INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS Departamento de Biotecnología

“Estudio exploratorio para el establecimiento del cultivo in vitro de especies de helechos silvestres con potencial ornamental” T

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Que para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos

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Biól. JOSÉ ALICVAJAN DÍAZ ESPINOZA DIRECTORA: Dra. SILVIA EVANGELISTA LOZANO

Yautepec, Morelos.

Noviembre del 2007

Imagen de Portada El "koru" es un símbolo Maaori (de Nueva Zelanda). El "koru" es simplemente la fronda nueva de un helecho, que se desarrolla para ser una hoja del helecho. Sin embargo, se considera que el Koru se extiende para alcanzar la luz, esforzándose para tener perfección, y fomentando nuevo crecimiento. El Koru representa el desarrollo de una nueva vida, con la esperanza del futuro, pero también la necesidad de esfuerzo para lograr crecimiento y perfección.

Este trabajo de investigación constituye uno de los objetivos planteados en los proyectos CGPI 20040676, 20050278 y 20060123 apoyados por el Instituto Politécnico Nacional y por el proyecto “Transferencia de tecnología en la propagación de Bouganvillea glabra Choise y otras ornamentales” apoyado por la Fundación Produce Morelos y dirigidos por la Dra. Silvia Evangelista Lozano. Para la realización de los estudios de Maestría se contó con las becas CONACYT (BO40677), PIFI (Programa Institucional de Formación de Investigadores) y BecaTesis del IPN.

El trabajo experimental de esta tesis se realizo en el Departamento de Biotecnología Vegetal del CEPROBI-IPN (en los Laboratorios de Cultivo de Células y Tejidos Vegetales y de Propagación ex vitro), bajo la dirección de la Dra., Silvia Evangelista Lozano. Así también parte de este trabajo se desarrollo en áreas de otras instituciones: en la Unidad de Laboratorio de Micropropagación del Centro de Desarrollo Tecnológico Tezoyuca del FIRA, con la asesoría del Biol. Ricardo Flores Olascoaga y en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala de la UNAM, bajo la asesoría del Dr. Ernesto Aguirre León.

EN SILENCIO Aquí estoy en la guerra de emociones aquí estoy sin dolor ni pasión, respirando soledad, leo en libro, libertad en dibujos animados describiendo todo y nada de mí. Reverberación, hay una razón, late en mi corazón una canción en un vuelo sin límites en un vuelo sin límites Quiero cantar sin límites quiero volar sin límites quiero vivir sin límites y en silencio... recordar... recordar Alfredo Díaz Ordaz

DEDICADO A: JADE, JADEITO, JADEITA, JADEITOA, JADEIS, JADEISIMO, FERNSITO. LA MEJOR MA DEL MUNDO QUE ES LA MIA: TODO LO HAGO POR USTED, EL ÚNICO SER QUE NUNCA, NUNCA DEJARA DE AMARME, AQUÍ ESTA Y ESTARA POR SIMEPRE SU MIJO. MIS HERMANAS BÉLGICA (TE EXTRAÑO MUCHO) Y DALIA, POR SU APOYO EN TODO LO QUE HAGO. ROSENDO Y FERNADO, POR SU APOYO MORAL. MIS SOBRINOS: IVAN (FLAKITO), YAO, VANEZA Y XAVIERO. Y A EL ESPOSO DE MI HERMANA: GERARDO. RMVM FLPH (HAND ON YOUR HEART) Y RTH (TRULY MADLY DEEPLY). FALTA LA TERCERA R, POR QUE JJEH Y JAA NO EMPIEZAN CON R. THALIA, MADONNA Y KYLIE MINOGUE.

AGRADECIDO CON:

