19

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 227 048

51 Int. Cl. : A61K 35/84

7

A61P 35/00 A61P 31/12 A61P 31/18

ESPAÑA

12

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 01128539 .2

86 Fecha de presentación: 29.11.2001

87 Número de publicación de la solicitud: 1245235

87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.10.2002

54 Título: Método para extraer sustancias oleaginosas de esporas de Ganoderma lucidum.

30 Prioridad: 19.03.2001 US 810234

19.03.2001 US 810213

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.04.2005

73 Titular/es: Xin Liu

Building nº 391, 135 Xingang Xi Road Guangzhou, CN Xiao-Ni Huang y Peter Chee-Keung Chung 72 Inventor/es: Liu, Xin;

Huang, Xiao-Ni y Chung, Peter Chee-Keung

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Gil Vega, Víctor

ES 2 227 048 T3

01.04.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 227 048 T3 DESCRIPCIÓN Método para extraer sustancias oleaginosas de esporas de Ganoderma lucidum. 5

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para extraer sustancias oleaginosas de esporas de Ganoderma lucidum mediante la utilización de fluido dióxido de carbono supercrítico (SCF-CO2 ). Las esporas se activan por germinación y su parte externa (epispora) se rompe antes de la extracción de SCF-CO2 .

10

Antecedentes de la invención

15

20

El Ganoderma (Ganoderma lucidum Leyss ex Fr. Karst) es un hongo Polyporus. Pertenece a la clase de los Basidiomicetos, familia Polyporaceae y género Ganoderma. En la medicina tradicional china, la Ganoderma ha sido considerada como una panacea, probablemente debido a cierta eficacia de la Ganoderma en el tratamiento de muchas enfermedades. Algunos de sus efectos medicinales o terapéuticos conocidos incluyen el tratamiento de los pacientes con bronquitis crónica, hepatitis viral crónica, enfermedades coronarias, granulocitopenia, enfermedad de Keshan crónica, neurastenia, distrofia muscular progresiva, miotonía atrófica y algunas enfermedades neurológicas (véase por ejemplo, Liu y col., Chinese Medical Journal, 92:496-500 (1979)). Existen también diversas referencias a la Ganoderma como agente anti-VIH (ver por ejemplo, El-Mekkawy y col., Phytochemistry, 49:1651-1657 (1998); Min y col., Chem. Pharm. Bull, 46:1607-1612 (1998)), o en referencia a actividad antitumoral, cardiovascular, antivírica, antibacteriana, antiparasitaria, e inmunológica (ver por ejemplo, Wasser y col., Critical Review in Immunology, 19:65-96 (1999)).

25

Existen dos tipos principales de compuestos encontrados en Ganoderma que se ha demostrado están asociados a sus efectos medicinales o terapéuticos. Son los compuestos polisacáridos y los terpenoides. Los compuestos polisacáridos son esencialmente hidrosolubles. Los terpenoides son sustancias oleaginosas y, en general, insolubles en agua.

30

Los compuestos polisacáridos aislados de Ganoderma incluyen hetero-β-glucanos y sus complejos proteínicos (como xiloglucano y ácido urónico que contiene β-glucanos ácidos, fibras dietéticas, lecitinas). Se ha informado que los polisacáridos encontrados en Ganoderma poseían efectos antitumorales y de modulación inmunológica (ver Wasser y col., supra).

35

Los terpenoides de Ganoderma contienen un esqueleto de lanosterol. Se clasifican en varios grupos según su número de carbonos y su estado de oxidación (Komoda y col., Chem. Pharm. Bull., 33: 4829-4835 (1985)). Estos terpenoides de Ganoderma incluyen triterpenos del tipo lanosterol (por ejemplo, los ácidos ganodéricos A, B, C1 , C2 , D1 , D2 , E1 , E2 , F, G, H, I, J, K1 , K2 , L, Ma Mb, Mc, Md, Me, Mf, Mg, Mi, Mj, Mk, Mn, N, O, P, Q, S, T, U, V, W, X, Y, y Z), ácido O 7-O-metilganodérico, ácido T trideacetilganodérico, ácidos ganoderénicos A, B, C, D, E, F, G, H, I, ácidos ganolucídicos A, B, C, D, y E, ácidos lucidénicos A, B, C, D1 , D2 , E1 , E2 , F, G, H, I, J, K, L, M, ganoderiol tipo 1 (A, B, F) y tipo 2 (C, D, E, F, G, H, e I), ganoderal A y B, epoxiganoderiol A, B, C, lucidona A, B, C, ácido furanoganodérico, y demás componentes terpenoides. Se ha informado que los terpenoides de Ganoderma (por ejemplo, los ácidos ganodéricos R, T, U-Z) inhiben el crecimiento de células de hepatoma in vitro (ver Toth y col., Tetrahedron Lett., 24: 1081-1084 (1983).

40

45

50

Las esporas de Ganoderma son esporas ovaladas minúsculas de color marrón similares al polvo de 6-7 µm x 10-12 µm de tamaño que se liberan en el punto álgido de maduración de Ganoderma lucidum. Estas esporas contienen todos los materiales genéticos así como las sustancias biológicas de Ganoderma. Sin embargo, las esporas de Ganoderma silvestre son difíciles de recoger, particularmente debido a su corto período de liberación, a su bajo porcentaje de germinación y a su baja producción en condiciones ambientales desfavorables. Por tanto, aunque se sepa que las esporas de Ganoderma tienen un valor farmacéutico mayor que los cuerpos fructíferos de Ganoderma, debido a las dificultades asociadas a la recogida de sus esporas, la mayoría de los estudios sobre Ganoderma se realizan utilizando sus cuerpos fructíferos.

