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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 236 736

51 Int. Cl. : A61K 31/195, A61K 31/21

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A61K 31/34, A61K 31/42 A61K 31/70, A61K 31/04 A61K 31/00, A61P 7/08

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 96919782 .1

86 Fecha de presentación: 17.05.1996

87 Número de publicación de la solicitud: 0914110

87 Fecha de publicación de la solicitud: 12.05.1999

54 Título: Método de modulación de la microcirculación.

30 Prioridad: 18.05.1995 GB 9510037

73 Titular/es: Novartis AG.

Lichtstrasse, 35 4056 Basel, CH

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

72 Inventor/es: Schneider, Heinz

16.07.2005

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

ES 2 236 736 T3

16.07.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 236 736 T3 DESCRIPCIÓN Método de modulación de la microcirculación. 5

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La presente invención se refiere a un método de modulación de la microcirculación, en particular en pacientes que han experimentado o que han de experimentar cirugía electiva. La disrupción de la microvasculatura es un factor clave en mecanismos de daños por reperfusión, inter alia, hepáticos, mesentéricos e isquemia cardiaca. Recientes estudios in vitro empleando un modelo de perfusión hepática libre de sangre, con bajo flujo de sangre y con reflujo de sangre, han demostrado que los daños por reperfusión pueden ser reducidos mejorando la microcirculación. Por ejemplo, hígados perfusionados de ratas tratadas previamente con una dieta de aceite de pescado mostraron una notable mejora en la microcirculación y una importante reducción del daño hepático. Además, también se sabe que la adenosina, un vasodilatador conocido y un componente esencial en la solución Caroline Rinse, mejora la supervivencia después del transplante de hígado.

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Coughlan et al. (1193), Cadiovascular Research 27: 1444-1448; describen experimentos realizados en segmentos de arteria coronaria diseccionados en perros que previamente habían sido sometidos a oclusión y reperfusión de la arteria coronaria, y revelan que la isquemia y la reperfusión pueden aumentar la sensibilidad de dichos segmentos de arteria coronaria a SIN-1, un donador de NO y vasodilatador conocido. 20

Richard et al. (1993), Circulation, 88, 4:1254-1261, se refieren a experimentos realizados en ratas que revelan que el grado de vasodilatación de segmentos aislados de la arteria coronaria, en respuesta a la exposición SIN-1 permaneció inalterado incluso después de múltiples episodios isquémicos. 25

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La Patente US 5.385.940 describe que la L-arginina, o cualquier otro donador de NO, cuando se administra en una infusión intravascular rápida, puede mejorar las consecuencias de la isquemia relacionada con apoplejía. El uso de donadores de óxido nítrico como agentes protectores después de la isquemia y reperfusión miocardíaca ha sido dado a conocer y se describe, por ejemplo, en Lefer (1995), New Horizons, 3, 1:105-112. Se describen medios de administración, tales como infusión sistémica y aplicación intracoronaria. Siegfried et al. (1991), The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 260, 2:668-675, informan que dos donadores de ácido nítrico ejercen efectos beneficiosos en un modelo de isquemia miocardiaca por reperfusión. El donador de NO fue administrado a través de un catéter en la vena yugular una vez iniciada la isquemia.

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La presente invención proporciona, inter alia, un medicamento enteral, cuya administración, antes de la operación, a pacientes que han de ser sometidos a cirugía electiva, tiene un efecto profiláctico frente al daño por hipoperfusiónreperfusión en numerosos sistemas microcirculatorios. 40

De acuerdo con la presente invención se proporciona el uso de L-arginina, un precursor de L-arginina y/o sus sales fisiológicamente aceptables, en la preparación de un medicamento enteral o formulación nutricional para la mejora de la hipoperfusión microcirculatoria y/o para el tratamiento o profilaxis de daños por hipoperfusión-reperfusión, en pacientes que han experimentado cirugía electiva, caracterizado porque el medicamento o la formulación nutricional se administra al paciente antes de someterse éste a la operación quirúrgica.

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Precursores preferidos de L-arginina son ornitina o glutamina, prefiriéndose en particular la ornitina.

