Instituto de Tecnología Química (UPV/ CSIC) ESTUDIO DE LAS PLANTAS LATICÍFERAS COMO POTENCIALES CULTIVOS ENERGÉTICOS PARA CLIMA SEMIÁRIDO

TESIS DOCTORAL

Presentada por: Pablo Vicente Escrig Aparici

Dirigida por: Dra. Nuria Cabedo Escrig Dr. Domingo J. Iglesias Fuente Valencia, Enero de 2014

Doña NURIA CABEDO ESCRIG, Doctora en Farmacia por la Universidad de Valencia, y

D. DOMINGO J. IGLESIAS, Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad de Valencia,

CERTIFICAN: que la Tesis Doctoral titulada “Estudio de las plantas laticíferas como potenciales cultivos energéticos para clima semiárido” realizada por Pablo Vicente Escrig para optar al grado de Doctor Ingeniero Agrónomo, ha sido realizada bajo su dirección y reúne los requisitos suficientes para su lectura y defensa.

Y para que así conste, firman este certificado en Valencia a 13 de Enero de 2014

Fdo. Dra. Nuria Cabedo

Fdo. Dr. Domingo J. Iglesias

A mi esposa Macarena a Vicente i Emilia, els meus pares als meus germans David i Ana a Trufa i a Max.

AGRADECIMIENTOS

Ha llegado el momento mas esperado por mí desde que empecé con esta tesis allá por la primavera del año 2008. Van a ser casi seis años de momentos buenos y malos pero en los que he redescubierto, por suerte para mí, lo que es la ayuda desinteresada y el valor del compromiso con un proyecto; desearía dedicar unas líneas a expresar mi gratitud hacia todas aquellas personas que han ayudado a que esta tesis fuera posible. Al Professor Avelino Corma, per l´ extraordinària oportunitat que em va concedir a l´hora de fer esta investigació, així com els seus consells i tot el suport material donat al llarg de tot este temps. Ha sigut un verdader honor treballar a les seues ordres i espere haver estat sempre a l´alçada. A la meua directora de tesi la Dra. Núria Cabedo sense la qual esta tesi no haguera sigut la que és. La gran dedicació a este treball, l´ enorme paciència que ha tingut amb mi (només ella i jo sabem fins a quin punt) i el seu gran esforç en fer de mi un bon tècnic de laboratori, han permés en gran mesura traure avant aquest treball. Moltes gràcies Núria per tota l´ajuda i tot allò que m´has ensenyat. Al Dr. Domingo Iglesias, el segundo de mis directores cuyo compromiso con esta investigación ha sido total desde el principio y cuyos consejos han sido imprescindibles para la realización de mi tesis. Sirvan estas líneas para transmitirle mi más sincero agradecimiento. Mi investigación no estaría completa sin el trabajo que realicé en Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, donde tuve la inmensa suerte de conocerle. Muchas gracias al Profesor Jaime Primo por haberme acogido en su laboratorio durante más de cuatro años, por haberme tratado siempre con amabilidad y cariño, y por haber estado siempre disponible para cualquier cosa que he podido necesitar. Al Dr. Eduardo Primo que apareció en el momento justo en el transcurso de mi investigación, me transmitió ilusión y ganas de trabajar e hizo que no me importara estar horas y horas delante del ordenador o tomando datos en el campo. Al Profesor Herminio Boira y sus colaboradores la Dra. Mercedes Verdaguer y el Dr. Garcia Rellán que me aconsejaron en todos los temas relacionados con la selección de especies, me acompañaron y me ayudaron

