta importantes implicaciones para proporcionar implantes óseos y dentales mejorados. Dichos implantes incluyen trasplantes óseos autólogos, alotrasplantes óseos cadavéricos, cementos óseos que contienen hidroxiapatito, aparatos protésicos tales como articulaciones y dientes postizos con superficies de unión al hueso recubiertas con hidroxiapatito y aparatos de fijación ortopédicos tales como grapas y placas con superficies de contacto con el hueso recubiertas de hidroxiapatito. Continuando con la invención, TRAP enzimáticamente activa, p. ej.: de origen recombinante, se adsorbe al componente de hidroxiapatito del trasplante óseo, cemento óseo o aparato antes de la implantación. En el caso de implantes óseos autólogos o de tejido de bancos óseos, el trasplante óseo puede estar simplemente sumergido en una solución estéril de TRAP en el quirófano antes de la implantación. Un alotrasplante de hueso implantado en una zona quirúrgica en la que se desea la sustitución completa eventual por el hueso del huésped se puede impregnar, en lugar de recubrir con TRAP solamente la superficie. Los equipos protésicos recubiertos con hidroxiapatito se pueden fabricar con un penetración predeterminada de TRAP adsorbida, p. ej.: del orden de aproximadamente 10 micras, me3

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didas por control de calidad por los procedimientos utilizados histoquímicamente para evaluar la distribución de la actividad enzimática de TRAP en secciones de tejido mineralizado. En algún caso, la TRAP se une al mineral del hueso (es decir, hidroxiapatito) o a la superficie de hidroxiapatito del implante. Se puede utilizar bien TRAP enzimáticamente activa o una forma latente que se puede activar en el cuerpo por proteolisis o por otros medios. En la implantación, el recubrimiento de TRAP sirve para regenerar o atraer las células progenitoras de los osteoclastos de la médula ósea o del torrente sanguíneo al implante óseo o a la superficie de hidroxiapatito del equipo protésico o accesorio. La población de osteoclastos regenerados graba el mineral del hueso o la superficie de hidroxiapatito del implante y proporciona de este modo las señales naturales para regenerar los osteoblastos que depositan hueso nuevo que se apoyarán y se integrarán en el trasplante o en la superficie protésica que simula el proceso natural de deposición ósea sobre una superficie ósea reabsorbida por los osteoclastos. La simulación producida por TRAP en la regeneración de osteoclastos produce la osteointegración y la unión mejorada del trasplante o de la prótesis en el hueso del paciente. Esto reduce el tiempo de recuperación de la operación y prolonga la vida de los implantes reduciendo su tendencia bien documentada a la pérdida a lo largo de varios años. Los trasplantes óseos también se integran más eficaz, mecánica y biológicamente en el hueso vivo en la zona del implante. El hidroxiapatito (conocido también como hidroxilapatito, fosfato hidróxido de calcio, trifosfato de calcio y fosfato tricálcico), Ca5 (PO4 )3 OH, es el componente mineral principal del hueso. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “hidroxiapatito” significa que comprende además compuestos derivados del fosfato de calcio utilizados en los implantes ortopédicos y dentales. Un amplio intervalo de dichos compuestos derivados ha estado constituido por reacciones entre, p. ej.: óxido de calcio y pentóxido de fósforo. Las cerámicas resultantes se pueden preparar en, por lo menos, ocho formas cristalinas, con varias microestructuras y densidades y pueden contener también otros elementos. (Campbell’s Operative Orthopaedics, octava edición, A.H. Crenshaw (Ed.), Mosby Year Book, pág 382, 1992). (véase, p. ej.: la patente U.S. nº 5.171.326 titulada “Calcium phosphate ceramics for bone tissue calcification enhancement” y la patente U.S. nº 4.097.935 titulada “Hydroxylapatite ceramic”). El hidroxiapatito poroso para usos médicos se ha formado también por transformación del exoesqueleto del coral Porites goniopora (hidroxiapatito coralino) (Pro Osteon, Interpore