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La L-arginina es el sustrato para óxido nítrico sintetasa (NOS), la enzima responsable de la producción de óxido nítrico, una molécula altamente inestable que, inter alia, media la relajación del músculo liso en tejido vascular. Se sabe que dos formas de esta enzima están presentes in vivo, una forma constitutiva sensible a calmodulina - dependiente de calcio/NADPH localizada en células endoteliales y una forma esencialmente independiente de calcio cuya producción/actividad es inducida en respuesta, por ejemplo, a estrés metabólico mediado por endotoxina/citoquinina. La forma inducible de óxido nítrico sintetasa está localizada en macrófagos y células similares, tales como células de Kupffer y células microgliales en el hígado y sistema nervioso respectivamente.

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La producción endógena de óxido nítrico puede aumentar también el flujo sanguíneo al reducir el número de elementos sanguíneos que se adhieren al lumen del vaso. A elevadas dosis, el óxido nítrico puede ser citotóxico y causar daños oxidativos. 60

De acuerdo con la presente invención se proporciona también el uso de (i) un donador de óxido nítrico y/o (ii) un sustrato de óxido nítrico sintetasa y/o (iii) un precursor de dicho sustrato, en la preparación de un medicamento enteral o formulación nutricional para la mejora de la hipoperfusión microcirculatoria y/o para el tratamiento o profilaxis de daños por hipoperfusión-reperfusión, en pacientes que han experimentado cirugía electiva, caracterizado porque el medicamento o la formulación nutricional se administra al paciente antes de someterse éste a operación quirúrgica.

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Es preferible que el tratamiento se inicie al menos un día antes de la operación quirúrgica y que el medicamento o formulación se administre durante un período de 3 a 10 días antes de la operación quirúrgica, con lo que el tratamiento se inicia entre 3 y 10 días (inclusive) antes de la operación quirúrgica. 2

ES 2 236 736 T3

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Como se ha indicado anteriormente, el medicamento o formulación se puede administrar en un forma adecuada para administración enteral, contemplándose en particular la administración oral, la administración nasal y/o la alimentación por tubo. El medicamento o formulación se administra convenientemente en forma de un líquido acuoso. El medicamento o formulación se encuentra preferentemente en forma acuosa o en polvo, en donde el polvo se incorpora convenientemente en agua antes de su uso. Para su empleo en la alimentación por tubo, la cantidad de agua a añadir dependerá, inter alia, de las necesidades de fluido y estado del paciente. El efecto beneficioso del uso del medicamento o formulación de la presente invención para el tratamiento o profilaxis de daños por hipoperfusión-reperfusión, en pacientes que han experimentado cirugía electiva, se debe a la mejora de la microcirculación en los respectivos órganos. Las mejoras más pronunciadas en las microcirculaciones están asociadas con las circulaciones mesentérica, intestinal, hepática y cardiaca derivadas del uso del medicamento o formulación de acuerdo con la invención.

