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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 054 026 kInt. Cl. : A01N 35/02

11 N.◦ de publicaci´ on: 5

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 89311852.1 kFecha de presentaci´on : 16.11.89 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 375 149 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 27.06.90

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Compuestos l´ıquidos libres de fenol y utilizaci´ on de los mismos.

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73 Titular/es: Wave Energy Systems, Inc.

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72 Inventor/es: Boucher, Raymond Marcel Gut

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74 Agente: Gil Vega, V´ıctor

30 Prioridad: 20.12.88 US 286738

One Riverway Suite 1700 Houston Texas 77056, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.08.94

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.08.94

Aviso:

k k k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

2 054 026 DESCRIPCION Esta invenci´on se refiere a compuestos l´ıquidos libres de fenol, por ejemplo compuestos virucidas. 5

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Antecedentes de la Invenci´ on Existe una necesidad de compuestos virucidas que contengan una cantidad m´ınima de activos qu´ımicos con una baja toxicidad, pero que proporcionan una destrucci´ on r´ apida y completa de virus resistentes de superficie animada o inanimada. Hay muy pocos desinfectantes qu´ımicos que son efectivos contra los virus resistentes al utilizarlos en concentraciones bajas en el rango de aproximadamente un 0,006% al 0,00125% (peso/vol.). Con el fin de medir la efectividad virucida de los compuestos, el trabajo de Noll and Younger (Virology 8:319-343, 1959) propuso clasificar los virus sobre la base de su afinidad con los l´ıpidos. Estos virus que se combinan f´ acilmente con los l´ıpidos, como son el colesterol, se llaman “lip´ofilos”. Los virus que no se combinan f´ acilmente con los l´ıpidos se llaman “hidr´ ofilos”. En 1963 Klein and Deforest (Proceedings, 49th meeting of Chem. Spec. Manuf. Assoc., p´ aginas 116-118, New York) realizaron una investigaci´on minuciosa del comportamiento de diferentes tipos de virus con varios desinfectantes y descubrieron que la resistencia de los virus hidr´ofilos a algunos germicidas se basaba en el falta de reacci´ on de estos germicidas con los virus hidr´ofilos. Por el otro lado, los virus lip´ofilos son m´ as susceptibles a la inactivaci´ on de los germicidas lip´ofilos. Al utilizar tres virus hidr´ ofilos resistentes (poliovirus tipo 1, virus de Coxsackie B1 y virus Echo 6) y cuatro virus lip´ ofilos (Adenovirus tipo 2, virus de Herpes Simple Tipo 1, virus de la vaccinia y Virus de Gripe Asi´atica), Klein y Deforest determinaron las concentraciones m´as bajas de germicidas requeridos para inactivar estos virus en 10 minutos. En la tabla 1 pueden ver los resultados correspondientes a los virus m´as resistentes (poliovirus tipo I). TABLA I

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CONCENTRACIONES MAS BAJAS (PESO/VOL.%) DE DESINFECTANTES QUE INACTIVAN EL POLIOVIRUS TIPO 1 EN 10 MINUTOS∗

Hipoclorito s´ odico Iodoforo Bicloruro de mercurio Formalina Glutaraldehido Alcohol de etilo Alcohol de isopropilo Fenol O-fenil fenol Amonio cuarternario

: : : : : : : : : :

0,02 0,015 0,2 8,0 2,0 70,0 95,0 5,0 12,0 (neg.) 10.0 (24 hrs. contacto neg.)

Seg´ un demostraron antes Klein y Deforest (v´ease Table I), los fenoles o compuestos de fenol como el orto fenilfenol tienen poca o ninguna actividad contra los virus hidr´ ofilos. En su estudio, Klein y deforest mostraron, por ejemplo, que una concentraci´ on de fenol ortofenil al 12% ni siquiera destruye los virus siguientes: polio tipo 1, Coxsackie B-1 y Echo 6. El fenol mismo requer´ıa concentraciones del 5% para ser activo contra los mismos tres virus hidr´ ofilos. M´as recientemente, un estudio de laboratorio independiente (Hazelton Biotech Corp., Proyecto No. 2288-100, 26 de junio de 1984) confirm´ o que una mezcla de fenol con fenato s´ odico con un contenido del 0,51% de estos compuestos no pod´ıa destruir el virus de la polio tipo 1, ATCC VR 912, de acuerdo con las normas EPA (DIS/TSS-7, Nov. 1981). Queda claro que se requiere una alta concentraci´on de fenoles o compuestos de fenol para actuar sobre los virus resistentes. A la inversa, el fenol, los sales de fenol o compuestos fen´ olicos en concentraciones del 0,5 al 5% son muy t´ oxicos. Los da˜ nos locales en la piel incluyen eczema, inflamaci´on, decoloraci´on, papilomas, necrosis, formaci´on o separaci´on de la escara y gangrena (v´ease Industrial Hygiene and Toxicology, Vol. 2, 1363-1408, segunda edici´on, Interscience Publishers, 1963). Los fenoles monohalogenados o fenoles de metilo o fenoles de dimetilo demostraron ser tan potente en provocar papilomas en animales como los fenoles mismos. Los bifenilos (PCB) policlorinados han sido rechazados por el EPA debido a que son 2

2 054 026 extremadamente t´oxicos incluso a niveles muy bajos de concentraci´ on en la cadena alimenticia.

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M´ as recientemente se determinaron otras concentraciones m´ınimas germicidas requeridas para la inactivaci´on en 10 minutos (Journ. Hosp. Supp. Process. Distrib., Enero de 1985, p´ aginas 40-47) con el poliovirus Tipo 1 y 2. Estos datos fueron recopilados por Dr. J. Bednarz-Prashad (University of Texas Medical School, Houston) utilizando el test virucida standard AOAC aprobado por la Agencia de Protecci´on del Medio Ambiente (EPA Notice, DIS/TSS-7, 12 de noviembre de 1981). Los resultados de este estudio que muestran la concentraci´on m´ınima requerida para inactivar el virus con un tiempo de contacto de 10 minutos se encuentran listados en la Tabla II.

