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TAXONOMÍA MOLECULAR TAXONOM ÍA MOLECULAR
Dra. Marisa Biasoli Micología Centro de Referencia de Micolog ía
Métodos basados en en la la comparaci comparación del ADN ADN M étodos basados ón del Composición en bases (% G+C) del ADN Hibridación de ácidos nucleicos Restricción del ADN mitocondrial Polimorfismos de ADN generados aleatoriamente por PCR (RAPD-PCR) Electroforesis de campo pulsante Ribotipado Secuenciación de genes nucleares y mitocondriales Extracción del ADN ADN FFúngico Extracci ón del úngico
Extracción del ADN ADN FFúngico Extracci ón del úngico Protocolos de extracción de ADN Conservación de Ácidos Nucleicos Electroforesis del ADN Cuantificación del ADN
Extracción del ADN ADN FFúngico total Extracci ón del úngico total El protocolo protocolo de de aislamiento aislamiento de de un un á ácido nucleico El cido nucleico depende del del tipo tipo de de organismo organismo y y del del á ácido nucleico depende cido nucleico que interese: interese: nuclear nuclear (cromos (cromosómico), de org orgánulos que ómico), de ánulos (mitocondria, cloroplasto) cloroplasto) o o plasm plasmídico (mitocondria, ídico
Pasos más importantes: Lisis de la pared celular y la membrana plasmática Digestión y/o precipitación de proteínas (purificación) Extracción y Precipitación del ADN con solventes orgánicos (concentración)
Lisis de de la la pared pared celular celular yy la la membrana membrana Lisis plasmática plasm ática Ruptura enzim ática: lisozyma, zymoliasa enzimática: (liticasa), novozym, proteinasa K. Ruptura qu ímica: detergentes (SDS), química: agentes reductores ((β β Mercapto etanol, Ditiotreitol ), EDTA, Ditiotreitol), Ruptura mec ánica: Molinillo, mortero, mecánica: perlas de vidrio, sonicaci ón. sonicación.
Digestión y/o Precipitaci Precipitación de prote proteínas Digesti ón y/o ón de ínas (purificación) (purificaci ón) Proteinasa K (serin proteasa) CTAB: detergente catiónico (compleja polisac.) NaCl, NaAc, KAc Extracción con fenol–cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) -fenol (desnat. proteínas) -cloroformo (desnat prot., mejora interfase) -isoamílico (evita formación de espuma) RNAsa
Extracción precipitación del ADN ADN con con Extracci ón yy precipitaci ón del solventes org orgánicos solventes ánicos Isopropanol, 1 volumen, a temperatura ambiente Etanol absoluto 2 volúmenes en frío (2º C, 30´) Lavado del ADN con etanol al 70% para eliminar la fuerza iónica Resuspender en buffer TE (Tris-EDTA) o H2O (ultrapura, sin DNAsa, estéril)
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN FÚNGICO PARA HONGOS LEVADURIFORMES Extracción por lisis química (Técnica de Mitchell y col. 1994, modificada por Binolfi y col, 2004) Inocular una ansada de las levaduras (crecidas en Agar Sabouraud Glucosa, ASG, durante 24-48 hs) en 8 ml de medio líquido Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD).Incubar en agitación a 120 rpm. por 24 horas a 28oC. Centrifugar las levaduras a 13000 r.p.m. durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante. Resuspenden las células en 1 ml de solución de sorbitol/EDTA (SE) fría y trasvasar a tubos eppendorf. Centrifugar a 13000 rpm. 10 minutos. Lavar con 1 ml de SE y volver a centrifugar a 13000 rpm. 10´. Descartar el sobrenadante. Agregar al sedimento 400 µl de solución de lisis (β Mercapto etanol+SDS) y 10µl de proteinasa K 20 mg/ml (cc 600 µg/ml). Agitar en vórtex a baja velocidad. Incubar 2 horas a 65oC, mezclando por inversión cada 30 minutos.