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La cantidad de medicamento o formulación a administrar depende en gran medida de las necesidades específicas del paciente. En el caso de que el medicamento o formulación comprenda L-arginina (o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma) o un precursor de L-arginina, tal como ornitina, el paciente deberá ser administrado lo suficiente para aumentar la concentración total de L-arginina en plasma desde niveles basales de alrededor de 70-85 µM a alrededor de 100-200 µM, preferentemente a alrededor de 120-150 µM. La concentración total de L-arginina en plasma no deberá elevarse preferentemente por encima de alrededor de 200 µM, como consecuencia del uso de acuerdo con la invención. El medicamento o formulación puede ser de este modo formulado para suministrar al paciente alrededor de 1 a 30 g, preferentemente 5 a 18 g, de sustrato de óxido nítrico sintetasa o L-arginina, un precursor de L-arginina y/o sus sales fisiológicamente aceptables, durante 24 horas, o alrededor de 0,1 a 20 g de donador de óxido nítrico durante 24 horas. Sin embargo, ha de apreciarse que, en particular, cuando el medicamento o formulación comprende donadores de óxido nítrico per se, el paciente no deberá ser administrado con una dosis de medicamento o formulación tan elevada que lleguen a ser evidentes los efectos (cito)tóxicos del óxido nítrico. En particular es preferible que el sustrato de óxido nítrico sintetasa sea L-arginina o una sal fisiológicamente aceptable de la misma. En un individuo no estresado por endotoxina/citoquinina cabe esperar que el sustrato sea utilizado por la óxido nítrico sintetasa constitutiva sensible a calmodulina/dependiente de calcio y NADPH y, por tanto, la invención contempla esta forma de la sintetasa como la diana para la L-arginina contenida dentro del medicamento o formulación, o bien para la L-arginina que resulta del precursor (tal como ornitina o glutamina contenida dentro del medicamento o formulación) que metabólicamente se convierte a L-arginina tras la ingestión/digestión por el paciente. El donador de óxido nítrico presente en el medicamento o formulación se puede seleccionar del grupo consistente en trinitrato de glicerol, dinitrato de isosorburo, nitroprusiuro, 8-bromoguanosina-3,5’-monofosfato, espermina-NO, espermidina-NO y SINI. La angiotensina II es un potente vaso-constrictor espláncnico y se libera en cantidades acentuadas durante la cirugía que está asociada con una alta incidencia de hipoperfusión mucosal del intestino. Además, los fármacos antiinflamatorios no esteroidales y los barredores de radicales libres podrían modular el grado de hipoperfusión mucosal del intestino y/o el grado de daños histológicos consecuentes tras la reperfusión. En consecuencia, el medicamento o formulación comprende además convenientemente barredores de radicales libres (superóxido) (tales como vitaminas C y E) y/o inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) y/o fármacos anti-inflamatorios no esteroidales, tal como aspirina o ibuprofeno, y/o ácidos grasos omega-3 poliinsaturados (PUFAs) que están protegidos de un modo farmacológicamente aceptable contra la peroxidación. Los omega-3 PUFAs se pueden emplear en forma del ácido libre, en una forma adecuada para el suministro fisiológico de omega-3 PUFAs, por ejemplo, en forma de triglicéridos, o bien en forma de fuentes naturales farmacológicamente aceptables de PUFAs. Dichas fuentes naturales incluyen aceite de linaza y aceites de pescado, tales como aceite de sábalo, aceite de salmón, aceite de caballa, aceite de atún, aceite de hígado de bacalao y aceite de anchoa. Dichas fuentes naturales, en particular, los aceites de pescado, comprenden cantidades sustanciales de ácidos omega5 grasos. Cuando los omega-3 PUFAs se emplean en forma de triglicéridos, dichos triglicéridos pueden comprender ésteres con otros ácidos grasos farmacológicamente aceptables.

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Los omega-3 PUFAs preferidos incluyen ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA), en forma del ácido libre, en forma de triglicéridos o en forma de fuentes naturales que tienen un alto contenido en EPA y/o DHA. 60

Si bien el medicamento o formulación debe administrarse antes de la operación quirúrgica, no existe razón alguna por la cual su administración no pueda continuarse opcionalmente después de la operación. Dicho uso opcional del medicamento dependerá como es natural de las circunstancias del individuo, pero se supone que el uso podría continuarse convenientemente durante todo el período de hospitalización del paciente (hasta 20 días) y quizá aún más.

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En una modalidad preferida, la presente invención proporciona el uso de L-arginina, un precursor de L-arginina y/o sus fisiológicamente aceptables junto con omega-3 PUFAs que opcionalmente están protegidos de un modo farmacológicamente aceptable contra la peroxidación, en la preparación de un medicamento enteral o formulación nutricional para la mejora de la hipoperfusión microcirculatoria y/o para el tratamiento o profilaxis de daños por hipoperfusión-re3

ES 2 236 736 T3 perfusión, en pacientes que han experimentado cirugía electiva, caracterizado porque el medicamento o la formulación nutricional se administra al paciente antes de someterse éste a la operación quirúrgica. 5

En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona el uso de (i) un donador de óxido nítrico y/o (ii) un sustrato para óxido nítrico sintetasa y/o (iii) un precursor de dicho sustrato junto con omega-3 PUFAs, en la preparación de un medicamento enteral o formulación nutricional para la mejora de la hipoperfusión microcirculatoria y/o para el tratamiento o profilaxis de daños por hipoperfusión-reperfusión, en pacientes que han experimentado cirugía electiva, caracterizado porque el medicamento o la formulación nutricional se administra al paciente antes de someterse éste a la operación quirúrgica.