DRA. SILVIA EVANGELISTA LOZANO, SOLO PUEDO DECIRLE: GRACIAS POR ENSEÑARME A SER UN TECNOLOGO, POR ADENTRARME AL MUNDO ORNAMENTAL, POR SU CONFIANZA, POR EL CARIÑO DEMOSTRADO, MIL GRACIAS!!! DRA. MA. DE LA LUZ ARREGUIN SANCHEZ POR LOGRAR “SACAR” MI GUSTO NATURAL POR LO HELECHOS, POR GUIARME EN LA LICENCIATURA Y TAMBIEN EN LA MAESTRIA, POR CONFIAR EN MI. MIS AMIGOS DE TODA LA VIDA (CASI): RUBEN, CARMEN Y EMANUEL, CON USTEDES HE CRECIDO DEMASIDO COMO PERSONA. MIS AMIGOS DE LA LICENCIATURA Y QUE LO SIGUEN SIENDO (QUE AGUANTE): AYAX Y LILIA, GRACIAS POR ESTAR CONMIGO, A PESAR DE MIS TROPIEZOS. MIS AMIGOS QUE GANE EN LA MAESTRÍA: MISS KAROLITA (MANITA), JORGE (PAPI), DENISSE (SOCIA: Deniptera mortis) Y SAN JOSÉ (SANTO, SANTO ES EL SEÑOR). A QUE NO HABIAN CONOCIDO ALGUIEN TAN CHOCOSITO COMO YO. ROGER (MANITO): GRACIAS POR SER MI AMIGO Y ENSEÑARME TODO MORELOS. MIS COMPAÑEROS DE MAESTRÍA, DOCTORADO Y PERSONAL DEL CEPROBI: SEÑORA GABY, MINE BONITA (JA), ALEJO (AMIGOO), J GO (EX AMIGA COMPARTIDA), ANGEL (ESCARABAJITO VERACRUZANO), NORMA (YA NO ME REGAÑES), PLÁCIDO (PhaseolusitoI), LINO (PhaseolusitoII), TOÑITA, SANDRA, MARIA LUISA, ARACELI. LOS MEJORES PROFESORES DE LA MAESTRIA (SEGÚN YO): DR. ARZUFFI (GRACIAS POR LA CONFIANZA, VALE MIL!!!) Y DRA. ISABEL (SUPER SUS CLASES). LOS PROFESORES QUE ME APOYARON EN LO ACADEMICO: DR. ANTONIO, DRA. MARTHA Y DR. ALFREDO. BIÓL. RICARDO FLORES OLASCOAGA, POR TODO EL APOYO EN LA ÚLTIMA FASE DE LA TESIS. EL COMITÉ REVISOR DE LA TESIS LA COMUNIDAD MAS DIVERSA DEL CEPROBI: ARNOLD (SEÑOR), PABLO (SEÑOR DR.), FERCHITO Y GUS (MAMI!!!).

ÍNDICES, RESUMEN-JADE

ÍNDICE CAPÌTULO

PÁGINA

ÍNDICE DE CUADROS. ÍNDICE DE FIGURAS. LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS. RESUMEN. ABSTRACT. 1. ANTECEDENTES. 1.1. Recursos Fitogenéticos de México: el caso de las plantas ornamentales. 1.1.2. La Horticultura Ornamental. 1.1.3. Sustratos en horticultura ornamental. 1.1.4. Fuentes de propágulos en horticultura ornamental. 1.2. Comercialización de las plantas ornamentales en el país. 1.2.1. Los helechos como plantas ornamentales. 1.2.2 Comercialización de helechos ornamentales en la zona centro-sur de México. 1.2.3. Los helechos ornamentales en el Estado de Morelos. 1.2.4. Los helechos silvestres de Morelos con potencial ornamental. 1.3. División Pteridophyta divis. J.Y. Bergen & B.M. Davis. 1.3.1. Los Helechos. 1.3.2. Distribución. 1.3.4. Morfología. 1.3.5. Ciclo Biológico. 1.4. Descripción de las especies en estudio. 1.4.1. Familia Aspleniaceae fam. Newman 1.4.2. Género Asplenium L. 1.4.2.1. Asplenium muenchii A.R. Sm. 1.4.2.2. Asplenium sessilifolium Desv., Ges. 1.4.3. Familia PTteridaceae fam. E.D.M. Kirchn. 1.4.4. Género Adiantum L. 1.4.4.1. Adiantum poiretii Wikstr 1.5. Germinación y viabilidad de esporas. 1.6. Propagación de helechos. 1.6.1. Propagación in vitro. 1.6.1.1. Cultivo de tejidos vegetales. 1.6.2. Propagación in vitro de helechos. 1.6.2.1. Germinación de esporas in vitro. 1.6.2.2. Uso de explantes vegetativos in vitro. 2. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTÉSIS. 3. OBJETIVOS. 4. MATERIALES Y METÓDOS. 4.1. Selección del sitio de colecta para la elección de las especies en estudio, con base a antecedentes de tipos de vegetación y de pteridoflora del Estado de Morelos. 4.2. Descripción del sitio de colecta y abundancia de las especies en estudio. 4.3. Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para fuentes de propágulos, aclimatización y herborización.

