UNIVERSIDAD DE COLIMA .

EL EFECTO DE LA TERBUTALINA SOBRE EL ACOPLE EXCITACIÓN CONTRACCIÓN EN FIBRAS MUSCULARES LENTAS DE RANA PIPIENS.

TESIS Que para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS MEDICAS

Presenta:

M. en C. RAUL LOPEZ ASCENCIO

ASESOR: D. en C. MIGUEL HUERTA VIERA COASESOR : D. en C. XOCHITL A. R. TRUJILLO TRUJILLO Colima, Col. septiembre del 2001.

DEDICATORIAS. A mi esposa: Martha Alicia Madrigal Madrigal: Por su apoyo incondicional en todo momento.

A mis hijos: Laura y Raúl. Por cederme parte de su tiempo que ya no podré regresárselos.

A mis Asesores: Dr. Miguel Huerta Viera Dra. Xochitl Trujillo Trujillo Por brindarme su apoyo y su valiosos tiempo para la realización de este trabajo.

A la Universidad de Colima: De forma muy especial a los Dres. Carlos Salazar Silva y Ramón A. Cedillo Nakay; Por brindarme la oportunidad de realizar esta Tesis. A todos aquellos que de una u otra forma me brindaron su apoyo incondicional Gracias: Mario, Raymundo, Leo, Juan Carlos.

Colima, Colima. Septiembre del 2001.

INDICE

Página

RESUMEN..................................................................................................

1

SUMMARY ................................................................................................

2

I.-

INTRODUCCIÓN ......................................................................................

3

II.-

ANTECEDENTES ......................................................................................

5

2.1 Sarcolema ...............................................................................................

6

2.2 Túbulos- T. ..............................................................................................

7

2.3 Miofibrillas .............................................................................................

10

2.4 Núcleo ....................................................................................................

11

2.5 Mecanismo de acople entre la excitación y la contracción .....................

12

a).- Movimiento Intramembranal de Cargas ..............................................

15

b).- Control de la Liberación de Calcio Intracelular ....................................

16

2.6 Agonistas Adrenérgicos .........................................................................

18

2.7 Clasificación de los receptores adrenérgicos .........................................

19

2.8 Función de los receptores adrenérgicos β. .............................................

19

2.9 Agonistas beta adrenérgicos. .................................................................

21

A).- ANTECEDENTES MEDIATOS. ........................................................

21

B).- ANTECEDENTES INMEDIATOS ......................................................

26

a).- La Terbutalina ......... .............................................................................

26

III.-

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...................................................

27

IV.-

JUSTIFICACIÓN .......................................................................................

28

V.-

HIPÓTESIS ................................................................................................

29

5.1 Hipótesis nula ........................................................................................

29

5.2 Hipótesis alternativa ...............................................................................

31

OBJETIVO GENERAL................................................................................

30

6.1 Objetivos específicos ............................................................................

30

METODOLOGÍA ......................................................................................

31

7.1 Diseño experimental ..............................................................................

31

VI.-

VII.-

7.2 Universo de estudio ................................................................................

31

7.3 Definición de las unidades de observación ...........................................

31

7.4 Definición de las unidades de control ......................................................

31

7.5 Criterios de inclusión ...............................................................................

32

7.6 Criterios de no inclusión ..........................................................................

32

7.7 Criterios de eliminación ..........................................................................

32

7.8 Proceso experimental ...............................................................................

32

7.8.1 Curva concentración respuesta .............................................................

34

7.8.2 Contracturas en cero calcio ...................................................................

34

7.8.3 Soluciones .............................................................................................

35

7.8.4 Reactivos ...............................................................................................

35

7.8.5 Análisis estadístico ................................................................................

36

VIII.- RESULTADOS.

..........................................................................................

37

8.1 Efecto de la terbutalina sobre la contractura por K+. ...............................

37

8.2 Curva Concentración-Respuesta a la terbutalina en haces de fibras lentas de Rana pipiens. ...................................................................

40

8.3 Modulación del curso temporal al pico máximo de tensión por la terbutalina. .......................................................................................

41

8.4 Recuperación del pico máximo de tensión después de la contractura de prueba. 8.5 Efecto de la terbutalina en contracturas realizadas en cero calcio. .........

41

IX.-

DISCUSIÓN. ...............................................................................................

45

X.-

CONCLUSIONES. ......................................................................................

47

XI.-

BIBLIOGRAFÍA. ........................................................................................

48

RESUMEN. Introducción: La terbutalina es un agonista ß2 selectivo, que produce relajación del músculo liso bronquial lo que lo vuelve útil en el manejo del asmático, sin embargo, el temblor producido por la activación de receptores ß2 del músculo esquelético tiende a limitar su uso (Hoffman y Lefkowitz, 1996). Objetivo: Conocer el efecto de la terbutalina sobre el acople excitación contracción en los haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana pipiens. Método : Se realizaron contracturas con alto potasio en haces de fibras tónicas del músculo crulalis de rana, en soluciones con 1.8 mM de calcio y libres de calcio, en presencia y ausencia de terbutalina. Resultados : La terbutalina produjo una disminución en la fuerza de la contracción en fibras lentas del músculo cruralis de Rana pipiens, ésta fue dependiente de la concentración, con una CE50 de 3 µM. Además, se produjo un retraso en el inicio del pico máximo de tensión hasta de 24 segundos para concentraciones de 10 µM de terbutalina. La concentración de 10 µM de terbutalina produjo una disminución del pico máximo de tensión en un 18 % en soluciones sin calcio extracelular. Conclusión: El efecto de la terbutalina sobre la fuerza de contracción en fibras lentas de rana, es dependiente de la liberación de calcio a partir de fuentes intracelulares, como es el retículo sarcoplásmico.

SUMMARY. Introduction: Terbutaline is a ß2 selective agonist, that produces relaxation in bronchial smooth muscle being useful in the management of the asthmatics, however the trembling produced by the activation of receptors ß2 in skeletal muscle tends to limit its use (Hoffman and Lefkowitz, 1996). Objective: To Know the effect of terbutaline upon the excitationcontraction coupling in fascicles of slow muscle fibers from crulalis of the frog Rana pipiens. Method: The contracture with high potassium were carried out in tonic fibers of the crulalis of the frog, in solutions with 1.8 mM of calcium and free of calcium, in the presence and in the absence of terbutaline.

Results: Terbutaline produced a decrease in the strength of the

contraction in slow fibers of the crulalis muscle of the frog Rana pipiens, an effect dependent of the concentration, with a CE50 of 3 µM. Besides, a delay was produced in the beginning of the peak of tension even in 24 seconds for concentrations of 10 µM of terbutaline. The concentration of 10 µM of terbutaline produced a decrease in maximum peak of tension in bout 18% in solutions without calcium. Conclusion: The effect of terbutaline upon the strength of contraction in slow fibers of frog, is clerk of the liberation of calcium from intracellular organelles as sarcoplasmic reticulum.

I.- INTRODUCCIÓN. El músculo esquelético de rana posee dos tipos diferentes de fibras musculares; Las fibras rápidas y las tónicas o lentas. Las fibras musculares lentas presentan una contracción lenta y graduada con estimulación del nervio, diferente a la de las fibras rápidas, además, son capaces de mantener su tensión muscular cuando su membrana se mantiene despolarizada de manera continua (Kuffler y Vaughan Williams, 1953; Huerta, Muñiz y Stefani, 1985). El desarrollo de tensión isométrica en respuesta a despolarizaciones intensas se instala cerca de 10 veces más lentamente que en las fibras rápidas y la relajación en respuesta a la repolarización es igualmente lenta (Nuñez,1987). El desarrollo de tensión inducido por despolarizaciones producidas con alto potasio, o con fijación de voltaje se mantiene mientras perdura la despolarización. Para despolarizaciones sostenidas, a valores del Potencial de membrana en reposo (Em) más positivos que - 40mV, la meseta está precedida de un pico inicial de tensión (Nuñez, 1987). En las fibras tónicas, el pico inicial al igual que en las fibras rápidas depende de Ca

++

liberado de fuentes intracelulares (Gilly y Hui, 1980). Además se

conoce que el Ca++ extracelular es importante para el mantenimiento del desarrollo de tensión durante despolarizaciones prolongadas (Luttgau,1963; Godt et al. 1984; Huerta, 1984). ++

Actualmente se conoce que las fibras tónicas de anfibio presentan una doble fuente de Ca

activador, una fuente externa, y el retículo sarcoplásmico (Huerta y Stefani, 1981; Huerta, Muñiz, y Stefani, 1985). Así, cuando las fibras lentas son bañadas con altas concentraciones de K+ se producen contracciones sostenidas, las cuales presentan dos fases: una fase temprana, y una fase de ++

mantenimiento; donde el Ca

externo parece que no es esencial dur ante la fase temprana del

desarrollo de tensión (Miledi, Parker y Schalow, 1977; 1981 ). En contraste, el Ca

