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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93920301.4 kFecha de presentaci´on: 24.08.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 746 303 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 11.12.1996

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54 T´ıtulo: Composiciones antimicrobianas enzim´ aticas estabilizadas.

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73 Titular/es: Robert E. Montgomery

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72 Inventor/es: Montgomery, Robert E.

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74 Agente: G´ omez M´ ugica, Luis Antonio

30 Prioridad: 24.08.1992 US 934772

Fairview Road Monterrey, MA 02145, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.03.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 182 831 T3

16.03.2003

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 182 831 T3 DESCRIPCION Composiciones antimicrobianas enzim´aticas estabilizadas. 5

Antecedentes de la invenci´ on 1. Campo de la invenci´ on

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Esta invenci´on se refiere a composiciones antimicrobianas que son capaces de activar o complementar sistemas de peroxidasas naturales. En particular, se describen composiciones que son estables durante la preparaci´ on y despu´es del empaquetamiento en entornos que contienen algo de ox´ıgeno, m´etodos para preparar dichas composiciones, y m´etodos para usarlas. 2. Antecedentes de la t´ ecnica

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Se acepta en general con respecto a la etiolog´ıa de la caries dental y enfermedad periodontal, que la microflora encontrada en el entorno bucal es capaz de acumularse en las superficies bucales y en los sacos no expuestos, desarroll´andose y produciendo metabolitos perjudiciales en ausencia de una adecuada higiene dental. Las colonias de microbios que no son perturbadas incluso durante periodos de tiempo cortos, son capaces de adherirse agresivamente a la superficie del esmalte, estableciendo un punto de apoyo para el posterior crecimiento de la colonia. Muchos de los tipos de bacterias encontrados normalmente en la boca segregan polisac´aridos tales como glucanos y dextranos, que forman una matriz de soporte y as´ı proporcionan un entorno mec´ anicamente m´ as estable para la posterior proliferaci´on. Las colonias subgingivales de bacterias aerobias y anaerobias que no son perturbadas pueden establecer matrices de polisac´aridos similares, adem´as de formaciones de tipo saco. Estas matrices de polisac´ aridos, junto con la microflora que se desarrolla contenida en ellas, forman lo que se denomina normalmente placa. Las primeras etapas de la formaci´on de la placa se producen casi inmediatamente despu´es de que una superficie de esmalte haya sido rascada, limpiada y pulida en el dentista con procedimientos de limpieza dentales. Cuando aumenta el n´ umero de colonias, y la integridad estructural de la matriz de polisac´ aridos de alrededor evoluciona, la placa se convierte en una fuente potencial de metabolitos bacterianos, tales como el ´acido l´ actico. En contacto ´ıntimo con la superficie del esmalte, los metabolitos ´acidos de la placa son capaces de disminuir el pH de la superficie del esmalte hasta un punto en el que puede producirse la desmineralizaci´ on del hidroxiapatito. Se sabe que dicha desmineralizaci´ on es la causa de la caries dental, tambi´en conocida como caries. Se sabe que las colonias de la placa y del saco subgingivales producen desmineralizaci´ on tanto del esmalte como de la estructura o´sea periodontal. La gingivitis y periodontitis, infecci´on e irritaci´on de tejidos blandos que rodean el diente, son otras manifestaciones cl´ınicas de la proliferaci´on de la colonia de la placa y del saco subgingivales. Un enfoque que se ha seguido para disminuir la caries es limitar la desmineralizaci´on del esmalte y del hueso mediante fluoraci´ on del agua potable. Se ha mostrado que el fluoruro proporcionado con el agua potable (y en una extensi´ on m´ as limitada, a trav´es de la dieta), es capaz de ser incorporado en el hidroxiapatito, el componente inorg´ anico mayoritario del esmalte y el hueso. El hidroxiapatito fluorado es menos susceptible a la desmineralizaci´on por a´cidos, y por lo tanto se ha visto que resiste las fuerzas degradantes de los metabolitos a´cidos de la placa y del saco. Adem´as, la concentraci´on de i´ on fluoruro en la saliva aumenta por el consumo de agua potable fluorada. Por lo tanto, la saliva sirve como un dep´ osito de fl´ uor adicional; combinado con sales tamp´ on que se encuentran normalmente en el fluido salivar, los iones fluoruro son intercambiados activamente en la superficie del esmalte, compensando adicionalmente los efectos de los metabolitos ´acidos desmineralizantes. Un gran conjunto de datos indica que la fluoraci´ on del agua potable conduce a una disminuci´ on estad´ısticamente significativa de los dientes CAOD (cariados, ausentes y obturados) para un amplio intervalo de poblaci´ on estudiada. Se observan efectos m´ as peque˜ nos y menos significativos en los estudios de agua potable fluorada que examinan cambios en la salud periodontal. Se cree que los efectos periodontales positivos surgen por los efectos antimicrobianos del aumento de la concentraci´ on de i´ on fluoruro en la saliva. Sin embargo, a pesar de los beneficios establecidos del tratamiento de los dientes con fluoruro, el tratamiento con el i´on fluoruro puede dar como resultado el manchado de los dientes, si se administra sistem´aticamente a trav´es del agua potable o se aplica v´ıa t´ opica. Se sabe que este efecto est´a relacionado con la concentraci´on y es espec´ıfico del paciente. Adem´ as, recientemente la toxicolog´ıa del fluoruro se ha sometido a un riguroso examen, aunque no hay una respuesta clara con respecto a su efecto a largo plazo 2

ES 2 182 831 T3 en la salud humana. Sin embargo, por el momento, se cree que la fluoraci´ on del agua potable sirve cada vez a m´as personas, y sus efectos en la salud dental de las poblaciones de todo el mundo son pronunciados.