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TABLA II

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CONCENTRACION MINIMA (PESO/VOL.%) PARA INACTIVAR POLIOVIRUS EN 10 MIN. (METODO AOAC)

Gluconato de clorhexidina Glutaraldehido + no-i´ onico Glutaraldehido + no-i´ onico + glicol O-fenil fenol Glutaraldehido-fenato

0,5 ∗ 0,25 0,19 1,0 ∗ 0,14∗

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∗ estos representa la concentraci´on m´ as baja del producto comercial ensayado. El virus no se inactiv´ o con esta concentraci´on. 30

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La concentraci´on m´ınima de glutaraldehido era ocho veces inferior en los experimentos de Prashad que en los de Klein y Deforest, debido a que Prashad utiliz´o un glutaraldehido activado por peque˜ nas cantidades de etoxilatos no-i´ onicos de alcoholes lineales isom´ericos (por ejemplo TERGITOL 15-S-12). En otras palabras, seg´ un se describe en la patente U.S. No. 3.968.248, y qued´ o demostrado por R.M.G. Boucher (Am. Journ. Hosp. Pharm. 31: 546-557, Junio de 1974), la presencia de peque˜ nas cantidades de surfactantes no-i´ onicos puede, en algunos casos, incrementar la actividad destructiva de soluciones de glutaraldehido. A esta misma f´ormula se a˜ nadi´ o glicol de trietileno para hacerla inodora, y este compuesto con contenido de glicol permiti´o una concentraci´ on m´ınima de glutaraldehido del 0,19% (p/v). Esta concentraci´on est´a muy cerca del valor observado al utilizar la soluci´ on de glutaraldehido con contenido de etoxilato no-i´onico sin glicol. Los resultados anteriores demuestran la necesidad de un compuesto con una mayor actividad virucida con concentraciones bajas, relativamente no-t´ oxicas. Por esta raz´on, el objetivo de la presente invenci´ on es producir soluciones virucidas eg m´as potentes, y reducir la cantidad de dialdehido requerido para destruir los virus t´ıpicos, lip´ ofilos o hidr´ ofilos. De acuerdo con esta invenci´on, se proporciona un compuesto l´ıquido libre de fenol que incluye:

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a) un solvente consistente en agua o un alcanol inferior; b) un dialdehido que contiene de 2 a 6 a´tomos de carbono:

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c) un agente reductor del olor seleccionado del grupo consistente de glicol de etileno, glicol de propileno, glicol de dietileno, glicol de trietileno, glicol de polietinelo, glicol de polipropileno y mezclas de los mismos; d) un surfactante ani´ onico con un grupo hidr´ ofilo de carga negativa del grupo compuesto por sulfatos de alquilo sulfonatos de alquilo sulfatos de alcohol, sulfonatos de arilo de alquilo sulfosuccinatos y mezclas de los mismos; e) sales reguladoras en cantidad suficiente para estabilizar el pH del compuesto dentro del rango de 4 a 7,4. 3

2 054 026 en el que la proporci´ on sobre peso del surfactante ani´ onico frente al dialdehido es de 1:4 hasta 10:11 y el peso del compuesto de glicol es de una a 32 veces el peso del dialdehido.

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En la parte restante de la descripci´ on se hace referencia al glutaraldehido para mayor simplicidad. Sin embargo, se entiende que comentarios y resultados similares aplican a los dialdehidos que contienen de 2 a 6 ´atomos de carbono. Se ha descubierto que se consiguen compuestos virucidas nuevos y potentes mediante la combinaci´ on sinerg´etica de C2−6 monomeros de dialdehido (por ejemplo monomero de glutaraldehido) en equilibrio con sus hidratos y polimeros; junto con las mol´eculas de glicol enlazados por hidr´ogeno y un surfactante ani´ onico seleccionado del grupo de los tipos de surfactante ani´ onico incluyendo sulfato de alquilo sulfonato de alquilo sulfato de alcohol y sulfonato de arilo de alquilo En particular se prefiere el sulfato de dodecilo s´odico. Estos compuestos son efectivos contra los virus tanto lip´ ofilos como hidr´ofilos, y muestran un fuerta sinergismo destructor contra el Virus de Herpes Simple Tipo 1 y una actividad virucida mejorada contra los virus Coxsackie B. Los compuestos virucidas de esta invenci´ on son efectivos en soluciones acuosas muy diluidas, es decir al 0,0025% (p/v), estando presente un surfactante ani´ onico en concentraciones tan reducidas como es el 0,0005% por (p/v). Adem´as se puede ver en la Patente U.S. No. 3.886.269 la pr´ actica de a˜ nadir mol´eculas de glicol a los compuestos de glutaraldehido para desodorizar el compuesto, lo que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Al adoptar esta pr´actica, la eficacia virucida del compuesto de la presente invenci´ on no se ve afectada de forma perjudicial. Breve descripci´ on de las figuras

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La figura 1 es una fotograf´ıa de cuatro conjuntos de ocho monocapas de c´elulas sobre cubetas de pl´ astico inoculadas con el virus de Herpes Simple Tipo 1 (HSV) tratadas o no tratadas de diferentes formas seg´ un se describe m´as en detalle a continuaci´on. La figura 2 es una representaci´ on simb´ olica del equilibrio entre el monomero de aldehido y hidratos mayores y polimeros.

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Descripci´ on detallada de las figuras

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La figura 1 muestra un conjunto de c´elulas de cultivo crecidas en forma de pel´ıculas redondas (monocapas de c´elulas) en cubetas de pl´ astico. Las monocapas de c´elula se inocularon con el virus de Herpes Simple Tipo I (HSV). Al estar presentes virus activos en el inoculado, el virus produce agujeros (placas) en las monocapas de c´elula. Estos aparecen desiguales, como zonas blancas en las monocapas oscuras. Contando el n´ umero de placas, se puede determinar el n´ umero de virus activos (unidades que forman placas o pfu) en el inoculado. En cada panel (A hasta D de la figura 1) se inocul´ o la fila superior de cuatro monocapas de c´elula con un tratamiento; la fila inferior de cuatro monocapas, una diluci´ on de HSV 10−2 y no se someti´o a ning´ on 10−3 , en cada panel de cuadrante, se inocul´ o con una diluci´ on 10−3 del virus. HSV, con una diluci´ ◦ se dej´ o sin tratar (fila inferior del cuadrante A), o se trat´ o durante 10 minutos a 23 C con sulfato de dodecilo s´odico (SDS) de s´ olo un 0,001% (p/v) (fila inferior del cuadrante B), con glutaraldehido de s´ olo un 0,0025% (p/v) (fila inferior del cuadrante C), o con una mezcla de 0,001% (p/v) SDS y 0,0025% (p/v) de glutaraldehido (fila inferior del cuadrante D). En todos los casos, el tiempo de exposici´ on era igual a 10 minutos a temperatura ambiente. Los paneles B y C muestran una peque˜ na o ninguna reducci´ on del n´ umero de virus pfu seg´ un se compara con el panel A. Sin embargo, el panel D muestra una reducci´ on del virus pfu del 80% al 90%. As´ı, con las concentraciones utilizadas en este ensayo, SDS y glutaraldehido han de estar presentes juntos y han de trabajar de forma sinerg´ıstica para inactivar el HSV Tipo I. Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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Para entender mejor porqu´e una combinaci´on de glutaraldehidos diluidos en gran medida con surfactantes ani´ onicos se despliega m´as que un efecto virucida aditivo, es necesario analizar y comprender cada mecanismo de efecto de los dos compuestos qu´ımicos y determinar c´omo cada uno afecta la estructura fundamental de los virus. Sin quedar limitado a cualquier teor´ıa en particular, se cree que la siguiente l´ogica es pertinente para entender el efecto de los compuestos virucidas de la presente invenci´on. En primer lugar se ha de considerar el mecanismo destructor de los aldehidos en general y de gluta4