++

extracelular es importante durante el mantenimiento de la fase de contractura en fibras lentas de pollo (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981; Kikucki y Schmidt, 1983) y en Rana pipiens (Huerta, Muñiz y Stefani, 1985). Existen evidencias de que las aminas simpático miméticas modulan la contracción y relajación en fibras de músculo esquelético de mamífero (Tomita, 1975; Bowman 1980; Williams y Barnes, 1989). La naturaleza de la respuesta depende del tipo de fibras del músculo: en fibras musculares de sacudida rápida, la fuerza medida al pico de la sacudida se

incrementa 10 a 20 % y la relajación se enlentece (Bowman y Zaimis, 1958; Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita 1975; Holmberg y Waldeck 1980). En contraste, la fuerza al pico de la sacudida es deprimida en un 10 a 25 % en fibras musculares de sacudida lenta y la relajación de la sacudida es acelerada (Bowman y Zaimis 1958; Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita 1975). Sin embargo, bajo algunas condiciones la fuerza se incrementa en músculos de sacudida lenta (Tashiro 1973; Tomita 1975; Holberg y Waldeck, 1980) o en fibras tónicas (Huerta et al. 1991). La terbutalina es un agonista β2 selectivo que

en clínica es conocida como un

broncodilatador ß2 selectivo. Se ha utilizado para el tratamiento prolongado de las enfermedades obstructivas de las vías aéreas y para tratar el broncoespasmo agudo (Creticos, 1993; Brown, 1993). Además, se ha utilizado en la prevención del parto prematuro (Vera, 1998). El uso continuo de la terbutalina genera efectos adversos tales como el tremor, por estimulación de receptores ß2 del músculo esquelético,

provocando

un aumento en la

amplitud de los movimientos en el rango de frecuencia de los temblores fisiológicos (Lulich et al. 1986). En estudios realizados con terbutalina por Cairns y Dulhunty (1993) en fibras musculares rápidas con sacudida única y en tétanos, ésta incrementa el pico de tensión y disminuye el tiempo de la relajación en las preparaciones estudiadas. Sin embargo, no se han realizado estudios con terbutalina en fibras lentas. Por lo anterior se decidió conocer la actividad que la terbutalina produce en fibras musculares lentas de Rana pipiens. Para conocer el efecto de la terbutalina en fibras lentas se utilizaron haces pequeños (< 500 µm de diámetro) de fibras musculares tónicas de músculo cruralis de Rana pipiens, estos fueron sometidos a soluciones con alto K+ (40 mM) con concentraciones de cero y de 1.8 mM de calcio en presencia y en ausencia de terbutalina. En las contracturas con alto potasio y 1.8 mM de calcio la terbutalina produjo una disminución del pico máximo de tensión dependiente de la concentración de terbutalina con una CE50 de 3 µM, además de un retraso en la aparición del pico máximo de tensión hasta de 24 segundos para concentraciones de 210 µM de terbutalina, estos efectos sugieren la presencia de receptores ß2 en las fibras musculares lentas de Rana pipiens, además que la

terbutalina no solo está afectando la cantidad de Ca++ liberado por el RS , sino la velocidad en que este Ca++ es liberado por el mismo RS ( Hayatsu et al. 1981;Huerta et al. 1991). Las contracturas realizadas en cero calcio permitieron aseverar que el efecto que la terbutalina produce es a través de una disminución de la liberación de calcio por el retículo sarcoplásmico, como se demuestra con la disminución del 18.8 % como promedio del pico máximo de tensión producido por la terbutalina en cero calcio (Huerta, Muñiz y Stefani; 1986). Aunque para concentraciones bajas de terbutalina (0.1nm y 1.0 µM) la recuperación del pico máximo de tensión es casi completa (hasta un 97 % respecto al testigo), ésta difiere mucho para concentraciones mayores (10 y 100 µM), donde la recuperación es incompleta

(80.5

hasta un 59 % respecto al testigo). Al parecer, la recuperación es dependiente de la dosis. Sin embargo, es muy posible que la recuperación sea incompleta solo para el tiempo de lavado estudiado, y aunque se dejaron para algunas preparaciones hasta 1.5 horas la recuperación no fue total. Esto podría atribuirse a un efecto metabólico producido por la activación de los receptores β y la cascada de segundos mensajeros. Por otro lado, la lesión de la fibra podría ser otra posibilidad que pudiese explicar la recuperación incompleta de los fascículos después del lavado (Hoffman y Lefkowitz, 1996). De los resultados obtenidos se puede concluir que la terbutalina produce una disminución de la tensión en fibras musculares lentas posiblemente por un efecto ß2 adrenérgico, secundario a una disminución de la liberación de calcio por fuentes intracelulares.

II.- ANTECEDENTES

El tejido muscular esquelético está compuesto por células multinucleadas llamadas fibras, cuya longitud varia desde unos milímetros hasta varios centímetros y su diámetro entre 10 y 100 µm. Las células musculares esqueléticas no tienen ningún tipo de conexión entre sí como ocurre con las células cardiacas, pero están unidas por tejido conectivo que las rodea y que contiene a los capilares y a los nervios. Al tejido conectivo que rodea a las células musculares se le llama endomisio y al que rodea a grupos de 10 a 20 células para formar un fascículo se le llama perimisio. Los fascículos a su vez están agrupados por el epimisio formando haces que son visibles a simple vista (Nuñez, 1987). Desde el punto de vista esquemático es posible distinguir dos tipos de fibras, unas pálidas y otras más rojas, lo cual permite correlacionar el color, la estructura, las propiedades mecánicas y las características metabólicas de las fibras (Franzini-Armstrong y Peachey, 1981). La gran mayoría de las células musculares son inervadas por un solo axón que termina en una región especializada del músculo conocida como placa neuromuscular. Una neurona puede inervar hasta 1000 fibras, pero en algunos músculos de movimiento fino como en los oculares extrínsecos la relación puede ser 1:1. En la placa neuromuscular el axón se engruesa y se pone en contacto casi directo con la membrana celular quedando separadas por una hendidura o surco sináptico (Anderson- Cedergren, 1959). La neurona y las fibras musculares inervadas por ésta, forman lo que se denomina “unidad motora”. Así las fibras musculares que componen una unidad motora son del mismo tipo, pero un fascículo muscular puede contener un 90 % de fibras del tipo rápido y un 10 % del tipo lento como ocurre en el flexor largo del dedo del gato (Gauthier, Burke, Lowey y Hobbs, 1983), en el caso del sóleo del mismo animal las fibras son casi todas de tipo lento ( Burke, Levine, Salcman y Tsairis, 1974). En las fibras lentas de contractura de la rana, el único axón que las inerva forma numerosas uniones neuromusculares relativamente pequeñas, en cambio en las fibras rápidas

(de sacudida) se forman pocas uniones o una unión más grande (Gauthier et al. 1983).

2.1 Sarcolema. La célula muscular esquelética esta rodeada de una membrana plasmática: el sarcolema (del griego sarcos = carne, lema = cáscara), que al igual que las demás células eucariontes, está formada de una doble capa de fosfolípidos con proteínas inmersas para formar una estructura de 8-10 nm de espesor, es continua y envuelve a todo el material contráctil, organitos, núcleos y sarcoplasma (Nuñez, 1987).

Visto

el

sarcolema

a

través

del

microscopio electrónico, éste presenta depresiones mas o menos marcadas conocidas como caveolas, las cuales aumentan el área aparente de la célula muscular por un factor de 1.8. Sin embargo, se conoce que la longitud de la sarcómera es de 2.4 µm, entonces podrían servir como una reserva de membrana que permite el estiramiento de la fibra sin que ésta se rompa (Dulhunty y Franzini -Armstrong, 1975). De algunas de estas caveolas se originan invaginaciones del sarcolema que en forma de delgados tubos constituyen lo que se llama sistema de tubulos-T.

2.2.- Túbulos-T. El sistema-T o sistema tubular transverso es el conjunto de túbulos-T de una célula muscular, cuyo interior está en continuidad con el espacio extracelular (Huxley, 1964). En los músculos rápidos de la rana cada túbulo-T está frente a la línea Z, mientras que en los músculos lentos de los vertebrados y en la mayoría de los músculos de los invertebrados, la disposición del sistema-T no es tan regular. En el túbulo-T se describen dos componentes básicos: una porción delgada de sección circular y otra aplanada que se relaciona con el retículo sarcoplásmico (RS) (ver figura 1). Esta última porción ocupa un 67% de la superficie total del túbulo-T (Mobley y Eisenberg, 1975). En el músculo esquelético los túbulos-T tienen un diámetro de 50 nm .

