REVISIÓN

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R e v. Soc. Esp. Dolor 7: 313-318, 2000

Modelos animales de dolor y aspectos éticos de la experimentación animal J. M. González-Dard e r *

G o n z á l e z - D a rder JM. Animal pain models and ethical issues re g a rding animal experimentation. Rev Soc

Esp Dolor 2000; 7: 313-318.

SUMMARY We present the animal models currently accepted by the International Association for the Study of Pain (IASP), along with their features and uses. In addition, ethical issues that should be considered for the design of models and experiences with animal pain models are described. Finally, the requirements that an animal pain model must comply with in order to be validated are listed. © 2000 Sociedad Española del Dolor. Published by Arán Ediciones, S.A. Key words: Animal pain models. Ethics of animal pain experimentation.

RESUMEN Se presentan los modelos animales de dolor actualmente aceptados por la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP), describiendo sus características y utilidad. Se describen los aspectos éticos a ser tenidos en cuenta para el diseño de modelos y experiencias con modelos animales de dolor. Finalmente, se describen las características que debe cumplir un modelo animal de dolor para ser validado. © 2000 Sociedad Española del Dolor. Publicado por Arán Ediciones, S.A. Palabras clave: Modelos animales de dolor. Ética de la experimentacion con animales en dolor.

*Servicio de Neurocirugía Hospital General de Castellón Castellón de la Plana Recibido: 1 3 - 1 2 - 9 9 . Aceptado: 1 - 2 - 0 0 .

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ÍNDICE 1. CRITERIOS PA R A L A VALIDACIÓN DE LOS MODELOS ANIMALES DE DOLOR 2. CONSIDERACIONES ÉTICAS EN LA E X P E R IM E N TACIÓN A N I M A L 3. CARACTERÍSTICAS Y UTILIDAD DE LOS MODELOS ANIMALES DE DOLOR

1. CRITERIOS PARA LA VALIDACIÓN DE LOS MODELOS ANIMALES DE DOLOR Básicamente, los modelos animales de dolor deben tratar de reproducir situaciones clínicas o fisiopatológicas que permitan el estudio de alternativas terapéuticas aplicables a la clínica humana o, al menos, el mejor conocimiento de las mismas. Las características que deberían cumplir estos modelos son las siguientes (1): 1. El modelo ha de tener utilidad clínica. El modelo debe reproducir situaciones de dolor que se presentan en la práctica clínica o, en todo caso, reproducir aspectos concretos de algún tipo de dolor clínico. Sólo de esta forma los resultados obtenidos de la experimentación animal pueden eventualmente transportarse a la clínica humana. 2. El modelo debe ser cuantificable. Aunque el dolor es una experiencia subjetiva y puede discutirse si los animales de hasta determinado grado de evolución son capaces de sentir dolor, lo cierto es que tanto en la experimentación clínica como animal, lo único que puede medirse son respuestas objetivas del individuo sometido a la agresión nociceptiva. Es un principio reconocido que cuanto más sencillo es el

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estímulo aplicado mas fácil es la cuantificación de la respuesta. Habitualmente, los modelos animales de dolor agudo inducen cambios motores reflejos o conductuales muy elementales (reflejos de retirada, vocalización, cambios vasomotores), mientras que los modelos de dolor crónico producen cambios de conducta más elaborados (autoagresión en forma de rascado, mordisqueo o autotomía; alteraciones en el patrón de ganancia ponderal, de sueño, actividad sexual o aprendizaje). 3. El modelo debe ser facilmente re p roducible. É sta es una condición que asegura la fiabilidad de los resultados permitiendo la comparación de los diversos tratamientos o de las experiencias de diferentes grupos o laboratorios. Algunos modelos se encuentran disponibles comercialmente y existen catálogos de aparatos de analgesiometría. 4. El modelo debe tener coherencia interna. C o n esto queremos indicar que debe haber una concordancia entre los aspectos conductuales, neuroquímicos, neurofisiológicos y anatomopatológicos. Este requisito implica un trabajo previo al de la proposición del modelo para su eventual experimentación en el campo del dolor, que consiste en el estudio del propio modelo experimental. 5. El modelo debe estar validado. Para ello se pueden usar una serie de procedimientos, como puede ser la utilización de tratamientos de reconocida eficacia en la clínica o buscando en el animal respuestas o cambios conductuales semejantes a los que clínicamente presentan los pacientes con ese tipo de dolor que se intenta reproducir. La situación ideal sería el modelo que reprodujera todas las condiciones fisiopatológicas de la forma de dolor clínico a reproducir y que tuviera uno o varios patrones de respuesta modificables por un tratamiento de reconocida eficacia en la clínica. 6. El modelo debe cumplir determinados re q u e r i mientos de tipo ético. Más adelante son discutidos ampliamente.

2. CONSIDERACIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL Aunque la definición de dolor implica que se trata de una experiencia subjetiva (2), parece evidente que los animales sufren dolor o, al menos, es una observación común que las respuestas reflejas y conductuales ante un mismo estímulo nociceptivo son muy semejantes entre los humanos y animales. Sin embargo, recientemente se está revisando la definición de dolor para poder aplicarla a individuos vivos que no

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sean capaces de comunicarse, como es el caso de neonatos o niños pequeños, retrasados mentales, personas en coma, dementes, pacientes incapacitados para hablar y, por extensión, animales (3). Por esta razón, debe rechazarse el argumento de que los animales no sienten dolor más allá de sus respuestas reflejas o conductuales, de la misma forma que admitimos que pacientes en las situaciones enumeradas más arriba sufren dolor. Una de las primeras guías acerca de los cuidados especiales que hay que tener en cuenta en la experimentación con animales sobre el dolor fue dada por la International Association for the Study of Pain (IASP) en 1983 (4). En una reciente editorial de la revista Pain, Patrik D. Wall (5) hace un recordatorio de los elementos fundamentales que han de valorarse a la hora de planificar experimentos con modelos animales de dolor y que deben ser especificados por los autores que deseen ver publicados sus artículos en dicha revista, órgano de la IASP. Este editorial s u rge como respuesta a una serie de comentarios expresados por la Royal Society for the Prevention of C ruelty to Animals respecto a determinados artículos publicados en dicha revista. En resumen, los elementos a considerar son: 1. Justificación. Los experimentos con animales en dolor son sólo justificables cuando resulta evidente qué puede resultar de la información recogida un beneficio concreto para la salud. Esto es diferente al empleo de los animales en la experimentación general, donde puede ser una justificación suficiente el conseguir un aumento del conocimiento científico. 2 . P ro c e d i m i e n t o s . Detallar anestesia, monitorización, técnica quirúrgica, analgesia postoperatoria, razones para emplear drogas inusuales, métodos de observación conductual y método de sacrificio. Siempre que sea posible el animal debe poder eludir el estímulos nociceptivo, por lo que debe evitarse el empleo de animales no anestesiados pero paralizados farmacológicamente y que consecuentemente no pueden escapar del estímulo doloroso. 3. Duración e intensidad del estímulo doloro s o . Deben ser los mínimos. Idealmente, los estímulos nociceptivos a aplicar sobre el animal deberían haber sido previamente aplicados sobre el investigad o r. 4. N ú m e ro de animales. También debe ser el mínimo para demostrar o rechazar la hipótesis de trabajo utilizando métodos estadísticos adecuados. Durante el desarrollo de una técnica nueva el número de animales empleados puede ser más alto. 54

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3. CARACTERÍSTICAS Y UTILIDAD DE LOS MODELOS ANIMALES DE DOLOR De entre todos los modelos de dolor agudo y crónico disponible, que son innumerables (1,6,7) sólo vamos a describir someramente y valorar los incluidos en el C o re Curriculum for Professional Educa tion in Pain (CCPEP) (8). En la Tabla I recogemos estos modelos definiendo las principales características, que pretenden reproducir en relación a los tipos de dolor clínico, más importantes desde un punto de vista fisiopatológico (dolor somático, visceral o neuropático) y cronológico (dolor fásico, tónico y crónico). 1. Modelos de retirada ante un estímulo térmico. El test de retirada de la cola ante un estímulo térmico ( Tail-flick test) fue descrito hace casi sesenta años por D'Amour y Smith (9). El test consiste en colocar la cola del animal, habitualmente la rata o el ratón, debajo de una fuente de luz radiante que aumenta la temperatura de la piel del animal hasta que al alcanzar un nivel que produce dolor, éste retira la cola con un rápido movimiento. En la experiencia se mide el tiempo de latencia desde el momento de encender la fuente de luz hasta el momento de la retirada, aunque se establece un tiempo máximo para que se apague la fuente luminosa en el caso de que el animal no retire su cola, con el fin de no producir quemaduras. Habitualmente se realizan tres medidas en puntos diferentes de la cola y se calcula la media. Recientemente se ha valorado la importancia de la temperatura de la piel del animal en el momento de realizar la experiencia, que puede variar en un rango de hasta 8° C,