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raldehidos en particular. Las soluciones de aldehido acuosas tienen concentraciones bajas de la mol´ecula aldehida pura, llamada el “monomero”. Este monomero, que se entiende es una mol´ecula de aldehido sencilla y simple, est´a siempre presente en equilibrio con mol´eculas mayores m´as complejas llamadas los “hidratos”. Los hydratos resultan de la condensaci´ on o polimerizaci´on de peque˜ nos monomeros en aglomeraciones mayores. En todas las soluciones de aldehido, se supone que se establece r´ apidamente un equilibrio entre los monomeros relativamente peque˜ nos y los polimeros mayores o hidratos de lo que resultan concentraciones relativamente estables de cada una. Este equilibrio se basa sobre variables que incluyen la concentraci´on del producto qu´ımico, pH, temperatura, turbulencia y una variedad de otros factores.

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El monomero de aldehido es el agente destructor primario en la soluci´ on acuosa de aldehido. La eficacia destructiva de toda f´ ormula con contenido de aldehido (es decir formaldehido, glutaraldehido etc.) depende directamente del n´ umero de mol´eculas de monomeros presentes en el momento del uso en la soluci´on. El equilibrio entre el monomero y los hidratos mayores y polimeros tanto en las soluciones acuosas de formaldehido como las de glutaraldehido se encuentra ilustrado en la figura 2. on acuosa alcalina, el monomero se Para el glutaraldehido, (OHC-CH2 -CH2 -CH2 -CHO), en una soluci´ encuentra en equilibrio con los polimeros del tipo II, III y IV mostrados en la figura 2. La formaci´on de estos polimeros es irreversible y no es posible volver a la forma de monomero activo, ni siquiera con calentamiento o ultrasonido. Tanto el envejecimiento como el pH alcalino aceleran en gran medida la formaci´ on de polimeros irreversibles. En otras palabras, el envejecimiento y la alcalinidad reducen r´apidamente la actividad cidal de la soluci´on de glutaraldehido. Cuando el pH es a´cido, los monomeros de glutaraldehido tienen una velocidad m´ as lenta de polimerizaci´on y se encuentran en equilibrio con los polimeros del Tipo V que son reversibles. Esto explica porqu´e las soluciones ´acidas de glutaraldehido tienen una vida biocida bastante m´ as larga que las soluciones alcalinas. Este tema se puede completar por la referencia al art´ıculo Mecanismos Biocidas de Dialdehidos Saturados y su Potenciaci´on por Ultrasonido, Boucher, Last and Smith, Proc. West. Pharmacol. Soc. 16:282-288 (1973), incorporado en la misma por referencia en su totalidad.

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Como agentes alquilizadores se pueden indicar el formaldehido y glutaraldehido, as´ı como otros aldehidos que pueden reaccionar qu´ımicamente con grupos sulfhidrilos, hidroxilos, aminos y carboxilos. Muchos de estos grupos est´ an presentes en los compuestos estructurales de los virus y las estructuras de viri´ on son altamente susceptibles a los aldehidos. Al estudiar los virus de la enfermedad de los pies y de la boca, Sanger et al (Journ. of Gen. Virology 21:399-406, 1973) fueron los primeros en demostrar que el glutaraldehido produce considerables alteraciones en la disposici´ on de ARN y las subunidades de prote´ına en este picornavirus. Adem´ as, Hopwood demostr´ o (Histo-chem. J. 7:267, 1975) que el glutaraldehido reacciona con m´ as facilidad con ARN, es decir, a temperaturas inferiores, que con ADN. Es decir, los a´cidos nucleicos y las encimas, prote´ınas y los l´ıpidos reaccionan todos con el glutaraldehido. Las reacciones m´as comunes observadas, sin embargo, son aquellas que incluyen aminogrupos que conducen a una reticulaci´on de prote´ına.

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Con el fin de entender mejor la acci´ on virucida de la combinaci´ on de aldehidos y surfactantes ani´ onicos, hemos estudiado dos virus diferentes: el virus del Herpes Simple Tipo 1 y el virus Coxsackie B6. El virus del Herpes Simple 8HSV) tipo 1 es un virus relativamente fr´ agil que contiene ADN (con una envoltura); el virus Coxsackie B6 es un virus descubierto (sin envoltura) resistente y que contiene ARN.

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El viri´ on HSV tiene tres caracter´ısticas estructurales mayores e importantes para esta invenci´on: (1) un ADN lineal de doble cadena, (2) una envuelta sim´etrica de prote´ına conocida como el c´apsido y (3) una envuelta general que contiene l´ıpidos. El c´apsido se compone de racimos individuales de polip´eptidos (capsomeros) que son codificados por el virus. La envoltura procede de la membrana nuclear de la c´elula infectada. Esta envoltura contiene l´ıpidos, carbohidratos y prote´ınas. Durante la reproducci´ on del virus est´a presente un n´ umero de encimas como son las polimerasas de ADN; cuando se bloquean se inhibe la reproducci´on del virus. Como ya se ha mencionado anteriormente, las mol´eculas de glutaraldehido pueden interferir con encimas y prote´ınas ligantes del ADN, pero probablemente reaccionan m´ as f´acilmente con las prote´ınas estructurales o las glicoprote´ınas de la envoltura. El virus de Coxsackie B6 es un virus m´as peque˜ no (24-30 nm) de simetr´ıa c´ ubica. Este virus de ARN no tiene envoltura; tiene 32 capsomeros que est´ an estrechamente ajustados entre s´ı formando el c´apsido. Resulta muy dif´ıcil penetrar el c´apsido, protegiendo as´ı el n´ ucleo del ´acido nucle´ıco del virus. Las mol´eculas de glutaraldehido pueden, por esta raz´ on, requerir tiempos de contacto mayores para alcanzar los polip´eptidos de referencia internos o los ´acidos nucleicos que pueden ser cr´ıticos para inactivar el virus.