Figura 1.- Corte longitudinal del músculo sartorio de rana. En este se puede apreciar los diferentes tipos de bandas que conforman el músculo esquelético. A nivel de las líneas z se puede observar los túbulos-T (Nuñez, 1987). El retículo sarcoplásmico. Todas las células superiores (eucariontes) tienen organitos membranosos, éstos son sistemas de membranas que forman compartimientos cerrados, aislados tanto del exterior como del citoplasma, uno de estos sistemas lo constituye el retículo endoplásmico, rugoso y liso. Esta última porción adquiere gran importancia morfológica y funcional en el tejido muscular en general. En las células musculares, este organito se denomina retículo sarcoplásmico (RS). Las primeras descripciones que confirmaron su existencia se hicieron con el microscopio electrónico (Benett y Porter, 1953; Fawcett,1961; Revel 1962; Peachey 1965), describiéndolo como un sistema de cisternas y túbulos dispuestos en sentido longitudinal entre las fibras contráctiles ( ver figura 1). En el músculo rápido de la rana (Peachey, 1965) se distinguen tres porciones: a).- Una porción de sacos aplanados que tienen contacto con el túbulo-T, llamado cisternas terminales. b).- Una segunda porción de tubos longitudinales que se unen a los anteriores y, c).- una red fenestrada que rodea a las

miofibrillas a nivel de la banda A. Las dos últimas porciones del RS

se encuentran

estrechamente relacionadas con el material contráctil y forman una malla de delgados tubos que unen a dos cisternas terminales. Las estructuras más estudiadas son las cisternas dilatadas, llamadas cisternas terminales; una o dos de éstas forman, junto con un túbulo-T, las llamadas tríadas, estructuras en las que se efectúa el mecanismo de acople excitación-contracción. La tríada se forma por la oposición estrecha de los dos sistemas membranosos, el RS y el sistema-T. La tríada la forman dos cisternas terminales junto con una porción

aplanada de un túbulo-T y

aproximadamente el 27 % del área total del RS forma parte de las tríadas (Mobley y Eisenberg, 1975). Cuando los elementos son dos no tres se llama díada. Aproximadamente, de un 60 a 70 % del área de la membrana del túbulo-T está asociada al RS ( Peachey, 1965; Mobley y Eisenberg, 1975). Entre los dos sistemas membranosos queda un espacio de aproximadamente 10 nm , que es ocupado por los pies , estructuras que miden 10 nm y tienen 2

una disposición regular sobre la membrana del RS , con una densidad de 1000/ µm (FranziniArmstrong, 1974). La homogenización del músculo permite obtener dos fracciones microsomales provenientes del RS: la fracción pesada y la fracción ligera. La primera se cree que corresponde a las cisternas terminales, y la segunda a los elementos longitudinales. Hace poco ++

tiempo se comprobó la acumulación de Ca

en la cisterna terminal (Somlyo, Shuman y

Somlyo, 1977). Más recientemente se han descrito otras estructuras en el espacio entre las membranas de la tríada: los pilares. Mientras que el músculo en reposo tiene unos 40 pilares 2

por µm , estos aumentarán a 66 cuando las fibras desarrollan contracturas con soluciones con altas concentraciones de potasio, por esto se cree que éstos intervienen en el mecanismo de acople excitación-contracción, ya sea como consecuencia de un movimiento de cargas fijas en la membrana o de corrientes iónicas a través de ellas (Eisenberg y Eisenberg , 1982).

2.3.- Miofibrillas.Las estructuras más obvias de la fibra muscular son las miofibrillas, las cuales son las unidades responsables de la contracción y relajación de la fibra. En los músculos estriados esquelético y cardiaco las fibras muestran bandas claras y obscuras o estriaciones características que se originan por la ordenación periódica de las dos proteínas contráctiles (actina y miosina) a lo largo de cada miofibrilla, y por la coincidencia de esta ordenación entre las diferentes miofibrillas. Las miofibrillas tienen de 0.5 a 2.0 µm de diámetro, se extienden a todo lo largo de toda la fibra. Así la disposición regular de las proteínas a lo largo de la miofibrilla da a la fibra muscular su apariencia bandeada bajo el microscopio. La banda clara o banda I (de isotrópica) se tiñe menos intensamente con los colorantes histológicos, es menos refringente cuando se observa con luz polarizada y aparece menos densa cuando se observa al microscopio electrónico (ME). La otra banda, la banda A (de anisotrópica) se tiñe más intensamente, desvía a la luz polarizada y se ve más densa al ME. En medio de la banda A, se ve una banda clara llamada H; y en medio de la banda I se distingue una banda estrecha, que se tiñe intensamente: la línea Z o disco Z. La estructura que queda comprendida entre dos líneas Z se llama sarcómera, que además corresponde a la unidad contráctil del músculo estriado (figura 1). En la miofibrilla se distinguen dos tipos de filamentos contráctiles: los gruesos y los delgados. Un tercer tipo de filamentos , los filamentos intermedios, no tienen función contráctil, sino mecánica (Wang y Ramírez-Mitchell, 1983).

Los filamentos gruesos y

delgados se disponen de tal manera que su sobreposición genera las bandas obscuras y claras atrás mencionadas. Los filamentos gruesos tienen unos 10 nm de diámetro mientras que los delgados tienen unos 5 nm. Los filamentos gruesos miden 1.5 µm de largo y su longitud es muy constante en cada músculo; en cambio, los filamentos delgados tienen una longitud variable en cada sarcómera (Traeger y Goldstein, 1983). Los filamentos gruesos están formados por la proteína miosina, y presentan dos zonas:

una zona larga formada por dos cadenas ligeras de miosina arregladas en forma de una estructura enrollada que terminan en una zona que tiene forma de bastón formada por dos cabezas de miosina, las cuales poseen actividad ATPásica y son capaces de unirse a la actina. Las moléculas de miosina están orientadas a partir del centro del filamento grueso en sentidos opuestos dando así una simetría de orientación. Las colas de miosina se asocian entre sí formando el cuerpo del filamento grueso (Olguín, 1987). Los filamentos delgados están formados por la unión de moléculas de actina G. Esta se encuentra dispuesta en dos cadenas entrelazadas como una doble espiral que da un giro completo cada 35 nm. Además de la actina G, otras dos proteínas forman parte de estos filamentos: la tropomiosina que forma una estructura helicoidal y que proporciona un apoyo estructural al filamento delgado y la troponina (Tn) la cual a su vez se encuentra formada por tres subunidades: la TnI (o subunidad inhibitoria la que en reposo se une a la actina), la TnT (subunidad que se une a la ++

tropomiosina) y la TnC (la subunidad que fija al Ca ). Durante la contracción, ambos tipos de filamentos se deslizan entre sí, interdigitándose y

como resultado de este proceso la

sarcómera se acorta ( Nuñez, 1987).

2.4.- Núcleo. Las células musculares esqueléticas tienen varios núcleos pequeños que se disponen en la periferia inmediatamente por debajo del sarcolema. Las mitocondrias aportan la energía a las células musculares esqueléticas, en general los músculos que son resistentes a la fatiga tienen una mayor cantidad de mitocondrias que los que se fatigan más fácilmente (FranziniArmstrong y Peachey, 1981). En los músculo semitendinoso y el sartorio de la rana las mitocondrias ocupan del 1 - 1.5 % del volumen citoplasmático (Mobley y Eisenberg, 1975).

2.5.- Mecanismo de acople entre la excitación y la contracción (EC).

El mecanismo de acople excitación contracción (EC) tradicionalmente se ha descrito como el proceso que une la excitación eléctrica de la membrana muscular con la contracción muscular (Ríos y Pizarro, 1991) posiblemente corresponda a un conjunto de eventos cuyo ++

resultado final es la apertura de canales y la liberación de Ca . Este fenómeno ha sido objeto de amplios estudios y existen a la fecha varias hipótesis para explicarlo, sin embargo, ninguna de ellas ha sido completamente probada y, en términos generales, aún persiste como un fenómeno por describirse (Uribe, 1989). Al parecer la dificultad consiste en conocer cuál de los pasos es el responsable en el mecanismo de acople EC que explique la dependencia del voltaje, la liberación de calcio y la cinética del incremento de la concentración del calcio intracelular. Por lo que una completa descripción sobre el voltaje de activación y el acople entre la EC requiere no solo de la identificación de las proteínas que participan, sino de la interacción entre las proteínas, las propiedades funcionales de las mismas, y de la contribución de cada proteína, además, de las características de cambios de tensión producidos por la despolarización de la superficie de membrana (Dulhunty, 1992). A continuación se pretende tratar de abordar las diferentes teorías que intentan explicar el proceso del mecanismo de acople EC. ++

Desde hace tiempo se conoce que los iones de Ca

funcionan como mensajeros

intracelulares en el acople entre el estímulo y la respuesta celular, en una gran variedad de tipos celulares incluyendo a las células musculares (Ebashi,1980). En el músculo estriado las evidencias experimentales señalan que: a) la contracción es activada por un incremento en la concentración de Ca

++

++

libre en el mioplasma; y, b) que el Ca

es liberado al mioplasma en

respuesta a la despolarización del sarcolema y de sus invaginaciones (sistema de túbulos transversos) (Luttgau,1977; Luttgau y Moisescu, 1978; Caputo, 1983). El acople EC en las células musculares esqueléticas está asociado a un pequeño incremento en la capacitancia de

la membrana el cual es inducido por la despolarización (Schneider y Chandler, 1973 ; Dulhunty y Gage, 1983). Es posible que este incremento de la capacitancia de la membrana se deba al movimiento lento de los dipolos, o grupos cargados eléctricamente, que estarían localizados en el interio r de las membranas de los túbulos transversos y que serían sensibles al ++

voltaje transmembranal. Así, este movimiento de cargas podría controlar la liberación de Ca

del RS mediante el desplazamiento mecánico de macromoléculas dispuestas entre las membranas del túbulo transverso y la cisterna terminal del mismo (Gilly, 1981; Schneider, 1981; Hui, 1982). Otra hipótesis para explicar el acople entre despolarización del sarcolema y la ++

liberación de Ca

por el RS considera que entre ambos sistemas membranales, el del túbulo-T

y el de la cisterna terminal del RS, se forman conexiones transitorias de baja resistencia eléctrica, con características similares a las de las uniones comunicantes presentes en otros ++

tejidos. Así, la liberación de Ca

se activaría como consecuencia de la propagación de la

despolarización desde los túbulos-T hacia las membranas del RS (Mathias, Levi y Eisenberg, 1981). El mencionado incremento de la capacitancia quedaría explicado por el movimiento de cargas durante la formación de las conexiones eléctricas, así como por el flujo de corriente a través de ellas (Gilly, 1981). ++