55

Las sustancias biológicas del interior de las esporas de Ganoderma, responsables de sus efectos terapéuticos, se almacenan dentro de las episporas de doble capa de Ganoderma lucidum. Sin embargo, estas episporas tienen una estructura compacta extremadamente rígida y resistente. Por tanto, resulta muy difícil romper las capas de episporas de las esporas de Ganoderma y liberar las sustancias biológicas mediante métodos de extracción convencionales.

60

Existen diversos estudios sobre los métodos de ruptura de las episporas de las esporas de Ganoderma. Por ejemplo, la Patente Japonesa Nº JP52041208 muestra un método de extracción para romper las esporas de Ganoderma mediante fuerzas mecánicas. La Patente China Nº CN1134306 presenta un método para romper la esporodermis de las esporas de Ganoderma poniendo las esporas en remojo en agua y seguidamente su calentamiento por microondas. La Patente China Nº CN1165032 describe un método para romper la pared celular de las esporas de Ganoderma lucidum mediante digestión de tales esporas con enzimas disolventes de la piel como lisozimas, enzimas Snail, celulasas, o hemicelulasas, y posterior fractura ultrasónica de las paredes celulares a 20-50ºC.

65

Sin embargo, estos métodos emplean un conjunto mezcla de esporas recogidas en diferentes etapas del ciclo vital 2

ES 2 227 048 T3 de Ganoderma. Se sabe que las esporas en diferentes etapas de su ciclo vital producen diferentes tipos y/o proporciones de sustancias biológicas, que pueden poseer o no un alto nivel de efectos terapéuticos tal como se espera. Por tanto, las esporas con su esporodermis rota obtenidas con estos métodos muestran resultados contradictorios y sus diferentes efectos medicinales varían. 5

10

También existen estudios de aislamiento o separación de las sustancias oleaginosas (por ejemplo, terpenoides) procedentes de Ganoderma, la mayoría de ellos implican la utilización de disolventes orgánicos. Por ejemplo, Min y col., Chem. Pharm. Bull., supra, muestra el aislamiento de triterpenos de tipo lanosterol mediante cromatografía de columna de una fracción soluble en CHCl3 del extracto de metanol de esporas de Ganoderma. En Lin y col., J. Chromatography, 410: 195-200 (1987) se muestra la separación de triterpenoides oxigenados procedentes de Ganoderma lucidum mediante cromatografía líquida de alta resolución de un extracto metanólico de Ganoderma lucidum. Estos métodos no son satisfactorios debido a la complejidad de los procedimientos de extracción y al escaso rendimiento en la producción de sustancias oleaginosas.

15

En Derwent AN 2000-639170 se describe un método para extraer sustancias oleaginosas a partir de esporas de Ganoderma que comprende la extracción de dichas sustancias oleaginosas mediante un método de extracción que emplea dióxido de carbono fluido supercrítico (SCF-CO2 ) para obtener aceite de esporas de Ganoderma y polvo de esporas de Ganoderma desgrasado.

20

En los artículos de B.S. Min y col., publicados en Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 48, Nº 7, pp. 10261033 y Vol. 46, Nº 10, pp. 1607-1612, respectivamente, se aíslan triterpenos de tipo lanosterol específicos, donde tales triterpenos se obtienen mediante un método de extracción utilizando disolventes orgánicos con el fin de producir una fracción soluble en CHCl3 .

25

La EP 1.092.765 describe cómo activar la germinación de esporas de Ganoderma, donde la extracción de las sustancias bioactivas se lleva a cabo por condensación en agua, alcohol o en capa delgada.

30

35

En la presente invención, se proporciona un método para extraer las sustancias oleaginosas de esporas de Ganoderma. Las esporas de Ganoderma que se deben utilizar en la presente invención son de germinación activada para asegurar la máxima producción de sustancias biológicas. Las episporas de las esporas Ganoderma de germinación activada se rompen por medios mecánicos para liberar las sustancias biológicas. Las sustancias oleaginosas de las sustancias biológicas se separan de las demás mediante un método de extracción con dióxido de carbono fluido supercrítico (SCF-CO2 ). La presente invención tiene la ventaja de obtener una gran producción de sustancias oleaginosas procedentes de Ganoderma (es decir, el rendimiento de sustancias oleaginosas es aproximadamente del 37% en peso de la totalidad de sustancias biológicas liberadas a partir de Ganoderma). Las sustancias oleaginosas aisladas obtenidas según el presente método presentan una fragancia especial de Ganoderma, indicativo de no-oxidación, y están libres de trazas residuales de disolventes, de olores extraños ni depósitos. Sumario de la invención

40

La presente invención proporciona un método para extraer sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma lucidum según la reivindicación 1. Las realizaciones preferentes del método de acuerdo con la invención vienen definidas en las sub-reivindicaciones. La presente invención proporciona además los productos definidos en las reivindicaciones 21 a 24, así como las utilizaciones tal como se definen en las reivindicaciones 25 a 28. 45

La presente invención proporciona métodos para extraer las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma con esporodermis fracturada mediante la utilización de un método de extracción por dióxido de carbono fluido supercrítico (SCF-CO2 ). Las esporas de Ganoderma son de germinación activada y con esporodermis fracturada antes de la extracción. 50