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2 054 026 Substancias ani´ onicos espec´ıficas, como es el sulfato de dodecilo s´ odico (SDS) pueden contribuir al mecanismo virucida de los aldehidos. Este sulfato de alquilo, SDS, tiene una carga fuertemente negativa; su f´ ormula es la siguiente 5

CH3 (CH2 )X 10

O k -O—S—O− Na+ k O {z } |

con x=11 15

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segmento hidr´ofilo

La siguiente secuencia de eventos se puede producir al encontrarse un virus con envoltura en presencia del SDS. En primer lugar, el agente ani´ onico enlaza con la membrana produciendo una lisis de membrana. La membrana se solubiliza en forma de complejos de prote´ına-l´ıpido-ani´ onico que se siguen solubilizando para proporcionar complejos de prote´ına de SDS y complejos de l´ıpidos de SDS. Este mecanismo fue propuesto por Simons et al (Membrane Protein and Their Interaction with Lipids - Prote´ına de Membranas y su Interacci´ on con L´ıpidos - Ed Capaldi, Vol. 1, 207-2343, Marcel Dekker, NY, 1977). Estos autores trabajaron con el virus Semliki Forest (SFV), un alfavirus en la Togaviridae. El SFV contiene un nucleoc´apsido esf´erico que se compone de una mol´ecula de ARN de cadena simple y una clase de prote´ına rica en lisina, la prote´ına nucleocapsida, estando la u ´ltima cubierta por una membrana de l´ıpido que est´ a cubierta con proyecciones de superficie de glicoprote´ına. La lisis de la membrana viral comienza on del nucleocapsido en ARN con concentraciones de SDS de aproximadamente 5 x 10−5 M. La disociaci´ y prote´ına tiene lugar con concentraciones de SDS bajas de 1 x 10−4 M. Concentraciones de SDS libres on. Esto significa que toda la secuencia desde de 0,75 x 10−3 M son suficientes para la completa delipidaci´ la lisis hasta la delipidaci´on se desarrolla con concentraciones de SDS inferiores a la construcci´ on micelar cr´ıtica (CMC). Seg´ un nuestra opini´ on esta destrucci´ on f´ısica extremadamente r´ apida de la envoltura viral representa el factor clave que permite a las mol´eculas de glutaraldehido penetrar en e inactivar los virus por medio de reacciones espec´ıficas con encimas, prote´ınas de viri´ on o a´cido nucleico. El SDS por s´ı solo puede inactivar los virus a trav´es del mecanismo arriba descrito. Por ejemplo, en el caso del virus del Herpes Simple Tipo 1, F. Burnet and Lush (Australian J. Exp. Biol. and Med. Sci., 18:141-150, 1940) concluyeron que se produc´ıa una inactivaci´ on parcial del HSV con 0,002% (p/v) de SDS, mientras que la inactivaci´on completa se observaba con 0,005% (p/v) de SDS. Esto qued´ o confirmado en nuestro estudio reciente (v´ease tabla IV) que se realiz´o seg´ un un m´etodo EPA ligeramente modificado y que mostr´ o una destrucci´ on completa en 10 minutos con una concentraci´ on de SDS de 0,005%. Seg´ un lo muestran Burnet and Lush, los virus m´ as resistentes, como son el virus de Coxsackie o el virus de vaccinia (un virus que contiene ADN con una capa que contiene l´ıpidos) requer´ıan concentraciones superiores de SDS (0,025% p/v) para la inactivaci´ on completa del virus. La presente invenci´on demuestra que la solubilizaci´on y disociaci´ on de los nucleocapsidos por agentes ani´ onicos, como son los sulfatos de alquilo, permiten la r´apida penetraci´ on de radicales activos de aldehido para seguir con la acci´on destructiva de los componentes clave estructurales de los virus. Este mecanismo destructivo de “doble acci´ on” puede observarse claramente de los resultados de los experimentos registrados en las Tablas III, IV, V y VI.

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(Ver TABLA III en la p´agina siguiente) 55

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2 054 026 TABLA III Estudio de Inactivaci´on del Virus Coxsackie B6 (CBV) Experimentos realizados con glutaraldehido, glicol de trietileno, surfactantes no-i´ onicos (Tergiton 15-S-12) y ani´ onicos (SDS)

5

% de actividad restante despu´es de 10

Tratamiento del virus1 min.

15

0 min.

5 min.

7.5 min.

10

Ninguna adici´ on TEG2 Terg. SDS

100 100 100 100

100 100 82

100 70 48

92 100 100 46

TEG + Terg. TEG + SDS

100 100

100 100

100 100

100 100

Glut Glut Glut Glut Glut Glut

100 100 100 100 100 100

100 100 100 36 100 45

85 100 100 35 86 42

90 96 100 40 72 12

20

25

30

1

35 2

40

+ + + + +

TEG Terg. SDS TEG + Terg. TEG + SDS

Los experimentos se realizaron a temp. ambiente en 1,0 ml de volumen de reacci´on. El procedimiento seg´ un descripci´on de la patente. concentraciones utilizadas:

(p/v)

Glicol de trietileno (TEG) Tergiton (15-S-12) Sulfato de dodecilo s´ odico (SDS) Glutaraldehido (Glut)

0,04 % 0,05 % 0,05 % 0,006 %

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(Ver TABLA IV en la p´agina siguiente)

55

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7

2 054 026 TABLA IV Estudio de inactivaci´on del virus de Herpes Simple (HSV) Tipo 1 Experimentos realizados con glutaraldehido, surfactantes no-i´ onicos (Tergitol 15-2-12) y ani´ onicos (SDS)

5

% de actividad restante despu´es de 10

Tratamiento del virus

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30

35

40

45

50

0 min.

10 min.

0,0006% Glut 0,0006% Glut 0,00125% Glut

100 100 100

100 100 100

0,05% SDS 0,005% SDS 0,003% SDS 0,001% SDS 0,00075% SDS 0,00050% SDS

100 100 100 100 100 100

0 0 3 58 100 100

0,05% Terg 0,04% Terg 0,005% Terg 0,0005% Terg 0,00005% Terg 0,0000006% Terg

100 100 100 100 100 100

0 94 49 100 100 100

0,00125% Glut+0,00075% SDS 0,00125% Glut+0,00100% SDS 0,00125% Glut+0,003% SDS

100 100 100

71 74 9,4

0,00250% Glut 0,00250% Glut+0,0005% Terg 0,00250% Glut+0,0005% SDS 0,00250% Glut+0,00075% SDS 0,00250% Glut+0,001% SDS 0,00250% Glut+0,003% SDS

100 100 100 100 100 100

80 50 32 38 24 4,7

Glut: SDS : Terg:

Glutaraldehido Sulfato de dodecilo s´ odico (surfactante ani´ onico) Tergitol 15-S-12 etoxilatos de alcoholes isom´ericos lineales (surfactante no-i´ onico).