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Otro enfoque para limitar la proliferaci´ on de microflora en el entorno bucal es mediante la aplicaci´on t´ opica o sist´emica de compuestos antibacterianos de amplio espectro. Se postula que matando grandes cantidades de microflora bucal, se puede reducir o eliminar la acumulaci´on en la placa y el saco, junto con su producci´ on de metabolito ´acido perjudicial. El principal inconveniente de este enfoque es que hay una gran variedad de cepas de bacterias benignas o beneficiosas que se encuentran en el entorno bucal, a las que se mata mediante los mismos compuestos antibacterianos de la misma forma que las cepas da˜ ninas. Adem´ as, dicho tratamiento con compuestos antibacterianos puede seleccionar ciertas bacterias y la mayor´ıa de los hongos, que entonces pueden ser resistentes al compuesto antibacteriano administrado y, por lo tanto, proliferar sin restricci´ on de las fuerzas simbi´oticas de una poblaci´ on de microflora adecuadamente equilibrada. Dicho proceso proliferativo seleccionado conduce todav´ıa a otro problema cl´ınico que entonces se debe tratar con otras estrategias antimicrobianas. Por lo tanto, la aplicaci´ on o administraci´on de antibi´ oticos de amplio espectro no es aconsejable, excepto en situaciones cl´ınicas preventivas o paliativas, tales como cirug´ıa bucal, periodontitis grave y enfermedades de disfunci´ on inmunitaria. Se han ideado compuestos antimicrobianos menos potentes y m´as selectivos, que cuando se aplican v´ıa t´ opica, han logrado diferentes grados de ´exito en el control del crecimiento de microorganismos bucales da˜ ninos. Son de particular inter´es y relevancia para el problema de la presente invenci´on los enfoques que intentan activar o complementar el potencial antimicrobiano de la saliva. Se sabe que la saliva contiene una variedad de compuestos antibacterianos tipo inmunoglobulina y no inmunoglobulina como una defensa frente a la proliferaci´ on de pat´ ogenos da˜ ninos. Entre dichas prote´ınas tipo no inmunoglobulina se incluyen la lisozima, la lactoferrina y la peroxidasa salivar. Estas prote´ınas, o unas de funci´ on similar, se encuentran en casi todas las secreciones de mucosas de mam´ıferos, proporcionando una primera l´ınea de defensa frente a los organismo pat´ ogenos que de otra forma proliferar´ıan r´ apidamente en dichos entornos c´alidos y h´ umedos. La enzima peroxidasa salivar, o SPO, funciona usando per´ oxido de hidr´ ogeno (producido y excretado principalmente por ciertas bacterias como metabolito, pero que se encuentra tambi´en en la saliva reci´en expresada) para oxidar un i´ on pseudohaluro en la saliva, atico, el i´ on hipotiocianito (OSCN− ). el tiocianato (SCN− ), para producir un potente agente bacteriost´ El i´ on hipotiocianito y su correspondiente a´cido, el a´cido hipotiocianoso (denominados colectivamente hipotiocianito en el presente documento) son capaces de inhibir el crecimiento de una amplia variedad de pat´ ogenos da˜ ninos encontrados en el entorno bucal. Dependiendo de la concentraci´ on de hipotiocianito en la saliva, el sistema de peroxidasa salivar puede inhibir simplemente el metabolismo microbiano o realmente matar al organismo. En general, se ha mostrado que concentraciones de hipotiocianito mayores que aproximadamente 100 micromoles/litro son suficientes para inhibir el metabolismo de las bacterias de la placa. Puesto que el sistema de peroxidasa salivar y, por lo tanto, la producci´ on de hipotiocianito, depende de la disponibilidad de per´ oxido de hidr´ ogeno, se han hecho diferentes intentos en la t´ecnica anterior para proporcionar suficiente per´ oxido de hidr´ ogeno para activar o complementar el sistema de SPO. A la inversa, puesto que la SPO empieza a mostrar inhibici´ on con concentraciones de per´ oxido de hidr´ ogeno mayores que aproximadamente 1 milimol/litro, un mecanismo eficaz de activaci´on de la SPO no proporcionar´ a ni acumular´ a molaridades de per´ oxido mucho mayores que esto. Se ha mostrado que la inclusi´ on directa de per´ oxido de hidr´ ogeno en una composici´ on de enjuague bucal con estas concentraciones bajas, activa el sistema de SPO durante cortos periodos de tiempo (Mansson-Rahemtulla, et al., J. of Dental Res. 62 (10): 1062-1066). Otra t´ecnica anterior intenta generar per´ oxido de hidr´ ogeno in situ, incluyendo en un dent´ıfrico una enzima ´oxido-reductasa, tal como glucosa-oxidasa (Hoogendorn et al., Patentes de on bucal, reaccioEE.UU. n◦ 4.150.113 y 4.178.519). La glucosa-oxidasa as´ı proporcionada, por aplicaci´ nar´ a con la glucosa presente en la saliva y en el fluido intersticial de la placa para producir per´ oxido de hidr´ ogeno en bajas concentraciones. Puesto que este enfoque depende de la disponibilidad de la glucosa en la boca, los autores de la presente invenci´on y otros consideraron una v´ıa m´ as reproducible y predecible, que incluye en una composici´on dent´ıfrica tanto glucosa-oxidasa como beta-D-glucosa. (Patente de omero de la glucosa para el cual la glucosa-oxidasa es EE.UU. n◦ 4.537.764). La beta-D-glucosa es el an´ espec´ıfica; en soluci´ on acuosa, la glucosa mutarrotar´ a r´apidamente para formar una mezcla de aproximadamente el 65 % de beta-D-glucosa y el 35 % de alfa-D-glucosa. Con el fin de evitar la inestabilidad y la interacci´on prematura de enzima/sustrato, la cantidad de agua en la composici´on deb´ıa limitarse a menos de 10 por ciento. Mediante el uso de esta composici´on dent´ıfrica, el agua adicional presente (de la saliva y del agua a˜ nadida en el transcurso de los procedimientos normales de cepillado de dientes) diluir´ıa la composici´on a un contenido de agua superior al 10 por ciento, permitiendo as´ı la reacci´on entre la glucosa-oxidasa y la glucosa. As´ı, el per´oxido de hidr´ ogeno creado como un producto de reacci´ on activar´ a 3

ES 2 182 831 T3 el sistema de peroxidasa salivar en la saliva, produciendo hipotiocianito.