International). Están disponibles las formulaciones para inyectables y en el escenario in situ de las fracturas óseas (p. ej.: el cemento óseo esponjoso SRS, Norian Corporation) para proporcionar resistencia mecánica y permitir que tenga lugar con tiempo la remodelación mediante mecanismos celulares naturales. Los recubrimientos porosos de hidroxiapatito se aplican de forma convencional mediante técnicas de atomización de plasma a las superficies de contacto con el hueso de prótesis óseas permanentes. (Véase, p. ej.: la patente U.S. nº 5.397.362 titulada “Implant prosthesis and method for producing same” y patente U.S. nº 5.279.831 titulada “Hydroxyapatite prosthesis coatings”). Por ejemplo, en una prótesis postiza de 4

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cadera, el vástago de aleación de titanio que se insertará en un fémur del paciente se recubre con una capa delgada de aproximadamente 50 micras de hidroxiapatito cerámico. La superficie de hidroxiapatito poroso favorece el crecimiento del hueso y la integración entre el implante y el huésped, aliviando la necesidad del cemento acrílico en el hueso y proporcionando mejor transferencia de la resistencia mecánica. Se mejoró la respuesta funcional de los resultados totales del reemplazamiento de la articulación. (Por ejemplo, véase la patente U.S. nº 5.730.598, titulada “Prosthetic implants coated with hydroxylapatite and process for treating prosthetic implants plasma-sprayed with hydroxylapatite”). En resumen, este aspecto de la invención proporciona una composición o aparato adecuado para la implantación ortopédica o dental en el hueso, caracterizado por fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida en un sustrato poroso de hidroxiapatito. Las composiciones en cuestión incluyen composiciones para trasplante óseo, en la que el sustrato de hidroxiapatito se selecciona de entre hueso autólogo, hueso de alotrasplante cadavérico, hidroxiapatito coralino y bloques de hidroxiapatito sintético. En una forma de realización, el TRAP se adsorbe mediante el sustrato poroso de hidroxiapatito. En una forma de realización preferida, el TRAP se adsorbe únicamente en la superficie externa del sustrato poroso de hidroxiapatito. Las composiciones del asunto incluyen también composiciones de cemento para el hueso, en las que la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) es adsorbida en un sustrato con partículas de hidroxiapatito (p. ej.: cemento para el hueso IRC, Centro de Investigación Interdisciplinaria en Materiales Biomédicos de la Universidad de Londres) que se puede mezclar con un polímero acrílico de autocurado tal como polimetilmetacrilato (PMMA). Como alternativa se pueden formular cementos de fosfato de calcio que autoendurecen con hidroxiapatito (p. ej.: la patente U.S. nº 5.525.148) con TRAP continuando con esta invención. Los equipos en cuestión incluyen aparatos protésicos con, por lo menos, una superficie externa de unión al hueso en la que la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) se adsorbe a un sustrato de hidroxiapatito. Preferentemente, el TRAP se adsorbe aproximadamente 10 micras en el exterior del sustrato de hidroxiapatito, en cuyo caso esta capa externa se puede recubrir por atomización con hidroxiapatito de bajo peso molecular relativamente absorbible, antes de la adsorción del TRAP. Equipos protésicos representativos para este fin incluyen las articulaciones postizas y los dientes postizos. Los equipos en cuestión incluyen además los equipos para unión ortopédica que tienen por lo menos una superficie de contacto con el hueso en la que la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) se adsorbe a un sustrato poroso de hidroxiapatito. Los equipos con unión representativa con este objeto incluyen tornillos, grapas, clavos, pernos y placas. Por ejemplo el hueso en contacto con la superficie inferior de la placa de acero inoxidable está recubierto por atomización de plasma con hidroxiapatito, en el que se adsorbe la TRAP posteriormente. Ejemplos Materiales y procedimientos Medio acondicionado para células tumorales: Se