i

iii iv vi vii viii 1 1 1 2 3 3 4 4 5 5 6 7 7 7 8 10 10 10 10 11 11 12 12 13 14 15 15 16 16 17 19 21 22 22

22 26

ÍNDICES, RESUMEN-JADE

CAPÌTULO

PÁGINA

4. MATERIALES Y METÓDOS 4.4. Desinfección de esporas. 4.5. Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas in vitro. 4.6. Evaluación de la viabilidad de esporas. 4.7. Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro. 5. RESULTADOS. 5.1. Abundancia de las especies en estudio. 5.2. Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para fuentes de propágulos, aclimatización y herborización. 5.3. Desinfección de esporas. 5.4. Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas in vitro. 5.5. Evaluación de la viabilidad de esporas. 5.6. Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro. 6. DISCUSIONES. 6.1. Abundancia de las especies en estudio. 6.2. Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para fuentes de propágulos, aclimatización y herborización. 6.3. Desinfección de esporas. 6.4. Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas in vitro. 6.5. Evaluación de la viabilidad de esporas. 6.6. Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro. 7. CONCLUSIONES Y SUGERENCIAS. 8. BIBLIOGRAFIA. ANEXOS. ANEXO 1. COMPOSICIÓN DE AGROQUÍMICOS: BACTERICIDAS FERTILIZANTES Y FUNGICIDAS. ANEXO 2. SUSTRATOS HORTÍCOLAS. ANEXO 3. VARIOS.

ii

28 30 34 35 40 40 41 47 48 51 52 54 54 56 57 59 63 64 67 69 I I IV VI

ÍNDICES, RESUMEN-JADE

ÍNDICE DE CUADROS NÚMERO Y NOMBRE Cuadro 1. Medición de las variables ambientales y el pH de los sitios de colecta. Cuadro 2. Ubicación geográfica helechos en estudio.

del sitio de colecta de las especies de

PÁGINA 24 24

Cuadro 3. Protocolos de desinfestación de esporas de helechos.

29

Cuadro 4. Medio de cultivo MS.

31

Cuadro 5. Componentes del Medio MEI.

37

Cuadro 6. Modificaciones del MEI.

37

Cuadro 7. Abundancia-cobertura (Braun-Blanquet*), de las especies de helechos en estudio.

41

Cuadro 8. Índice de densidad lineal (DLi) y especies de helechos en estudio.

41

cobertura lineal (CL), de las

Cuadro 9. Respuesta de las plantas madre de campo a la aclimatización.

45

Cuadro 10. Evaluación del desarrollo de las prefoliaciones de las plantas madre provenientes de campo en el proceso de aclimatización.

46

Cuadro 11. Evaluación de los protocolos de desinfestación de esporas de helechos.

47

Cuadro 12. Índice de germinación (IG)* de las esporas de las especies de helechos en estudio en medios y sustratos.

49

Cuadro 13. Viabilidad de las esporas de los helechos en estudio, utilizando el Reactivo de Mutzing.

51

Cuadro 14. Evaluación de los protocolos de desinfestación de prefoliaciones y yemas foliares.

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iii

ÍNDICES, RESUMEN-JADE

ÍNDICE DE FIGURAS NÚMERO Y NOMBRE

PÁGINA

Figura 1. Principales géneros de helechos silvestres con potencial ornamental del Estado de Morelos (Díaz Barriga, 1995; Riba et al., 1996).

5

Figura 2. Géneros representativos de las principales Clases de la División Pteridophyta: A. Psilotum, B. Lycopodium, C. Equisetum y D. Polypodium.

6

Figura 3. Esquema de la especie Dryopteris filis-max (L.) Schott., en donde se aprecian las principales partes de un helecho: A. Fronda, B. Prefoliaciones, C. Rizoma, D. Raíces, E. Soros y F. Esporangios (Fuente: www.plant-pictures.de).

8

Figura 4. Ciclo homospórico, el más común en los helechos. (Fuente: www.bio.miami.edu.

9

Figura 5. Imágenes que muestran la fisonomía de uno de los sitios de colecta: Barranca Agua Bendita, Ocuituco, Morelos. A. Pendiente; B. Fondo.

23

Figura 6. Imágenes de los equipos usados en campo para determinar temperatura, humedad relativa e intensidad luminosa. A. Higrotermómetro, B. Cuántometro y C. Sensores de los equipos.

23

Figura 7. Mapa del Estado de Morelos en donde se muestra el sitio de las colectas realizadas (GoogelEarth®, 2006).

