PROCEDIMIENTO RECUENTO DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Sección Microbiología de Alimentos 1.

Fecha revisión: 11.07.2008 Página 1 de 15

PRT-712.04-034

OBJETIVO

Detectar el número de unidades formadoras de colonias alimentos. 2.

Fecha emisión: 1996 Revisión: 2

de Clostridium

perfringens en

CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento a los alimentos en los que se espera detectar >100 células/g o mL. 3.

FUNDAMENTO

El fundamento del método se basa en las características bioquímicas de este microorganismo. El medio contiene sulfitos y sales de Fe, dado que el Clostridium perfringens es capaz de reducir los sulfitos a sulfuro y en presencia de Fe se forma Sulfuro ferroso y por tanto las colonias de Clostridium perfringens las veremos de color negro, además precipita la lecitina de la yema de huevo, por lo que se observa un halo de precipitación alrededor de la colonia. 4.

REFERENCIAS

4.1

Food and Drug Administration "Bacteriological Analytical Manual online, enero 2001, carpeta 16.

5.

TERMINOLOGÍA

No Aplica

PROCEDIMIENTO RECUENTO DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Sección Microbiología de Alimentos

PRT-712.04-034

6.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

Materiales

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6.1.1

Pipetas bacteriológicas estériles de 1, 5 y 10 mL graduadas en 0,1 mL

6.1.2

Placas Petri estériles 15 x 100 mm

6.1.3

Propipetas

6.1.4

Jarras de Anaerobiosis

6.2

Medios de Cultivo y Reactivo

6.2.1

Agar Triptosa Sulfito Cicloserina (TSC) en frascos Schott

6.2.2

Agar Nitrato Movilidad en tubos 16 x 160 t/ rosca

6.2.3

Medio Lactosa Gelatina en tubos 16 x 160 t/ rosca

6.2.4

Caldo Tioglicolato en tubos 18 x 180

6.2.5

Agua peptonada 0,1 %

6.2.6

Solución de cicloserina al 0,5 %

6.2.7

Emulsión de Yema de Huevo al 50 %

6.2.8

Solución de α naftol 0,5 % en ácido acético 5 M

6.2.9

Solución Ácido Sulfanílico 0,4 % en ácido acético 2,6 M

6.2.10

Indicador de Anaerobiosis Oxoid, Merck o Biomerieux

6.2.11

Reactivos para producir anaerobiosis Oxoid (Gaspack)

6.2.12

Sílica gel con indicador u otro desecante

6.2.13

Zinc en polvo

6.2.14

Iron Milk medium

6.2.15

Caldo esporulación

6.2.16

Medio de fermentación de Spray

6.2.17

Medio de esporulación AE

6.2.18

Medio de esporulación modificado de Duncan-Strong

6.2.19

Caldo hígado o medio cooked meat modificado

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Solución Glicerina–Sal

6.2.21

Reactivos Tinción Gram

6.3

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Equipos

6.3.1

Estufa de incubación regulada a 35 ± 1º C

6.3.2

Baño termorregulado a 47± 2º C

6.3.3

Refrigerador 4 a 8 ° C

7.

DESARROLLO

7.1

Recepción de la muestra en el laboratorio 339

7.1.1

Recibir la dilución 10-1 de la muestra procesada en el laboratorio de Recepción de muestras según PRT–712.01-002 “Procedimiento Procesamiento de las muestras de alimentos y agua para análisis microbiológico”

7.1.2

Anotar en el cuaderno de inscripción de muestras del laboratorio, la clave, N° de muestra asignado por CISP, fecha y naturaleza de la muestra.

7.1.3

En el caso de muestras de brotes de ETA, anotar la información adicional que se disponga, si la hay.

7.1.4

Mantener la dilución de la muestra refrigerada mientras se prepara el material, si no está dispuesto para comenzar la siembra.

7.1.5

El período transcurrido entre la preparación del homogeneizado de la muestra y la siembra no debe superar los 20 minutos.

7.2

Siembra de la muestra

7.2.1

Fundir el medio base TSC y mantener a 47 ° C ± 2 ° C.