55

60

65

Para obtener las esporas Ganoderma de germinación activada, primero se ponen en remojo las esporas de Ganoderma en una solución nutritiva adecuada para inducir la germinación. La solución nutritiva con propósitos de germinación incluye, pero no se limita a, una solución del cuerpo fructífero de Ganoderma inmerso, una solución de biotina, agua, y una solución del micelio de Ganoderma inmerso. La solución del cuerpo fructífero de Ganoderma o del micelio de Ganodermma inmersos es, preferentemente, del 0,5 al 25% en peso; la solución preferente de biotina es del 0,1 al 0,5% en peso. La relación entre el volumen de solución nutritiva y el peso de las esporas de Ganoderma es aproximadamente de 0,01 a 5. El tiempo a permanecer en remojo preferente es de entre 10 minutos y 10 horas. La temperatura de remojo preferente se sitúa entre 16ºC y 43ºC. Las esporas de Ganoderma de germinación inducida se activan colocando las esporas remojadas en una caja de cultivo bien ventilada. La humedad relativa preferente es del 60% al 98%. La temperatura preferente es de 16ºC a 43ºC. El período de activación preferente se encuentra entre 10 minutos y 24 horas. La rotura de las episporas de las esporas de Ganoderma se puede conseguir aplicando a las esporas ciertos medios mecánicos. Los medios mecánicos preferentes incluyen, sin limitación, micronización, corriente de aire de alta velocidad, corte con tijeras/trituración y microflujo de alta presión. Opcionalmente las esporas Ganoderma de germinación activada se pueden incubar con enzimas como quitinasa y/o celulasa para ablandar las paredes celulares de dichas esporas antes de ser aplicados los medios mecánicos. 3

ES 2 227 048 T3

5

La extracción de las sustancias oleaginosas de las esporas Ganoderma de germinación activada y con su esporodermis fracturada se lleva a cabo mediante extracción en dióxido de carbono fluido supercrítico (SCF-CO2 ). El método incluye las etapas de: (1) colocar las esporas en un recipiente a presión; (2) poner en contacto el SCF-CO2 con las esporas en el recipiente a presión; y (3) despresurizar el recipiente a presión para recoger las sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma. La presión en el recipiente a presión es, preferentemente, de entre 5 M Psia (Pa) y 60 M Pa. La temperatura en el recipiente a presión se mantiene, preferentemente, a 32ºC hasta 85ºC. La capacidad de flujo preferente del recipiente a presión se sitúa entre 5 kg/h y 80 kg/h. El tiempo de extracción preferente oscila entre 30 minutos y 6 horas.

10

Opcionalmente, las esporas Ganoderma con esporodermis fracturada se mezclan con un vehículo, como agua o etanol al 85% hasta el 100%, antes de colocarlas en el recipiente a presión. La proporción de vehículo con respecto a las esporas de Ganoderma preferente es del 2% al 200% en peso. Es preferible que las sustancias oleaginosas se separen del vehículo por centrifugación.

15

El método de extracción por SCF-CO2 produce sustancias oleaginosas procedentes de esporas de Ganoderma, que son aproximadamente el 37% del peso total de las esporas Ganoderma. Las sustancias oleaginosas son transparentes y presentan una fragancia especial de las esporas de Ganoderma. No existen trazas de depósitos, de disolventes residuales o de oxidación en las sustancias oleaginosas.

20

Las sustancias oleaginosas extraídas de las esporas Ganoderma de esporodermis fracturada poseen efectos medicinales que incluyen, sin limitación, efectos antitumorales, anti-VIH o VHB y ante trastornos inmunológicos. Pueden utilizarse en el tratamiento de pacientes con tumores, infección de VIH o VHB y en caso de trastornos inmunológicos. Descripción detallada de la invención

25

30

35

40

La presente invención proporciona un método de extracción para aislar y separar las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma mediante la utilización de un SCF-CO2 . La cantidad de sustancias oleaginosas producidas por este método constituían aproximadamente el 37% del peso total de las esporas. Además, las sustancias oleaginosas producidas por este método se preservaron bien en su estado natural (es decir, en ausencia de disolventes residuales y sin olor extraño). El olor extraño es una indicación de que las sustancias oleaginosas se han oxidado. Convencionalmente, los métodos para extraer o separar las sustancias de una mezcla incluyen extracción por destilación y en disolvente. La destilación separa las sustancias de una mezcla según las características de ebullición de cada sustancia. La extracción en disolvente separa las sustancias de una mezcla según las propiedades hidrofílicas y lipofílicas de cada sustancia. La destilación no puede utilizarse cuando las sustancias a separar son térmicamente inestables. La extracción en disolvente tiene una utilidad limitada cuando las sustancias a separar son tan similares en su solubilidad que no se puede conseguir una separación eficaz. La tecnología de fluidos supercríticos (SCFs) es una alternativa viable a los métodos de extracción convencionales. Los SCFs se denominan a menudo gases densos. Técnicamente, un SCF es un gas que existe por encima de su temperatura crítica y de su presión crítica. Cuando se comprime un gas por encima de su temperatura crítica, la densidad se incrementa dramáticamente. Por tanto, en determinadas condiciones establecidas, un SCF puede poseer la densidad de un líquido al mismo tiempo que mantiene la difusividad de un gas.

45

Cada gas tiene una presión crítica (Pc) y una temperatura crítica (Tc), por encima de cada una de las cuales se alcanza un estado de fluido supercrítico. Se ha descubierto que las propiedades disolventes de estos SCFs son función compleja de la densidad del fluido, que a su vez es una función compleja de la temperatura y de la presión. Así, variando la temperatura y la presión de un fluido supercrítico pueden llevarse a cabo extracciones y precipitaciones.

50

Se ha comprobado que el dióxido de carbono es un gas particularmente ventajoso para ser utilizado en extracciones SCF porque posee buenas propiedades de disolución y tiene una reactividad y toxicidad químicas bajas. Además, el dióxido de carbono no es inflamable, es barato y puede reciclarse fácilmente, y no deja ningún residuo indeseable en los precipitados. El dióxido de carbono tiene una Pc de 73,8 bar, una Tc de 31,1ºC y una densidad con estas Pc y Tc de 0,468 g/cc.