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En particular, es preferible que el sustrato de óxido nítrico sintetasa sea L-arginina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. 15

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El medicamento o formulación que se emplea de acuerdo con la invención puede comprender además (y preferentemente así será) otros compuestos nutricionalmente convenientes tales como vitaminas, minerales, trazas de elementos, fibras (preferentemente fibras solubles), así como fuentes de nitrógeno, fuentes de carbohidratos y otras fuentes de ácidos grasos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen proteínas nutricionalmente aceptables tales como proteínas derivadas de la soja o suero, caseinatos y/o hidrolizados de proteínas. Fuentes de carbohidratos adecuadas incluyen azúcares tales como maltodextrinas. Ejemplos de fuentes adecuadas de ácidos grasos, aportadoras de energía, incluyen triglicéridos, así como di- y monoglicéridos. Ejemplos de vitaminas adecuadas para incorporarse en el medicamento de la invención incluyen vitamina A, vitamina D, vitamina K, ácido fólico, tiamina, riboflavina, vitamina B6 , vitamina B12 , niacina, biotina y ácido pantoténico en una forma farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de elementos minerales y trazas de elementos adecuados para incorporarse en el medicamento incluyen sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso, cobre, zinc, hierro, selenio, cromo y molibdeno en una forma farmacéuticamente aceptable. En particular, el medicamento o formulación comprenderá preferentemente beta-caroteno (vitamina A), vitamina E, vitamina C, tiamina y colina, en una forma farmacéuticamente aceptable.

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El término “fibra soluble” tal como aquí se emplea se refiere a fibras que son capaces de experimentar una fermentación sustancial en el colon para producir finalmente ácidos grasos de cadena corta. Ejemplos de fibras solubles adecuadas incluyen pectina, goma guar, goma de algarrobilla, goma de xantano, que pueden estar opcionalmente hidrolizadas. Para adultos, la cantidad total de fibra soluble por día será convenientemente del orden de 3 a 30 g.

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El medicamento o formulación está destinado principalmente a utilizarse como un suplemento dietético. En tal caso, la cantidad de energía aportada por el mismo no deberá ser demasiado excesiva, con el fin de no suprimir de forma innecesaria el apetito del paciente. El suplemento deberá comprender convenientemente fuentes energéticas en una cantidad que aporten de 600 a 1500 Kcal/día. La contribución de la fuente de nitrógeno, fuente de carbohidratos y fuente de lípidos a las calorías totales diarias puede variar dentro de amplios intervalos. En formas preferidas del medicamento o formulación, la fuente de carbohidratos proporciona del 40 a 70% del aporte energético total y las fuentes de nitrógeno y de ácidos grasos aportan, cada una de ellas del 15 a 30% del aporte energético total del medicamento.

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El medicamento o formulación se puede formular de una manera conocida per se, por ejemplo, mezclando simplemente los ingredientes. La invención podrá entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos. Se utiliza el modelo de perfusión del hígado con bajo flujo y con reflujo para investigar los efectos de L-arginina sobre el daño por reperfusión en ausencia de posibles complicaciones de elementos sanguíneos. En este modelo, regiones pericéntricas del lóbulo del hígado se hacen anóxicas reduciendo la velocidad de flujo durante un período inicial de la perfusión. Posteriormente, se restablecen velocidades de flujo normales que dan lugar a un daño por reperfusión dependiente de oxígeno en las regiones pericéntricas del lóbulo de hígado. Ejemplo 1

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Perfusión de hígado a bajo flujo y reflujo - modelo animal Animales y dietas 65

Ratas Sprague-Dawley machos que pesan 100-160 g son enjauladas individualmente y suministradas con dietas en polvo que contienen 5% en peso de aceite de maíz, aceite de pescado encapsulado o aceite de pescado encapsulado con L-arginina adicional en un diseño ciego ad libitum durante 12-19 días o con una dieta en polvo que contiene 5% en peso como L-arginina durante 3 días (Tabla 1). Las dietas se mantienen bajo nitrógeno a 4ºC y diariamente se 4

ES 2 236 736 T3 proporcionan dietas nuevas. La toma de alimentos se evalúa pesando la dieta que queda cada día. Las ratas se dejan en ayunas durante 24 horas antes de la perfusión del hígado. Perfusión 5