Agregar a las levaduras lisadas 400 µl de mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Mezcla en vórtex a baja velocidad 5 veces (períodos de 30´´ de agitación y 30´´ de reposo en hielo). Centrifugar 13000 rpm. durante 15´. Repetir el proceso de extracción hasta obtener la fase acuosa superior clara. Toma la mayor cantidad posible de la fase acuosa y añadir 350 µl de la mezcla cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Mezclar y centrifugar a 13000 rpm. por 15´. Toma nuevamente la fase acuosa y agregarle 18 µl de NaCl 5M y 600 µl de etanol absoluto frío. Mezclar por inversión e incubar a –80oC durante 30 minutos. Centrifugar a 13000 rpm. 15´ a 4oC; eliminar el sobrenadante y secar el residuo a 37oC por aproximadamente 15´. Resuspender el ADN en 60 µl de agua desionizada ultrapura estéril calentando a 65oC por 10 minutos. Guardar a –20oC.
Conservación del ADN ADN Conservaci ón del Cortos períodos Resuspender en buffer TE (Tris-EDTA, quelante cationes divalentes, protege frente DNAsas) o H2O (ultrapura, sin DNAsa, estéril) a 4ºC
Largos períodos -Resuspender en TE o H2O a -20 ºC. Evitar congelar y descongelar -Precipitado en etanol y congelado a -20 ºC - Desecado con bomba de vacío
Electroforesis Electroforesis del del ADN ADN La electroforesis es una técnica en la que se separan moléculas en función de su diferente movilidad en presencia de un campo eléctrico Es el método mas utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ácidos nucleicos. Los geles son los soportes más utilizados para las electroforesis de ácidos nucleicos; forman una matriz de poros que producen un tamizado de las moléculas que estamos separando.
Electroforesis Electroforesis del del ADN ADN Los geles presentan una serie de características que los hacen más ventajosos frente a otros soportes: 1.- Permiten muestra.
cargar
gran
cantidad
de
2.- Permiten una gran resolución. 3.- Mejor detección de la muestra. 4.- Facilitan la recuperación de la muestra. Hay varios tipos de geles, entre los más comunes y utilizados están los de poliacrilamida y los de agarosa.
Geles Geles agarosa agarosa Existen diferentes tipos de agarosas: 1.- Agarosa de baja electroendosmosis (Low EEO): -Es la más común y la más utilizada -Su cc puede variar del 0.8% al 3% -Permite separar fragmentos de 10 Kb a 100 pb. 2.-Agarosa de bajo punto de fusión: -Su punto de fusión es más bajo de lo habitual (90ºC) -Polimeriza a una temperatura más baja de la normal (45ºC). -Se utiliza en electroforesis preparativas, en las que vamos a cortar las bandas que nos interesen y vamos a extraer el DNA.
Geles Geles agarosa agarosa 3.- Agarosas de alto poder de resolución: -Pueden resolver fragmentos de 10 a 500 pb. -Su poder de resolución es menor que el de la poliacrilamida. 4.- Agarosas de grado cromosomal: -Muy purificada y de gran poder gelificante. -Se utiliza para la separación de fragmentos muy grandes de DNA en las electroforesis en campo pulsante (PFGE).
Geles Geles agarosa agarosa vs vs geles geles poliacrilamida poliacrilamida Ventajas de la poliacrilamida frente a la agarosa: 1.- Mayor poder de resolución. 2.- Admite mayor cantidad de muestra (zona de compactación en el gel). 3.- El DNA recuperado es mas puro. Ventajas de la agarosa frente a la poliacrilamida: 1.- Facilidad de manejo de los geles, más flexibles, menos frágiles y más gruesos. 2.- La polimerización es mas segura, los geles siempre salen bien, son fáciles de preparar. 3.- Permite la separación de fragmentos tan grandes como cromosomas (PFGE).
Migraci Migración de las las mol moléculas en la la electroforesis electroforesis ón de éculas en -Viene condicionada tanto por su carga como por su masa. Las moléculas pequeñas atraviesan más fácilmente la matriz de agarosa y se mueven más rápidamente que las moléculas grandes. -Voltaje: La migración es proporcional al voltaje aplicado. El máximo de separación se obtiene aplicando un voltaje de 5 V/cm (distancia entre los electrodos). -Composición del buffer: Los buffers más utilizados son: - TAE (Tris-acetato): Poca capacidad de tamponamiento, puede llegar a "agotarse" en electroforesis largas. Cambio frecuente en la cubeta. - TBE (Tris-borato): Tiene mayor capacidad tampón.