55

60

65

Utilizando SCF-CO2 , cualquier material en una mezcla que exista o que pueda convertirse en un estado físico que sea permeable al dióxido de carbono en condiciones supercríticas se disolverá en el dióxido de carbono y se separará de la mezcla. El principio detrás del método de extracción por SCF-CO2 es que, bajo las altas presiones necesarias para la extracción con gases en el fluido supercrítico, se incrementa la solubilidad de muchos compuestos orgánicos. Esto junto con una mayor difusividad del fluido supercrítico en los disolventes convencionales resulta en una transferencia de masa más rápida a través del material a extraer, y así una mayor velocidad de extracción. Los gases de fluidos supercríticos tienen la capacidad de disolverse de manera selectiva y de extraer especies orgánicas de mezclas orgánicas, mezclas organicoacuosas, matrices orgánicas/inorgánicas, y matrices lipofílicas/ hidrofílicas. Teóricamente, cuanto más alta es la presión, más alta es la eficacia de la extracción. Esencialmente, la mayoría o todas las sustancias oleaginosas (con escasa solubilidad en agua) de las esporas de Ganoderma deberían disolverse en el dióxido de carbono. Las minúsculas esporas de Ganoderma lucidum tienen una epispora de doble capa extremadamente dura y resis4

ES 2 227 048 T3 tente. En la naturaleza, la germinación de las esporas del Ganoderma lucidum es relativamente lenta y su velocidad de germinación es extremadamente baja. Los tubos germinales de las esporas tardan aproximadamente de 24 a 48 horas en empezar a brotar en condiciones apropiadas, y los capilicios empiezan a formar ramificaciones a las 72 horas, con un índice de germinación del 3-15% solamente. 5

Cuando se extrajeron las esporas minúsculas de Ganoderma lucidum en SCF-CO2 , solo se recuperó el 3,5% aproximadamente de sustancias oleaginosas. 10

15

20

25

30

Con el fin de maximizar la producción de sustancias oleaginosas a partir de Ganoderma lucidum, se diseñó un proceso de rotura de la esporodermis para romper las paredes celulares de las episporas de Ganoderma así como un procedimiento para activar la germinación. Este procedimiento fue seguido por un proceso de rotura de la esporodermis para romper las paredes celulares de las episporas de Ganoderma. Finalmente, las esporas Ganoderma de germinación activada y de esporodermis fracturada se extrajeron en SCF-CO2 para separar las sustancias oleaginosas de las esporas. Se observó que cuando se activaba la germinación de las esporas inactivas de Ganoderma, la velocidad de producción de las sustancias biológicas en las esporas alcanzaba su máximo. Estas sustancias biológicas contienen, entre otros, genes y promotores activos, enzimas activas, esteroles, citoquinas, interferones, lactona A, ácido A de ganodermis, triterpenos, polisacáridos, vitaminas, superóxido dismutasas (SOD), glicoproteínas, etc. Estas sustancias biológicas presentan unos efectos medicinales excelentes, particularmente referidos a la estimulación y modulación del sistema nervioso y del sistema inmunológico. Estas sustancias biológicas presentan también efectos terapéuticos frente al cáncer hepático y la infección por VHB. Asimismo, se observó que durante el período de activación de la germinación, la resistencia de la epispora se reducía de manera significativa, lo cual, a su vez, incrementaba la velocidad de penetración de las paredes celulares de la epispora. Los resultados de los estudios clínicos y con animales referentes al efecto de la activación de la germinación mostraron que las sustancias biológicas producidas a partir de esporas Ganoderma de germinación activada presentaban efectos inhibitorios sobre el cáncer de hígado mediante la supresión de la actividad telomerasa en el tejido hepático canceroso. Estas sustancias biológicas mostraron también efectos terapéuticos sobre la infección por VHB. Además, cuando se administraron las esporas Ganoderma de germinación activada a los animales, los resultados mostraron que las esporas con esporodermis no rota tenían un índice antitumoral del 23,2%, lo que era sustancialmente inferior a las esporas con esporodermis fracturada que tenían un índice antitumoral del 86,1%. El método de extracción de la presente invención se describe como sigue:

35

1. Recogida de esporas de Ganoderma

40

Se recogieron esporas maduras y gordas de Ganoderma en el momento adecuado de liberación procedentes de Ganoderma lucidum cultivado sobre un tronco. Resultaba ventajoso cultivar el Ganoderma en un tronco porque las esporas así producidas eran más frescas y más nutritivas y porque el índice de penetración/rotura para las episporas era mucho más alto. 2. Inducción de la germinación de las esporas de Ganoderma

45

50

55

60

Después de recoger las esporas de Ganoderma, se pudo romper directamente las esporas con medios mecánicos como en la etapa 4 posterior y luego extraerlas. Alternativamente, se indujo las esporas a que germinaran y se activaran como en las etapas 2 y 3 antes de que las esporas se rompieran por fuerzas mecánicas. Se remojaron las esporas seleccionadas en una solución nutritiva que podía ser de agua destilada, una solución salina, una solución donde se habían sumergido los cuerpos fructíferos de Ganoderma o sus micelios. El objetivo de remojar las esporas en la solución nutritiva era permitir y acelerar la germinación de las mismas. Ejemplos de soluciones nutritivas son del 0,5∼25% en peso de una solución con los cuerpos fructíferos o micelios de Ganoderma inmersos, del 0,1-0,5% en peso de una solución de biotina, etc. La solución nutritiva era aproximadamente de 0,01 a 5 veces el peso de las esporas de Ganoderma. El tiempo de remojo fue aproximadamente de 10 minutos ∼ 8 horas. La temperatura era de aproximadamente 16∼43ºC. 3. Activación de las esporas germinadas de Ganoderma Para activar las esporas germinadas de Ganoderma, se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se dejó gotear el exceso de solución. Las esporas remojadas se colocaron entonces en una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a temperatura y humedad constantes. La humedad relativa en la caja de cultivo se mantuvo aproximadamente al 60∼98%. La temperatura de la caja de cultivo se mantuvo aproximadamente a 16∼48ºC. El tiempo de activación de las esporas fue aproximadamente de 10 minutos∼24 horas. 4. Penetración/ruptura de las episporas