25

Figura 8. Transecto realizado en campo para Asplenium muenchii A. R. Sm.

40

Figura 9. Fronda de un individuo de Adiantum poiretii Wikstr. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis.

42

Figura 10. Aspecto general de un individuo de Asplenium muenchii A.R. Sm. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis.

43

Figura 11. Aspecto general de un individuo de Asplenium sessilifolium Desv., Ges. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis.

43

Figura 12. Proceso de aclimatización en cámara de cultivo de individuos de Asplenium muenchii A. R. Sm. A. Planta colocada en maceta, B. Bolsa de polipapel cubriendo a la planta y C. Disposición final de las plantas en la cámara de cultivo.

44

Figura 13. . Prefoliaciones en diferentes estados de crecimiento en plantas de Adiantum poiretii Wikstr: A. Estado de crecimiento 1; B. Estado de crecimiento 2; C. Estado de crecimiento 4 y D. Estado de crecimiento 6 (con base a la escala de Strandberg, 2003).

47

iv

ÍNDICES, RESUMEN-JADE

NÚMERO Y NOMBRE

PÁGINA

Figura 14. Formación de gametofitos, como resultado de la germinación de las esporas, en medios de cultivo semisólidos y en sustratos hortícolas: A. Gametofitos de Adiantum poiretii Wikstr en medio MS; B. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. creciendo en medio MS; C. Gametofitos de Asplenium muenchii A. R. Sm en agrolita y D. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. sobre vermiculita.

50

Figura 15. Imágenes de la esporas sometidas al reactivo de Mutzing: A. Espora no viable de Asplenium muenchii A. R. Sm. (10X), B. Espora no viable de Asplenium sessilifolium Desv.(40X) y C. Espora viable de Asplenium sessilifolium Desv. (40X) 1. Perisporio, 2. Exosporio, 3. Endosporio y 4. Célula germinal.

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v

ÍNDICES, RESUMEN-JADE

LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS. % µmol.m-2s-1 2,4-D 2n AG ANA BA cm. FIRA g GPS ha HCl HR I IAA IB IG INEGI kg KIN L lb/kg m2 mg min ml mm MS n N NaOCl NaOH o C pH rpm T v/v µs

porcentaje micromoles por metro cuadrado sobre segundo ácido 2,4-diclorofenoxiacético diplóide;dos juegos de cromosomas ácido giberelico ácido naftanelacético. bencil aminopurina. centímetros Fideicomisos Instituidos en Relación con la Agricultura. gramos. Global Positioning System (Sistema de Posicionamiento Global). hectárea acido clorhídrico humedad relativa. Intensidad luminosa ácido indol acético. acido indol butirico índice de germinación Instituto Nacional de Estadística, Geografia e Informática. kilogramo cinetina litro libras sobre kilogramos metros cuadrados miligramos. minutos mililitros milímetros medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962). haploide; un solos juego de cromosomas normalidad hipoclorito de sodio. hidróxido de sodio grados centígrados potencial de hidrogeniones revoluciones por minuto. temperatura Volumen sobre volumen micro siemens por metro

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ÍNDICES, RESUMEN-JADE

R E S U M E N.

La industria de la Horticultura Ornamental, representa una buena fuente de empleos, ya sea de manera directa e indirecta, siendo los Estados de Puebla, México, Michoacán, Morelos y Sinaloa los que cuentan con mayor producción y superficie cultivada de plantas ornamentales (Mundo, 2006).

En el caso de los helechos ornamentales en México se manejan alrededor de 20 géneros, que incluyen 33 especies y 35 variedades; siendo los géneros más comercializados Adiantum, Asplenium, Blechnum, Cyathea, Davallia, Nephrolepis, Pteris, Platycerium y Rumorha.

Morelos es un Estado reconocido por la producción de plantas ornamentales, entre ellas los helechos, es el principal proveedor de helechos para la zona centro-sur del país (Cabrera y Orozco, 2003); estos se importan in vitro o en charolas, y el acondicionamiento final (aclimatización) se lo dan los productores (Flores, 2006).