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cultivaron células CESJ, Bc66 o Bc-TRAP en un medio sin suero. El sobrenadante del cultivo se concentró 500 veces para CESJ y 100 veces para medio celular Bc66 o Bc-TRAP. Análisis para colonias de médula ósea: Se obtuvieron células de médula ósea de 6 ratones C57 negros. Se alojaron los ratones en un vivario de la Universidad de Washington y la asistencia del animal y los experimentos se llevaron a cabo según las pautas institucionales. Se cultivaron células de médula ósea a razón de 105 células por ml en un medio de cultivo que contenía suero de ternero fetal al 20% (v/v), agar-agar al 0,3% o agarosa al 0,25% (la agarosa se utilizó en los experimentos en las que las colonias se recogieron para aislamiento de ARNm) y varias concentraciones de muestra de la prueba. Se incubaron los cultivos celulares durante 14 días a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO2 al 5% y se tiñeron para la actividad de la TRAP después de la fijación tal como se describe (7). Se evaluaron al microscopio las células individuales, grupos (> 8 células, 50 células) TRAP positivas en las secciones teñidas como se definió anteriormente (7). Enriquecimiento de las células progenitoras de médula ósea: Se redujeron células adherentes procedentes de células de médula ósea total pasándolas a través de columnas de Sephadex G10 y se seleccionaron las células de baja densidad utilizando un procedimiento Percoll de gradiente de densidad. Las células que expresan los marcadores de linaje específico se eliminaron mediante anticuerpos monoclonales específicos para los linfocitos B murinos (B220), granulocitos (Gr-1), macrófagos (Mac-1) y erotrocitos (YW25.12.7) en MACS (Miltenyi Biotec) utilizando lechos magnéticos conjugados con IGG anti-rata de cabra y las células negativas para los marcadores de linaje anterior (Lin-) se utilizaron como población de células objetivo de la proteína aislada. Se ha demostrado que los progenitores hematopoyéticos formadores de colonias y los progenitores de osteoclastos se enriquecen en la población de células Lin- (Muguruma y Lee, Blood, 91:1272-1279: 1998). Observaciones preliminares Los huesos de ratones con carcinoma de mama CE presentan un aumento notable en el número de osteoclastos como prueba de la excesiva reabsorción ósea (5). El sobrenadante del cultivo sin suero de las líneas celulares clonadas (CESJ) de este tumor presentaba una capacidad exclusiva para producir colonias de células que presentan intensa actividad de la TRAP en las células de médula ósea de ratón cultivadas en medio semisólido. La actividad afectó directamente a los progenitores más que mediarlos mediante o conjuntamente con células accesorias, ya que las células clonógenas del progenitor aisladas de la médula también respondieron al medio CESJ y formaron colonias TRAP positivas (8). Además, las colonias TRAP positivas producidas a partir de progenitores aislados en medio de CESJ expresaron a los marcadores de osteoclastos: receptor αV β3, ρρc−src y al receptor de calcitonina y formaron fosas de recepción durante el cultivo posterior en condiciones de cultivo apropiadas (8). En cambio, el sobrenadante del cultivo de otra línea celular de carcinoma de mama, Bc66 (6,7), no posee dicha actividad productora de osteoclastos a pesar de que contiene el factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF) y el tumor progenitor no fue osteolítico en los ratones. Además, utilizando M-CSF