65

Después de activar la germinación de las esporas de Ganoderma, se rompieron las esporas mediante medios mecánicos. Ejemplos de medios mecánicos para romper la esporas incluyen micronización, prensado con rodillos, o corte con tijeras/molienda, trituración por impacto de microflujo, trituración por impacto de corriente de aire a alta velocidad, trituración por microflujo a alta presión, trituración a baja temperatura, etc. 5

ES 2 227 048 T3 Antes de romper las episporas, opcionalmente se podía tratar las esporas con enzimas como quitinasa y celulasa para ablandar las paredes celulares de las episporas. Las esporas tratadas con enzimas podían separarse de la mezcla de reacción por centrifugación aproximadamente a 3.000∼30.000 rpm o por ultrafiltración utilizando un filtro de corte de peso molecular de 10.000. 5

5. Extracción de las sustancias oleaginosas con SCF-CO2

10

15

La extracción de las sustancias oleaginosas de las esporas con esporodermis fracturada se realizó en un dispositivo de extracción con SCF-CO2 , que incluía una fuente de CO2 , un compresor, un intercambiador de calor, un regulador de presión y un recipiente a presión. Como alternativa, cualquier equipo convencional de extracción con fluido supercrítico que contenga un extractor (es decir, un recipiente a presión) y un separador también es adecuado para la extracción. Para la operación, las esporas con su esporodermis rota se colocaron en el recipiente a presión. Se dejó circular el dióxido de carbono por el compresor y el intercambiador de calor para conseguir una temperatura y una presión superiores a las supercríticas, y luego se dejó fluir por las esporas del recipiente a presión. Posteriormente se eliminó el SCF del recipiente a presión y se despresurizó para que se evaporase el dióxido de carbono. La presión supercrítica utilizada en el presente método fue aproximadamente de 5∼60 M Pa. La temperatura supercrítica en el presente método fue aproximadamente de 32∼85ºC. El flujo en volumen de CO2 era aproximadamente de 5∼80 kg/h. El tiempo de extracción fue aproximadamente de 0,5∼6 horas.

20

Opcionalmente, se podía añadir a las esporas un vehículo entre la iniciación de la extracción en CO2 . Ejemplos de vehículos son agua o etanol al 85 a 100%. La proporción de vehículo con respecto a las esporas era aproximadamente del 2∼200% (volumen/peso). Cuando se añadió el vehículo a las esporas, las sustancias oleaginosas pudieron separarse del resto de esporas mediante centrifugación aproximadamente a 3.000∼30.000 rpm.

25

Ejemplo 1 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación:

30

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 2 kg de una solución de inmersión con el 5% de cuerpos fructíferos de Ganoderma y 150 kg de una disolución salina (NaCl 0,15M). Se remojaron las esporas en la solución nutritiva durante 6 horas a 32ºC.

35

40

3. Se sacaron las esporas remojadas de Ganoderma de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura constante de 34ºC y a una humedad relativa del 90%. Las esporas se mantuvieron en la caja de cultivo durante 3 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas de germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 4. Se micronizaron las esporas de germinación activada de Ganoderma. Se controlaron las esporas con el microscopio. El índice de penetración/rotura de las episporas alcanzó el 99,6% después de este tratamiento.

45

5. Se colocaron las esporas de Ganoderma con sus episporas rotas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . La presión supercrítica se mantuvo a 45 M Pa y la temperatura supercrítica fue de 53ºC. El caudal en volumen de CO2 se mantuvo a 60 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 1,5 horas. Resultados

50

Este método proporcionó aproximadamente 37 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. 55

Ejemplo 2 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 60

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 20 kg de una solución de biotina al 1% y 250 kg de agua destilada. Se remojaron las esporas en la solución nutritiva durante 3 horas a 43ºC. 65

3. Se sacaron las esporas remojadas de Ganoderma de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 18ºC y a una humedad relativa del 60%. Las esporas se mantuvieron en la caja de cultivo durante 24 horas. En estas condiciones, el índice de 6

ES 2 227 048 T3 germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 5

4. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 5 g de quitinasa, 10 g de celulosa y 150 kg de agua destilada (a un pH de 6,8). La reacción se realizó a una temperatura de 43ºC durante 1,5 horas. Al final de la reacción, las episporas habían perdido su resistencia.

10

5. Las esporas se micronizaron mediante trituración. Se controlaron las esporas con el microscopio. El índice de penetración/rotura de las episporas alcanzó el 99,6% después de este tratamiento. Las esporas de esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante centrifugación a 3.000 rpm.

15

6. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Como vehículo se añadieron a las esporas diez (10) kg de etanol al 90%. La presión supercrítica se mantuvo a 40 M Pa y la temperatura supercrítica era de 32ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 15 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 5 horas. 7. Después de la extracción por SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 6.000 rpm.

20

Resultados

25

Este método proporcionó aproximadamente 36,9 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 36,9% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 3

30

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma.

35

2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 200 kg de agua destilada. Las esporas se remojaron en esta solución durante 8 horas a 16ºC.

40

3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 48ºC y a una humedad relativa del 98% durante 10 minutos. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 4. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 10 g de quitinasa, 20 g de celulosa, y 200 kg de agua destilada (a un pH de 6,8). La reacción se realizó a una temperatura de 38ºC durante 3,0 horas. Al final de la reacción, las episporas habían perdido su resistencia.