En Morelos se reportan especies de helechos silvestres, que cuentan con características arquitectónicas, con las que podrían ser considerados con potencial ornamental (Díaz, 1995; Riba et al., 1996; Red de Ornamentales, 2006), destacando los géneros Thelypteris, Asplenium, Adiantum, Cheilanthes, Pellaea y Pteris; en este trabajo se aporta información de tres especies silvestres colectadas in situ: Adiantum poiretii Wikstr, Asplenium

muenchii A. R. Sm. y Asplenium

sessilifolium Desv.

relacionada con la abundancia; germinación de esporas tanto en medios de cultivos como en sustratos hortícolas in vitro, con la implementación del protocolo de desinfestación y pruebas de viabilidad; aclimatización de plantas colectadas en campo; así también, información sobre protocolos para desinfestación y medio de cultivo para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro.

vii

ÍNDICES, RESUMEN-JADE

A B S T R A C T. The industry of the Ornamental Horticulture, is a good source of jobs, either directly or indirectly, with the states of Puebla, Mexico, Michoacan, Morelos and Sinaloa those with higher production and area under cultivation of ornamental plants (Mundo, 2006).

In the case of ornamental ferns in Mexico are handled around 20 genera, including 33 species and 35 varieties; being marketed more genres: Adiantum, Asplenium, Blechnum, Cyathea, Davallia, Nephrolepis, Pteris, Platycerium y Rumorha.

Morelos is a State recognized by the production of ornamental plants, including ferns, is the leading provider of ferns for the central area of the country (Cabrera y Orozco, 2003); these are imported in vitro or in trays, and the fitting end (acclimatization) will give producers (Flores, 2006).

In Morelos reported species of wild ferns, which have architectural features, which might be considered ornamental potential (Díaz, 1995; Riba et al., 1996; Red de Ornamentales,

2006),

stressing

gender

Thelypteris,

Asplenium,

Adiantum,

Cheilanthes, Pellaea y Pteris; this paper provides information collected in situ three wild species Adiantum poiretii Wikstr, Asplenium muenchii A. R. Sm. y Asplenium sessilifolium Desv. related abundance; germination of spores both in culture media as horticultural substrates in vitro, with the implementation of the protocol and testing disinfection feasibility; acclimatization of plants collected in the field, and also, information about protocols for disinfection and a half crop prefoliaciones and apical leaf buds in vitro.

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ANTECEDENTES-JADE

1. A N T E C E D E N T E S.

1.1. Recursos fitogenéticos de México: el caso de las plantas ornamentales.

El potencial ornamental que tiene nuestro país no se ha aprovechado en toda su magnitud, especialmente por sectores de la sociedad que cuentan con los recursos fitogenéticos. Galicia (1995), Leszczyñska y Borys (2001), Ortega et al. (2000), Mejía y Espinosa (2003), exponen la importancia de las plantas ornamentales cultivadas, nativas cultivadas o con potencial de ser cultivadas. Rzedowski (1995) menciona que en el ámbito mundial México ha aportado alrededor de 40 especies ornamentales de gran importancia. Así en un muestreo de catálogos de horticultura de diferentes países, se detectaron 600 especies mexicanas que se ofrecen a la venta (Red de Ornamentales, 2006).

Además, existe un importante grupo de plantas que no aparecen en los catálogos, pero son de uso consistente (que se siembran en los jardines, calles, huertos familiares del país y que son plantas nativas), muchas de ellas en etapas avanzadas de selección, por ejemplo: fresno (Fraxinus uhdei -Wenz.- Lingelsh.), colorín (Erytrina americana Mill), cedro blanco (Cupressus lusitanica Mill.), tigridia o cacomite (Tigridia pavonea (L. f.) DC.), entre otras (Red de Ornamentales, 2006).

1.1.2. La Horticultura Ornamental.

Una rama de la agricultura la constituye la horticultura (“hortus”: jardín; “cultura”: cultivar), que su vez se divide en olericultura, fruticultura, especicultura y ornamenticultura, esta última llamada también Horticultura Ornamental, que se define como un sistema de producción y comercialización de especies vegetales que tienen un valor estético o decorativo (Mundo, 2006).

1

ANTECEDENTES-JADE

Se considera que el valor del comercio internacional de las plantas ornamentales puede oscilar entre 5,000 y 10,000 millones de dólares por año, independientemente del valor del comercio interno de cada país (Mundo, 2006).