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Las ratas se anestesian con pentobarbital sódico (1 µl/g) antes de la cirugía y los hígados se retiran quirúrgicamente y son perfusionados, por vía de una cánula insertada en la vena portal, con tampón de bicarbonato Krebs-Henseleit (pH 7,4, 37ºC) saturado con una mezcla de oxígeno-dióxido de carbono (95:5) en un sistema de no recirculación como es conocido en la técnica. Después de la cirugía, los hígados son perfusionados a velocidades de flujo de alrededor de 1 ml/g/min durante 75 minutos (bajo flujo). En estas condiciones, las áreas periportales son normóxicas mientras que las regiones pericentrales adyacentes son anóxicas. A continuación, los hígados son perfusionados a velocidades de flujo normales (4 ml/g/min) durante 40 minutos (reflujo). La concentración de oxígeno en el perfusado efluente es controlada continuamente con un electrodo de oxígeno de tipo Clark, revestido con Teflon. La absorción de oxígeno se calcula a partir de la diferencia de la concentración influente menos la efluente, la velocidad de flujo y el peso en húmedo de los hígados. Se inserta una llave de tres vías en el tubo junto antes de la cánula que entra en la vena portal. Se coloca un tubo de polietileno (PE 240) en la llave de tres vías perpendicularmente a la cánula que entra en la vena portal. Se controla la presión portal por cambios en la altura de una columna de agua durante la perfusión. El conducto biliar común se canula con tubo de polietileno (PE-10; Clay Adams) y se recogen partes alícuotas de bilis en viales tarados a intervalos de 15 minutos en la perfusión a bajo flujo y a intervalos de 10 minutos durante los períodos de reflujo. Las tasas de producción de bilis se calculan a partir del peso de las bilis, intervalos de tiempo y peso en húmedo del hígado. Análisis Se determina la actividad de lactato dehidrogenasa (LDH) en el perfusado empleando técnicas enzimáticas estándar y se evalúa malondialdehído (MDA) empleando ácido tiobarbitúrico de acuerdo con métodos conocidos. De forma resumida, se mezclan a fondo 3 ml de perfusado con un reactivo que contiene 15% de ácido tricloroacético, 0,735% de ácido tiobarbitúrico y ácido clorhídrico 0,25 N y se calienta durante 15 minutos en un baño de agua hirviendo. Después de enfriar, se determina la absorbancia a 535 nm del sobrenadante. La concentración de MDA en el perfusado se calcula por comparación con referencias de MDA. Las velocidades de liberación de LDH y MDA se expresan como peso en húmedo en gramos del hígado por hora. Para evaluar la microcirculación en el hígado, se infusiona azul de tripano en el hígado al término de todos los experimentos a una concentración de 0,2 mM. Se anota el tiempo para que la superficie del hígado se vuelva de color azul oscuro uniforme, lo cual es una indicación del estado de la microcirculación del hígado. Los resultados se someten a análisis estadístico cuando resulte adecuado. Se emplean el ensayo T de Student o ANOVA, considerándose importantes las diferencias al nivel de P0,05, ensayo T de Student). Considerando esto de forma conjunta, el daño por reperfusión, que ocurre cuando se vuelve a introducir oxígeno en el hígado previamente anóxico, se reduce al mínimo al alimentar previamente las ratas con una dieta suplementada con aceite de pescado y arginina.

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ES 2 236 736 T3 Efecto de la prealimentación con arginina sobre la producción de molondialdehído

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El MDA, un producto final de la peroxidación de lípidos, se libera en el perfusado efluente a velocidades de alrededor de 15 nmol/g/h durante 75 minutos de perfusión a bajo flujo en hígados de ratas alimentadas con aceite de maíz, aceite de pescado encapsulado, L-arginina y aceite de pescado encapsulado más arginina. Cuando las velocidades de flujo se restablecieron a valores normales, la producción de MDA aumentó rápidamente hasta valores pico en aproximadamente 15 minutos y luego descendió ligeramente. La producción máxima de MDA durante el período de reperfusión fue de alrededor de 90 nmol/g/h en ratas de control, 80 nmol/g/h en ratas tratadas con aceite de pescado encapsulado, 45 nmol/g/h en ratas tratadas con L-arginina y 67 nmol/g/h en ratas prealimentadas con aceite de pescado encapsulado suplementado con arginina, respectivamente, no siendo estadísticamente importante las diferencias entre los diversos grupos. Efecto de la prealimentación con arginina sobre el tiempo de distribución de azul de tripano

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El tiempo de distribución del azul de tripano es un indicador de la microcirculación hepática. Se necesitaron 10,7 minutos para que el azul de tripano se distribuyera uniformemente en los hígados de ratas tratadas con aceite de maíz, 6,0 minutos en el caso de ratas prealimentadas con aceites de pescado encapsulados, 3,8 minutos en el caso de ratas prealimentadas con L-arginina y 2,8 minutos para ratas prealimentadas con aceites de pescado encapsulados suplementados con arginina. Estos resultados son extremadamente importantes (p