45

5. La esporodermis de las esporas se rompió mediante apisonado/prensado con trituración. Se controlaron las esporas con el microscopio. Las esporas con esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante ultrafiltración. 50

6. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . La presión supercrítica se mantuvo a 60 M Pa y la temperatura supercrítica era de 48ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 5 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 4,5 horas. Resultados

55

Este método proporcionó aproximadamente 36,9 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 36,9% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. 60

Ejemplo 4 Se extrajeron las sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 65

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 10 kg de una solución con los cuerpos fructíferos 7

ES 2 227 048 T3 de Ganoderma inmersos, 10 kg de una solución de biotina al 0,1%, y 200 kg de agua destilada. Se remojaron las esporas en esta solución durante 30 minutos a 25ºC. 5

10

15

3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 16ºC y a una humedad relativa del 80% durante 24 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 4. Se utilizó una corriente de aire de muy alta velocidad para romper las episporas de las esporas. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. Aproximadamente un 99,6% de las esporas se rompieron en estas condiciones. 5. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron cincuenta (50) kg de etanol al 100% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 10 M Pa y la temperatura supercrítica era de 85ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 80 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 6 horas. 6. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo mediante centrifugación a 20.000 rpm.

20

Resultados

25

Este método proporcionó aproximadamente 37 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 5

30

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma.

35

40

45

2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 50 kg de una solución al 5% de micelios de Ganoderma inmersos y 5 kg de una solución de biotina al 0,1%. Se remojaron las esporas en esta solución durante 5 horas a 38ºC. 3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 30ºC y a una humedad relativa del 70% durante 1,5 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 4. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 20 g de quitinasa y 180 kg de agua destinada (a un pH de 6,4). La reacción se realizó a una temperatura de 38ºC durante 4,0 horas. Al final de la reacción, las episporas habían perdido su resistencia.

50

5. Se rompieron las esporas mediante corte con tijeras/molienda. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones, se rompieron aproximadamente el 99,6% de las esporas. Las esporas con su esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante centrifugación a 15.000 rpm.

55

6. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron cincuenta (50) kg de agua destilada como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 55 M Pa y la temperatura supercrítica era de 55ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 42 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 2 horas. 7. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo mediante centrifugación a 20.000 rpm.

60

Resultados

65

Este método proporcionó aproximadamente 37 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas.

8

ES 2 227 048 T3 Ejemplo 6 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 5

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma.

10

2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 5 kg de una solución del 20% de cuerpos fructíferos de Ganoderma inmersos y 150 kg de agua destilada. Se remojaron las esporas en esta solución durante 2 horas a 28ºC.

15

3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 40ºC y a una humedad relativa del 65% durante 3 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 4. Las episporas de las esporas se rompieron mediante micronización. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones, se rompieron aproximadamente el 99,7% de las esporas.

20

5. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron doscientos (200) kg de etanol al 95% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 55 M Pa y la temperatura supercrítica era de 68ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 70 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 2 horas.

25

6. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo mediante centrifugación a 20.000 rpm. Resultados

30

Este método proporcionó aproximadamente 37 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas.

35

Ejemplo 7 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación:

40

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 20 kg de una solución al 25% de micelios de Ganoderma inmersos y 150 kg de agua destilada. Se remojaron las esporas en esta solución durante 6 horas a 22ºC.

45

3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 26ºC y a una humedad relativa del 75% durante 4 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 50

4. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 20 g de celulasa y 250 kg de agua destilada (con un pH de 5,6). La reacción se realizó a una temperatura de 45ºC durante 2 horas. Al final de la reacción, las episporas había perdido su resistencia. 55

60

5. Las esporas se rompieron mediante apisonado/prensado. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones, se rompieron aproximadamente el 99,7% de las esporas. Las esporas con su esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante centrifugación a 15.000 rpm. 6. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . La presión supercrítica se mantuvo a 55 M Pa y la temperatura supercrítica era de 70ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 60 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 0,5 horas. Resultados

65

Este método proporcionó aproximadamente 36,9 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 36,9% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. 9

ES 2 227 048 T3 Ejemplo 8 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 5

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 20 kg de una solución de biotina al 1% y 150 kg de agua destilada. Se remojaron las esporas en esta solución durante 2 horas a 40ºC. 10

3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 18ºC y a una humedad relativa del 88% durante 12 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 15

4. Las episporas de las esporas se rompieron mediante corte con tijeras/molienda. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones, se rompieron aproximadamente el 99,9% de las esporas. 20

25

5. Se colocaron luego las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron setenta (70) kg de etanol al 95% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 10 M Pa y la temperatura supercrítica era de 38ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 18 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 4 horas. 6. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 15.000 rpm. Resultados

30

Este método proporcionó aproximadamente 37 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 9

35

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 40

2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 250 kg de agua destilada. Se remojaron las esporas en esta solución durante 10 horas a 34ºC. 45

50

3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 31ºC y a una humedad relativa del 80% durante 2 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 4. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 10 g de quitinasa y 250 kg de agua destilada (con un pH de 6,8). La reacción se realizó a una temperatura de 44ºC durante 2 horas. Al final de la reacción, las episporas había perdido su resistencia.

55

5. Las esporas se rompieron mediante micronización/prensado. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones, se rompieron aproximadamente el 99,9% de las esporas. Las esporas con esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante centrifugación a 30.000 rpm.

60

6. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron dos (2) kg de agua destilada como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 14 M Pa y la temperatura supercrítica era de 45ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 12 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 2 horas. 7. Después de la extracción por SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 30.000 rpm.

65

Resultados Este método proporcionó aproximadamente 36,8 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 36,8% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las 10

ES 2 227 048 T3 esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 10 5

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 10

2. Se añadió a las esporas una solución nutritiva que contenía 200 kg de una solución salina. Se remojaron las esporas en esta solución durante 6 horas a 22ºC. 15

20

25

3. Se sacaron las esporas remojadas de la solución nutritiva y se colocaron dentro de una caja de cultivo bien ventilada que se mantuvo a una temperatura de 34ºC y a una humedad relativa del 75% durante 5 horas. En estas condiciones, el índice de germinación de las esporas fue del 95% y las paredes celulares de las esporas con germinación activada mostraron claros indicios de ablandamiento. 4. Las episporas de las esporas se rompieron mediante microflujo a muy alta presión. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,9% de las esporas. 5. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron sesenta y cinco (65) kg de etanol al 85% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 14 M Pa y la temperatura supercrítica era de 40ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 25 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 1 hora. 6. Después de la extracción por SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 8.000 rpm.