sobretodo en las primeras etapas de esta investigación. Ha sido un verdadero placer trabajar con ellos y que me honren con su amistad. Moltes gràcies a Ilde i Juan: perquè m´han ajudat quan ho he necessitat i perquè a pesar de tots els anys que porten en el CEQA i els galons que ostenten sempre m’han fet sentir com un més. A Maria per la seua constant alegria i la seua sana ironia que ha fet que tot aquest temps i les llargues hores en el laboratori estigueren envoltades d´un ambient de treball agradable. Un recuerdo muy especial para la Dra. Sandra Vacas por toda la ayuda que me ha brindado con los equipos de cromatografía, siempre con su sempiterna sonrisa aunque le pidiera exactamente lo mismo que le había pedido las 10 veces anteriores. Ha sido una extraordinaria compañera. No me olvido de los doctores Vicente Navarro, Cristina Alfaro, Pilar Moya, Ignacio de Alfonso e Ismael Navarro por la gran disponibilidad que han mostrado Tampoco querría dejar pasar la oportunidad de mandar un abrazo muy fuerte a Dani y a Ceci que compartieron conmigo un laboratorio que siempre se quedaba pequeño cuando trabajábamos los tres. Al Dr. Francisco Legaz, persona cuya laboriosidad y amor por el trabajo bién hecho es solo comparable a su bondad y gran corazón, muchísimas gracias por ayudarme a poner en marcha los experimentos en campo y por la extraordinaria meticulosidad y su desinteresada colaboración. Moltes gràcies també a Ramon Pardo per la seua inestimable ajuda en les faenes de camp i tots els consells fruit de la seua amplíssima experiència i amor per l´agricultura. Un record especial també per a Jesus, Javi i Vicent i les magnifiques converses mantingudes en el menjador de la masia. Las faenas delicadas nunca han sido mi punto fuerte pero he sido afortunado al contar con Ana y las dos “Isabeles” que me han enseñado (o al menos lo han intentado) la mejor forma de realizar las tareas mas tediosas haciéndome además compañía durante esas largas horas contando semillas, tamizando tierra o separando pequeñas raíces de la tierra. Muchas gracias de todo corazón chicas.

Gracias de todo corazón a las Dras. Quiñones y Martinez-Alcántara por haberme honrado con su cariño y amistad y a la Dra. Forner-Giner por haber puesto a mi disposición su laboratorio y sus equipos. Una abraçada forta a la resta dels meus companys del IVIA, Enric, Mari Carmen, Carmen, Aurelio, Almudena, Mamen, Mari Rús, Fuen... gràcies per fer-me sentir un més. A todos vosotros va dedicada esta tesis y mi más sincero agradecimiento.

La presente Tesis Doctoral ha sido realizada con la ayuda de una beca predoctoral concedida por la Cátedra Cemex de Sostenibilidad

Índice página I. INTRODUCCIÓN

1

1. Antecedentes generales sobre los biocombustibles

2

1.1. Clasificación de los biocombustibles

2

1.1.1. Biocombustibles primarios

2

1.1.2. Biocombustibles secundarios

3

1.1.2.1. Biocombustibles de primera generación

3

1.1.2.2. Biocombustibles de segunda generación

6

1.1.2.3. Biocombustibles de tercera generación 1.2. Procesos utilizados en la obtención de biocombustibles secundarios

7

1.2.1. Conversión termoquímica

8

1.2.2. Conversión biológica

10

1.2.3. Conversión química

12

1.2.4. Conversión de la biomasa en refinerías convencionales

14

8

1.3. Biocombustibles de segunda generación. Origen y fuentes de obtención

18

1.3.1. Lignocelulósicos

19

1.3.1.1. Miscanthus spp. como cultivo energético

19

1.3.1.2. Switchgrass (Panicum virgatum L.) como cultivo energético

22

1.3.1.3. Silvicultura de rotación corta

25

1.3.2. Oleaginosos

26

Jatropha curcas L. como cultivo energético

26

1.4. Microalgas

31

1.5. Plantas laticíferas

34

2. Antecedentes agronómicos

40

2.1. El estrés hídrico en plantas cultivadas

42

2.2. La salinidad como factor limitante de la producción en las plantas cultivadas 2.3. El suelo como potencial limitante del desarrollo de los cultivos

i

44 45

Índice página II. OBJETIVOS

50

III. MATERIAL Y MÉTODOS

52

1. Selección de las especies. Screening botánico

52

1.1. Descripción botánica de las especies

52

1.2. Extracción en Soxhlet de las distintas especies

57

2. Optimización del método extractivo de E. characias 3. Estudio metabolómico de ecotipos salvajes de E. characias 4. Estudio metabolómico de E. characias cultivada

58

5. Estudio agronómico de E. characias cultivada

74

5.1. Ensayo 1: Estudio de la respuesta a diferentes dosis de riego

74

5.2. Ensayo 2: Estudio de la respuesta ante diferentes estreses abióticos

81

5.2.1. Estudio de la respuesta frente al déficit hídrico

81

5.2.2. Estudio de adaptación al suelo y tolerancia a la clorosis férrica

83

5.2.3. Estudio de tolerancia a la salinidad

86

5.3. Análisis estadístico de E. characias cultivada

88

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

90

1. Selección de las especies. Screening botánico 2. Estudio metabolómico de ecotipos salvajes de E. characias 3. Estudio agronómico de E. characias. Plantas cultivadas