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recombinantes de ratón para producir colonias de macrófagos en condiciones de prueba similares, las colonias fueron siempre negativas en la coloración de TRAP incluso en presencia de 1,25(OH)2 D3 (10−8 M) e hidrocortisona (10−6 M) (datos no mostrados). En el trabajo inicial, se purificó un componente activo procedente del medio de CESJ y demostró ser un factor estimulante de la colonia de osteoclastos (OCSF) (6). Durante el análisis posterior de la actividad estimulante de los osteoclastos del medio de CESJ, se puso de manifiesto que otro factor potente estuviera presente en el medio que producía células TRAP positivas para diferenciarlas de las células de médula ósea en el cultivo. Aislamiento del factor de diferenciación de osteoclastos (ODF) Se utilizó más de 100 l de medio acondicionado sin suero procedente de cultivos de un clon de CESJ (8) para aislar y caracterizar el factor. Se dividió el medio acondicionado de células CESJ mediante cromatografía secuencial en columna en heparina-sefarosa, hidroxiapatito y HPLC con tamices moleculares (gel TSK de Toso Haas, G3000 SV). Se controló la actividad productora de osteoclastos mediante un análisis en el que las células de la médula ósea del ratón se cultivaron durante 14 días en agar-agar semisólido (6, 7). Las colonias, los grupos o las células individuales procedentes de progenitores de osteoclastos se detectaron por su aspecto rojo brillante en la coloración para la actividad de TRAP. La Figura 1 presenta los resultados de la purificación de las proteínas del medio inicial por cromatografía en columna de Heparina-Sefarosa. Heparina sefarosa CL-6B (Pharmacia Biotech) rellenada en una columna Econo-Pac (Bio-Rad; 1,5 x 4 cm) se equilibró con Tris-HCl 20 mm que contenía NaCl 0,1 M, pH 7,2. Alícuotas de 40 ml de medio de CESJ concentrado 100x se equilibraron en el tampón anterior y se aplicaron en la columna a cada serie. Aproximadamente el 95% de las proteínas totales pasaron a través de la columna tal como se estimó por absorbancia UV a 280 nm. Después de lavar la columna con el mismo tampón toda la noche, se eluyeron las proteínas unidas a la columna mediante un gradiente lineal de NaCl 0,1 a 0,7 M en Tris-HCl 20 mM (pH 7,2) a un caudal de 0,7 ml/min a 22ºC. En una parte de cada fracción recogida se analizó la actividad de ODF en la prueba del cultivo de médula después de reequilibrar en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,2) y filtrar (0,22 µM, Millipore). La Figura 1 demuestra que, en la cromatografía en columna con heparina, la actividad de ODF se recuperó constantemente en la fracción unida eluída en NaCl aproximadamente 0,47 M. En cambio, M-CSF y granulocito-CSF (G-CSF), que estaban presentes en el medio de CESJ (9) no se unieron a la heparina. La actividad de O-CSF descrita anteriormente (6) tampoco estaba unida. La actividad de ODF unida a la heparina, produjo células individuales o grupos de 4 a 8 células intensamente TRAP positivos en la prueba del cultivo de médula, pero las colonias TRAP positivas de más de 50 células, tal como las producidas por el medio total de CESJ fueron algo raras. Combinando la fracción activa unida a la heparina y el grupo no unido se restableció la actividad original de estimulación de la colonia TRAP positiva del medio de CSEJ. La actividad de ODF de la columna de heparina se 5

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unió a la columna de hidroxiapatito y se eluyó en fosfato aproximadamente 170 mM (Figura 2): Las fracciones que contienen actividad de ODF procedente de heparina-sefarosa se regeneraron, se concentraron y se equilibraron mediante filtración centrífuga a través de una membrana Centricon en fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0 y se aplicaron a una columna de hidroxiapatito (Econo-Pac, CHT-11 Cartridge, Bio-Rad). La columna se lavó con fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0. Se eluyeron las proteínas unidas con un gradiente lineal de fosfato Na 10 a 300 mM (pH 7,0). Se analizó la actividad de ODF en partes de cada fracción y se analizaron las proteínas por SDS-PAGE al 14%. El material en la fracción que se eluyó en fosfato aproximadamente 170 mM produjo células monucleares TRAP positivas en los análisis en cultivo de médula de hueso, pero cuando se combinaron con M-CSF recombinante murino produjo la formación de la colonia positiva a TRAP. Se combinaron las fracciones activas de varias series de la columna de hidroxiapatito y se introdujeron en HPLC en columna por exclusión de tamaño (SECHPLC) en tampón de fosfato 0,1 M (pH 6,8) conteniendo acetonitrilo al 30% (v/v) (Figura 