30

Resultados

35

Este método proporcionó aproximadamente 37 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 11

40

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma.

45

50

2. Se micronizaron las esporas de Ganoderma. Se controlaron las esporas con un microscopio. El índice de penetración/rotura de las episporas alcanzó un 99,6% después del tratamiento. 3. Se colocaron las esporas de Ganoderma con las episporas rotas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . La presión supercrítica se mantuvo a 35 M Pa y la temperatura supercrítica era de 50ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 25 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 3,0 horas. Resultados

55

Este método proporcionó aproximadamente 37 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 12

60

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 65

2. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 10 g de quitinasa, 20 g de celulosa y 200 kg de agua destilada (a un pH de 6,2). La reacción se realizó a una temperatura de 45ºC durante 1 hora. Al final de la reacción, las episporas habían perdido su resistencia. 11

ES 2 227 048 T3 3. Se micronizaron las esporas mediante trituración. Se controlaron las esporas con un microscopio. El índice de penetración/rotura de las episporas alcanzó el 99,9% después de este tratamiento. Las esporas con la esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante centrifugación a 3.000 rpm. 5

4. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron a las esporas diez (10) kg de etanol al 90% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 30 M Pa y la temperatura supercrítica era de 41ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 5 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 5 horas.

10

5. Después de la extracción por SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 3.000 rpm. Resultados

15

Este método proporcionó aproximadamente 37,1 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,1% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas.

20

Ejemplo 13 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación:

25

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 2. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 20 g de quitinasa, 10 g de celulosa y 250 kg de agua destilada (a un pH de 6,5). La reacción se realizó a una temperatura de 48ºC durante 2 horas. Al final de la reacción, las episporas habían perdido su resistencia.

30

3. La esporodermis de las esporas se rompió por apisonado/prensado con trituración. Se controlaron las esporas con un microscopio. Las esporas con la esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante ultrafiltración. 35

4. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . La presión supercrítica se mantuvo a 40 M Pa y la temperatura supercrítica era de 32ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 10 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 4 horas. Resultados

40

Este método proporcionó aproximadamente 37,3 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,3% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. 45

Ejemplo 14 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 50

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma.

55

2. Se utilizó una corriente de aire a muy alta velocidad para romper las episporas de las esporas. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,6% de esporas.

60

3. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron veinte (20) kg de etanol al 100% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 10 M Pa y la temperatura supercrítica fue de 35ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 12 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 6 horas. 4. Después de la extracción por SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del soporte por centrifugación a 5.000 rpm.

65

Resultados Este método proporcionó aproximadamente 37,2 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,2% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las 12

ES 2 227 048 T3 esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 15 5

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 10

2. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 30 g de quitinasa y 250 kg de agua destilada (a un pH de 6,2). La reacción se realizó a una temperatura de 45ºC durante 2,5 horas. Al final de la reacción, las episporas había perdido su resistencia. 15

20

25

3. Se rompieron las esporas por corte con tijeras/molienda. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,9% de esporas. Las esporas con la esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante centrifugación a 15.000 rpm. 4. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron cincuenta (50) kg de agua destilada como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 50 M Pa y la temperatura supercrítica era de 60ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 40 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 2,5 horas. 5. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 10.000 rpm. Resultados

30

Este método proporcionó aproximadamente 37,6 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,6% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 16

35

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 40

2. Se rompieron las episporas de las esporas por micronización. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,7% de esporas. 45

50

3. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron cien (100) kg de etanol al 95% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 55 M Pa y la temperatura supercrítica era de 68ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 70 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 2 horas. 4. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 20.000 rpm. Resultados

55

Este método proporcionó aproximadamente 37,5 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,5% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 17

60

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 65

2. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 30 g de celulosa y 200 kg de agua destilada (con un pH de 5,8). La reacción se realizó a una temperatura de 40ºC durante 1,5 horas. Al final de la reacción, las episporas habían perdido su resistencia. 13

ES 2 227 048 T3 3. Se rompieron las esporas mediante apisonado/prensado. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,8% de esporas. Las esporas con la esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante centrifugación a 20.000 rpm. 5

4. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . La presión supercrítica se mantuvo a 60 M Pa y la temperatura supercrítica era de 75ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 80 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 0,5 horas. Resultados

10

Este método proporcionó aproximadamente 37,4 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,4% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. 15

Ejemplo 18 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 20

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 2. Se rompieron las episporas de las esporas por corte con tijeras/trituración. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,9% de esporas. 25

3. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron cien (100) kg de etanol al 90% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 15 M Pa y la temperatura supercrítica era de 48ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 25 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 2 horas. 30

4. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 25.000 rpm. Resultados 35

Este método proporcionó aproximadamente 37,5 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,5% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. 40

Ejemplo 19 Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 45

1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma.

50

2. Se añadió y se sometió a reacción con las esporas una mezcla de enzimas que contenía 10 g de quitinasa, 10 kg de celulasa y 220 kg de agua destilada (con un pH de 7,3). La reacción se realizó a una temperatura de 45ºC durante 1,5 horas. Al final de la reacción, las episporas habían perdido su resistencia. 3. Se rompieron las esporas mediante micronización/prensado. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,9% de esporas. Las esporas con la esporodermis rota se separaron de la mezcla de enzimas mediante ultrafiltración.