TA B L A I . CARACTERÍSTICAS FISIOPATO L Ó GICAS Y CRONOLÓGICAS DE LOS MODELOS ANIMALES DE DOLOR

Modelo animal

Tipo fisiopatológico Tipo cronológico

Tail-flick test Hot-plate test Estimulación pulpa dental Test del formol Modelos de artritis Distensión de vísceras huecas Inyección intraperitoneal de sustancias algógenas Compresión/constricción de estructuras nerviosas Sección completa/parcial de estructuras nerviosas

Somatogénico Somatogénico Somatogénico Somatogénico Somatogénico Visceral

Tónico Tónico Tónico Tónico-Fásico Crónico Tónico-Fásico

Visceral

Tónico-Fásico

Neuropático

Crónico

Neuropático

Crónico

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ya que la cola de los roedores es un importante elemento termoregulador (10). Ello obliga a realizar las experiencias tras la aclimatación del animal en un ambiente de temperatura controlada idéntica a la de la sala de la experiencia. Además, otras circunstancias pueden producir cambios en el flujo sanguíneo periférico que influyan de la misma forma, como es cualquier forma de estrés desencadenado por la manipulación, inmovilización o drogas. El tail-flick e s un reflejo espinal, por lo que se supone que no induce un dolor excesivo al animal, ya que se permite que el animal pueda liberarse del estímulo al mover la cola de forma refleja. Ésta es la diferencia esencial con el modelo de estimulación eléctrica de la cola, donde pueden establecerse varios niveles de respuesta ya que el animal no puede liberarse del estímulo al estar los electrodos fijos a la cola, lo que plantea problemas éticos. Con este modelo pueden valorarse varios niveles anatómicos de respuesta, que van desde el reflejo de retirada idéntico al descrito (nivel medular), seguido de la vocalización (nivel bulbar) y, finalmente, la vocalización que persiste más allá de la finalización del estímulo (nivel encefálico). El t a i l - f l i c k test es probablemente el modelo de analgesiometría más universalmente utilizado. 2. Test de la placa caliente. Es un test semejante al a n t e r i o r, pero ahora se deja libre al animal sobre una placa que se calienta progresivamente ( h o t - p l a t e test), por lo que siente calor en las patas traseras y trata de escapar dando un pequeño salto, momento en el que se enfria la placa. Se mide la latencia desde el inicio del calentamiento hasta la respuesta motora, dejando también un tiempo máximo de calentamiento. En este test parece que influye menos la temperatura cutánea que en el t a i l - f l i c k . 3. Estimulación eléctrica de la pulpa dental. E s t e modelo animal fue introducido por Kerr y cols. en 1955 (11) y se basa en la estimulación eléctrica de la pulpa dental realizada a través de un electrodo colocado aguda o crónicamente a través de un orificio practicado en la parte coronal de un canino del animal. La estimulación produce una serie de respuestas dependiendo de la intensidad del estímulo, que se han gradado en cuatro puntos: apertura refleja de la mandíbula (1 punto), hiperextensión del cuello (2 puntos), rotación de la cabeza (3 puntos), rascado del diente estimulado (4 puntos). Se trata de un modelo interesante, ya que se admite que los nervios intradentales están constituidos exclusivamente por fibras A-delta y C. Sin embargo, existen problemas, ya que la estimulación a baja intensidad de la pulpa dental en el hombre produce dolor mientras que en el animal existen una serie de reflejos de retirada y, por

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TA B L A I I . CARACTERÍSTICAS DE LOS MODELOS ANIMALES DE DOLOR NEUROPÁTICO

Trastorno motor Alodinia Hiperalgesia Anestesia Dolor espontáneo Autotomía Cambios en espejo Efecto de la simpatectomía