3). Mediante SDS-PAGE la actividad de ODF parecía coincidir con la posición en la elución de una proteína de 35 kDa. En detalle, se regeneraron las fracciones activas procedentes de la cromatografía en columna de hidroxiapatito, se concentraron por ultrafiltración en Centricon, se ajustaron con acetonitrilo al 30% (v/v) y se fraccionó la muestra por HPLC de exclusión de tamaño (dos G3000SW de Toso-Haas, 7,5 mm x 60 cm en serie) equilibrado con tampón de fosfato Na 0,1 M, pH 6,8, conteniendo acetonitrilo al 30% (v/v). Se controló la absorbancia de las proteínas a 220 nm en el eluyente. Se recogieron las fracciones (0,5 ml) en tubos que contenían CHAPS (Calbiochem) al 0,02% (p/v). Se analizó la actividad estimulante de las células TRAP positivas en las muestras regeneradas cada 10 fracciones. Identificación del factor de diferenciación de los osteoclastos Las fracciones regeneradas correspondientes a las zonas de actividad biológica de otras alícuotas del grupo de hidroxiapatito se realizaron idénticamente en SEC-HPLC, se secaron para el análisis de la secuencia amino-terminal (Porton 2090E equipado con análisis de HPCL en línea de derivados del aminoácido feniltiohidantoína). La única secuencia N-terminal manifiesta en las fracciones entre 24 y 32 ml del volumen de elución fue APTPTLRFVAV que corresponde al terminal N de la TRAP del ratón, menos su péptido con señal (23). En esta zona del eluyente de la columna y en las primeras fracciones en las que también se detectó actividad biológica, se puso de manifiesto la banda de la proteína de 35 kDa. El tamaño y la secuencia fueron consecuentes con la proteína de TRAP (banda 5 del isoenzima TRAP; EC 3.1.3.2). No se encontró ninguna otra compatibilidad u homología próxima a otro gen mediante búsqueda en la base de datos genómica o de proteínas. Se midió la actividad de TRAP, por consiguiente, en una placa de microvaloración de 96 pocillos. El análisis de la actividad del enzima TRAP utilizando como sustrato fosfato de p-nitrofenol en presencia de tartrato confirmó la presencia del enzima activo en varías fracciones de la columna y en el medio de cultivo original de CESJ. Se añadió una muestra de 100 6

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µl (fracción de 20 µl de la columna + 80 µl de H2 O) a 100 µl de acetato Na 0,2 M, tartrato Na 40 mM, fosfato de p-nitrofenilo 16 mM, ditiotreitol 5 mM, pH 5,7. Después de incubar a 37ºC durante 1 h, se añadió 20 µl de NaOH 0,5 M y se midió la absorbancia a 405 nm. Se analizaron las fracciones de una serie de SECHPLC por SDS-PAGE, tiñendo con plata. El medio Bc66, en cambio, no presentó actividad enzimática. Esta actividad demostró que se inhibía por molibdato, un conocido inhibidor de TRAP. Experimentos de confirmación Para confirmar que TRAP era responsable de la actividad de ODF, el enzima recombinante se expresó en dos líneas celulares, células Bc66 y del ovario del hamster chino (CHO). Las células Bc66 se transdujeron mediante un vector retrovírico para expresar la TRAP de rata (10). El medio acondicionado de las células transducidas (BcTRAP) demostró abundante actividad del enzima TRAP y estimuló intensamente las colonias TRAP positivas. En cambio, el medio de las células Bc66 de referencia estimuló solamente las colonias negativas a TRAP. Las células Bc66 son conocidas porque producen M-CSF. Por consiguiente, las células CHO, que no producen M-CSF, se transfectaron con el vector que contiene el gen de TRAP de rata (11). El medio acondicionado de las células transfectadas de CHO (CHO-TRAP) estimuló las colonias TRAP positivas mientras que el medio de las células de CHO de referencia no presentó ninguna capacidad estimulante de las colonias o productora de TRAP. Aunque M-CSF solo estimuló únicamente las colonias TRAP negativas, M-CSF y TRAP juntos estimularon las colonias grandes TRAP positivas los que sugiere una sinergia de TRAP y M-CSF en la proliferación celular. Este descubrimiento sugiere que tanto TRAP como M-CSF deberían actuar conjuntamente para conducir el linaje a los osteoclastos con TRAP que produce diferenciación