El mecanismo de liberación de Ca

++

inducido por Ca

fue primeramente propuesto a

partir de experimentos realizados en fibras de músculo esquelético de anfibios, desprovistas de sarcolema (Endo, Tanaka y Ogawa, 1970). Dado que este proceso dista mucho ser un efecto fisiológico, actualmente esta teoría resulta más convincente para algunos autores porque así ocurre en el miocardio ventricular de mamífero (Fabiato, 1983). ++

Una manera adicional de entrada de Ca

es a través de un transporte transmembranal

de este ión activado por la despolarización. La despolarización produce un incremento en la ++

permeabilidad al Ca , esto produce una corriente de calcio (I Ca) a favor de un gradiente electroquímico (Hagiwara y Byerly, 1981). Al igual que otros tipos de canales iónicos

++

regulados primariamente por el voltaje transmembrana, los canales de Ca

(a través de los

cuales fluye la ICa) aún constituidos por proteínas oligoméricas intrínsecas de la membrana, las cuales son capaces de responder a las alteraciones del campo eléctrico transmembrana con ++

cambios en su forma, que implica la apertura o el cierre del canal por el cual fluye el Ca (Reuter, 1983; Tsien, 1983). ++

Otro mecanismo que podría explicar la entrada de Ca consiste en el intercambio de Ca

++

activado por la despolarización,

+

extracelular por Na intracelular, mediante la operación del

intercambiador Na+/Ca++ el cual es un grupo de macromoléculas de la membrana que funcionan como acarreadores iónicos, donde la entrada de este ión se reflejaría como una +

corriente entrante, intercambiándose 3 o 4 iones de Na

++

por uno de Ca . Así, el

intercambiador generaría una corriente neta saliente (Mullins, 1981). Sin embargo, Tsien (1983) menciona que el mecanismo del intercambiador es difícil de explicar, solo interviene en el intercambio iónico puesto que la ICa depende del voltaje y del tiempo. Tampoco explica ++

como un número tan grande de iones de Ca

pueden ser transferidos por segundo a través de

una vía permeable. Por otro lado, Reuter (1983), menciona que posiblemente el canal y el intercambiador sean rutas diferentes para la entrada de Ca++ separadas tanto espacial como funcionalmente. En el axón gigante de calamar se observan salvas sostenidas durante decenas de segundo y se descarta que el intercambiador Na+/Ca++ sea el principal mecanismo de ++

entrada de Ca

(Mullins y Requena , 1981).

Como fue anteriormente mencionado el proceso que enlaza la excitación eléctrica (despolarización) de la membrana muscular con la contracción recibe el termino de acople excitación-contracción (E-C). Sin embargo, más recientemente, este término es usado para describir el acople entre la despolarización de la membrana de los túbulos-T y la liberación de calcio a partir del retículo sarcoplásmico (RS). Es posible distinguir tres cambios o pasos implicados en el mecanismo de acople E-C. A).- El primer paso es el proceso de sensor de voltaje. Existen evidencias de que este

proceso inicia con el primer registro de movimiento intramembranal de cargas (MIC) (Schneider y Chandler, 1973). B).- El segundo paso es el proceso de la liberación de calcio. Técnicamente el curso temporal del proceso de liberación fue primeramente inferido, por su consecuencia mecánica, el desarrollo de tensión (Ashley et al.1974). Posteriormente, en los 70s fue medido, el transiente de calcio, como un indicador de la concentración de calcio mioplásmico originado por un estímulo adecuado. Más tarde fue posible derivar el flujo de calcio liberado desde el transiente de calcio. En los mismos 70s fue posible medir el flujo de este calcio (corriente de compuerta) y la corriente iónica a través de los canales fue medida con la técnica de fijación de voltaje. Comprobándose años más tarde que el proceso de compuerta y de liberación de calcio, es un proceso biofísicamente similar al flujo de sodio (Ríos y Pizarro, 1988). C).- El tercer paso es la transmisión. Lo que es necesario para unir el sensor de voltaje y el canal de compuerta.

a).- MOVIMIENTO INTRAMEMBRANAL DE CARGAS (MIC). El termino MIC se refiere a la corriente que surge del movimiento de moléculas cargadas que presumiblemente residen en la membrana celular. Este MIC puede envolver naturalmente a las moléculas que se encuentran cargadas (aminoácidos con carga dentro de una proteína) o iones solubles en lípidos adicionados en situaciones experimentales. Estrictamente, el movimiento de cargas es una corriente eléctrica. El término es correcto porque la corriente eléctrica es experimentalmente medible. Sin embargo, el término es usado para

referir procesos físicos que genera la corriente, la cual incluye

cambios

conformacionales en las proteínas específicas de la membrana. El término de carga móvil o carga móvil intramembranal, se refiere a las moléculas cargadas, presumiblemente proteínas que se encuentran envueltas en el proceso de "movimiento de carga" y se refiere más específicamente a la carga total que circula como una consecuencia de un cambio dado de

voltaje (usualmente un pulso de fijación de voltaje), siendo la integral del tiempo de la corriente medida (Ríos y Pizarro, 1991). La medición del MIC es difícil ya que en ella hay inmersas corrientes pequeñas y las corrientes iónicas introducen error en la lectura. Asimismo, la técnica de brecha de vaselina tiene la ventaja que estabiliza los microeléctrodos, pero presenta fallas en lo propio. Existen dos formas básicas de medir el MIC: la carga 1, que consiste en la medición de carga en fibras que se encuentran próximas al potencial de membrana y la carga 2, la cual es medida en fibras despolarizadas. En la corriente de carga 1, se presentan dos componentes con diferente cinética, Iß e Iγ . Para algunos, las corrientes Iß e Iγ surgen de diferentes especies de sensores de voltaje; para otros, la Iγ es consecuencia de la liberación de calcio. La carga 2, se relaciona con la contribución de esta al potencial de reposo, sin embargo, parece ser que su incremento ocurre en la transición al estado inactivado del sensor de voltaje en el acople E-C (Ríos y Pizarro, 1991).

b).- CONTROL DE LA LIBERACION DE CALCIO INTRACELULAR: ACTIVACION. En respuesta a la despolarización de los túbulos-T, el calcio es liberado hacia el mioplasma desde las cisternas terminales del RS (Peachey y Franzini-Armstrong,1983). a).- Transiente de calcio. La medición del transiente de calcio se hizo con Antipyrylazo III, sin embargo, debido a los errores en la lectura, el antipyrylazo es aceptado en la cinética del transiente pero no en la medición absoluta de los cambios con el calcio intracelular (Baylor et al. 1985 ) b).- Cinética de activación: retardo en la transmisión. En 1977, Miledi et al. mostraron que la latencia de la activación con arsenazo

III se encuentra entre 0.6 y 4 ms en fibras musculares de rana, utilizando la técnica de fijación de voltaje (Miledi et al. 1979). Además, Miledi et al (1981), sugirieron que los pulsos ++

subumbrales reducen la latencia e incrementan el transiente de Ca . Este fenómeno establece la correspondencia del activador hipotético con un proceso que aumenta antes de la liberación ++

de Ca (Miledi et al. 1983) y que es llamado acoplador. ++

c).- Flujo de liberación de Ca ++

El Ca

es liberado del RS y la concentración del ión libre se incrementa.

Posteriormente ocurre una rápida remoción desde la solución por un proceso de bombeo que incluye la unión a sitios blanco sobre la troponina C del filamento de actina y eventualmente el resecuestro al RS. ++

El transiente de Ca

++

es el resultado de la liberació n de Ca

y el proceso de remoción

del mismo que se puede representar con la siguiente ecuación:

++

d ( (Ca

)i (f))/ df = flujo de entrada - el flujo removido

De donde : la d = a la derivada ++

(Ca

)i = es igual al calcio intracelular

(f) es el flujo de calcio y df = es la derivada del flujo De tal forma que: la derivada del producto del calcio intracelular por el flujo del mismo entre la derivada del flujo es igual al flujo de entrada menos el flujo removido.