90 105

3.1. Ensayo 1: Estudio de la respuesta a diferentes dosis de riego

105

3.2. Ensayo 2: Estudio de la respuesta ante diferentes estreses abióticos

118

3.2.1. Estudio de la respuesta ante la sequía

119

3.2.2. Estudio de adaptación al suelo y tolerancia a la clorosis férrica

127

3.2.3. Estudio de tolerancia a la salinidad

132

V. CONCLUSIONES

137

VI. BIBLIOGRAFÍA

141

ii

59 67

91

Índice página VII. RESÚMENES

154

1. Resumen

154

2. Resum 3. Abstract

155 156

iii

Índice de Esquemas, Tablas, Imágenes y Figuras ÍNDICE DE ESQUEMAS Esquema 1. Reacción de fermentación alcohólica ……………..……... 4 Esquema 2. Representación simplificada del proceso de transesterificación …………………………………………..…... 5 Esquema 3. Clasificación de biocombustibles según Nigam y Singh ….. 7 Esquema 4. Reacciones de los procesos de conversión termoquímica …. 9 Esquema 5. Proceso simplificado de la utilización integral de la biomasa a partir de microalgas, adaptado de Chisti ......................... 34 Esquema 6. Diagrama de aprovechamiento integral de las plantas laticíferas ………………………………………………….. 48 Esquema 7. Procedimiento de extracción y análisis de los extractos según Nemethy et al. ………………………………………………….. 57 Esquema 8. Esquema de extracción en fresco de metabolitos en plantas laticíferas ………………………………………………….. 62 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Conversión de extractos de E. lathyris sobre ZSM-5 en un reactor de lecho fluido a 500ºC y velocidad espacial por hora y gramo de catalizador (WHSV) de 0.4 …………………………………………....… 38 Tabla 2: Selectividad a productos en el cracking del biocrudo de E. antisyphilitica a diferentes ratios catalizador/carga (C/O) a 480ºC, adaptada de Padmaja et al. ……………………………………………………........ 39 Tabla 3: Selectividad a productos en el cracking del biocrudo de E. antisyphilitica a diferentes temperaturas con C/O=3, adaptada de Padmaja et al. ……………………………………………………………………..…. 40 Tabla 4. Análisis de suelo de las tres localizaciones estudiadas ….…….. 61 Tabla 5. Resultados del screening previo de distintas especies, donde n= 5-9 (número de plantas estudiades de la especie en cuestión); el rendimiento hexánico medio se calculó como la media arimética de cada una de las n medias ponderadas de hojas y tallos para cada una de las especies …...... 91 Tabla 6. Tiempo de retención (tR) por GC-FID relativo a tetracosano (tR= 11.8 min) y en GC-MS relación m/z de los iones generados en muestras derivatizadas (ácidos grasos y alcholes) y no derivatizadas (alcanos, alquenos, triterpenos, esteroles y aldehídos)…………………………….. 94

Índice Tabla 7. Cuantificación de los metabolitos 1-5 en hojas y tallos de E. characias en las tres localizaciones estudiadas durante los meses de julio y septiembre de 2009. El rendimiento de los compuestos se ha calculado como cantidad de metabolito (mg) por g de peso seco de parte aérea de la planta …………………………………………………………………….. 98 Tabla 8. Cuantificación de los metabolitos 6-11 en hojas y tallos de ecotipos salvajes de E. characias de las tres localizaciones estudiadas durante julio y septiembre de 2009. El rendimiento de los compuestos se ha calculado como cantidad de metabolito (mg) por g de peso seco de parte aérea de planta ………………………….……………………………..…. 99 Tabla 9. Cuantificación de los metabolitos 12-18 en hojas y tallos de ecotipos salvajes de E. characias de las tres localizaciones estudiadas durante julio y septiembre de 2009. El rendimiento de los compuestos se ha calculado como cantidad de metabolito (mg) por g de peso seco de parte aérea de la planta….... 100 Tabla 10. Rendimiento en componentes de alto valor energético según el estado fenológico (fase), siendo la fase I, la prefloración (cuando la planta todavía no ha desarrollado sus órganos florales), la fase II es la época que va desde la floración a la maduración del fruto y la expulsión de la semilla y la fase III el periodo posterior a la expulsión de la semillas. Cada valor es el resultado de la media de un mínimo de tres plantas independientes sometidas al mismo tratamiento y fueron tomados al final de cada una de las fases. Significaciones estadísticas: *p