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Se hicieron intentos posteriores para proporcionar una composiciones dent´ıfrica que contuviera un sistema completo de componentes capaces de generar hipotiocianito in situ (Patentes de EE.UU. n◦ 4.564.519 y 4.578.265). Se combin´o una enzima ´oxido-reductasa junto con su correspondiente sustrato en una sola composici´ on dent´ıfrica, con una enzima peroxidasa y una sal de tiocianato, proporcionando as´ı un m´etodo para preparar hipotiocianito independiente de las fluctuaciones de la glucosa salivar, la peroxidasa salivar y el i´on tiocianato salivar. De nuevo, la estabilidad de dichas composiciones dent´ıfricas que contienen un sistema enzim´atico completo capaz de producir hipotiocianito, s´ olo se pod´ıa mantener por formulaci´ on con menos de aproximadamente el 10 por ciento de agua. De manera similar, la secuencia de reacci´on empezaba con la diluci´on del dent´ıfrico durante el cepillado de dientes. Hay muchos otros ejemplos en la t´ecnica anterior de intentos de proporcionar una composici´ on dent´ıfrica enzim´aticamente estable que contenga tanto enzima ´oxido-reductasa como su sustrato espec´ıfico, con el prop´ osito de producir per´ oxido de hidr´ ogeno. La estabilidad de dichas composiciones de la t´ecnica anterior se ha logrado mediante limitaciones puestas en la cantidad de agua contenida en la composici´ on o separando f´ısicamente (mediante microencapsulaci´ on, patente de EE.UU. n◦ 4.978.528) la enzima ´oxido-reductasa de su sustrato espec´ıfico.

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A la luz de la descripci´ on anterior, ser´ıa ventajoso proporcionar una composici´ on enzim´atica acuosa y estable, capaz de complementar, o en presencia de saliva u otras secreciones humorales, activar el sistema de peroxidasa, de forma que se produzcan iones hipotiocianito (OSCN− ) por encima de aproximadamente 100 micromoles/litro/minuto in vitro o in vivo.

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Adem´as del sistema de peroxidasa salivar, se pueden encontrar otros sistemas antimicrobianos naturales en las secreciones humorales de todos los mam´ıferos. Estos sistemas antimicrobianos constan de una enzima peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa salivar encontrada en la saliva y peroxidasa cervical encontrado en el fluido cervical) junto con un aceptor de ox´ıgeno tal como i´on tiocianato o el yoduro. Ambos componentes se encuentran normalmente en las propias secreciones, y la adici´on de per´ oxido de hidr´ ogeno ex´ogeno activa el sistema y produce potentes especies antimicrobianas, tales como hipotiocianito e hipoyodito (OSCN− y OI− , respectivamente).

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Como se describe en la solicitud anterior del autor de la invenci´on, a la que se ha hecho referencia antes, las composiciones acuosas capaces de producir per´oxido de hidr´ ogeno enzim´aticamente mediante la acci´on de una enzima o´xido-reductasa, se deben fabricar de forma que contengan un contenido bajo de ox´ıgeno disuelto con el fin de evitar la formaci´ on prematura de per´ oxido de hidr´ ogeno antes del momento en el que se pretenden usar. Dichas composiciones tambi´en se deben empaquetar de forma esencialmente anaer´ obica para excluir as´ı el ox´ıgeno durante el almacenamiento. Estos requisitos son el objetivo de la solicitud anterior del autor de la invenci´ on, a la que se ha hecho referencia antes.

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Tambi´en seria ventajoso proporcionar una composici´ on enzim´ atica acuosa y estable capaz de producir o, en presencia de saliva, de conducir a la producci´ on de hipotiocianito, independientemente del contenido de agua de la composici´on o de la cantidad de agua disponible para la diluci´ on cuando se usa. Adicionalmente, la flexibilidad y la econom´ıa de formulaci´ on se beneficiar´ıan enormemente de dichas composiciones dent´ıfricas enzim´aticas producidas y estabilizadas sin tener en cuenta la cantidad de agua contenida en la formulaci´ on. Tambi´en ser´ıa ventajoso proporcionar dicha composici´ on que se pueda formular en presencia de ox´ıgeno sin tener que tener particular cuidado de eliminar y/o sustituir el ox´ıgeno que est´a presente hasta que se empaqueta. Ser´ıa de utilidad adicional proporcionar un m´etodo para fabricar una composici´ on enzim´atica acuosa y estable, que contenga tanto una enzima o´xido-reductasa como su sustrato especifico, y que evite la acumulaci´on de per´ oxido de hidr´ ogeno antes de su uso. Sumario de la invenci´ on

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De acuerdo con la descripci´on precedente de la t´ecnica anterior, y con un deseo de proporcionar una composici´ on acuosa estabilizada capaz de producir o, en presencia de saliva, conducir a la producci´ on de concentraciones antimicrobianas de iones hipotiocianito (OSCN− ) en el presente documento se describen composiciones que contienen tanto una enzima ´oxido-reductasa como su sustrato especifico, con el prop´ osito de producir per´ oxido de hidr´ ogeno al menos en la concentraci´on m´ınima eficaz. Las composiciones dent´ıfricas acuosas de la presente invenci´on se pueden estabilizar frente a la interacci´on prematura de enzima/sustrato, controlando el nivel de ox´ıgeno disuelto en el veh´ıculo acuoso del dent´ıfrico. Op4

ES 2 182 831 T3 cionalmente, se puede incluir una enzima peroxidasa para actuar sobre el per´ oxido de hidr´ ogeno antes mencionado, oxidando as´ı iones tiocianato (encontrados en la saliva u opcionalmente incluidos en las composiciones de la presente invenci´on) para producir las concentraciones antimicrobianas de iones hipotiocianito (OSCN− ). 5