7.2.2

Preparar las diluciones seriadas 10-2 y 10-3 o más si fuese necesario a partir de la dilución 10-1 de la muestra preparada según PRT-712.01-002 cuidando de airear lo menos posible la muestra.

7.2.3

Recuento de células viables de C. perfringens

7.2.3.1

Vierta 6 a 7 mL de agar TSC sin yema de huevo mantenido en baño termorregulador a 47° C ± 2° C a cada placa donde se va a realizar la siembra respectiva.

7.2.3.2

Con movimiento giratorio distribuya uniformemente el agar.

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7.2.3.3

Una vez solidificado asépticamente transfiera 1 mL de cada dilución previamente homogeneizada en el centro de la placa por duplicado.

7.2.3.4

Vierta 15 mL de agar TSC sin yema de huevo mantenido en baño a 47 ° C ± 2° C y mezcle el inóculo rotando la placa en sentido de la manecilla de reloj, luego en forma vertical, después en sentido contrario a las manecillas del reloj y finalmente en forma horizontal.

7.2.3.5

Alternativamente para muestras que contienen otros tipos de microorganismos sulfito- reductores, sembrar 0,1 mL de cada dilución sobre placas con 15 mL de agar TSC con yema de huevo previamente solidificado en la placa.

7.2.3.6

Considerar en ciertos alimentos las límites de los rangos establecidos en el Reglamento Sanitario de los Alimentos en las cuales las muestras pueden aceptarse con recuentos entre 10 y 100 ufc/g C. perfringens, en este caso se recomienda sembrar 1 mL distribuido en 3 placas con 0,3 mL, 0,3 mL y 0,4 mL para alcanzar el rango de lectura.

7.2.3.7

Diseminar con rastrillo estéril y dejar que se absorba por unos 5 minutos y finalmente cubrir con aprox. 10 mL de agar TSC sin yema de huevo mantenido en baño de agua termorregulador a 47 ° C ± 2 ° C.

7.2.3.8

Dejar solidificar.

7.2.3.9

Preparar caldo hígado o cooked meat para inoculación, previo calentamiento por 10 minutos a baño de agua hirviendo y enfriado rápidamente.

7.2.3.10 Inocule 3 a 4 tubos con 2 mL de dilución 1:10. 7.2.3.11 Incubar los tubos 24 a 48 h a 35° C en incubadora estándar. 7.2.3.12 Descarte si existe desarrollo en las placas de agar. 7.2.4

Preparación de la jarra anaerobiosis

7.2.4.1

Comprobar que la sílica–gel este seca, por observación de color, al hidratarse vira de azul a rosado.

7.2.4.2

Comprobar viraje del color del indicador.

7.2.4.3

Una vez comprobado el color del indicador y del sílica gel, preparar la jarra de Anaerobiosis, colocando en su interior estos dos reactivos cubriendo el sílica-gel con papel filtro y adherir el indicador a las paredes de la jarra.

7.2.4.4

Colocar las placas sin invertir dentro de jarras de anaerobiosis.

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7.2.4.5

Colocar un sobre de Anaerogen, recién sacado del sobre protector en un costado de la jarra y utilizar según instrucciones del fabricante.

7.2.4.6

Tapar la jarra cuidadosamente, debe quedar hermética.

7.2.5

Incubación

7.2.5.1

Incubar a 35º C ± 1° C por 24 horas.

7.2.5.2

En caso de no haber desarrollo (presencia de colonias negras) o son muy pequeñas, incubar por 24 horas más en anaerobiosis.

7.2.5.3

Una vez concluido el período de incubación, sacar las jarras de la estufa.

7.2.5.4

Dejar un rato a temperatura ambiente.

7.2.5.5

Comprobar que el indicador de anaerobiosis esté virado de incoloro a rosado.

7.2.5.6

Abrir la jarra y sacar cuidadosamente las placas.

7.2.5.7

Ordenarlas de acuerdo al número de la muestra y a las diluciones realizadas.

7.3

Lectura

7.3.1

Recuento presuntivo de células viables de C. perfringens

7.3.1.1

Seleccionar las placas que contienen entre 20 y 200 colonias.

7.3.1.2

Las colonias de C. perfringens en medio yema de huevo son negras con 2 a 4 mm de zona blanca opaca al rededor de la colonia como resultado de la actividad de la lecitinasa.