Cuantificación del ADN ADN Cuantificación del Si la muestra es pura: Determinaci ón espectofotom étrica Determinación espectofotométrica de la cantidad de ADN a 260 nm -Los ácidos nucleicos absorben luz debido a las bases aromáticas (λ=260 nm). Para el DNA una Abs260nm=1 significa una [DNA]=50 µg/ml= 50 ng/µl -Se diluye la muestra de ADN 1/1000 -Pureza del DNA: A260nm / A280nm > 1,75
Cuantificación del ADN ADN Cuantificación del Si la muestra tiene impurezas o es pequeña: Cuantificaci ón por comparaci ón con Cuantificación comparación cantidades conocidas de ADN de Fago λ -Se utiliza cuando la cantidad de ADN < 250ng/ml o está muy contaminado por sustancias que absorven a λ=260 nm -Comparación visual de la fluorescencia emitida por la muestra con la emitida por estándares de cc conocidas de ADN -[DNA]λ =500 ng/µl -1 µl de la dilución 1/10=50 ng
Extracciones de ADN de levaduras.
a) Extracción usando zimoliasa. Marcador de PM λ III; b) Extracción para PCR usando método rápido (Liu, D. y col.) Marcador de PM λ III; c) Extracción de ADN usando la técnica de Mitchell . Marcador de PM Cien Marquer;
Algunos ejemplos ejemplos de de aplicaci aplicación Algunos ón de la la Taxonom Taxonomía molecular en en la la de ía molecular identificación de levaduras levaduras identificaci ón de
Análisis genómico por ADN fingerprinting de cepas atípicas de C. albicans
Patrones de ADN Fingerprinting (hibridización con la sonda Ca3 luego de la digestión con EcoRI).
• Diferenciaci ón de Candida albicans y Candida Diferenciación
dubliniensis
• Caracter ísticas fenot ípicas Características fenotípicas
C. albicans
C. dubliniensis
•• Emiten ºC Emiten tubos tubos germinativos germinativos en en suero suero aa 37 37ºC •• Forman íz Forman clamidoconidios clamidoconidios en en Agar Agar Harina Harina de de Ma Maíz •• Crece ºC Crece aa 45 45ºC •• Asimila Asimila Xilosa Xilosa •• Asimila metil-D-glucósido Asimila α α--metil-D-glucósido •• No ºC No Crece Crece aa 45 45ºC •• No No Asimila Asimila Xilosa Xilosa •• No metil-D-glucósido No Asimila Asimila α α--metil-D-glucósido
•M étodos de diferenciaci ón basados en caracteres fenot ípicos Métodos diferenciación fenotípicos Ensayo Ensayo
Características
Referencias
Color de las colonias en medio CHROMagar Candida
Color Verde Oscuro
Producció Producción de clamidoconidios en Staib Agar (Guizotia abyssinica creat) creat) Producción de clamidoconidios en Pal’s Agar (Agar semilla de girasol)
Producció Producción clamidoconidios
Producció Producción de pseudomicelio y clamidoconidios
Al Mosaid, Mosaid, A. y col. 2003
Producció Producción de clamidoconidios en Agar Caseí Caseína Test de opacidad en Tween 80
Producció Producción de clamidoconidios Producció Producción de un halo opaco por C. albicans Perfiles de asimilació asimilación especí específicos para cada especie.
Mosca, C. y col. (2003)
Precipitació Precipitación del coagregado C. dubliniensis y F. nucleatum Anticuerpos especí específicos antiantiC. dubliniensis C. dubliniensis no tiene actividad β-glucosidasa
JabraJabra-Rizk, Rizk, 1999b
Colonia dorada, rugosa Producció Producción de clamidoconidios
Khan y col. 2004
Perfiles de asimilació asimilación carbohidratos: API 20 C Aux, Aux, ID 32 C System, System, Vitek YBC y VITEK 2 IDID-YST system Coagregació in vitro de C. Coagregación dubliniensis con Fusobacterium nucleatum. nucleatum. Ensayo Indirecto de Inmunofluorescencia Actividad β-glucosidasa Producció Producción de clamidoconidios en Agar tabaco
Kirkpatrick, W. y col. 1998
de
Staib, Staib, P. y col 1999; Al Mosaid A. y col 2001
Slifkin, Slifkin, M., 2000 Gales, A.C. A.C. y col. 1999; Pincus, Pincus, D. y col. 1999.