++

1).- Dependencia de voltaje de la liberación de Ca

Existen evidencias que muestran el pico de flujo de liberación de Ca

++

como una

función de los pulsos de voltaje de prueba en una fibra usando la técnica de doble brecha de

vaselina con fijación de voltaje (Brum et al. 1988; Melzer, et al. 1986; Zhu, et al. 1986). ++

2.-Cinética de la liberación de Ca

. ++

Miledi et al. (1983) presentaron que la magnitud del transiente de Ca

dado por un

pulso era dependiente de la aplicación previa de pulsos condicionantes subumbrales. La ++

magnitud del transiente de Ca

causada por los pulsos condicionantes decrece con el voltaje,

sin embargo, este decaimiento no ocurre a través de la inactivación dependiente del voltaje del sensor (Brum et al.1988). Schneider et al. (1987) explican el decaimiento del flujo de liberación como la ++

consecuencia de la depleción de Ca

++

desde el RS por una activación dependiente de Ca , ++

presumiblemente operado por un canal de liberación. La depleción de la liberación de Ca del ++

RS, presumiblemente se da por que el Ca

se encuentra unido a la parvalbúmina y es

explicado por un modelo de 2 pasos ++

Ca + R ⇒ Ca

++

R⇐⇒ Ca

++

R ++

Donde la inhibición puede requerir de la unión directa del Ca

sobre el canal liberador ++

o de la función de un mediador, esto es, la formación de un complejo calmodulina-Ca . Este ++

último, deprime el flujo de Ca

en vesículas aisladas de RS (Meissner 1986).

2.6.- AGONISTAS ADRENERGICOS En años recientes se ha acumulado una enorme cantidad de información sobre las catecolaminas y compuestos relacionados, sin embargo, ésta no hubiese sido posible sin la identificación de los receptores en los cuales estos interactúan.

Clasificación de los receptores adrenérgicos Ahlquist (1948) propuso por vez primera la existencia de más de un receptor

adrenérgico, designándolos α y β

para los receptores del músculo liso donde las

catecolaminas producen respuestas excitadoras e inhibidoras. Más tarde, los receptores β se subdividieron en β 1 (miocardio) yβ 2 (músculo liso y otros sitios), por que la adrenalina y la noradrena lina son esencialmente equipotentes en los primeros sitios, mientras que la adrenalina es de 10-50 veces más potente que la noradrenalina en los últimos sitios (Lands et al. 1967). Recientemente se ha aislado un gen humano que codifica para un tercer tipo de receptor adrenérgico (β 3 , de tejido adiposo) (Emorine et al. 1989). La subdivisión de los receptores α (α1 y α 2 ) se basó en las consideraciones funcionales y anatómicas, al observarse que la noradrenalina y otros agonistas α adrenérgicos podían inhibir la liberación de la noradrenalina en las neuronas (Langer, 1980; Stark, 1987). Este efecto inhibitorio esta mediado por receptores presinápticos a los cuales se les denominó α 2 mientras que a los receptores excitatorios postsinápticos se les denominó α 1 (Langer y Lehmann, 1988).

2.7.- Función de los receptores adrenérgicos β. Todos los receptores β adrenérgicos estimulan la adenilciclasa (enzima membranal), fenómeno mediado por las proteínas G (G inhibitoria Gi, G estimuladora Gs). La estimulación del receptor conduce a la acumulación de AMP cíclico (AMPc), lo cual activa a la proteincinasa AMPc dependiente, que altera numerosas proteínas celulares como resultado de la fosforilación (ver figura 2). La Gs puede aumentar directamente la activación de los ++

canales de Ca voltaje sensible en la membrana plasmática del músculo esquelético (Brown y Birnabaumer, 1988). Gran número de compuestos sintéticos estructuralmente semejantes a las catecolaminas naturales pueden interactuar con los receptores α o β adrenérgicos y producir un efecto simpático mimético. A estos compuestos se les denomina agonistas α y β (Lefkowitz et al. 1991).

Figura 2 .- En este esquema se muestra el mecanismo de acción de la activación de los diferentes receptores adrenérgicos por los neurotransmisores. El neurotransmisor ( H) se une al receptor (ß AR), activando la proteína Gs, que a su vez activa la adenilciclasa , como resultado se produce un incremento de AMPc a partir de ATP. Este AMPc activa a la proteincinasa A generándose la respuesta celular. (Lefkowitz, R. J., Hofman, B.B. y Taylor, P. 1991)

2.8 Agonistas beta adrenérgicos

Los agonistas β adrenérgicos se hallan involucrados en varias circunstancias clínicas. En la actualidad juegan un papel importante en el control del asma y como estimulantes cardiacos. Existen agonistas como el isoproterenol que tiene efecto

importante tanto en

receptores ß1 como en ß2 , y que al ser utilizados en el control del asma provoca efectos adversos al estimular a los receptores ß1 . En concordancia, se han desarrollado drogas con afinidad preferencial por los receptores ß2 en comparación con los receptores ß1 . Sin embargo, esta selectividad no es absoluta y se pierde con concentraciones elevadas de estas drogas. A pesar de ello se les ha denominado agonistas ß2 selectivos. Entre estos fármacos se encuentran: el metaproterenol, el albuterol, la terbutalina, el pirbuterol, y el bitolterol

(Hoffman y

Lefkowitz, 1991).

A).- ANTECEDENTES MEDIATOS.

El músculo esquelético de rana posee dos tipos diferentes de fibras musculares; Las fibras rápidas y las tónicas o lentas. Existen evidencias de que las fibras musculares lentas presentan una contracción lenta y graduada con estimulación del nervio, diferente a la de las fibras rápidas, además, son capaces de mantener su tensión muscular cuando su membrana se mantiene despolarizada de manera continua (Kuffler y Vaughan Williams, 1953; Huerta, Muñiz y Stefani, 1985). Las fibras musculares de la mayoría de los músculos esqueléticos de anfibios son del tipo de sacudida, en contraste las fibras tónicas solo constituyen un pequeño porcentaje en

algunos músculos como el iliofibularis, el piriformis (Elizalde, Huerta y Stefani, 1983; y el cruraris (Muñiz 1981). Características de las fibras tónicas. Estas fibras tienen un axón único que las inerva formando numerosas uniones neuromusculares relativamente pequeñas; son incapaces de +

generar potenciales de acción dependientes de sodio (Na ). Además la conductancia de la membrana en reposo es extremadamente baja, dando lugar a propiedades eléctricas pasivas como alta resistencia efectiva y grandes constantes de tiempo y de espacio (Stefani y Steinbach, 1969). Se conoce que el sistema membranal interno está desarrollado, pero en menor grado que en las fibras rápidas (Franzini- Armstrong, 1973). La activación y regulación de la contracción, bajo condiciones fisiológicas, depende de la suma espacial y temporal de los potenciales sinápticos lentos generados en las múltiples placas motoras a lo largo de la célula. El desarrollo de tensión isométrica en respuesta a despolarizaciones intensas se instala cerca de 10 veces más lentamente que en las fibras rápidas y la relajación en respuesta a la repolarización es igualmente lenta (Nuñez,1987). El desarrollo de tensión inducido por despolarizaciones producidas con alto potasio, o con fijación de voltaje se mantiene mientras perdura la despolarización. Para despolarizaciones sostenidas, a valores del Potencial de membrana en reposo (Em) más positivos que - 40mV, la meseta está precedida de un pico inicial de tensión (Nuñez, 1987).

++

En las fibras tónicas, el pico inicial al igual que en las fibras rápidas depende de Ca

liberado de fuentes intracelulares (Gilly y Hui, 1980). Para pulsos despolarizantes relativamente cortos (< 100 ms) el incremento transitorio en la concentración de Ca

++

libre

intracelular no se modifica apreciablemente al incrementar la despolarización de 0 a +100 ++

mV, lo cual reduciría apreciablemente la entrada pasiva de Ca , además, estos cambios ++

transitorios en la concentración de Ca ++

no se modifican cuando el Ca

++

extracelular es

sustituido por Mg (Miledi et al. 1981), pero el Ca++ extracelular es importante para el

mantenimiento del desarrollo de tensión durante despolarizaciones prolongadas; primero la amplitud de la meseta de las contracturas inducidas por potasio ( K+) 100 mM aumenta en más ++

del 100 % cuando la concentración extracelular de Ca

es elevada de 0.25 mM a 4.0 mM.