1.1.3. Sustratos en horticultura ornamental.

El término “sustrato” que se aplica en la producción viverística, se refiere a todo material sólido diferente del suelo que puede ser natural o sintético, mineral u orgánico y que colocado en un contenedor, de forma pura o mezclado, permite el anclaje de las plantas a través de su sistema radicular; el sustrato puede intervenir o no en el proceso de nutrición de la planta. Esto último clasifica a los sustratos en químicamente inertes como la agrolita y roca volcánica; y químicamente activos como la turba y la corteza de pino (Pastor, 1999). Las características de los sustratos son: A. Características físicas. Determinadas por la estructura interna de las partículas, su granulometría y el tipo de empaquetamiento: densidad real y aparente, distribución granulométrica, porosidad y aeración, retención de agua, permeabilidad, distribución de tamaños de poros y estabilidad estructural. B. Características químicas. Definidas por la composición elemental de los materiales, estas caracterizan las transferencias de materia entre el sustrato y la solución del mismo: capacidad de intercambio catiónico, pH, capacidad tampón, contenido de nutrimentos y relación C/N. D. Características biológicas. Se refiere a las propiedades dadas por los materiales orgánicos: contenido de materia orgánica y estado y velocidad de descomposición (Abad, 1997; Florián, 1997; Pastor, 1999).

En general los requerimientos que un sustrato debe tener son: elevada capacidad de retención de agua fácilmente disponible, elevada aireación, baja densidad aparente, elevada porosidad, baja salinidad, elevada capacidad tampón, baja velocidad de descomposición, estabilidad estructural, reproductividad y disponibilidad, bajo costo y fácil manejo (mezclado, desinfección, entre otras) (Pastor, 1999). 2

ANTECEDENTES-JADE

1.1.4. Fuentes de propágulos en horticultura ornamental.

Dentro de los materiales necesarios para la propagación de plantas ornamentales esta precisamente la planta que servirá como fuente de propágulos, es decir, la planta madre. Esta se considera un individuo seleccionado por sus cualidades estéticas y de productividad, que puede ser un cultivar establecido o ejemplares silvestres; además, preferentemente debe estar libre de infecciones (Ávila y Pereyra, 2005).

Para el cultivo in vitro una planta madre, además de cumplir con las características arriba señaladas, debe proveer explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado, por lo que deben de mantenerse semanas o meses, en condiciones de invernadero, cuidando la calidad sanitaria y nutricional, y de ser posible,

el

fotoperíodo

y

la

irradiancia

(Olivera,

2005;

www.etsea2.vdl.es/micropro.htm#fase0). A pesar de que son importantes cuando se inicia un programa de propagación in vitro la información encontrada en la literatura es poca, en el caso concreto de los helechos se tienen reportes del manejo agronómico de plantas madre (Hvoslef-Eide, 1991a, 1991b y 1992; Nowak et al., 2002), de un cultivar ya establecido como ornamental: “Bostonienis” de la especie Nephrolepis exaltata (L.) Schott. El tener una cantidad adecuada de plantas madre, ya aclimatizadas, permitió que estos estudios exploraran los efectos de la temperatura, la irradiancia, el fotoperíodo y la fertilización nitrogenada, sobre la calidad de los explantes (puntas del rizoma) para la propagación in vitro.

1.2. Comercialización de las plantas ornamentales en el país.

En México existe un gran número de especies nativas ornamentales; sin embargo, en la industria hortícola se produce y comercializa de manera dominante las especies introducidas, descuidando el potencial fitogenético que existe en el país. La preferencia de las empresas hortícolas a producir solo las especies de origen de otros países se debe a la falta de promoción y conocimiento de especies nativas, la 3

ANTECEDENTES-JADE

posibilidad de obtenerlas ya mejoradas y el desconocimiento de técnicas para su propagación, cultivo y manejo (Red de Ornamentales, 2006).

Hasta 1998, la industria de la horticultura ornamental se basaba en una superficie de 18,090 ha y el valor de la producción era de 1,891.75 millones de dólares. Siendo Puebla, México, Michoacán, Morelos, y Sinaloa los estados con mayor producción y superficie cultivada de plantas ornamentales (Mundo, 2006).

1.2.1. Los helechos como plantas ornamentales.

El uso más reconocido para los helechos, es precisamente el ornamental, debido a que sus hojas llamativas (frondas) son populares, tanto en arreglos florales (confección de ramos, centros y composiciones florales, ya que sus frondas ofrecen una adaptabilidad a la confección de estos, como elementos centrales o complementarios); así como en jardínes y plantas de interiores (Infoagro, 2006); así también se utilizan como plantas medicinales o alimenticias (Arreguín ,1987; Pacheco y Bautista ,2001).