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En el caso en el que la presente invenci´on se use como una composici´ on dent´ıfrica, adem´ as de contener los componentes que se encuentran normalmente en las composiciones dent´ıfricas y conocidos por los expertos en la t´ecnica, las composiciones dent´ıfricas acuosas de la invenci´on tambi´en contienen una enzima ´oxido-reductasa, junto con el sustrato espec´ıfico de dicha enzima, en cantidades suficientes para producir per´ oxido de hidr´ ogeno a una velocidad de desde aproximadamente 0,1 milimoles/litro/minuto hasta aproximadamente 10,0 milimoles/litro/minuto durante el uso. La secuencia de reacci´on, en general, es la siguiente: ´ Oxido-reductasa 2 Sustrato + O2 + 2H2 O −−−−−−−−−−−→ 2 Sustrato reducido + 2H2 O2 Adem´as, las composiciones antes mencionadas pueden contener una enzima peroxidasa capaz de actuar sobre el per´ oxido de hidr´ ogeno producido enzim´ aticamente y as´ı oxidar iones tiocianato (encontrados normalmente en la saliva) para formar iones hipotiocianito (OSCN− ). El nivel de enzima peroxidasa en dichas composiciones en la realizaci´on preferida, ser´ a suficiente para que cuando est´e en contacto con la saliva (que contiene iones tiocianato), produzca la producci´ on de al menos 100 micromoles/litro/minuto de iones hipotiocianito (OSCN− ) durante el uso. opcionalmente, los iones tiocianato tambi´en se pueden incluir en las composiciones de esta invenci´on en una cantidad suficiente, junto con los otros componentes de la invenci´on, para producir m´ as de aproximadamente 100 micromoles/litro/minuto de iones hipotiocianito durante el uso. La secuencia de reacci´on, en general, es la siguiente: Peroxidasa H2 O2 + SCN− −−−−−−−−−→ OSCN− + H2 O

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Otro aspecto de la presente invenci´ on es que se ha descubierto que, independientemente de la cantidad de agua contenida en las composiciones dent´ıfricas que constan de una enzima o´xido-reductasa junto con su sustrato espec´ıfico, la interacci´on prematura de enzima/sustrato se puede eliminar limitando la cantidad de ox´ıgeno disuelto en el veh´ıculo acuoso del dent´ıfrico. As´ı, se puede proporcionar una composici´on dent´ıfrica acuosa que contenga tanto una enzima ´oxido-reductasa como su sustrato espec´ıfico, con el prop´ osito de producir per´ oxido de hidr´ ogeno cuando se use, que mostrar´a poca o ninguna acumulaci´ on de per´ oxido de hidr´ ogeno antes del uso pretendido. S´ olo por exposici´on a ox´ıgeno adicional las composiciones dent´ıfricas de la presente invenci´on mostrar´ an ser enzim´aticamente activas. No se conoce en la t´ecnica anterior la manipulaci´ on y control de los niveles de ox´ıgeno disuelto en las composiciones dent´ıfricas enzim´aticas, con el prop´ osito de limitar una interacci´on de enzima ´oxido-reductasa/sustrato y estabilizar as´ı dicho dent´ıfrico enzim´atico hasta el momento en que se pretende usar. Un beneficio inesperado de la capacidad de controlar la interacci´ on entre la enzima ´oxido-reductasa y su sustrato especifico controlando la cantidad de ox´ıgeno disuelto en el veh´ıculo acuoso del dent´ıfrico, es la posibilidad de “activar” o “desactivar” la reacci´ on en cualquier momento en el transcurso de su fabricaci´ on. Por lo tanto, se pueden producir concentraciones controladas de per´oxido de hidr´ ogeno (o alternativamente, si se formulan adicionalmente tanto con una peroxidasa como con iones tiocianato, iones hipotiocianito) en el transcurso de la fabricaci´ on con el fin de reducir cualquier poblaci´ on microbiana sin usar conservantes. Se ha encontrado que la adici´on o inclusi´ on de catalasa (EC 1.11.1.6) en composiciones capaces de producir per´ oxido de hidr´ ogeno enzim´aticamente (tal como la glucosa-oxidasa y glucosa) mejora mucho la retenci´on de la actividad de la o´xido-reductasa en el transcurso de la fabricaci´ on, empaquetamiento y almacenamiento de la composici´on. En el momento de uso, el per´ oxido de hidr´ ogeno producido es consumido casi exclusivamente por las peroxidasas antimicrobianas, debido a su mayor afinidad por el per´ oxido de hidr´ ogeno que la catalasa. La relaci´on de la enzima ´oxido-reductasa frente a la catalasa debe estar en el intervalo de desde 50 Unidades valorim´etricas de o´xido-reductasa frente a 1,0 Unidad Baker de catalasa, hasta 1,0 Unidad valorim´etricas de o´xido-reductasa frente a 1,0 Unidad Baker de catalasa (de 50:1 hasta 1:1).

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Una Unidad valorim´etrica (TU, por sus siglas en ingl´es) se define aqu´ı como la cantidad de enzima o´xido-reductasa capaz de producir 1,1 micromoles de per´oxido de hidr´ ogeno por minuto a una temperaon de sustrato para cada enzima o´xido-reductasa tura de 35◦ C, y condiciones ´optimas de pH y concentraci´ 5

ES 2 182 831 T3 particular.

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Una Unidad Baker (BU, por sus siglas en ingl´es) es equivalente a la cantidad de catalasa capaz de descomponer 264 mg de per´ oxido de hidr´ ogeno en una hora en las condiciones del ensayo (25◦C y pH 7,0). Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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En su forma m´ as sencilla, esta invenci´on comprende composiciones acuosas que contienen una enzima o´xido-reductasa y un sustrato especifico para dicha enzima con el prop´ osito de producir per´ oxido de hidr´ ogeno cuando se use, combinado con catalasa para descomponer el per´ oxido de hidr´ ogeno en la composici´on. En particular, s´ olo se contemplan las enzimas ´oxido-reductasas que usan agua como co-reactivo y ox´ıgeno como un donante de electrones, produciendo as´ı per´ oxido de hidr´ ogeno al reaccionar con un sustrato espec´ıfico.