7.3.1.3

Registrar las lecturas hoja de registro de análisis del laboratorio RG-712.00-080.

7.3.1.4

Calcular el recuento presuntivo aplicando la fórmula que aparece a continuación: Recuento presuntivo = Lectura x factor de dilución

7.3.1.5

En caso de no tener colonias aisladas, tomar con asa una porción del cultivo inocular en Caldo tioglicolato previamente calentado en agua a ebullición por 20 minutos y enfriado rápidamente en agua fría antes de inocular, para ello después de cumplido el tiempo de ebullición para eliminar el oxígeno disuelto, trasladar rápidamente los tubos y enfriar en agua de grifo. Asegurar cerrar las tapas de los tubos.

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7.3.1.6

Incubar durante 24 horas a 35° C en anaerobiosis.

7.3.1.7

Una vez transcurrido el tiempo, observar que haya suficiente desarrollo.

7.3.1.8

Sembrar por agotamiento en superficie una gota de cultivo utilizando el mismo medio que para el recuento, aplicando una segunda capa como indica el punto 7.2.3.7.

7.3.1.9

Incubar durante 24 horas a 35° C en anaerobiosis.

7.3.1.10 Registrar este procedimiento si fue realizado para aislar colonias e indicar la dilución de las placas utilizadas. 7.4

Pruebas Presuntivas

7.4.1

Test presuntivo caldo tioglicolato

7.4.1.1

Seleccionar 10 colonias típicas desde el agar TSC con yema de huevo e inocular en caldo tioglicolato previamente calentado y enfriado.

7.4.1.2

Incubar en forma estándar, es decir no en jarra de anaerobiosis por 18 a 24 horas a 35° C.

7.4.1.3

Realizar Gram para verificar pureza del cultivo. C. perfringens son bacilos cortos, gruesos, Gram positivos.

7.4.1.4

Si existe evidencia de contaminación traspase cultivo(s) contaminados mediante siembra en estría, a agar TSC con yema de huevo e incube en jarra anaeróbica por 24 horas a 35° C.

7.4.1.5

Las colonias en superficie son de color gris amarillentas, con zona opaca de 2 a 4 mm producto de la actividad de la lecitinasa.

7.4.1.6

Este procedimiento es utilizado también para aislar C. perfringens desde caldo hígado o cooked meat cuando el microorganismo no es detectado directamente en placas de agar.

7.4.2

Test presuntivo Iron- Milk

7.4.2.1

Inocular el medio modificado de Iron–Milk tioglicolato.

7.4.2.2

Incubar en baño de agua a 46° C.

con 1 mL de cultivo en caldo

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7.4.2.3

Después de 2 horas observar la “fermentación en tormenta”.Esta reacción es caracterizada por la rápida coagulación de leche seguida de la fractura del requesón en masa esponjosa que usualmente se eleva hasta la superficie.

7.4.2.4

Remover los tubos positivos para evitar derrame en el baño. Por esta razón no use tubos pequeños.

7.4.2.5

Cultivos que tardan 5 o más horas en presentar fermentación en tormenta son poco probable cepas de C. perfringens y como es una prueba que depende del tipo de cepa y del inóculo se debe definir su propósito, por lo que se recomienda realizarla en casos de brotes.

7.5

Pruebas confirmativas

7.5.1

Repicar 3 a 5 colonias según el recuento y si es necesario repicar hasta 10 en los siguientes medios de cultivo:

7.5.1.1

Agar nitrato-movilidad (tamponado) y Medio lactosa gelatina

7.5.1.1.1 Repicar con asa de 2 mm de un cultivo puro del caldo tioglicolato o de colonia aislada en agar TSC. 7.5.1.1.2 Pinchar por picadura el medio nitrato movilidad y el medio lactosa gelatina pinchar varias veces para asegurar una inóculo adecuado. Enjuagar el asa en agua tibia antes de flamear para evitar aerosoles. 7.5.1.1.3 Incubar a 35 ° C por 24 horas. 7.5.1.1.4 Medio Lactosa-Gelatina Observar cambio de color rojo a amarillo debido a la producción de ácido y gas. Incubar a 5° C por 1 hora y examine la licuación de gelatina. Si el medio presenta gel incube 24h a 35° C y examine posteriormente licuefacción como se indica arriba. 7.5.1.1.5 Medio Nitrato-Movilidad: Observe desarrollo sólo en la línea de inoculación, C. perfringens es inmóvil. C. perfringens reduce nitratos a nitritos lo que se evidencia al añadir 0,5 mL del reactivo A y 0,2 mL del reactivo B, el desarrollo de un color violeta dentro de 5 minutos indica presencia de nitritos. Si no se desarrolla color agregar polvos de zinc y si sigue incoloro indica que los nitratos fueron completamente reducidos. Si después de agregar polvos de zinc ocurre coloración, indica que los nitratos no fueron reducidos a nitritos. 7.5.1.2

Caldo de esporulación

7.5.1.2.1 Inocular caldo de esporulación con 1 mL de de cultivo en tioglicolato.

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7.5.1.2.2 Incubar los tubos sembrados a 35° C ± 1° C por 24 horas. 7.5.1.2.3 Cumplido este período, sacar los tubos de la incubadora. 7.5.1.3

Del caldo de esporulación realizar Gram y examine la presencia de esporas. Mantener a 4° C si nuevas pruebas se requieren.

7.5.1.4

Anotar los resultados en hoja de registro RG-712.00-080.

RESULTADOS CONFIRMATIVOS para Clostridium perfringen Agar SFP - TSC

Colonias negras con zona precipitación

GRAM

Bacillo Gram positivo, esporulado

Agar Nitrato Movilidad

Color rojo por reducción de nitrato a nitrito. Desarrollo sólo en la línea de siembra, es inmóvil.

Medio Lactosa Gelatina

Color amarillo por fermentación de la lactosa y gas Permanece líquido después de estar durante 1 hora en refrigeración, por hidrólisis de la gelatina.

Se deben cumplir todas estas pruebas para confirmar las colonias en estudio como C. perfringens

7.6

Pruebas adicionales

7.6.1

Cuando se presentan pruebas dudosas realizar las siguientes pruebas adicionales.

7.6.2

Inocular 0,1 mL de cultivo puro del caldo tioglicolato a un tubo que contiene medio de fermentación de Spray con salicina al 1%, un tubo con rafinosa al 1% y un tubo sin carbohidrato.

7.6.3

Incubar 24 horas a 35° C.

7.6.4

El medio con salicina observar ácido y gas, el ácido se examina transfiriendo cultivo con asa de 2 mm a un papel de prueba al azul de bromotimol. Usar sólo asa de platino. La ausencia de color o el desarrollo de un ligero color verde indica que el ácido se ha producido .Alternativamente transfiera 1,0 mL del cultivo a una placa y

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añada 1 ó 2 gotas de azul de bromotimol al 0,04%. Un verde suave o color amarillo indica que el ácido se ha producido. 7.6.5

Incubar por 48 horas y realice nuevamente el test si es necesario.

7.6.6

Salicina es rápidamente fermentada con producción de gas por especies similares de Clostridium pero no es fermentada por C. perfringens.

7.6.7

La producción de ácido a partir de rafinosa es producida por C. perfringens dentro de 3 días pero no es producida por otras especies similares.

7.6.8

Un ligero cambio de pH puedo ocurrir en el tubo sin carbohidratos.

7.7

Cultivo de esporulación y producción de enterotoxina

7.7.1

Utilizar caldo tioglicolato o cooked meat como se describe arriba.

7.7.2

Incubar por 24 horas a 35° C, seguido por una incubación a temperatura ambiente por 24 horas.

7.7.3

Para subcultivos para esporulación y producción enterotoxina. Mezclar el cultivo de cooked meat con Vortex y transferir 0,5 mL de la mezcla a cada uno de los 2 tubos conteniendo 10 mL de medio tioglicolato.

7.7.4

Calentar un tubo en baño de agua a 75° C por 10 minutos. Luego incubar a 35° C por 18 horas.

7.7.5

Incubar el segundo tubo a 35° C por 4 horas y use este cultivo para inocular el medio AE de esporulación modificado o medio de esporulación de Duncan- Strong.