M.A. M.A.
y
col.
Bikandi, Bikandi, J. y col. 1998 Boerling, Boerling, P. y col. 1995
• C. dubliniensis
100 X.
400 X (Gueguén)
• C. albicans
100 X.
400 X (Gueguén)
• M étodos de diferenciaci ón basados en caracteres Métodos diferenciación genot ípicos genotípicos ón sustancialmente Existe Existe una una organizaci organización sustancialmente diferente diferente de de los los genomas genomas de de C. C.
albicans albicans yy C. C. dubliniensis dubliniensis
Análisis genómico por ADN fingerprinting
Análisis genómico por ADN fingerprinting
C. albicans
C. dubliniensis
Patrones de ADN Fingerprinting (hibridización con la sonda Ca3 luego de la digestión con EcoRI). -Las calles 1 a 4 muestran los patrones de hibridización típicos de C. albicans; -Las calles 5 a 15 muestran los patrones de hibridización atípicos de C. dubliniensis.
• M étodos de diferenciaci ón basados en caracteres Métodos diferenciación genot ípicos genotípicos Existe una organización sustancialmente diferente de los genomas de C.
albicans y C. dubliniensis
Análisis genómico por ADN fingerprinting Análisis del cariotipo(PFGE):
C. albicans: 7 cromosomas C. dubliniensis: 9-10 cromosomas
Relación filogenética entre C. albicans y C. dubliniensis Secuencia region V3 subunidad mayor del ARNr Secuencia completa de la subunidad chica del ARNr Secuencia del Gen ACT1 de β-actina
2,3 % (Sullivan y col. 1995) 1,4 %
(Donnelly y col., 1999) 1999)
2,1% exón 16,6 % intrón (Donnelly .
1999)
• IDENTIFICACION DE C. dubliniensis POR PCR La secuencia del intrón de CdACT1 se usó para diseñar un par de cebadores específicos para C. dubliniensis permitiendo de esta forma detectarla rápidamente y diferenciarla de C. albicans en una reacción de PCR (Donnelly, S. y col. 1999). Cebadores específicos para Cd: DUBF/DUBR (fragmento de 288 pb) Cebadores universales : ITS1/ITS4 (fragmento de 530 pb)
C. dubliniensis
C. albicans
530 pb > 288 pb >
•(Binolfi et al., 2005)
• Diferenciación de especies dentro del complejo Candida parapsilosis por PCR
MLST: multilocus sequence typing
Amplificaci ón por secondary alcohol Amplificación por PCR PCR del del gen gen SADH ((secondary alcohol dehydrogenase , C. metapsilosis dehydrogenase)) para para diferenciar diferenciar C. parapsilosis parapsilosis, metapsilosis yy
C. orthopsilosis
Restricci ón del producto de PCR con BanI para diferenciar Restricción
C. parapsilosis , C. metapsilosis y C. orthopsilosis parapsilosis, 716 pb
1 fragmento 716 pb -96 pb
4 fragmentos
-373 pb -60 pb -187 pb
2 fragmentos
-196 pb -520 pb
Un fragmento de 716 pb del gen SADH (secondary alcohol dehydrogenase) es amplificado, purificado y digerido con Ban I. Los diferentes patrones de digestión son usados para identificar las 3 especies ya que los amplicones contienen 1, 3 y ninguún sitio de restricción para Ban I.
ón del Restricci Restricción del producto producto de de PCR PCR con con BanI BanI para para diferenciar diferenciar C.
parapsilosis , C. metapsilosis y C. orthopsilosis parapsilosis, orthopsilosis
ón yy restricci ón del Amplificaci Amplificación restricción del producto producto de de PCR PCR para para diferenciar diferenciar
C. parapsilosis , C. metapsilosis parapsilosis, metapsilosis yy C. C. orthopsilosis orthopsilosis
Análisis de los productos de la resricción con Ban I en 12 aislamientos clinicos. Lanes: M, 100-bp DNA ladder molecular weight marker; 2, C. metapsilosis; 1, 3 to 9, 11, and 12,C. parapsilosis; 10, C. orthopsilosis .