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Entre las o´xido-reductasas adecuadas se incluyen, pero no se limitan a, glucosa - oxidasa, galactosa oxidasa, glicolato - oxidasa, lactato - oxidasa, L - gulonolactona - oxidasa, L - 2 - hidroxi´ acido - oxidasa, aldeh´ıdo - oxidasa, xantina - oxidasa, D - aspartato - oxidasa, L - amino´ acido - oxidasa, D - amino´acido oxidasa, monoamina - oxidasa, piridoxamina - fosfato - oxidasa, diamina - oxidasa, y sulfito - oxidasa. La ´oxido - reductasa preferida es la glucosa - oxidasa. Los sustratos adecuados son espec´ıficos para la o´xido-reductasa particular elegida y son conocidos en la t´ecnica. Por ejemplo, la beta-D-glucosa es un sustrato espec´ıfico para la glucosa-oxidasa. Entre otros sustratos adecuados se incluyen, pero no se limitan a, D-glucosa, D-galactosa, L-sorbosa, etanol, tiramina, 1,4-diaminobutano, 6-hidroxi-L-nicotina, 6-hidroxi-D-nicotina, 2-aminofenol, glicolato, L-lactato, 2-desoxi-D-glucosa, L-gulonolactona, L-galactolactona, D-manonolactona, L-2-hidroxiisocaproato, acetaldeh´ıdo, butiraldeh´ıdo, xantina, D-aspartato, D-glutamato, L-amino´ acidos, y D-amino´ acidos. Por lo tanto, las composiciones dent´ıfricas de la invenci´on, contendr´ an al menos una de las o´xidoreductasas anteriores y al menos un sustrato especifico para dicha ´oxido-reductasa, con el prop´ osito de producir per´ oxido de hidr´ ogeno a una velocidad de aproximadamente 0,10 milimoles/litro/minuto a aproximadamente 10,00 milimoles/litro/minuto durante el uso. La producci´on de per´ oxido de hidr´ ogeno se puede controlar variando la concentraci´ on de o´xido-reductasa o la concentraci´ on de sustrato. Para una velocidad dada de producci´ on de per´ oxido de hidr´ ogeno, se observa que es m´as econ´omico aumentar el nivel de sustrato en la composici´ on dent´ıfrica con el fin de maximizar la velocidad que se puede lograr con un nivel de o´xido-reductasa especifico. Posteriormente, las concentraciones de ´oxido-reductasa se pueden aumentar si el aumento de sustrato ya no da una velocidad mayor o deseada de producci´ on de per´ oxido de hidr´ ogeno. En general, las concentraciones de sustrato pueden oscilar desde aproximadamente el 0,01 por ciento hasta aproximadamente el 20 por ciento o m´ as, en peso de la composici´on dent´ıfrica.

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Las composiciones de la presente invenci´on contienen en general, de aproximadamente desde 0,10 Unidades valorim´etricas hasta aproximadamente 100 Unidades valorim´etricas de una enzima o´xido-reductasa por gramo de dent´ıfrico. 45

El dent´ıfrico antes descrito que produce per´ oxido de hidr´ ogeno, puede incluir opcionalmente una enzima peroxidasa, con el prop´ osito de utilizar dicho per´oxido de hidr´ ogeno para oxidar iones tiocianato (SCN− ), que se encuentran normalmente en la saliva, a iones hipotiocianito (OSCN− ) antimicrobianos. Se considera que cualquier peroxidasa capaz de usar per´oxido de hidr´ ogeno para oxidar tiocianato tiene utilidad en la pr´ actica de esta parte de la invenci´on.

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Entre las peroxidasas adecuadas se incluyen, pero no se limitan a, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa salivar y cloroperoxidasa. La peroxidasa preferida es la lactoperoxidasa.

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La concentraci´on de peroxidasa ser´ a suficiente para producir iones hipotiocianito a una velocidad de aproximadamente 100 micromoles/litro/minuto cuando interacciona con el per´ oxido de hidr´ ogeno producido por la reacci´on de la o´xido-reductasa/sustrato y los iones tiocianato que se encuentran en la saliva. En general, las composiciones de esta invenci´ on pueden contener desde 0,10 Unidades ABTS hasta aproximadamente 1000 Unidades ABTS de peroxidasa por gramo de dent´ıfrico. Una Unidad ABTS, para el prop´ osito del presente documento, es la cantidad de peroxidasa capaz de oxidar un micromol de ABTS (´acido 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulf´ onico)) por minuto a 25◦ C, con tamp´ on fosfato 0,1 M (pH 6,0), y concentraci´ on inicial de per´ oxido de hidr´ ogeno 0,100 M. 6

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Opcionalmente, las composiciones dent´ıfricas antes descritas pueden contener una fuente de i´ on tiocianato con el fin de proporcionar un dent´ıfrico completo que produzca iones hipotiocianito, independiente de la disponibilidad de dichos iones en la saliva. Los iones tiocianato se pueden incluir en la composici´ on en concentraciones de desde aproximadamente 0,10 milimoles/gramo de dent´ıfrico hasta aproximadamente 10,00 milimoles/gramo de dent´ıfrico. Est´ a contemplado que las fuentes de iones tiocianato tales como tiocianato s´ odico, tiocianato pot´ asico, tiocianato am´onico y otras sales de tiocianato, son u ´ tiles en dichos sistemas completos. Las fuentes de iones tiocianato preferidas son el tiocianato pot´asico y el tiocianato s´odico.