1.2.2 Comercialización de helechos ornamentales en la zona centro-sur de México.

En la parte central de México las principales empresas que comercializan helechos ornamentales son: Stigma® (Stigma, 2006) y Akiko® (Akiko, 2006). Estas manejan alrededor de 20 géneros, que incluyen 33 especies y 35 variedades, siendo los géneros más comercializados Adiantum, Asplenium, Blechnum, Cyathea, Davallia, Nephrolepis, Pteris, Platycerium y Rumorha. La presentación de venta es en charolas que van de las 40 a las 273 cavidades (una plántula por cavidad) y los precios oscilan de los 0.22 a

los 1.05 euros, dependiendo de la especie que se trate

(Stigma, 2006). Es importante mencionar que estas plántulas son de importación, principalmente de Holanda y Estados Unidos de Norteamérica.

4

ANTECEDENTES-JADE

1.2.3. Los helechos ornamentales en el Estado de Morelos. Los helechos en el caso de Morelos, se producen como plantas envasadas o de maceta, destacando los géneros Nephrolepis spp., Adiantum spp., Asplenium spp., Cyrtomium spp. y Platycerium spp. (Cabrera y Orozco, 2003). Los helechos con presentación en maceta de 8 pulgadas (principalmente del género Nephrolepis de las variedades Boston, Dallas y chino), se cultivan en el 12% de los viveros de Morelos; su producción tiene un valor de $177,800 pesos, el costo del cultivo por planta es de $4 a $14 pesos, su precio de venta es de $7 a $20 pesos y el total de plantas producidas al año es de 25,400 (Cabrera y Orozco, 2003). 1.2.4. Los helechos silvestres de Morelos con potencial ornamental. De acuerdo a Riba et al. (1996), el Estado de Morelos cuenta con 170 especies de helechos, agrupadas en 45 géneros. Con base a la arquitectura foliar (arreglo, forma y tamaño de las frondas u hojas), de las especies citadas pueden ser consideradas como potenciales plantas ornamentales de interior (Díaz, 1995) el 60%, destacando por el número de especies los géneros Asplenium, Adiantum, Polypodium, Cheilanthes, Elaphoglossum, y Thelypteris (Figura 1). 8 8

24

9 12

Cheilanthes Polypodium Adiantum

16

Asplenium Thelypteris Elaphoglossum

Figura 1. Principales géneros de helechos silvestres con potencial ornamental del Estado de Morelos (Díaz, 1995; Riba et al., 1996).

5

ANTECEDENTES-JADE

1.3. División Pteridophyta divis. J.Y. Bergen & B.M. Davis.

Es una división del Reino Plantae que incluye a helechos y plantas afines. El nombre proviene del griego “pteris” que significa helecho y “phytón” que significa planta (Strasburguer et al., 1994). Son vegetales que se caracterizan por no presentar flor ni semilla, es decir, son plantas pertenecientes a la Clase Cryptogamia, pero poseen tejido vascular verdadero por lo que también se les denomina criptógamas superiores (Arreguín et al., 2004). El origen de este grupo de plantas es incierto, pero se cree que se derivaron en el Devónico de líneas antiguas de algas y musgos. Se reconocen cuatro clases de pteridofitas (Figura 2), con base a sus diferencias en origen y morfología (Moran, 2006): I.

Psilotpsida: incluye a los géneros Psilotum y Tmesipteris.

II.

Lycopodiopsida: incluye a los géneros Lycopodium y Phylloglossum.

III.

Equisetopsida: incluye a los géneros Isöetes, Stylites y Equisetum.

IV.

Polypodiopsida: considera a los helechos.

A

B

C

D

Figura 2. Géneros representativos de las principales Clases de la División Pteridophyta: A. Psilotum, B. Lycopodium, C. Equisetum y D. Polypodium. Fuente:A.www.richmond.edu/~jhayden/greenhouse&images/psilotum_nudum1_s.JPG,B.www.saxifraga.de/foto_bot/lycopodium_ clavatum.jpg,

C.www.nichegardens.com/images/plants/equisetum_hyemale.jpg,

y

D.www.legambientearcipelagotoscano.it/

biodiversita/flora/habitat/bosco/polypodium%20vulgare%20felce%20dolce002.JPG.

Estas clases pueden dividirse en subclases, ordenes y familias con base a las particularidades de su sistema de reproducción, ornamentación de la pared de la espora, el arreglo de los esporangios, entre otras características. 6

ANTECEDENTES-JADE

1.3.1. Los Helechos.

Clase Polypodiopsida class. Cronquist, Takht. & W. Zimm. Las Polypodiopsida constituyen los "verdaderos helechos”, la clase se encuentra representada en el registro fósil desde el período Misisipiano, casi 90% de los helechos actuales pertenecen a grupos que aparecieron primero en el período Cretácico. En consecuencia, son de origen más reciente, como las angiospermas. Se reconocen entre 31 y 51 familias (Moran, 2006).