Sección ciático

Rizotomía posterior

Sección p a rc i a l

Ligadura ciático

Ligadura raíces

+++ no no sí (inmed.) sí +++(1 sem.) no variable

++ no no sí (inmed.) sí

+ sí (inmed.) sí (inmed.) no sí ++ (1 sem.) sí sí

+ sí (1 sem.) sí (1 sem.) no sí — no no

+ sí (1 día) sí (3 días) no sí +/sí sí

sí no

otro lado, la estimulación de la pulpa dental en el hombre es capaz de producir una amplia gama de sensaciones además de la dolorosa. Finalmente, es difícil a veces dilucidar si las respuestas se deberían a la propia estimulación de la pulpa o si intervendrían los tejidos periodontales. 4. Infección intra-articular o en la pata de sustan cias. Se trata de una serie de modelos de dolor somático que se encuentran a caballo entre los modelos de dolor agudo descritos y los de dolor crónico que describiremos más adelante. El test del formol fue diseñado por Dubuisson y Dennis en 1977 (12) y revisado profundamente por Tjolsen y cols. (13). El test consiste en la inyección de una solución de formol, generalmente en el espacio subcutáneo de la cara dorsal de la pata de la rata o ratón. El volumen y concentración del formol varía en las diferentes experiencias, aunque se recomiendan pequeños volúmenes y concentraciones inferiores al 1%, con el fin de evitar daños tisulares a larg o plazo. Lo más interesante de este test es que se produce una respuesta bifásica. La primera fase se inicia inmediatamente después de la inyección, dura 3-5 minutos, se debe a la acción directa del formol y estaría mediada por la actividad de las fibras C. La segunda fase se produce tras un periodo de latencia de unos 10-15 minutos y dura entre 15-20 minutos, aunque puede extenderse más de una hora y se debería al desarrollo de un proceso inflamatorio local con liberación de sustancias algógenas así como a la puesta en marcha de mecanismos a nivel medular inducidos en la primera fase. El modelo es fácilmente cuantificable con una escala de tres grados: reducción del apoyo sobre la pata inyectada (1 punto), elevación total de la pata inyectada evitando totalmente el apoyo (2 puntos) y lameteo, mordisqueo o sacudida de la pata inyectada (3 puntos). La cuantificación se hace midiendo el tiempo que el animal está en cada situa-

ción durante un periodo de observación, y aplicando la siguiente fórmula: (T1 + 2.T2 + 3.T3)/300. El test del formol tiene una gran coherencia interna y está validado por múltiples estudios, reuniendo además la mayor parte de los requerimientos éticos, lo que hace del mismo un magnífico modelo animal de dolor relacionado con la inflamación, es decir, el dolor postraumático o postquirúrg i c o . Una serie de modelos animales de este tipo se basan en la inyección intraarticular de sustancias, lo que desarrolla una situación de dolor monoarticular. Es muy interesante el modelo de poliartritis inducida por inyección de Mycobacterium butiricum (solución adyuvante de Freund) en la base de la cola de la rata, lo que produce en unos días un cuadro de tumefacción y edema de múltiples articulaciones, sobre todo de las patas traseras. La respuesta del animal es la reducción de la movilidad y el rascado de la articulación afectada. Más objetivos son la medida del diámetro o volumen de la articulación y el test de presión (paw-pinch test de Randall-Shillito), en el que se aplica mecánicamente una presión puntual sobre la articulación hasta que se produce la retirada de la pata o la vocalización. Tras la inyección de la solución adyuvante, los cambios articulares se desarrollan entre los días 11 y 16 y se mantienen al menos durante 2 semanas, aunque es muy frecuente que quede un estado inflamatorio crónico. Se trata, pues, de un modelo de dolor crónico que implica una alto grado de sufrimiento para los animales por su afectación multiarticular, larga duración y grandes limitaciones producidas por la limitación de la movilidad para su relación social, aseo y alimentación, por lo que su utilización actual es muy limitada, centrándose sólo en modelos de tipo mono-articular. 5. Modelos animales de dolor visceral (14). Se refiere al estímulo nociceptivo de estructuras viscerales, es decir, a los órganos internos, que se contrapo56

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nen a las estructuras somáticas (piel, músculos, articulaciones, hueso y tejido conectivo). Hay una serie de estructuturas que se encuentran en el límite entre el campo somático y visceral, como son las cavidades oral y nasal, faringe, inicio de la uretra y de la vagina y el canal anal. El dolor visceral recoge características muy diferentes del dolor somático, ya que es sordo, mal delimitado, con características descriptivas específicas, se asocia a hiperalgesia cutánea y es muchas veces referido. Dentro de este punto se pueden considerar diferentes tipos de estímulos nociceptivos, como son la estimulación eléctrica de nervios aislados o de vísceras, isquemia aguda de la víscera, así como diferentes tipos de agresiones mecánicas o químicas. De entre todos estos modelos revisados por Ness y Gebhart (14), en el CCPEP (8) se menciona la distensión de las víscera y órganos huecos, y ello probablemente porque la distensión de estas vísceras es una causa muy frecuente de dolor en la clínica. En este sentido, se han desarrollado modelos de distensión del tracto gastrointestinal, vejiga urinaria y tracto uretral y ureteral, vagina y útero, así como de las vías y vesícula b i l i a r. Los modelos sobre el tracto gastrointestinal son los más utilizados, ya que se accede fácilmente al mismo por orificios naturales que evitan una manipulación quirúrgica adicional. La distensión del intestino, al contrario que la presión o el pellizco, produce respuestas identificables con el dolor en un gran número de especies, incluida la humana. El segundo modelo que se menciona en el CCPEP (8) es la inyección intraperitoneal de soluciones irr i t a n t e s , lo que conduce a repuestas sugestivas de nocicepción también en numerosas especies y también en estudios experimentales en humanos. Numerosas sustancias algogénicas han sido empleadas, tales como el ácido acético, suero salino hipertónico, serotonina, CIK. Sin embargo, la sustancia algogénica más experimentada ha sido la bradiquinina, que es un producto producido en condiciones normales tras un daño t i s u l a r. 6. C o m p resión o constricción de nervios periféri cos o raíces nerv i o s a s . Se trata de una serie de modelos animales que pretenden reproducir la situación de hiperalgesia, alodinia y dolor espontáneo típicos del dolor neuropático causálgico. El modelo más aceptado es el de constricción crónica del nerv i o ciático de la rata utilizando varias ligaduras poco apretadas para evitar interrumpir la circulación y separadas aproximadamente un milímetro entre sí. Este modelo fue presentado por Bennet y Xie en 1988 (15) y ha sido ampliamente utilizado. En este modelo la situación de dolor se desarrolla a partir de la pri57