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Adem´as de los componentes de la invenci´on antes descritos, las composiciones dent´ıfricas de esta invenci´on contienen muchos de los componentes que se encuentran normalmente en dichas composiciones y que resultan familiares para los expertos en la t´ecnica. Se incluyen o escogen varios componentes en las composiciones de la invenci´on para tratar los requisitos de estabilidad para la o´xido-reductasa y opcionalmente, las enzimas peroxidasas. Las composiciones dent´ıfricas de esta invenci´on contienen un veh´ıculo liquido, compuesto de agua y un humectante, en una cantidad que est´ a en el intervalo de desde aproximadamente el 10 % hasta aproximadamente el 90 % en peso de la composici´ on. Entre los humectantes adecuados se incluyen, pero no se limitan a, glicerina, propil´en glicol, sorbitol (soluci´ on al 70 %), polietil´en glicoles, polipropil´en glicoles, y sus mezclas. El contenido de agua de la composici´ on puede oscilar normalmente desde aproximadamente el 5 % hasta aproximadamente el 50 % en peso, m´ as preferiblemente desde aproximadamente el 10 % hasta aproximadamente el 30 % en peso de la composici´on total. Con el fin de lograr los efectos est´eticos deseados de fluidez y sabor liberado en la composici´on dent´ıfrica final, se incluye ventajosamente un espesante para proporcionar control de la viscosidad y tixotrop´ıa. Entre los espesantes naturales se incluyen pol´ımeros solubles en agua naturales y sint´eticos tales como carboximetil-celulosa s´odica, goma de xantano, carragenina, goma de algarroba, goma de tragacanto, hidroxietil-celulosa (Natrosol, Hercules, Inc.), alginato s´ odico, polivinilpirrolidona, poli(´acido acr´ılico) (Carbopol, B.F. Goodrich) y otros. Los espesantes inorg´anicos tales como silicato de magnesio y aluminio (Veegum, R.T. Vanderbilt), hectoritas (tales como Laponita, La Porte, Ltd.) y s´ılices hidratadas (Sylodent, W.R. Grace), entre otros, tambi´en son espesantes u ´ tiles para las composiciones dent´ıfricas de la invenci´on. La eliminaci´on de la placa y el sarro con el movimiento f´ısico del cepillado de dientes mejora por la inclusi´ on de abrasivos en la composici´on dent´ıfrica. Se consideran los abrasivos incluidos normalmente en las composiciones dent´ıfricas t´ıpicas y se incluyen, pero no se limitan a, pirofosfato c´ alcico, carbonato c´alcico, s´ılice hidratada (Sylodent), hidr´ oxido de aluminio, fosfato dic´ alcico dihidrato, fosfato tric´ alcico, metafosfato s´ odico, metafosfato pot´asico, silicato de aluminio, poli(metacrilato de metilo) finamente dividido, y sus mezclas. En general, como se sabe en la t´ecnica, el abrasivo est´a presente en la composici´on en concentraciones desde aproximadamente el 5 % hasta aproximadamente el 70 % en peso, y preferiblemente desde el 10 % hasta aproximadamente el 50 % en peso de la composici´on total. El grado de abrasividad de un dent´ıfrico se puede medir directamente o calcular a partir de la escala de RDA (Abrasi´ on de la dentina radiactiva). La escala de RDA es una medida de la capacidad abrasiva para erosionar la superficie del esmalte despu´es de cepillados repetidos. Cuanto mayor es la puntuaci´ on de RDA, mayor es el esmalte erosionado en unas condiciones dadas. Se desean puntuaciones de RDA altas para dent´ıfricos que eliminan manchas; y se desean puntuaciones de RDA bajas para dent´ıfricos para dientes sensibles. Los dent´ıfricos generalmente contienen un agente espumante, o tensioactivo, para lograr el cuerpo y textura deseados durante el cepillado de los dientes. Adem´ as, el tensioactivo proporciona una impresi´on psicol´ogica positiva del procedimiento de limpieza, y en menor grado, ayuda a ablandar las part´ıculas de alimento y la placa para ayudar a su eliminaci´ on por medios mec´anicos. Aunque es conveniente, no es necesario ni mucho menos, incluir un tensicactivo en las composiciones dent´ıfricas de esta invenci´on. De hecho, las composiciones dent´ıfricas que no se pretenden enjuagar despu´es del procedimiento de cepillado de dientes, tales como las composiciones usadas en odontolog´ıa veterinaria o productos para el cuidado bucal para individuos que no pueden cepillarse sus dientes por medios normales, no deben contener componentes, incluyendo los tensioactivos, que no sean adecuados o aceptables para ingerir. Sin embargo, en las composiciones en las que es conveniente la presencia de un tensioactivo, se debe confirmar la compatibilidad del tensioactivo con la enzima o enzimas de las composiciones de la invenci´on. Se sabe que muchos tensioactivos ani´ onicos, pero no todos, tales como el lauril-sulfato s´odico (un agente espumante usado normalmente para composiciones dent´ıfricas) forman complejo e inactivan una amplia variedad de enzimas. Muchos tensioactivos cati´onicos tambi´en son incompatibles con enzimas. En general, se prefieren 7

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tensioactivos no i´ onicos y anf´ oteros en las composiciones dent´ıfricas presentes, ya que en conjunto presentan una compatibilidad global mucho mejor con las enzimas. La t´ecnica anterior trata el problema de la incompatibilidad de enzima/tensioactivo extensamente, y la compatibilidad de un tensioactivo particular con las composiciones dent´ıfricas de la invenci´on se debe determinar individualmente de compuesto en compuesto. Entre los tensioactivos que se sabe que son compatibles con las composiciones dent´ıfricas enzim´aticas de esta invenci´on se incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 80, cocoamidopropilbeta´ına, cocoanfopropionato, lauroil-sarcosinato s´odico, alcohol isocet´ılico etoxilado (20), una amplia variedad de tensioactivos no i´ onicos de copol´ımeros de bloques de ´oxido de propileno/´ oxido de etileno, tales como los ofrecidos con el nombre comercial Pluronic por BASF/Wyandotte Corp.

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Puesto que las enzimas son m´as estables y muestran mayor actividad a niveles de pH espec´ıficos, es ventajoso proporcionar uno o m´ as compuestos tamp´ on en las composiciones dent´ıfricas enzim´aticas. Se observa que los tampones que proporcionan un pH en el dent´ıfrico y/o cuando se usa, desde aproximadamente 5,5 hasta 7,5, son m´ as beneficiosos para optimizar los niveles de per´oxido de hidr´ ogeno y/o de iones hipotiocianito producidos. Se puede prever que cualquier tamp´ on fisiol´ ogicamente aceptable que proporcione un valor de pH en el dent´ıfrico y/o cuando se usa, desde aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 7,5, y preferiblemente entre pH 6,0 y pH 7, 0, ser´ a u ´ til en la pr´ actica de esta invenci´on. Los tampones preferidos son fosfato pot´ asico, fosfato s´odico, fosfato dis´ odico, fosfato dipot´ asico, y sus mezclas. Las concentraciones preferidas de tamp´on son desde aproximadamente 0,01 moles hasta aproximadamente 1,00 mol/litro de veh´ıculo l´ıquido del dent´ıfrico (la parte del dent´ıfrico que excluye componentes insolubles tales como abrasivos). Se puede incluir una gran variedad de componentes dent´ıfricos auxiliares en las presentes composiciones, tales como conservantes, blanqueadores, colorantes, fluoruros, agentes antisarro y antic´alculos, compuestos de clorofila, materiales amoniacales y otros. Dichos componentes auxiliares deben ser compatibles con los componentes y prop´ ositos deseados del sistema de enzima/sustrato de la invenci´ on.