Cuando la concentración de K+ es de 50 mM, la amplitud de la meseta aumenta en un 25 % si ++

la concentración de Ca se eleva de 2 mM a 20 mM (Luttgau,1963; Godt et al. 1984). El ++

incremento en la concentración externa de Ca

durante la mesta de la contractura, aumenta

apreciablemente la amplitud de la misma (Huerta, 1984). La capacidad de mantener la tensión ++

durante una despolarización con K+ se pierde al reducir la concentración extracelular de Ca a nivel µM y se recupera cuando la concentración de Ca es nuevamente elevada a mM. A ++

++

++

diferencia de las fibras rápidas, el Ni no es capaz de reemplazar al Ca en esta función ++

(Huerta, 1984). La elevación transitoria del Ca

intracelular (utilizando arsenazo III), se ++

mantiene durante la despolarización prolongada en presencia de Ca ++

(12 mM) en el medio

++

extracelular; pero no ocurre así si el Ca es reemplazado por Mg cuando la concentración de ++

Ca es de 1.8 mM , se observa un comportamiento intermedio ( Miledi et al. 1981). Las propiedades eléctricas y mecánicas de las fibras tónicas están bajo control neural (Huerta ,1974). Cuando las fibras tónicas son desnervadas adquieren la capacidad de generar potenciales de acción dependientes de Na+ extracelular (Miledi et al. 1991; Bondi, et al. 1984), sin embargo, la propiedad de producir contracturas sostenidas se conserva en las fibras desnervadas (Lehmann y Achmidt, 1979), pero se pierde si son reinervadas por axones de alta velocidad de conducción (Miledi y Orkand, 1966) y se readquiere cuando los axones lentos reestablecen contactos sinápticos normales (Elul et al. 1970). Por lo cual se puede argumentar que los axones presentan una acción trófica sobre el mecanismo de acople entre la EC de las fibras tónicas (Miledi et al. 1981). Por otro lado, evidencias experimentales sugieren que la activación contráctil en fibras lentas es mediada por un incremento en la concentración de calcio libre miosplásmico, liberado desde almacenes internos de manera similar que en las fibras rápidas (Franzini –

Armstrong, 1973; Miledi, Parker y Shalow 1977; Gilly y Hui, 1980). La relajación de la contracción es promovida por un secuestro de calcio en el RS o por la salida de calcio a través del sarcolema. En diversas células, el intercambiador Na+/Ca++ ayuda a regular la concentración intracelular de calcio (Blaustein, 1974; Donoso y Hidalgo, 1989). Existen evidencias de que las fibras musculares tónicas de rana poseen un sistema de intercambiador ++

Na+/Ca++ el cual podría jugar un papel importante en la regulación del Ca intracelular. Por otro lado, hay evidencias de que las fibras lentas no producen un potencial de acción (Gilli y Hui, 1980). Sin embargo, en estudios recientes con la técnica de fijación de voltaje se demostró la presencia de una corriente entrante lenta y sostenida de Ca++ en las fibras musculares lentas (Huerta y Estefani, 1986), la cual podría participar en el proceso inicial que ++

es mediado por la translocación de Ca

intracelular (Huerta, Muñiz, y Stefani, 1986).

Actualmente existen evidencias de que las fibras tónicas de anfibio presentan una doble fuente ++

de Ca

activador, una fuente externa, y el retículo sarcoplásmico (Huerta y Stefani, 1981;

Huerta, Muñiz, y Stefani, 1985). Cuando las fibras lentas son bañadas con altas concentraciones de K+ se producen contracciones sostenidas, las cuales presentan dos fases: ++

una fase temprana, y una fase de mantenimiento; donde el Ca externo parece que no es esencial durante la fase temprana del desarrollo de tensión (Miledi, Parker y Schalow, 1977; ++

1981 ). En contraste, el Ca extracelular es importante durante el ma ntenimiento de la fase de contractura en fibras lentas de pollo (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981; Kikucki y Schmidt, 1983) y en Rana pipiens (Huerta, Muñiz y Stefani, 1985). Por otro lado, algunos cationes ++

++

++

como el Ni , Co no pueden reemplazar al Ca en el mantenimiento de la tensión de fibras lentas de pollo (Kikuchi y Schmidt, 1983) y en Rana pipiens (Huerta, Muñiz, y Stefani, 1985). ++

++

++

Sin embargo, Schmidt (1987) fundamenta que algunos cationes divalentes ( Sr , Ni . Co , ++

++

++

Cd y Mg ), producen un efecto cualitativamente similar al producido por el Ca . En contraste un efecto marcado fue descrito por Pauschinger y Brecht (1961), cuando los haces de ++

fibras fueron incubados por tiempo prolongado en bajo Ca . Miledi et al. (1977; 1981) ++

mencionan que en algunas especies las señales intracelulares de Ca durante el mantenimiento

++

de la despolarización, llega a convertirse en un transiente con bajas concentraciones de Ca . En fibras lentas de Rana pipiens, la fase sostenida de la contractura con K+ es reducida ++

después de remover el Ca externo o por aplicación de nifedipina (Huerta et al. 1985). La ++

Nifedipina produce una disminución de la corriente de Ca (Almers, Fink y Palade, 1981) y en fibras lentas de Rana pipiens produce un efecto similar (Huerta y Stefani, 1986). Por lo que cabe la posibilidad de que el mantenimiento de la tensión sea dado por una entrada de ++

Ca , o por su unión a sitios superficiales de la célula (Huerta y Stefani 1986). Posiblemente este último mecanismo sea esencial en fibras lentas de Rana temporaria, porque el ++

mantenimiento de la tensión, no solo es dado por el Ca

externo, sino, por la adición de

algunos cationes divalentes (Schmidt, 1987). Existen evidencias de que los iones más ++

++

efectivos para el mantenimiento de la tensión son Co y Ni (Schmidt, 1987), sin embargo, en ++

fibras musculares rápidas producen bloqueo de canales de Ca

(Almers y Palade, 1981;

++

Palade y Almers, 1985). De manera contrastante, el Mg presenta un efecto menor de bloqueo ++

de los canales de Ca , similarmente, la tensión desarrollada por éste es menor que la ++

++

producida por el Co y el Ni (Schmidt, 1987). De estos resultados se puede inferir que el ++

mantenimiento de la contractura es mejor entre menor sea la entrada de Ca (Schmidt, 1987). Neuhaus (1987) fundamenta con fijación de voltaje que en fibras lentas o rápidas de rana, el ++

bloqueo de la entrada de Ca ++

Esto es, la unión de Ca

con Nifedipina prolonga la fase de meseta de la contractura.

u otros iones divalentes sobre sitios específicos en la superficie

celular, puede ser un factor importante en el mantenimiento de la tensión (Schmidt, 1987). ++

Existen evidencias de que la unión de Ca con sitios de superficie, origina un movimiento de carga y que este movimiento es necesario para liberación de Ca intracelulares (Brune et al. 1987).

++

desde almacenes

B).- ANTECEDENTES INMEDIATOS. a).- LA TERBUTALINA La estimulación de receptores β2 causa relajación tanto en el músculo liso uterino como en el músculo bronquial. Desde hace tiempo, los agonistas β2 se han utilizado como agentes tocolíticos para prevenir el parto prematuro, o para reducir la resistencia de la vías aéreas durante el tratamiento de las enfermedades obstructivas de las vías aéreas como el asma y para el broncoespasmo (Creticos, 1993). La terbutalina es un agonista β2 selectivo que en clínica es conocida como un broncodilatador ß2 selectivo. Esta se ha utilizado para el tratamiento prolongado de las enfermedades obstructivas de las vías aéreas y para tratar el broncoespasmo agudo y su inicio de acción va de 5 a 10 minutos con un tiempo de acción de 3 a 4 horas (Creticos, 1993; Brown, 1993). Por otro lado, se ha utilizado en la prevención del parto prematuro, pero su infusión continua produce complicaciones tales como dolor torácico, taquicardia, disnea y edema pulmonar, por lo que su uso en obstetricia prácticamente ha desaparecido (Vera, 1998). El uso continuo de terbutalina en el paciente con enfermedad obstructiva pulmonar o en el asma genera otro tipo de efectos adversos tales como el tremor. Esta acción puede ser explicada por estimulación de los receptores ß2 del músculo esquelético, el cual parece estar provocando un aumento en la amplitud de los movimientos en el rango de frecuencia de los temblores fisiológicos (Lulich et al. 1986). Además, existen evidencias de que las aminas simpático miméticas modulan la contracción y relajación en fibras de músculo esquelético de mamífero (Tomita, 1975; Bowman 1980; Williams y Barnes, 1989). La naturaleza de la respuesta depende del tipo de fibras del músculo: en fibras musculares de sacudida rápida, la fuerza medida al pico de la sacudida se incrementa 10 a 20 % y la relajación se enlentece (Bowman y Zaimis, 1958; Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita 1975; Holmberg y Waldeck 1980). En este mismo tipo de fibras, la amplitud del tétanos se incrementa en un 60 % y el tiempo de fusión es disminuido (Bowman y Zaimis, 1958; Bowman y Nott, 1970; Holberg y Waldeck, 1980). En

contraste, la fuerza al pico de la sacudida es deprimida en un 10 a 25 % en fibras musculares de sacudida lenta y la relajación de la sacudida es acelerada (Bowman y Zaimis 1958; Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita 1975). La amplitud del tétanos es disminuida en un 60 % y la fusión se reduce (Bowman y Zaimis 1958; Bowman y Nott, 1970; Holberg y Waldeck, 1980). Sin embargo, bajo algunas condiciones la fuerza se incrementa en músculos de sacudida lenta (Tashiro 1973; Tomita 1975; Holberg y Waldeck, 1980) o en fibras tónicas (Huerta et al. 1991). Asimismo, Cairns y Dulhunty (1993) mostraron que la terbutalina produce un incremento en la fuerza de la sacudida y al pico del tétanos en músculo de sacudida lenta de rata; y, disminuye la sacudida y la relajación del tétanos. Confirmando que los receptores adrenérgicos en músculo esquelético de mamífero son predominantemente del tipo ß2.