7.7.6

Incubar a 35° C por 18-24 horas en jarra de anaerobiosis.

7.7.7

Verificar las esporas usando un microscopio de contraste de fase o por examen de frotis teñido.

7.7.8

Se considera buena esporulación a un valor > 5 esporas por campo.

7.7.9

Centrifugar una porción de cultivo de esporulación por 15 minuto a 10.000 x g y del sobrenadante realice test de toxina por RPLA.

7.8

Cálculo y Expresión de resultados

7.8.1

Anotar todos los resultados en el registro RG-712.00- 080.

7.8.2

Calcular el número de unidades formadoras de colonias por g de muestra. El recuento confirmado se obtiene mediante la siguiente fórmula:

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Recuento Confirmado = Promedio de Rto Presuntivo * N° colonias confirmadas * dilución N° colonias sometidas a confirmación 7.9

Informe de resultados

7.9.1 8.

Informar el recuento de Clostridium perfringens en ufc/g o mL de alimento. REGISTROS

Identificación del registro RG-712.00-080 Registro informe Recuento Clostridium perfringens en alimentos RG- 712.00-098 Registro control esterilidad medios de cultivo laboratorio 339 RG 712.00-100 Registro batería bioquímica de cepa control positivo y control negativo Clostridium perfringens 9.

Almacenamiento

Protección

Archivador azul Acceso rotulado registro restringido informes personal de laboratorio 339 Sección Microbiología Archivador Acceso Registro controles restringido laboratorio 339 personal de Sección Microbiología Archivador Acceso Registro controles restringido laboratorio 339 personal de Sección Microbiología

Recuperación Papel al la Papel al la Papel al la

Tiempo retención y disposición 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos

TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión Nº 0

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Motivo del cambio Se elimina página 1 por cambio en formato documento institucional.

Fecha Aprobación

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PRT-712.04-034 Motivo del cambio Se cambió formato del encabezado de página en todo el documento. Se corrige PRT-702.04-034 por “PRT712.04-034”.

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Se cambió número de revisión N° 0 por revisión N° 1 y el total de páginas. Se deja pie de página sólo en página 1 y se actualizan los cargos. Se actualizó la referencia del punto 4.1 y se eliminaron las referencias del 4.2 al 4.4 En el punto 6.1.1 se agregó :...” estériles”... En el punto 6.1.2 se agregó:” estériles 15 x 100 mm” En el punto 6.2.1 se cambió SFP por TSC y placas Roux por frascos Schott. En el punto 6.2.5 se corrigió Agua peptonada 0,01% por Agua peptonada 0,1% Se agregaron los puntos 6.2.14 al 6.2.20 En el punto 6.3.2 se corrigió 45°C± 1°C por 47°C ± 2°C. En el punto 7.1 se corrigió laboratorio 338 por laboratorio 339. En el punto 7.1.1 se corrigió PR-71.00-022 por PRT-712.01-002. En el punto 7.1.2 se agregó : ...”N° de muestra asignado por el CIPS”... Los puntos 7.2.1 y 7.2.3 se eliminaron. En el punto 7.2.2 se cambió : agar SFP por agar TSC y se corrigió 50°C por 47° C ± 2°C. En el punto 7.2.4 se agregó: ...”seriadas 10-2 y 10-3 o más si fuese necesario a partir de la dilución 10-1 de la muestra preparada según PRT-712.01-002”.... El punto 7.2.5 se cambió por: “Recuento