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Se puede usar un material saborizante y/o edulcorante para lograr los efectos est´eticos deseados para el dent´ıfrico. Ejemplos de componentes saborizantes adecuados son los aceites de menta, menta verde, clavo, gaulteria, canela, salvia, eucalipto y naranja. Entre los agentes edulcorantes adecuados se incluyen sacarina, ciclamato s´odico, aspartil-fenilalanina (´ester met´ılico), glucosa, xilitol, sacarosa, maltosa, y otros. Los agentes saborizantes y edulcorantes pueden comprender desde aproximadamente el 0,1 % hasta aproximadamente el 7,0 % o m´as de la composici´on dent´ıfrica.

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Como cuesti´on pr´ actica, la fabricaci´on se debe llevar a cabo en un entorno con poco ox´ıgeno, tal como al vac´ıo o bajo una capa de gas nitr´ ogeno, aunque dichas etapas no son necesarias.

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Las composiciones dent´ıfricas de esta invenci´on se pretenden usar o, en cualquier caso, aplicar de forma normal para el cepillado de dientes. El tiempo de permanencia o contacto en el entorno bucal debe ser al menos 30 segundos y, preferiblemente, desde 60 segundos hasta 120 segundos o m´ as. Normalmente, el dent´ıfrico se enjuaga de la boca despu´es del cepillado de dientes, sin embargo, se prev´e que las composiciones sin enjuagado o ingeribles son u ´tiles, como se ha descrito previamente.

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Las actividades de las enzimas generalmente se miden en micromoles de sustrato o co-reactivo consumido, o micromoles de producto producido, en un periodo de tiempo dado, en condiciones espec´ıficas de temperatura, concentraci´ on de sustrato y concentraciones de co-reactivos. Cualquier descripci´on de actividad “unitaria” para una enzima dada se debe considerar cuidadosamente evaluando una descripci´ on completa de las condiciones en las que se ha medido dicha actividad, y la presente invenci´on, como se define en las reivindicaciones, se considera que tiene el alcance adecuado para englobar la definici´ on mas amplia del t´ermino. A la luz de las definiciones antes mencionadas de actividad Unitaria para las o´xido-reductasas y peroxidasas las composiciones de la presente invenci´on contienen, en general, desde aproximadamente 0,10 Unidades valorim´etricas hasta aproximadamente 100 Unidades valorim´etricas de una enzima ´oxidoreductasa por gramo de dent´ıfrico y, opcionalmente, desde aproximadamente 0,10 Unidades de ABTS hasta aproximadamente 1.000 Unidades de ABTS de una enzima peroxidasa por gramo de dent´ıfrico. Un ejemplo de dicha composici´on es una pasta de dientes que contiene glucosa y glucosa-oxidasa con el prop´ osito de producir per´ oxido de hidr´ ogeno cuando se usa. La inclusi´on de catalasa en el siguiente ejemplo 2, demuestra la mayor estabilidad en comparaci´ on con el ejemplo 1. Tanto el ejemplo 1 como el 2 se fabricaron con vac´ıo parcial (20 mm de Hg) y se empaquetaron en tubos de pasta de dientes laminados con l´amina de metal/pl´ astico. 8

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Ejemplo 1

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Componente

Porcentaje/Cantidad

Sorbitol al 70 % Glicerina al 96 % Agua desionizada Carboximetil-celulosa s´odica 9M31XF Sylodent 750 Sylodent 2 Dextrosa Di´oxido de titanio Otros componentes Glucosa-oxidasa Catalasa

37,44 % 16,00 16,77 1,00 12,00 12,00 2,00 0,40 2,30 6,0 TU/g de pasta 0,06 BU/g de pasta

Componente

Porcentaje/Cantidad

Sorbitol al 70 % Glicerina al 96 % Agua desionizada Carboximetil-celulosa s´odica 9M31XF Sylodent 750 Sylodent 2 Dextrosa Di´oxido de titanio Otros componentes Glucosa-oxidasa Catalasa

37,44 % 16,00 16,77 1,00 12,00 12,00 2,00 0,40 2,39 6,0 TU/g de pasta 1,0 BU/g de pasta

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Ejemplo 2

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El ejemplo 2 retuvo aproximadamente el 95 % de su actividad original de la glucosa-oxidasa cuando se almacen´o a 35◦C durante 14 d´ıas, mientras que el ejemplo 1 retuvo menos del 8 % de su actividad original en las mismas condiciones.

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ES 2 182 831 T3 REIVINDICACIONES 1. Una composici´on dent´ıfrica que comprende: 5

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un veh´ıculo l´ıquido que comprende una enzima o´xido-reductasa presente en una cantidad de al menos 0,1 Unidades valorim´etricas por gramo de la composici´on; un sustrato de la enzima o´xido-reductasa; y una catalasa presente en una relaci´on de desde 50 Unidades valorim´etricas de enzima ´oxido-reductasa frente a 1,0 Unidad Baker de catalasa, hasta 1,0 Unidad valorim´etrica de enzima ´oxido-reductasa frente a 1,0 Unidad Baker de catalasa, en el que dicha enzima y sustrato forman per´ oxido de hidr´ ogeno cuando reaccionan entre s´ı en presencia de ox´ıgeno, form´andose dicho per´ oxido de hidr´ ogeno con una velocidad de 100 micromoles por litro por minuto; y en el que dicha catalasa se proporciona en suficiente cantidad para reducir sustancialmente la cantidad de per´ oxido de hidr´ ogeno en dicha composici´on. 2. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, en la que la relaci´on de o´xido-reductasa frente a catalasa es de 6,0 Unidades valorim´etricas de ´oxido-reductasa frente a 1,0 Unidad Baker de catalasa. 3. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, que adem´ as comprende una enzima peroxidasa para oxidar iones tiocianato a iones hipotiocianito.