III.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La terbutalina es una amina simpático mimética que en clínica es conocida como un broncodilatador ß2 selectivo. Esta se ha utilizado para el tratamiento prolongado de las enfermedades obstructivas de las vías aéreas y para tratar el bronco espasmo agudo. Su uso continuo en este tipo de tratamiento produce en los pacientes tremor. Este efecto ha sido correlacionado con la estimulación de los receptores ß2 del músculo esquelético, el cual, parece estar provocando un aumento en la amplitud de los movimientos en el rango de frecuencia de los temblores fisiológicos. El músculo esquelético de Rana se ha utilizado en modelos experimentales in vitro para estudiar el efecto de algunos

fármacos y la acción de estos es correlacionada con

cualquier tipo de músculo esquelético independientemente de la especie que se trate. Las fibras musculares de la mayoría de los músculos esqueléticos de Rana son del tipo de sacudida o fibras rápidas, sin embargo, las fibras tónicas solo constituyen un pequeño porcentaje en algunos músculos tales como el iliofibularis, el piriformis y el cruralis. En

estudios in vitro, en fibras musculares rápidas explorando en la sacudida única y en el tétanos, se observó que la terbutalina incrementa el pico de tensión y disminuye el tiempo de la relajación. Basados en lo anterior nos surgió la siguiente pregunta:

¿ La presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana pipiens in vitro produce un aumento o una reducción en la fuerza contráctil?.

IV.- JUSTIFICACION.

Existen evidencias de que los receptores adrenérgicos en músculo esquelético de mamífero son predominantemente del tipo ß2 (Cairns y Dulhunty, 1993). Si bién es cierto, existen estudios

sobre la actividad de las aminas simpático miméticas (entre ellas la

terbutalina) en músculo esquelético de mamífero como los realizados por Cairns y Dulhunty (1993) donde en fibras musculares rápidas con sacudida única y en tétanos, ésta incrementa el pico de tensión y disminuye el tiempo de la relajación en las preparaciones estudiadas. Sin embargo, otras aminas simpaticomiméticas como la adrenalina ofrece acciones contradictorias en el músculo esquelético de mamífero y rana (Huerta et al. 1991) Por otro lado, aunque se conoce

++

que el Ca

extracelular es importante en el

mantenimiento de la contractura en fibras lentas (ver antecedentes), en fibras lentas de Rana temporaria, la situación es me nos clara. Lüttgau (1963), Gilly y Hui (1980) y Schmidt (1987) ++

fundamentan que no existe una influencia del Ca

extracelular en el mantenimiento de la

tensión. Así, Schaechtelin (1961) y Nasledov et al. (1966) solo atribuyen al Ca++ un efecto

pequeño. De cualquier modo, el papel del calcio externo durante el mantenimiento de la contractura permanece poco claro (Nasledov et al. 1966; Miledi et al. 1977; Gilli y Hui 1980). Huerta, Muñiz y Stefani (1986), exploraron el efecto del Ca++ externo sobre las contracturas por K+ y atribuyen la meseta de la contractura al Ca++ externo y el pico de la misma al Ca++ del RS. Así, estas dos acciones del Ca++ son moduladas por la adrenalina (Huerta et al. 1991). Esta modula también la corriente entrante de Ca++ (Huerta et al. 1997). Así, aunque existen estudios del efecto de las aminas simpático miméticas en fibras musculares de sacudida- lenta (Bowman y Zaimis 1958; Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita, 1975), no se han realizado estudios con terbutalina en fibras lentas de rana.

V.- HIPÓTESIS.

La terbutalina es un agonista ß2 el cual participa modulando el acople entre la excitación y la actividad contráctil del músculo esquelético cuando se une a receptores ß2. In vitro, la presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana pipiens produce una disminución de la fuerza contráctil.

5.1.- HIPÓTESIS NULA.

In vitro, la presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana pipiens no produce una disminución de la fuerza contráctil.

5.2.- HIPÓTESIS ALTERNATIVA.

In vitro, la presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana pipiens produce un aumento de la fuerza contráctil.

VI.- OBJETIVO GENERAL.

Conocer el efecto de la terbutalina sobre el acople excitación contracción en los haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana pipiens.

6.1.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

1). - Elaborar una curva concentración-respuesta a la terbutalina en fibras lentas del músculo cruralis de Rana pipiens. 2).- Estudiar el efecto de la terbutalina sobre el acople excitación contracción en haces de fibras musculares lentas en músculos cruralis de Rana pipiens .

VII.- METODOLOGIA

7.1.- Diseño experimental. 7.2.- Universo de estudio

Se usaron ranas de la especie Rana pipiens de sexo indistinto, con un peso corporal entre 20 y 40 g, las cuales fueron obtenidas del Bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Colima. Las ranas fueron alimentadas a base de insectos y complementada con hígado de pollo enriquecido con aceite de hígado de bacalao, expuestas a ciclos normales de luz y oscuridad.

7.3.- Definición de las unidades de observación.

Haces pequeños (< 500 µm de diámetro) de fibras musculares tónicas de músculo cruralis de Rana pipiens fueron sometidos a soluciones con alto K+ (40 mM) en presencia de terbutalina. Con estas soluciones el fascículo desarrolla una contractura (contractura por K+ ) la cual presenta una fase inicial o pico seguida por una fase mantenida o meseta. La acción de la terbutalina fue evaluada sobre estas fases de la contractura.

7.4.- Definición de la unidades de control.

Las unidades de control fueron los haces de fibras musculares tónicas de músculo cruralis de Rana pipiens sometidos a contracturas con alto K+ (40 mM) en ausencia de terbutalina y que referiremos más adelante como contracturas control.

7.5.- Criterios de Inclusión.

= Ranas de la especie Rana pipiens sanas. = De uno y otro sexo. = Con peso corporal entre 20 y 40 g. = Que la contractura por K+ en el haz de fibras tónicas sea adecuado (presencia de pico y meseta).

7.6.- Criterios de no inclusión.

= Ranas con patología aparente. = Peso mayor a 40 g o menor a 20 g. = Que la respuesta al K+ no sea adecuada.

7.7.- Criterios de eliminación.

= Ranas que no correspondan a la especie pipiens.

7.8.- Proceso experimental. En este estudio el proceso experimental fue realizado en pequeños haces de fibras tónicas de Rana pipiens disecados del músculo cruralis (Gilly, 1975 ), con un diámetro menor a 500 µm. Una vez obtenidos, éstos fueron montados y perfundidos en un cámara experimental de lucita, a temperatura ambiente (22 - 23

o

C). Para el registro de tensión

isométrica el extremo dis tal del haz se fijó al fondo de la cámara experimental, sujeto con alfileres entomológicos de acero inoxidable, y el otro extremo se sujetó al gancho de un transductor mecanoeléctrico (Cambridge Technology 400 A) (fig.3). El transductor era sostenido por un soporte que podía deslizarse, por medio de una cremallera fina, en el sentido horizontal para ajustar la tensión basal del haz de fibras.

Figura 3.- En esta figura se muestra en una vista lateral del esquema del dispositivo experimental donde se montaron los fascículos de fibras musculares lentas del músculo cruralis de la Rana pipiens. En A, el fascículo de fibras lentas; en B, la cámara experimental de lucita; en C, llave de 3 vías por la cual se perfunde el haz de fibras lentas; en D, transductor mecanoeléctrico; en E, el tubo de succión con el cual se retiraban las soluciones perfundidas, y en F, la cremallera (micromanipulador) para ajustar la tensión basal del músculo. Las señales producidas por el fascículo fueron amplificadas con un amplificador Cyberamp 320 (Axon Instruments) e inscritas gráficamente con un registrador rectilíneo (Gould 220). Las fibras fueron estiradas 1.3 veces de su longitud en reposo. Dadas las características de la cámara experimental, la cual presenta una capacidad de 0.5 ml, el líquido a través de ella podría ser recambiado en un tiempo no mayor de 3 segundos. Para el paso de las soluciones, se uso una jeringa sin embola con capacidad para 10 ml. Los haces de fibras

fueron equilibrados por 3-5 minutos con un flujo constante (30 ml/min.) de la solución normal, antes de aplicar la solución de contractura (alto potasio 40 mM). Una vez realizada la primer contractura con alto potasio se mantuvo esta, por un espacio de tiempo de 7 minutos, siendo lavado a perfusión continua con la solución normal. Antes de realizar la contractura de prueba (en presencia de terbutalina) se realizaron por lo menos dos contracturas como testigo (contracturas control). Entre cada contractura, se lavó la preparación con la solució n normal (ver soluciones) hasta alcanzar la línea basal, (de 15 a 25 min.). En presencia de la solución normal, la preparación fue incubada por 5 minutos con solución normal a la cual se le había agregado la concentración correspondiente de terbutalina. Posteriormente a este tiempo de incubación se procedió a realizar la contractura de prueba con una perfusión continua (1.5 ml por minuto) de la solución de alto contenido de potasio más terbutalina (solución de prueba) ver soluciones. Las observaciones experimentales se hicieron para cada concentración correspondiente de terbutalina en 5 haces de fibras (n = 5).

7.8.1.- Curva concentración respuesta.

Para la obtención de la curva concentración respuesta, se inició con concentraciones bajas de terbutalina (0.l nM), mismas que fueron incrementadas en las diferentes series experimentales hasta obtener la concentración efectiva máxima (CEmax). De estas curvas, se obtuvo la Concentración efectiva 50 (CE50 ).