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PRT-712.04-034 Motivo del cambio de células viables de C. perfringens”, y sus ítemes 7.2.5.1 al 7.2.5.1 El punto 7.2.6 se cambió a: “Preparación de la jarra anaerobiosis” y sus ítemes del 7.2.6.1 al 7.2.6.6 Se continúa co la enumeración correlativa 7.2.7 al 7.2.13 Se asignó el número 7.3.1 y sus ítemes 7.3.1.1 al 7.3.1.4 y se continúo con la enumeración correlativa 7.3.2 al 7.3.7 Se cambió el punto 7.4 Pruebas confirmativas por Pruebas Presuntivas y se agregaron sus ítemes respectivos del 7.4.1 al 7.4.7 y los ítemes 7.4.7.1 al 7.4.7 5. El punto 7.5 se cambió por Pruebas Confirmativas con los puntos 7.5.1 al 7.5.11 a los cuales se les modificó el contenido. Se agregó el punto 7.6 Pruebas adicionales y sus ítemes respectivos 7.6.1.al 7.6.8 Se agregó el punto 7.7 Cultivo de esporulación y producción de enterotoxina con sus ítemes respectivos del 7.7.1 al 7.7.9 El punto 7.6 cambió a 7.8 y en el 7.6.1 se corrigió R6-702.00por RG- 712-00-080 En el punto 8.0 RESPONSABLES se cambió por REGISTROS y sus ítemes. Se incluyó tabla de registros. Se eliminaron los ítemes de responsables. El punto 9.0 Distribución se cambió por: TABLA DE MODIFICCAIONES. Se agregó el punto 10. ANEXOS y sus ítemes N°1 al N°5

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ANEXOS

Anexo N° 1: Preparación de medios de cultivo. Anexo N° 2: Preparación de reactivos Anexo N°3: Hoja de Registro Informe Recuento Clostridium perfringens en Alimentos RG712.00-080. Anexo N° 4: Hoja de Registro batería bioquímica de cepa control positivo y cepa control negativo C. perfringens, RG-712.00-100. Anexo N° 5: Hoja de Registro Control Esterilidad Medios de Cultivo Laboratorio 339, RG712.00-098

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ANEXO N ° 1- PRT-712.04-034 PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO Medio Iron Milk Fórmula: Leche entera fresca Sulfato ferroso x 7 H20 Agua destilada

1L 1g 50 mL

Disolver el sulfato ferroso en 50 mL de agua destilada. Añadir lentamente 1 litro de leche y mezcle con agitador magnético. Dispensar 11 mL en tubos de 16 x 150 mm. Autoclavar 12 minutos a 118° C.

Medio de fermentación de Spray Fórmula: Triptona Neopeptona Agar Tioglicolato de sodio

10 g 10 g 2g 0,25 g

Disolver todos los ingredientes excepto el agar y ajuste pH a 7.4± 0,2.Añada el agar y caliente con agitación hasta disolver completamente. Dispensar 9 mL en tubos de 16 x 125 mm. Autoclave 15 minutos a 121° C. Antes de su uso, caliente en baño de agua o vapor por 10 minutos. Añada 1 mL de solución estéril al 10% de carbohidrato a los 9 mL de base.

Caldo esporulación Fórmula: Polipeptona Extracto levadura Almidón soluble Mg SO4 Tioglicolato de sodio Na2 HPO4 Agua destilada

15 g 3g 3g 0,1 g 1g 11 g 1L

Ajuste pH a 7,8 ± 0,1. Dispense porciones de 15 mL en tubos de 20 x 150 mm con tapa rosca. Autoclave 15 minutos a 121° C.

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ANEXO N° 2- PRT-712.04-034 PREPARACIÓN DE REACTIVOS Reactivos detección Nitrito A. Reactivo Acido sulfanílico Acido sulfanílico Acido acético 5N

1g 125 mL

B. Reactivo N-(1 naphthyl) ethylenediamine N-(1 naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride Acido acético 5 N

0,15 g 200 mL

C. Reactivo Naphthol α – Naphthol Acido acético

1g 200 mL

Para preparar ácido acético 5 N, añada 28,75 mL de ácido acético glacial a 71,25 mL de agua destilada. Para el test añadir 0,1 a 0,5 mL de de reactivo A y B o C a un medio líquido o semisólido. El desarrollo de un color rojo–violeta con reactivo A y B o color naranjo con reactivo A y C indica que el nitrato ha sido reducido. A veces el color resultante de reactivo A y B puede palidecer o desaparecer dentro de pocos minutos, por tanto registre la reacción tan pronto como aparezca el color, si no se produce desarrollo de color añadir una pequeña cantidad de zinc en polvo. Si se desarrollo color, significa que el nitrato no ha sido reducido.

Indicador de azul de bromotimol al 0,04% Fórmula: Azul de bromotimol NaOH 0,01 N

0,2 g 32 mL

Disolver el azul de bromotimol y luego diluir en 500 mL de agua destilada.