y M-CSF proliferación. Para regular la posibilidad de que la TRAP exógena pueda ser responsable directamente de la coloración TRAP positiva observada de las células en los cultivos de médula, se evaluó la expresión de ARNm en TRAP. Se utilizó una fracción de las células de la médula del ratón seleccionada sobre la base de que fuera negativa al marcador del linaje (Lin-) y demostró que se enriquecía en progenitores de osteoclastos (8). Se cultivaron células con Lin- aisladas en medio semisólido en presencia de medio acondicionado concentrado de células de referencia de CHO-TRAP o de CHO. El ARNm aislado a los 7 días y a los 14 días presentaba la expresión de la TRAP endógena en las colonias TRAP positivas. Se examinó la sincronización de la adición de TRAP en los análisis del progenitor de la médula ósea cubriendo con TRAP purificada en cultivos de agaragar que contenían células de Lin- y de M-CSF en varios días de cultivo y evaluado las colonias formadas 14 días después del recubrimiento. Se observó la formación de colonias TRAP positivas solamente cuando se añadió TRAP purificado durante las primeras 48 horas de cultivo. La adición de TRAP después en el cultivo produjo el desarrollo de colonias de macrófagos. Considerados conjuntamente estos datos experimentales sugieren firmemente un papel crítico para TRAP en la diferenciación de los osteoclastos. Este enzima parece actuar en los progenitores inmaduros del paso monocito-macrófago y produce la diferen-

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ciación de los osteoclastos antes de su compromiso con los macrófagos. Las células BcTRAP transducidas y las células Bc66 se transplantaron también por vía subcutánea en ratones atímicos Balb/c para evaluar los efectos in vivo de un tumor productor de TRAP. El examen microscópico de varios tejidos puso de manifiesto notables cambios solamente en el hueso. El análisis morfométrico del hueso de ratones con tumor puso de manifiesto un aumento de la actividad osteoclástica y un adelgazamiento de las paredes corticales de los huesos largos en los ratones trasplantados con BcTRAP en comparación con los ratones trasplantados con células Bc66 normales. Los resultados reprodujeron esencialmente los descubrimientos originales en los ratones con tumor de CE. Por lo tanto TRAP parece que es el factor crítico responsable de las propiedades exclusivas que producen osteoclastos de las células CE del tumor de mama. Confirmación de la eficacia del implante in vivo La TRAP de ratón o del hombre se puede expresar por medios recombinantes, por ejemplo en células Sf9 de insecto procedentes de una construcción del vector del baculovirus recombinante (Hayman, A.R. y Cox, T.M. (1994), J. Biol. Chem. 269:1294-1300; Ek-Rylander, B. et al. (1997) Biochem.J. 321:305-311). La TRAP enzimáticamente activa que contiene dos átomos de hierro por molécula se puede purificar en el medio de cultivo en cantidades de mg/l. Tanto las actividades que generan fosfatasa como las que generan radical oxígeno se pueden demostrar respectivamente por la escisión del fosfato de p-nitrofenilo o por peroxidación de luminol y liberación de quimioluminiscencia. La capacidad de TRAP (recombinante o preparada a partir de fuentes naturales tal como el medio acondicionado con CESJ) para favorecer la regeneración de osteoclastos en las superficies del implante se puede evaluar en animales in vivo. En un planteamiento, una preparación purificada de TRAP que demuestra ser enzimáticamente activa se disuelve en un tampón neutro con fuerza iónica baja. Las preparaciones en fase sólida de hidroxiapatito (u otras fases sólidas con sal de calcio, p. ej.: capas finas recubiertas sobre membranas biológicamente inertes o bloques aislados) se sumergen en la solución de TRAP para unirse o adsorber moléculas de TRAP en la capa superficial de hidroxiapatito. Cortando y tiñendo las secciones para la actividad histoquímica de TRAP, utilizando procedimientos con colorantes azo o sal de plomo (Yamamoto, T. y Nagai, H. (1992) J. Bone Miner. Res. 7:1267-1273), se puede controlar la