7.8.2.-Contracturas en cero calcio Otros haces de fibras musculares tónicas (n =5) fueron utilizados para la obtención de contracturas en cero calcio, estos haces al igual que los anteriores fueron perfundidos con Ringer rana normal, antes de obtener la contractura testigo con alto potasio (40 mM), después de la contractura control o testigo, los haces fueron perfundidos con una solución con cero

calcio más 40 mM de KCl (ver soluciones) para obtener contracturas sin la fase sostenida, solo con la fase inicial, (Huerta, Muñiz y Stefani; 1986). Se utilizó la solución de prueba en cero calcio, ver soluciones, esta primera contractura que solo posee la fase inicial, la llamaremos como testigo de cero calcio, posteriormente las preparaciones fueron incubadas en una concentración de 10 µM de terbutalina (Posterino y Fryer 1999), obteniéndose el registro de prueba en cero calcio, después del lavado se tomó un segundo registro de testigo en cero calcio, regresando posteriormente a solución Ringer rana imidazol, para originar una nueva contractura con alto potasio (40 mM) obteniéndose así un control final.

7.8.3.- Soluciones. La solución normal (Ringer rana imidazol) estaba compuesta por: (mM) Na Cl, 117.5, KCl, 2.5, CaCl2, 1.8. El pH fue ajustado con cloruro de imidazol (2 mM) a 7.4. La solución con +

alto K (40mM) fue preparada por reemplazo isotónico del NaCl por KCl. La solución de prueba (40 mM de KCl) con diferentes concentraciones de terbutalina fue preparada en la solución con alto contenido de potasio, a la cual se le adicionó para cada experimento concentraciones de terbutalina que variaron entre 0.1 nM, 1 nM, 0.5 µM, 1µM , 10 µM, hasta 100 µM respectivamente. Estas concentraciones fueron agregadas en forma separada a la solución normal para incubar cada una de las preparaciones antes de adicionar la solución de prueba (40 mM de KCl más terbutalina). La solución con cero calcio se preparó con los mismos componentes de la solución Ringer rana imidazol, pero sin calcio, y adicionándole EGTA Na+ (1mM), la solución con alto potasio y cero calcio fue preparada por reemplazo isotónico de NaCl por KCl (40 mM KCl + EGTA Na+ y 0 CaCl2 ). La solución de prueba para cero calcio (40 mM KCl + EGTA Na+ y 0 CaCl2 ) se le adicionó terbutalina para tener en solución una concentración de 10 µM.

7.8.4 .- Reactivos. Como fármaco de prueba se usó Terbutalina en sal obtenida de laboratorios SIGMA,

St. Louis MO; y para obtener las soluciones normal y de contractura se usaron las siguientes Sales: KCl, NaCl, CaCl2 , Imidazol y EGTA Na+ obtenidas de laboratorios SIGMA, St. Louis MO.

7.8.5.- Análisis estadístico:

Para el análisis estadístico de los datos se emplearon medidas de tendencia central(medias) y de dispersión (desviación estándar y error estándar). Para determinar la posible diferencia entre los promedios se utilizó la prueba “t” Student. El índice de confianza utilizado fue de un 95 % y un error alfa del 5 %, considerando diferencia significativa si p < 0.05.

VIII.- RESULTADOS 8.1.- Efecto de la terbutalina sobre la contractura por K+. En experimentos preliminares realizados en haces de fibras lentas del músculo cruralis de Rana pipiens, se determinó el efecto de la terbutalina sobre contracturas con alto potasio (40 mM). Véase en la figura 4 el efecto de la terbutalina con una concentración de 0.1 µM.

Figura 4 . En esta figura se muestra el efecto de la terbutalina a una concentración de 0.1 µM. De arriba hacia abajo A y C representan los testigo, B representa la contractura en presencia de terbutalina. a una concentración de 0.1 µM.

En los experimentos preliminares se puede apreciar como el efecto de la terbutalina sobre la contractura con alto potasio fue dependiente de la concentración de ésta, en las figuras 5

y 6,

se presenta el efecto para una concentraciones de terbutalina de 10 y 100 µM

respectivamente.

Figura 5 . En esta figura se muestra el efecto de la terbutalina a una concentración de 10 µM. De arriba hacia abajo A y C representan los testigo, B representa la contractura en presencia de terbutalina. a una concentración de 10 µM.

Figura 6 . En esta figura se muestra el efecto de la terbutalina a una concentración de 100 µM. De arriba hacia abajo A y C representan los testigo, B representa la contractura en presencia de terbutalina. a una concentración de 100 µM.

8.2.- Curva Concentración-Respuesta a la terbutalina en haces de fibras lentas de Rana pipiens. Para la obtención de la curva dosis respuesta se midió el efecto de la terbutalina sobre el pico máximo de tensión de las contracturas producidas con alto potasio, en haces de fibras de músculo cruralis. Se exploró un rango de concentraciones que fue desde 0.1nm, 1nm, 0.5 µM, 10 µM hasta 100 µM de terbutalina. El análisis estadístico fue significativo con una p < 0.05, para todas las concentraciones de terbutalina exploradas, comparadas con la contractura testigo. La CE50 se encontró a una concentración de 3 µM de terbutalina (ver figura 7).

Figura 7.- En la cual se muestra la curva concentración-respuesta a la terbutalina. Los puntos corresponden al promedio del efecto obtenido con la terbutalina ± el error estándar del promedio (X ± E. E.). En las abscisas se presentan los logaritmos de diferentes concentraciones de terbutalina y en las ordenadas el % de la disminución de la tensión pico con respecto al testigo.

8.3.- Modulación del curso temporal al pico máximo de tensión por la terbutalina. Se analizó en cada registro el tiempo que tarda en instalarse el pico máximo de tensión en ausencia y en presencia de terbutalina, el tiempo fue medido en segundos desde la línea basal del inicio de la contractura hasta alcanzar la máxima tensión al pico. En presencia de dos concentraciones diferentes de terbutalina, 1µM y 10 µM como se observa en la figura 8. En presencia de ambas concentraciones de terbutalina existe un retraso al pico máximo de tensión, que varia de 12 segundos para concentraciones bajas de terbutalina (1µM) , hasta 24 segundos para concentraciones de 10 µM de terbutalina.

8.4.- Recuperación del pico máximo de tensión después de la contractura de prueba. En todos los experimentos se realizó un registro testigo posterior a la contractura de prueba a la cual se le llamará recuperación. La recuperación del pico máximo de tensión registrado, fue total para concentraciones bajas de terbutalina y baja para concentraciones altas de este fármaco (figura 9), el promedio de recuperación fue desde 97.3, 97.7, 80.5 y 59 % para las siguientes concentraciones de terbutalina , 0.1 nm, 0.5, 1, 10 y 100 µM, respectivamente.

8.5.- Efecto de la terbutalina en contracturas realizadas en cero calcio (0 Ca ++ ). Para la medición de la actividad de la terbutalina en cero calcio se comparó el pico máximo de tensión en contracturas realizadas en cero calcio, en ausencia de terbutalina, contra el efecto presentado con la presencia de 10 µM de terbutalina (n= 5), obteniéndose una disminución de la fuerza de contracción del pico máximo en un 18.88 % como promedio ± 3.9688249 D. E. con respecto al testigo (ver fig. 10).

Figura 8.- En esta figura se presentan dos registros representativos con dos concentraciones de terbutalina A y C, son concentraciones testigo para A y B. En b se puede apreciar el retraso en el inicio del pico de tensión máxima registrada en presencia de terbutalina para concentraciones de 1 µM (en A) de 10 µM (en B).

RECUPERACIÓN POSTLAVADO

Figura 9.- En esta figura se presentan dos series de registros. En A con una concentración baja de terbutalina (0.1 µM) y en B, con una concentración alta de terbutalina (10 µM). Se puede observar en c, la recuperación del pico máximo de tensión con respecto a las contracturas testigo (a) después de 1h de lavado con solución normal. En algunas preparaciones se lavó hasta 1.5 horas y la recuperación fue muy similar.

Figura 10.- En esta figura se presenta un registro representativo con una concentración de terbutalina de 10 µM en B, en cero calcio, obsérvese la disminución del pico máximo de tensión con respecto al testigo (A). En A se presenta el registro de una contractura en alto potasio (40 mM) y cero calcio mas EGTA (1mM), y postlavado.

en C el registro testigo

IX.- DISCUSION

La terbutalina es conocida como un agonista ß2 selectivo, lo cual es cierto a concentraciones terapéuticas (10 µM), pero a concentraciones mayores (20 µM) presenta un efecto ß1 y como efecto alfa. Este fármaco se ha utilizado para el manejo terapéutico del asmático o en la amenaza de aborto. Sin embargo, aún a la dosis terapéutica citada, administrada en forma sistémica produce efectos adversos tales como, nerviosismo, ansiedad, inquietud y de mayor importancia que conduce a los pacientes a limitar su uso es el temblor producido por la activación de receptores ß2 del músculo esquelético (Hoffman y Lefkowitz, 1996). La disminución del pico máximo de tensión es dependiente de la concentración de terbutalina como se puede apreciar en la figuras 4 y 5, de nuestros resultados. La disminución del pico máximo de tensión producido por la terbutalina, fue estadísticamente significativo (p