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60

8

2 054 026 TABLA V % de actividad restante de HSV 1 despu´es de un tiempo de contacto de 10 minutos con: 5

Composici´ on de soluciones

s´olo SDS

0,0005% SDS

100

s´olo Glut

Resultado esperado de aditivo

Resultados reales Glut/SDS

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0,0035% Glut

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0,0025% Glut

0,001 % SDS

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0,0025% Glut

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SDS: Sulfato de dodecilo s´ odico (surfactante ani´ onico) Glut: Glutaraldehido

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(Ver TABLA VI en la p´agina siguiente) 40

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2 054 026 TABLA VI Influencia del Glicol de Trietileno (TEG) sobre la Inactivaci´on del Virus de Herpes Simple (HSV) Tipo 1 por Compuestos no-i´ onicos y ani´ onicos-glutaraldehido

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Tratamiento del virus (concentraciones en %

% deactividad restante despu´es de

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(p/v)

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0,04% TEG 0,04% TEG + 0,0005% SDS 0,04% TEG + 0,0005% SDS + 0,0025% Glut. 0,0005% SDS + 0,0025% Glut.

0 min.

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100 100

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0,04% TEG + 0,0005% Terg + 0,0025% Glut. 0,0005% Terg + 0,0025% Glut. 0,00075% SDS + 0,00125% Glut 0,00075% SDS + 0,00125% Glut + 0,04% TEG

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TEG: SDS: Terg:

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Glut:

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Glicol de trietileno Sulfato de dodecilo s´ odico (surfactante ani´ onico) Tergitol 15-S-12 etoxilatos de alcoholes isom´ericos lineales (surfactante no-i´ onico) Glutaraldehido

Las formulaciones de aldehidos solo o con surfactantes tienen un valor pr´ actico muy reducido cuando la aplicaci´on requiere la eliminaci´ on bien del olor o del potencial de irritaci´ on que siempre est´an presentes en las soluciones acuosad de aldehido. Para eliminar el olor y reducir la agresividad del aldehido en la fase l´ıquida o de vapor, hemos combinado ani´ onicos y aldehidos con mol´eculas del tipo glicol. Mediante el enlace de hidrogeno, el glicol y los aldehidos forman complejos f´ısicos (es decir mol´eculas mayores) que tienen una presi´ on de vapor inferior y una toxicidad menor para los ojos o la piel. Este m´etodo lo propusieron por primera vez Trujillo and Lindell en 1973. Ha sido descrito en su totalidad tanto en la Patente U.S. no. 3.886.269 como en un documento con el t´ıtulo “Nuevos Desinfectantes de Base de Formaldehido” (J. Appl. Microb. 26 (1):106-110, Julio de 1973) que trataba sobre la formaci´ on de complejos de formaldehido con glicol de etileno, glicerol y glicol de propileno. En 1973 Harriet Field del Queen Mary Veteran’s Hospital en Montreal, C´ anada, inform´ o sobre la eliminaci´on de vapores de glutaraldehido por la formaci´ on de complejos del glutaraldehido con glicol de propileno y glicerol. La formaci´ on directa de complejos de una soluci´ on de glutaraldehido con trietilenglicol fue comunicado por primera vez por el presente inventor en verano de 1975. El 15 de febrero de 1977, la USDA aprob´ o el primer compuesto inodoro comercial de glutaraldehido/glicol de trietileno bajo el nombre comercial de AGROCIDE 2. M´ as tarde la EPA registr´ o el 2 de febrero de 1979 un concentrado de esta f´ ormula bajo el n◦ de registro 15136-5. Entre 1976 y 1977, H.D. Muller de la Universidad del Georgia College of Agriculture public´o varios informes que describ´ıan la sustituci´ on con ´exito del dormaldehido por soluciones de glutar-aldhido/glicol de trietileno para su aplicaci´ on en criaderos de pollos. Sobre el uso de estos complejos de glicol de trietileno en el sector de los hospitales inform´ o adem´as el inventor en noviembre de 1978 (Respiratory Care 23 (11):1063-1072). Las soluciones de glutaraldehido/trietileno utilizadas se potenciaron con surfactantes no-i´ onicos seg´ un se describen en la Patente U.S. No. 3.968.250, o por combinaciones de surfactantes no-i´ onicos y ani´ onicos. Sin embargo, los surfactantes no-i´ onicos, cati´onicos y ani´ onicos tienen un comportamiento diferente y, en algunos casos, en direcci´on opuesta, al encontrarse en presencia de los componentes clave de los virus (prote´ınas, encimas y membranas). Por 10

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ejemplo, la actividad destructiva de los surfactantes ani´ onicos queda incrementada a medida que se reduce el valor pH, mientras que se puede observar el comportamiento opuesto en el caso de los surfactantes cati´onicos, lo que significa que el primer paso de la interacci´on ani´ onica consiste en una absorci´ on i´ onica por las membranas. De esto puede resultar la citolisis, autolisis y la eventual inactivaci´on de procesos metab´ olicos (v´ease D.F. Hoelzl Wallach, The Plasma Membrane, Vol. 18, Heidelberg Science Library, Springer-VErlag, New York, 1972). En el caso de las prote´ınas, los surfactantes no-i´onicos muestran ninguna interacci´on o interacciones que son extremadamente d´ebiles, mientras que los ani´onicos muestran una interacci´on muy intensa con las prote´ınas y los polimeros. Los surfactantes no-i´ onicos, generalmente, no inactivan o desnaturalizan las encimas. Los surfactantes ani´ onicos, por otro lado, muestran una fuerte inactivaci´ on y desnaturalizaci´ on de las encimas, mientras que los surfactantes cati´ onicos son, normalmente, menos efectivos que los surfactantes ani´ onicos (M.J. Schwuger y F.G. Bartnik, ed. por C. Gloxhuber, Cap´ıtulo 1, pp 32, M. Dekker, Inc., NY 1980). Sin embargo, sorprendentemente se descubre que al sustituir los cati´ onicos y no-i´ onicos por ani´ onicos espec´ıficos en soluciones complejas de glutaraldehido-glicol se consiguen f´ ormulas cirucidas diferentes y m´as potentes que el efecto meramente aditivo de los dos componentes.

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Con el fin de evaluar la influencia sobre la eficacia virucida de los tres productos qu´ımicos clave (glutaraldehido, glicol de trietileno y surfactante ani´ onico) utilizados en las f´ormulas de la presente invenci´on, hemos llevado a cabo una serie de experimentos con los dos virus el de Coxsackie B6 y el del Herpes Simple Tipo 1. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla III (CBV) y la Tabla IV (HSV 1).