duración necesaria para adsorber un espesor determinado y la actividad de TRAP. Las preparaciones en conjunto se pueden también teñir utilizando un sustrato para TRAP según las técnicas histológicas anteriores. Las preparaciones de hidroxiapatito recubiertas de forma apropiada con TRAP se implantan a continuación quirúrgicamente en los animales de experimentación, ya sea por vía subcutánea o intramuscular. En un ejemplo, se utilizó TRAP murino en ratones como animales de experimentación. Se implantó un vehículo de hidroxiapatito (membrana recubierta con hidroxiapatito o bloque sólido sin TRAP) en una zona adyacente pero separada en el mismo animal que sirve como referencia. Para aumentar el número de progenitores de osteoclastos en la circulación, los animales de experimentación se pueden cebar con factores tales como G-

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CSF que aumentan la movilización de las células madre desde la médula ósea hasta el torrente sanguíneo (Purton, L.E., et al., Blood 87:1802-1808, 1996; Matayoshi, A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:1078510790, 1996). Como alternativa, las partículas o secciones mineralizadas de hueso o de dentina se pueden recubrir con TRAP e implantar igualmente, utilizando de nuevo para comparación material sobrenadante sin cubrir como referencia. Después de 7 a 14 días, se sacrifican los animales y se examina histológicamente la unión a los osteoclastos en los implantes recuperados utilizando los procedimientos establecidos. De este modo se puede demostrar la actividad de regeneración de osteoclastos de las superficies de hidroxiapatito recubiertas con TRAP. En una variación de este planteamiento, las zonas discretas de la superficie sólida de hidroxiapatito se pueden tratar selectivamente con TRAP y después de la recuperación de los animales, se puede confirmar por examen histológico una atracción de osteoclastos preferentemente en las superficies recubiertas con TRAP. La capacidad de TRAP para activar la osteointegración en o sobre superficies metálicas (o cerámicas u otras fabricaciones) de implantes tal como se utilizan en sustituciones de articulaciones o en aparatos protésicos dentales asentados en el hueso se puede investigar también en animales. Las preparaciones de aleaciones de titanio recubiertas con hidroxiapatito (varillas, placas u otras fabricaciones de tamaño adecuado), se recubren con TRAP y se implantan quirúrgicamente en o sobre las superficies óseas en los animales de experimentación. Actualmente, el objetivo es una evaluación a más largo plazo de la osteointegración del lecho óseo frente a una superficie plana o dentro de una superficie porosa de un implante metálico. Tanto los diseños de superficies lisas como los de recubrimiento poroso se utilizan en las prótesis metálicas, por ejemplo el componente del vástago femoral utilizado en las sustituciones totales de la cadera. Los recubrimientos metálicos porosos representativos del crecimiento del hueso incluyen polvos o bolitas de cobalto-cromo (superficie de Porocoat, DePuy; PCA, Howmedica) y la unión por difusión de la rejilla de titanio (Zimmer). Dichas superficies metálicas porosas se recubren preferentemente en primer lugar con hidroxiapatito mediante técnicas de atomización de plasma, antes de recubrirse con TRAP. La osteointegración se analiza en animales individuales en intervalos de tiempo de 1 a 12 meses después de la intervención quirúrgica mediante diagnóstico por imagen de rayos X para evaluar el grado de radiotransparencia y en consecuencia el hueco entre el metal y el hueso y por recuperación, seccionamiento y microscopía de la interfase metal/hueso del implante. Dichos procedimientos son utilizados generalmente por los fabricantes de implantes para evaluar nuevos materiales, fabricaciones y otros aspectos de diseño protésico. De este modo, se establecen las ventajas de las superficies recubiertas con TRAP para activar la osteointegración y se optimiza el protocolo de recubrimiento para diferentes aplicaciones clínicas. Se contemplan además que pueden incluirse otros materiales biológicos con TRAP en el sustrato en fase mineral para activar la unión al hueso. Los materiales biológicos representativos con este fin incluyen las citocinas u otras moléculas de señalización y cólageno, 7