55

4. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron diez (10) kg de agua destilada como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 5 M Pa y la temperatura supercrítica era de 85ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 35 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 1,5 horas. 60

5. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 30.000 rpm. Resultados 65

Este método proporcionó aproximadamente 37,1 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,1% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las 14

ES 2 227 048 T3 esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas. Ejemplo 20 5

Se extrajeron las sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma de acuerdo con el método expuesto a continuación: 1. Se seleccionaron cuidadosamente cien (100) kg de esporas maduras y gordas de Ganoderma. 10

2. Se rompieron las episporas de las esporas mediante microflujo a muy alta presión. Se controlaron las esporas rotas con un microscopio. En estas condiciones se rompieron aproximadamente el 99,9% de esporas. 15

20

3. Se colocaron entonces las esporas en el recipiente a presión del aparato de extracción por SCF-CO2 . Se añadieron doscientos (200) kg de etanol al 80% como vehículo. La presión supercrítica se mantuvo a 14 M Pa y la temperatura supercrítica era de 40ºC. El flujo en volumen de CO2 se mantuvo a 12 kg/h. El tiempo de extracción total fue de 0,5 horas. 4. Después de la extracción con SCF-CO2 , las sustancias oleaginosas se separaron del vehículo por centrifugación a 6.000 rpm. Resultados

25

Este método proporcionó aproximadamente 37,4 kg de sustancias oleaginosas (que constituían aproximadamente el 37,4% en peso de esporas). Las sustancias oleaginosas eran transparentes y contenían la fragancia especial de las esporas de Ganoderma, indicativo de que las sustancias oleaginosas no estaban oxidadas. No había trazas de depósitos o de disolventes residuales en las sustancias oleaginosas.

30

35

40

45

50

55

60

65

15

ES 2 227 048 T3 REIVINDICACIONES 1. Método para extraer sustancias oleaginosas de las esporas de Ganoderma lucidum que comprende: 5

• activación de la germinación de dichas esporas de Ganoderma; • rotura de dichas esporas de Ganoderma de germinación activada a través de medios mecánicos para obtener esporas con su esporodermis rota; y

10

15

20

25

• extracción de las sustancias oleaginosas procedentes de dichas esporas con su esporodermis rota mediante la utilización de un método de extracción con dióxido de carbono fluido supercrítico (SCF-CO2 ). 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque antes de que se rompan dichas esporas de Ganoderma a través de estos medios mecánicos, se activa la germinación de dichas esporas de Ganoderma poniendo en remojo dichas esporas de Ganoderma en una solución nutritiva adecuada para inducir la germinación; y mediante colocación de dichas esporas de Ganoderma con germinación inducida en una caja de cultivo ventilada para su activación hasta que se ablanden las paredes celulares de dichas esporas de Ganoderma. 3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha solución nutritiva es al menos una que está seleccionada a partir del grupo consistente en una solución donde se sumerge el cuerpo fructífero de Ganoderma, una solución de biotina, agua, y una solución donde se sumerge el micelio de Ganoderma. 4. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas esporas de Ganoderma se ponen en remojo en dicha solución nutritiva entre 10 minutos y 10 horas. 5. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas esporas de Ganoderma se ponen en remojo en dicha solución nutritiva a entre 16ºC y 43ºC.

30

6. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha caja de cultivo ventilada se encuentra a una humedad relativa entre el 60% y el 98%. 7. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha caja de cultivo ventilada se encuentra a una temperatura situada entre 16ºC y 48ºC.

35

40

8. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas esporas remojadas de Ganoderma permanecen en dicha caja de cultivo ventilada entre 10 minutos y 24 horas. 9. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos medios mecánicos consisten al menos en uno seleccionado de entre el grupo compuesto por micronización, corriente de aire a muy alta velocidad, corte con tijeras/molienda y microflujo a muy alta presión. 10. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa de digestión de dichas esporas de Ganoderma con al menos una enzima antes de aplicar tales medios mecánicos.

45

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha enzima es al menos una seleccionada de entre el grupo compuesto por quitinasa y celulasa. 12. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho método de extracción con SCF-CO2 comprende:

50

• colocar dichas esporas de Ganoderma con su esporodermis rota en un recipiente a presión; • poner en contacto el SCF-CO2 con dichas esporas de Ganoderma en dicho recipiente a presión; y

55

• despresurizar dicho recipiente a presión para recoger dichas sustancias oleaginosas procedentes de tales esporas de Ganoderma con su esporodermis rota. 13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho recipiente a presión se mantiene a una presión entre 5 M Psia (Pa) a 60 M Pa.

60

65

14. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho recipiente a presión se mantiene a una temperatura de 32ºC a 85ºC. 15. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho recipiente a presión se mantiene a un flujo en volumen de 5 kg/h a 80 kg/h. 16. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho tiempo de extracción es de entre 30 minutos y 6 horas. 16

ES 2 227 048 T3 17. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque dichas esporas de Ganoderma con su esporodermis rota se mezclan con un vehículo antes de ser colocadas en dicho recipiente a presión. 5

18. Método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicho vehículo es etanol del 85% al 100% (vol/vol) o agua. 19. Método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicho vehículo y dichas esporas de Ganoderma tienen una relación de peso del 2% al 200%.

10

20. Método según la reivindicación 17, que comprende además una etapa de separación de dichas sustancias oleaginosas del citado vehículo mediante centrifugación. 21. Agente antitumoral que comprende dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1.

15

22. Agente anti-VIH que comprende dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1. 20

23. Agente anti-VHB que comprende dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1. 24. Agente de modulación inmunológica que comprende dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1.

25

30

35

25. Utilización de una cantidad efectiva de dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para tratar a pacientes con tumores. 26. Utilización de una cantidad efectiva de dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para tratar a los pacientes con infección de VIH. 27. Utilización de una cantidad efectiva de dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para tratar a los pacientes con infección de VHB. 28. Utilización de una cantidad efectiva de dichas sustancias oleaginosas procedentes de las esporas de Ganoderma que pueden obtenerse según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para tratar a los pacientes con trastornos inmunológicos.

40

45

50

55

60

65

17