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El surfactante no-i´ onico (Patente U.S. No. 3.968.248) utilizado en nuestro estudio comparativo era una mezcla de etoxilatos de alcoholes isom´ericos lineales producidos por Union Carbide bajo el nombre comercial TERGITOL 15-S-12. La f´ormula estructural de este surfactante no-i´ onico es la siguiente: CH3 -(CH2 )n -CH-(CH2 )n ’ CH3 | O-(CH2 CH2 O)12 H

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en la que (n + n’) = 8 - 12 En la parte hidr´ ofoba de la mol´ecula hay de 11-15 a´tomos de carbono. 35

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I. Estudio del virus Coxsackie B6: A. La soluci´on existente del virus de Coxsackie B6 conten´ıa 5.17 (± 2.3) x 105 pfu/ml. El porcentaje de la concentraci´on (p/v) de los reactivos en las mezclas de la reacci´on eran para el glutaraldehido (0,006%), para el TERGITOL (0,05%), para el SDS (0,05%) y para el TEG (0,04%). Se mezclaron al´ıcuotas del virus con (1) glutaraldehido con o sin TEG, SDS o´ TERGITOL O (2) glutaraldehido m´as TEG con o sin SDS o´ TERGITOL, O (3) SDS o´ TERGITOL. B. La mezcla de la reacci´on se incub´ o a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacci´ on se par´ o por adici´ on de 0,1% (concentraci´on final) de metabisulfito s´ odico. De cada mezcla de reacci´on se obtuvieron diluciones en serie al 10%. Las diluciones se mantuvieron fr´ıas en un ba˜ no helado. C. Despu´es se inocularon cuatro al´ıcuotas de 0,2 ml de cada diluci´ on de serie en cuatro capas confluentes de c´elulas MA104 (fibroblastos de ri˜ no´n de mono). Despu´es de una hora de incubaci´ on a 37◦ C, se retir´o el inoculado de cada capa simple. Se a˜ nadi´ o a cada monocapa una cubierta de agar. Esta cubierta de agar conten´ıa nutrientes para mantener las monocapas de c´elulas, mientras que cualquier virus viable que sobreviv´ıa se reproduc´ıa. Tres d´ıas m´as tarde se realiz´o un recuento de las placas de virus y se registraron los resultados de los experimentos. Este protocolo difiere de una prueba AOAC en que este virus estaba presente en la soluci´on y no en los penicilindros y se cuentan las placas de virus para cuantificar el virus. En un ensayo AOAC, se seca el virus sobre penicilindros antes de exponerlo a un desinfectante. Tambi´en, en un ensayo AOAC el virus se cuantifica de forma diferente; las monocapas infectadas por virus se califican como positivas (existen placas de virus) o negativas (no existen placas de virus). II. Estudios del virus del Herpes Simple I:

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A. La soluci´on existente del virus de Herpes Simple conten´ıa 2.48 (± 1,0) x 105 pfu/ml. Se mezclaron los virus existentes en vol´ umenes de 1 ml con los diferentes productos qu´ımicos con concentraciones finales seg´ un se pueden ver de la Tabla IV. 11

2 054 026 B. Despu´es de 10 minutos a temperatura ambiente (22◦25◦ C) se obtuvieron diluciones de serie al 10% que se inocularon en cuatro monocapas de c´elulas por diluci´ on (0,1 ml/monocapa).

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C. Las c´elulas inoculadas se incubaron durante 60 minutos para permitir la fijaci´ on de los virus. Despu´es se retir´o el inoculado y se a˜ nadi´ o una cubierta de un medio de crecimiento para el virus m´as metilcelulosa. Cinco d´ıas m´ as tarde se formaronplacas. Para reforzar la visibilidad de las placas, las c´elulas se fijaron con 0,5% de glutaraldehido y ti˜ nieron con 1,5% de violeta de cristal. Se contaron las placas de cada monocapa y se registraron. Una caracter´ıstica importante de la presente invenci´on es la presencia de mol´eculas de glicol en cantidad suficiente que eliminan la mayor parte del olor del aldehido mientras que no reducen ni afectan de forma dr´ astica la eficacia virucida de la soluci´on ani´ onica de glutaraldehido. Existen pocos documentos relativos a la actividad virucida de los glicoles en la fase l´ıquida. Klein y Deforest informaron (Desinfecci´on, Esterilizaci´on y Preservaci´ on, ed. S.S. Block, P. 432, Editor Lea and Fabiger 1983) que 100% de glicol de propileno inactivaron 100% del virus Coxsackie B1, pero s´olo 99% (dos anotaciones) de la actividad del poliovirus 3. No existe ning´ un informe sobre que los glicoles s´ olos, en soluci´ on diluida, tengan un efecto virucida. Robertson et al. (Sicnece, 97, 142-144, 1943) inform´ o que los glicoles pulverizados en una c´ amara (40 a 60% de humedad), inactivaron el virus de la gripe aerosolizado. Estos resultados no han sido repetidos bajo condiciones de ensayo en campo. En nuestros experimentos (Tablas III, IV) el glicol de trietileno (TEG) se utiliz´o en forma l´ıquida y no como aerosol con concen-traciones muy bajas (0,04%) por lo que no se esperaba una contri-buci´ on a la acci´on virucida. Con el virus Coxsackie no se observ´ o ning´ un aumento o reducci´on substancial en la actividad virucida despu´es de a˜ nadir glicol de trietileno (0,04%) a 0,006% de glutaraldehido. Como se esperaba te´ oricamente, el glicol de trietileno por s´ı mismo, con una concentraci´ on del 0,04%, no ten´ıa ning´ un efecto sobre la concentraci´ on del virus despu´es de 10 minutos. Los mismos resultados se observaron al utilizar 0,04% TEG con 0,0% de surfactante no-i´ onico o´ ani´ onico. Sin embargo, la actividad virucida aument´ o al ensayar soluciones de glutaraldehido/no-i´onico y glutaraldehido/ani´ onico en presencia de 0,04% glicol de trietileno. En todos los casos las soluciones de glutaraldehido/ani´ onico con o sin glicol mostraron siempre una acci´ on virucida superior que las soluciones correspondientes con surfactantes no-i´ onicos. Saitanu y Lund (Appl. Microbiol. 29(5):571-574) tambi´en estudiaron el efecto del glutaraldehido sobre el virus de Coxsackie. utilizaron glutaraldehido al 0,5% como la concentraci´on de ensayo m´ as baja. Su informe refleja una p´erdida del 90% en la concentraci´ on en 20 minuto y una p´erdida del 99% en 30 minutos. Nuestros datos de la Tabla III muestran que el glutaraldehido al 0,006% (1/80 de la cantidad utilizada por Saitanu y Lund) puede tener como resultado una p´erdida del 60% en la concentraci´ on de virus en 10 minutos si junto con el glutaraldehido est´ an presentes 0,5% de SDS. El SDS s´ olo puede reducir la concentraci´on del virus Coxsackie B6; sin embargo, las caracter´ısticas cin´eticas de esta reacci´on son m´as lentas que las del glutaraldehido al 0,006% m´ as el SDS al 0,05%. Esto demuestra con claridad el reforzamiento de la actividad virucida que se produce si se a˜ nade SDS, en peque˜ nas cantidades, a niveles bajos de glutaraldehido. El estudio del virus Coxsackie B6 mostr´ o que era posible desodorizar el objecto de la presente invenci´on mediante la adici´ on del glicol, sin destruir la actividad de los compuestos de dialdehido/ani´ onico. Sin embargo, es importante se˜ nalar que las concentraciones de glicol en la soluci´ on final han de ser inferiores al 590 por cien sobre peso si se desea evitar una reducci´ on de la actividad destructiva. Por ejemplo, Dr. Hopfer, Cancer Center de Houston, utiliz´ o concentrados comerciales de glutaraldehido (25 y 50% sobre peso) y demostr´o que exist´ıa una p´erdida en la actividad destructiva despu´es de a˜ nadir una cantidad substancial de glicol. El m´etodo anal´ıtico utilizado en estos ensayos era el ensayo esporicida de AOAC. Se utilizaron y se han de utilizar porcentajes bastante m´ as reducidos de glicol en la f´ormula objeto de la presente invenci´ on. Por esta raz´ on era extremadamente importante mostrar que estos peque˜ nos porcentajes de glicol no afectan substancialmente la eficacia virucidal de nuestros compuestos.