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4. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, en la que dicha o´xido-reductasa se selecciona del grupo que consiste en glucosa - oxidasa, galactosa - oxidasa, glicolato - oxidasa, lactato - oxidasa, L - gulonolactona oxidasa, L - 2 - hidroxi´ acido - oxidasa, aldeh´ıdo - oxidasa, xantina - oxidasa, D - aspartato - oxidasa, L - amino´acido - oxidasa, D - amino´acido - oxidasa, monoamina - oxidasa, piridoxaminofosfato - oxidasa, diamina - oxidasa, y sulfito - oxidasa. 5. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, en la que dicha o´xido-reductasa es la glucosa-oxidasa. 6. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, en la que dichos sustratos son espec´ıficos para la o´xidoreductasa particular y se seleccionan de D-glucosa, D-galactosa, L-sorbosa, etanol, tiramina, 1,4diaminobutano, 6-hidroxi-L-nicotina, 6-hidroxi-D-nicotina, 2-aminofenol, glicolato, L-lactato, 2-desoxiD-glucosa, L-gulonolactona, L-galactolactona, D-manonolactona, L-2-hidroxiisocaproato, acetaldeh´ıdo, butiraldeh´ıdo, xantina, D-aspartato, D-glutamato, L-amino´ acidos, y D-amino´ acidos. 7. La composici´ on de la reivindicaci´ on 1, en la que dicha o´xido-reductasa es la glucosa-oxidasa y dicho sustrato es la D-glucosa. 8. La composici´ on de la reivindicaci´ on 2, en la que la enzima peroxidasa se selecciona de lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa salivar y cloroperoxidasa.

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9. La composici´ on de la reivindicaci´ on 8, en la que la peroxidasa es lactoperoxidasa. 10. La composici´on de la reivindicaci´ on 1, en la que la catalasa se deriva de la fermentaci´ on de A. niger.

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11. La composici´on de la reivindicaci´ on 1, en la que dicha composici´on comprende un veh´ıculo l´ıquido, compuesto de agua, en una cantidad que oscila desde el 10 % hasta el 99 % en peso de la composici´on. 12. La composici´on de la reivindicaci´ on 1, que adem´ as comprende un humectante seleccionado de glicerina, propil´en glicol, sorbitol (soluci´ on al 70 %), polietil´en glicoles, polipropil´en glicoles y sus mezclas.

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13. La composici´on de la reivindicaci´ on 11, en la que dicha agua est´ a comprendida en el intervalo de desde el 5 % hasta el 50 % en peso de dicha composici´on. 14. La composici´on de la reivindicaci´ on 1, que adem´ as comprende un espesante seleccionado de pol´ımeros solubles en agua naturales o sint´eticos tales como carboximetil-celulosa s´odica, goma de xantano, carragenina, goma de algarroba, goma de tragacanto, hidroxietil-celulosa, alginato s´odico, almid´on, polivinilpirrolidona, poli(´ acido acr´ılico) y espesantes inorg´anicos seleccionados de silicato de magnesio y aluminio, hectoritas, y s´ılices hidratadas. 15. La composici´on de la reivindicaci´ on 1, que adem´ as comprende abrasivos seleccionados del grupo que consta de pirofosfato c´ alcico, carbonato c´alcico, s´ılice hidratada, hidr´ oxido de aluminio, fosfato dic´alcico dihidrato, fosfato tric´ alcico, metafosfato s´odico, metafosfato pot´asico, silicato de aluminio, poli(metacrilato de metilo) finamente dividido y sus mezclas. 10

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16. La composici´on de la reivindicaci´ on 1, en la que dicha composici´ on adem´ as comprende un tamp´on fisiol´ ogicamente aceptable. 5

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17. La composici´on de la reivindicaci´ on 16, en la que dicho tamp´ on fisiol´ ogicamente aceptable se selecciona de fosfato pot´asico, fosfato s´odico, fosfato dis´ odico, fosfato dipot´ asico y sus mezclas. 18. La composici´on de la reivindicaci´ on 1, que adem´ as comprende aditivos seleccionados del grupo que comprende conservantes, blanqueadores, colorantes, fluoruros, agentes antisarro y antic´ alculos, compuestos de clorofila, materiales amoniacales, agentes saborizantes y edulcorantes. 19. m´etodo para preparar una composici´ on dent´ıfrica, que comprende las etapas de:

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mezclar una enzima ´oxido-reductasa, un sustrato de la enzima o´xido-reductasa y una catalasa, en el que dicha enzima y sustrato forman per´ oxido de hidr´ ogeno cuando reaccionan entre s´ı, form´ andose dicho per´ oxido de hidr´ ogeno a una velocidad de al menos 100 micromoles/litro/minuto, estando presente dicha enzima ´oxido-reductasa en dicha composici´ on en la cantidad de al menos 0,1 Unidades valorim´etricas por gramo de dent´ıfrico, en el que dichas enzima ´oxido-reductasa y catalasa est´ an presentes en un veh´ıculo l´ıquido en una relaci´on desde So Unidades valorim´etricas de enzima ´oxido-reductasa frente a 1,0 Unidad Baker de catalasa, hasta 1,0 Unidad valorim´etrica de enzima ´oxido-reductasa frente a 1,0 Unidad Baker de catalasa; y almacenar dicha mezcla en un recipiente impermeable al ox´ıgeno.

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20. El m´etodo de la reivindicaci´on 19, en el que la composici´on se prepara con vac´ıo parcial o en una atm´ osfera sin ox´ıgeno, despu´es de a˜ nadirle la enzima o´xido-reductasa y un sustrato de la enzima oxido-reductasa. ´ 30

21. El m´etodo de la reivindicaci´ on 20, en el que dicha etapa de limitar la cantidad de ox´ıgeno en dicha composici´on se lleva a cabo en atm´osfera de un gas inerte.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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