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mera semana y se mantiene estable durante unas seis semanas, a partir de las que se va reduciendo progresivamente hasta desaparecer a los 2-3 meses. Estos animales desarrollan una situación de dolor espontáneo, que se reconoce por el rechazo a apoyar la extremidad en el suelo, así como una hiperalgesia a estímulos térmicos y mecánicos junto a una alodinia a diferentes estímulos (16). Un modelo semejante, de utilización más restringida, ha sido el de la l i g a d u r a de las raíces L5 y L6 de la rata a nivel postganglio nar extrarr a q u í d e o , descrito por Kim y Chung en 1992 (17). Un modelo intermedio entre este grupo y el siguiente es el de sección parcial del nervio ciático de la rata, que fue descrito por Seltzer y cols. (18), ya que si bien supone una sección parcial del nervio ciático reproduce los aspectos clínicos del dolor de los modelos de este grupo. 7. Sección completa o parcial de nervios periféri cos, nervios raquídeos o raíces. El último grupo de modelos de dolor se basa en la sección total o parcial de diferentes elementos del sistema nervioso periférico, con lo que se pretende reproducir las situaciones clínicas de dolor neuropático de la anestesia dolorosa, del dolor por neuroma, avulsión del plexo braquial, post-rizotomía o en el amputado. Se trata de modelos muy clásicos y se basan en la sección de nervios periféricos (sección del nervio ciático) ( 1 9 ) o de las raíces posteriores a nivel preganglionar intradural (rizotomia posterior cervical) (20). La cuantificación de la intensidad del dolor en estos modelos se basa en la llamada autotomía, que es una conducta que se desarrolla en el animal y que le hace rascar y mordisquear la extremidad afecta produciéndose con el tiempo la pérdida anatómica de parte de la misma (21,22). Así, el animal es estudiado diariamente con el fin de determinar el día de comienzo y la intensidad de la autotomía. La escala de valoración de la intesidad es la siguiente: un punto por el mordisqueo de una o más uñas y un punto adicional por la lesión de cada medio dedo, del metacarpo/tarso o del carpo/tarso. De esta forma, la máxima puntuación posible de autotomía es de 13 puntos en los animales sometidos a rizotomía y de 7 puntos en los animales con sección del ciático, esto último debido a la inervación de la pata posterior por el nervio ciático (23). Como medida de protección ética, cualquier animal que alcanza el máximo grado de autotomía es inmediantamente sacrificado, manteniendo su puntuación hasta el final del periodo de seguimiento previamente determinado. Aunque la conducta de autotomía ha sido considerada por algunos repugnante y poco ética, por otros relacionada con la anestesia más que con el dolor y aún reconociendo las limitaciones de

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un método de medida en el que no hay posibilidad de mejoría, estos modelos se siguen considerando útiles y se incluyen en el listado del CCPEP. Dadas las semejanzas entre los modelos de dolor neuropático incluidos en los dos últimos grupos, se recogen en la Tabla II las características más relevantes de los mismos.

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8. 9. 10. 11 .

C o rre s p o n d e n c i a .

12. José M González-Darder Servicio de Neurocirugía Hospital General de Castellón Avda. de Benicassim, s/n. 12004-Castellón de la Plana Tel. 964 20 01 00 ext. 1600 FAX. 964 52 23 45 [email protected]

13. 14. 15. 16.

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