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este último para mejorar el acoplamiento metálico de la matriz ósea nueva con la composición o con el aparato implantado. Bibliografía 1. Roodman, G.D.: Advances in bone biology: The osteoclast. Endocrine Reviews 17:308-332, 1996. 2. Suda, T., et al., Bone 17(2S):87S-91S, 1995. 3. Suda, T., et al., Endocrine Reviews 13:66-80 1992. 4. Yasuda, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3597-3602, 1998. 5. Lee, M.Y., and Baylink, D.J., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172:424-429, 1983. 6. Lee, M.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8500-8504, 1991. 7. Lee, M.Y., et al., Blood 80:1710-1716, 1992. 8. Muguruma, Y., and Lee, M.Y., Blood 91:12721279, 1998. 9. Lee, M.Y., et al., Blood 74:115-122, 1989. 10. Palmer, T.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1055-1059, 1987. 11. Oliff, A., et al., Cell 50:555-563, 1987. 12. Ling, P., and Roberts, R.M., J. Biol. Chem.

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268:6896-6902, 1993. 13. Hayman, A.R., and Cox, T.M., J. Biol. Chem. 269:1294-1300, 1994. 14. Ketcham, C.M., et al., J. Biol. Chem. 264:557563, 1989. 15. Ek-Rylander, B., et al., J. Biol. Chem. 266:24684-24689, 1991. 16. Ek-Rylander, B., et al., Biochem. J. 321:305311, 1997. 17. Yam, L.T., et al., N. Engl. J. Med. 284:357360, 1971. 18. Lau, K.H., et al., Clin. Chem. 33:458-462, 1987. 19. Chamberlain, P., et al., Clin. Chem. 41:14951499, 1995. 20. Reinholt, F., et al., J. Bone Miner. Res. 5:10551061, 1990. 21. Zaidi, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159:68-71, 1989. 22. Hayman, A.R., et al., Development 122:31513162, 1996. 23. Cassady, A.L., et al., Gene 130:201-207, 1993.

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REIVINDICACIONES 1. Composición adecuada para implantación médica, que comprende fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito. 2. Composición para trasplante óseo según la reivindicación 1. 3. Composición para trasplante óseo según la reivindicación 2, en la que el sustrato de hidroxiapatito se selecciona de entre hueso autólogo, hueso para alotrasplante cadavérico e hidroxiapatito coralino. 4. Composición para trasplante óseo según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la que TRAP es adsorbida a través del sustrato de hidroxiapatito o es adsorbido únicamente por la superficie externa del sustrato poroso de hidroxiapatito. 5. Composición ósea de cemento según la reivindicación 1, que comprende fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato con partículas de hidroxiapatito mezclado con un polímero acrílico curable. 6. Equipo protésico, por ejemplo una articulación

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postiza o un diente postizo, que presenta una superficie exterior de unión al hueso que comprende fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato de hidroxiapatito. 7. Equipo protésico según la reivindicación 6, en el que la TRAP se adsorbe en las aproximadamente 10 micras exteriores del sustrato de hidroxiapatito. 8. Aparato de fijación ortopédico, por ejemplo seleccionado de entre un tornillo, una grapa, un clavo, un perno o una placa, que presenta una superficie de contacto con el hueso que comprende fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito. 9. Fosfatasa ácida resistente al tartrato adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito para su utilización como producto farmacéutico. 10. Utilización de la fosfatasa ácida resistente al tartrato adsorbida a un sustrato poroso de hidroxiapatito, para la preparación de un medicamento para producir la estimulación de la regeneración de osteoclastos o como factor de diferenciación para los osteoclastos.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 9

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