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(Ver TABLA VII en la p´agina siguiente) 60

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2 054 026 TABLA VII

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ACTIVIDAD ESPORICIDA DE GLUTARALDEHIDO POTENCIADO AL 50% (p/v) Y GLICOL DE TRITETILENO A TEMPERATURA AMBIENTE M´etodo AOAC 4015-4017

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Organismo ensayado: esporogenias Clostridium ATCC 3584 Portador: Penicilindros Soluciones del ensayo

N´ umero de tubos positivos/ total ensayado

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Glutaraldehido 50% Glutaraldehido 25% Glutaraldehido 25%+Glicol de Trietileno 50% Glicol de trietileno 100%

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Se pueden utilizar otros glicoles para desodorizar y reducir la agresividad de los aldehidos. Sin embargo, se eligi´ o el glicol de trietileno (TEG) debido a que es completamente soluble en soluciones acuosas de glutaraldehido. Los estudios de toxicidad de dosis oral repetida han mostrado que el TEG es m´ as seguro que los glicoles de etileno y de dietileno. Los ensayos de irritaci´on de los ojos tambi´en han mostrado que es menos irritante que el glicol de propileno. En nuestros ejemplos hemos utilizado entre 6,6 (CBV) y 16 veces (HSV) m´as TEG que glutaraldehido. Sin embargo, los ensayos complementarios han mostrado que la eliminaci´on del olor de los aldehidos puede conseguirse mediante el uso de una proporci´on de TEG frente al glutaraldehido de igual a uno o ligermente superior. Por esta raz´ on, para llevar a la pr´ actica esta invenci´on, la cantidad de glicol de trietileno a˜ nadida a la f´ ormula maximiza la eliminaci´ on del olor. Esta cantidad ha de ser igual a, pero no menor que el porcentaje de glutaraldehido presente en la soluci´ on acuosa. Si ahora miramos los datos correspondientes a los experimentos del virus del Herpes Simple Tipo 1 (Tabla IV y V), se puede ver que el efecto virucida de mezclas de baja concentraci´on de glutaraldehido y sulfato de dodecilo s´odico es muy superior al efecto virucida a˜ nadido de cada producto qu´ımico por separado. Lo mismo ha sido demostrado anteriormente en el caso del virus Coxsackie B6 m´as resistente. Sin embargo, en el caso del HSV 1, la adici´ on de TEG a la mezcla de glutaraldehidosurfactante no increment´ o la actividad cidal de esta f´ormula pero la redujo ligeramente (Tabla VI). Von el virus Coxsackie, la mezcla ternaria que contiene el agente ani´onico siempre era m´ as virucida que el compuesto correspondiente que conten´ıa el surfactante no-i´ onico. La peque˜ na reducci´on de la acci´on virucida debida a la adici´ on de glicoles diluidos era lo bastante insignificante como para no afectar los muchos usos de estas soluciones desodorizadas. Otra importante ventaja resultante del uso de surfactantes ani´ onicos de acuerdo con esta invenci´on es el hecho que, al contrario de los no-i´ onicos y cati´ onicos, se combinan r´apidamente con los polimeros y glicoles. En el caso del glicol de polietileno, por ejemplo, S. Gravesholt ha demostrado (Proc. Scand. Symp. Surf. Active Agents 132-136, 1965) que SDS se puede enlazar f´ acilmente con esta mol´ecula. Por esta raz´on, la preparaci´ on de soluciones virucidas que contienen, por ejemplo, los tres productos qu´ımicos siguientes, glutaraldehido, glicol de trietileno, y sulfato de dodecilo s´ odico, es extremadamente f´ acil puesto que TEG y SDS se disuelven en cuesti´on de minutos en una soluci´ on acuosa de glutaraldehido a´cido bajo condiciones de agitaci´ on suave y a temperatura ambiente. Como ya se ha explicado m´ as arriba, el pH de las soluciones ternarias es muy importante ya que define (Boucher, Proc. Wets Pharmocol Soc. 16:282-288, 1973) la cantidad de mononeros de dialdehido libres y disponibles para combinaci´ on con las mol´eculas cr´ıticas de la estructura viral. Todos los experimentos llevados a cabo con soluciones con un pH superior a 7,5 o inferior a 4,2 mostraron una actividad virucida inferior. El rango preferido se mueve entre 7,2 a 4,5. Esta tendencia hab´ıa sido anteriormente observada por Saitanu y Lund cuando estudiaron la actividad de soluciones de glutaraldehido sin glicol con un 13

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virus Coxsackie B3 (Appl Microb. 29 (5):571-574 Mayo de 1975). Las sales reguladoras de los siguientes productos qu´ımicos y compuestos qu´ımicos se han utilizado con ´exito con los compuestos ternarios objeto de la presente invenci´ on: potasio monob´asico o fosfatos s´ odicos con fosfatos s´odicos dib´ asicos anhidros, ´acido maleico, a´cido c´ıtrico tris´ odico, regulador de citratofosfato, a´cido succ´ınico , regulador de cacodiacido 2etansulf´onico), a´cido sulf´onico de lato, a´cido n-(2-acetamido)iminodiac´etico, piperacina-n, n1 -bis(´ 2(n-morfolino)etano, con rangos de pKa entre 4.2 y 7.2. Dos de las principales ventajas de la f´ ormula objeto de la presente invenci´on son la eliminaci´on del olor de aldehidos y el bajo nivel de irritaci´ on al usarla de forma t´ opica. Los enlaces entre el glicol y los monomeros de aldehidos parecen ser lo suficientemente fuertes para reducir la presi´on de vapor de la soluci´on, pero no afectan en mayor medida al estado de reacci´ on de los aldehidos mientras que el contenido total de glicol de trietileno no sea mayor que del 10 al 25% sobre peso. Para evaluar el potencial de los compuestos descritos en forma de antis´eptico para la piel, hemos llevado a cabo algunos ensayos de irritaci´ on de la piel con el compuesto utilizado para el estudio del virus Coxsackie B6 (v´ease Tabla III). El m´etodo aprobado por la EPA y FDA nos permite calcular la respuesta de irritaci´ on de la piel (PSI) seguida de una simple aplicaci´ on a la piel intacta de Conejos Blancos de Nueva Zelanda. El c´ odigo de evaluaci´ on (v´ease T. Soc. Cosmet. Chem. 13 (6):281-289, 1962) va desde 0 (no-irritante) a 8,0 (extremadamente irritante). Las tres puntuaciones m´ as bajas son n-irritante (0,00-0.09), m´ınima-mente irritante (0.100.50) y ligeramente irritante (0.51-1.50). La f´ ormula de la tabla II es de la categor´ıa no-irritante. Se realiz´ o tambi´en otro estudio con la misma f´ ormula para evaluar la irritaci´on vaginal potencial con el m´etodo standard de FDA. El tratamiento de la mucosa vaginal con la f´ ormula de la Tabla II no caus´ o ninguna irritaci´ on significativa de la mucosa. En cuanto a la irritaci´ on de los ojos, utilizamos el ensayo de EPA (40 CFR 163.81-4) y la f´ormula se consider´o como no irritante despu´es de una exposici´on de 72 horas. Todos los ensayos arriba mencionados indican que las f´ ormulas virucidas altamente diluidas de la presente invenci´on tienen un nivel de toxicidad tan bajo como o incluso m´as bajo que la mayor´ıa de los antis´epticos y depuradores prep. basados en iodoforos, compuestos cuarternarios de amonio, gluconatos de clorhexidina y soluciones alcoh´olicas. Tambi´en es posible que los compuestos de la presente invenci´on contengan alcanoles inferiores como son el metanol, etanol, isopropanol y an´ alogos. Tambi´en se puede utilizar una mezcla de ambos. Estas peque˜ nas modificaciones en la composici´on del solvente dependen de la naturaleza de la aplicaci´on: descontaminaci´ on de instrumentos, superficies inanimadas o animadas, desinfecci´ on de la piel, limpieza de heridas y aplicaciones an´ alogas.

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Aunque se han descrito varios ejemplos espec´ıficos del concepto de la invenci´ on para fines de ilustraci´on, la invenci´on no se considera limitada a ´estos ni a las caracter´ısticas espec´ıficas aqu´ı mencionadas, excepto en la medida en que estos puedan quedar incluidas en las reivindicaciones adjuntas interpretados desde el punto de vista de la t´ecnico anterior correspondiente. Tambi´en se entiende que se pueden realizar cambios, modificaciones y variaciones sin alejarse del esp´ıritu y del alcance de la presente invenci´on.

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2 054 026 REIVINDICACIONES 1. Un compuesto l´ıquido libre de fenol que comprende: 5

a) un solvente consistente de agua o un alcanol inferior; b) un dialdehido que contiene de 2 a 6 a´tomos de carbono;

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c) un agente reductor del olor seleccionado del grupo compuesto por glicol de etileno, glicol de propileno, glicol de dietileno, glicol de trietileno, glicol de polietileno, glicol de polipropileno y mezclas de los mismos; d) un sufactante ani´ onico con un grupo hidr´ ofilo de carga negativa seleccionado del grupo compuesto por sulfatos de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos de alcohol, sulfonatos de arilo de alquilo, sulfosuccinatos de dialquilo y mezclas de los mismos;

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e) sales reguladores en cantidad suficiente para estabilizar el pH del compuesto dentro del rango de 4 a 7,4 20

caracterizado porque la proporci´ on sobre peso entre el surfactante ani´ onico y el dialdehido es de 1:4 a 10:11 y el peso de los compuestos de glicol es de una a 32 veces el peso del dialdehido. 2. Un compuesto seg´ un reivindicaci´ on 1, caracterizado porque dicho dialdehido es glutaraldehido.

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3. Un compuesto seg´ un reivindicaci´ on 1 ´o 2, caracterizado porque dicho surfactante ani´ onico es sulfato de dodecilo s´odico. 4. Un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cantidad m´ axima de glicol comprende del 10% al 20% sobre peso basado en el peso de la soluci´ on.

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5. Un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el solvente es agua y porque contiene sales reguladoras que pueden ajustar el pH dentro de un rango de 7,4 a 4,5 a temperatura ambiente. 6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es un compuesto virucida. 7. El uso de un compuesto que comprende: a) un solvente que consiste en agua o un alcanol inferior;

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b) un monoaldehido saturado o dialdehido que contiene de 2 a 6 a´tomos de carbono; c) un surfactante ani´ onico con un grupo hidr´ ofilo de carga negativa seleccionado del grupo compuesto de slufatos de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos de alcohol, sulfonatos de arilo de alquilo, sulfosuccinatos de dialquilo y mezclas de los mismos; d) sales reguladoras en cantidad suficiente para estabilizar el pH del compuesto dentro de un rango de 4 a 7,4, caracterizado porque la proporci´ on sobre peso del surfactante ani´ onico frente al dialdehido es de 1:4 a 10:11

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para desactivar virus de una superficie animada o inanimada. 8. El uso de un compuesto seg´ un reivindicaci´ on 7, caracterizado porque (b) es un dialdehido.

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9. El uso de un compuesto seg´ un reivindicaci´ on 8, caracterizado porque dicho dialdehido es glutaraldehido. 10. El uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque dicho surfactante ani´ onico es un alquilsulfato o dodecilsulfato s´ odico.

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11. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque dicho compuesto comprende adem´ as un agente reductor del olor seleccionado del grupo compuesto por glicol de etileno, glicol de propileno, glicol de dietileno, glicol de trietileno, glicol de polietileno, glicol 15

2 054 026 de polipropileno y mezclas de los mismos; 12. El uso de un compuesto seg´ un reivindicaci´ on 11, caracterizado porque dicho agente reductor del olor es glicol de trietileno. 5

13. El uso de un compuesto seg´ un reivindicaci´ on 11 o´ 12, caracterizado porque la cantidad m´ axima de glicol es del 10% al 20% sobre peso basada en el peso de la soluci´on.

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14. El uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque el peso de los compuestos de glicol frente al dialdehido es de una proporci´ on de 1 a 32. 15. El uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, caracterizado porque dicho compuesto est´ a regulado en el rango del pH de 6.2 a 6.4.

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16. El uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, caracterizado porque incluye la aplicaci´on de dicho compuesto a una superficie inanimada contaminada por virus. 17. El uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, caracterizado porque incluye la destrucci´on de los virus por la limpieza de la piel contaminada con dicho compuesto.

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18. El uso de un compuesto seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, caracterizado porque incluye la limpieza de una herida contaminada de virus mediante la aplicaci´on a la misma de dicho compuesto. 25

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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