1.3.2. Distribución.

En el caso de México los helechos representan cerca del 5% de las especies de plantas vasculares en el país. Su diversidad se estima entre 1,000 y 1,100 especies pertenecientes a 110 géneros, de las que aproximadamente 190 son endémicas; en el país se encuentra alrededor de 11% del total de especies de helechos del mundo y está representado el 75% de los géneros reconocidos para América (Riba ,1993; Lira y Riba, 1993).

En general se considera que los helechos forman parte de casi todos los tipos de vegetación, sobre todo en zonas templadas (Rzedowski, 2006), siendo el bosque mesófilo de montaña el tipo de vegetación más rico en este tipo de plantas, le siguen el bosque tropical perennifolio, el bosque de Quercus, el bosque tropical subcaducifolio, el bosque tropical caducifolio, los matorrales xerófilos y la vegetación acuática (Riba, 1993). En Morelos se tienen registradas 158 especies y 15 variedades de helechos agrupados en 50 géneros y 21 familias (Riba et al., 1996).

1.3.4. Morfología.

Los helechos son plantas cormofitas, es decir, presentan verdaderos órganos como raíz, tallo, generalmente subterráneo llamado rizoma y hojas que comúnmente se les llama fronde (Figura 3), constituidas por lámina, pecíolo y raquis. Es característico de 7

ANTECEDENTES-JADE

los helechos el grado de división de la lámina; así, podemos tener enteras, pinnatífidas, pinnadas, bipinnadas, tripinnadas, entre otras (Arreguín et al., 2004).

A B

E

F

C D

Figura 3. Esquema de la especie Dryopteris filis-max (L.) Schott., en donde se aprecian las principales partes de un helecho: A. Fronda, B. Prefoliaciones, C. Rizoma, D. Raíces, E. Soros y F. Esporangios (Fuente: www.plant-pictures.de).

Las células reproductoras son las esporas que se

originan y almacenan en

estructuras multicelulares denominadas esporangios, que al agregarse conforman a los soros (Figura 2), cuya forma, tamaño y disposición varían con la especie.

1.3.5. Ciclo Biológico.

Presenta alternancia de generaciones: la fase gametofítica (formadora de gametos) (n) y la fase esporofítica (formadora de esporas) (2n), que es la dominante, mientras que la gametofítica tiende a reducir su tamaño y complejidad, en la mayoría de las especies muere al momento que el cigoto-embrión comienza su desarrollo. Ambas 8

ANTECEDENTES-JADE

generaciones pueden generar su propio alimento, realizando fotosíntesis o por medio del saprofitismo micorrízico, es decir, son fisiológicamente independientes además de que cada generación puede tener su nicho ecológico (Izco et al., 1998). El ciclo de los helechos se inicia con la formación de la espora, que al germinar dará origen al gametofito en donde se producen los arquegonios y/o los anteridios que respectivamente formarán las ovocélulas y los anterozoides (gametos femenino y masculino), que al ocurrir la fecundación formarán el cigoto-embrión, que dará origen al esporofito que al madurar contendrá frondas fértiles, donde se formarán los esporangios en los cuales se lleva a cabo la meiosis, para producir esporas con las que se cierra y se inicia el ciclo (Izco et al., 1998).

En los helechos se presentan dos tipos de ciclo de vida: A. Ciclo Heterospórico: presencia de dos tipos de esporas, las megasporas que darán origen a gametofitos que formarán ovocélulas y las microsporas que originarán gametofitos que formarán anterozoides. B. Ciclo Homospórico: se presenta en la mayoría de los helechos (Polypodiopsida), se distingue por que las esporas son morfológicamente similares y originan un gametofito que formará anteridios y arquegonios (Arreguín et al., 2004) (Figura 4).

Figura 4. Ciclo homospórico, el más común en los helechos. (Fuente:www.bio.miami.edu/dana/pix/fern_lifecycle.jpg).

9

ANTECEDENTES-JADE

En algunas familias de helechos se presenta el fenómeno conocido como apogamia, que es la producción de un esporofito a partir de las células del gametofito, sin la fusión previa de gametos (Lincoln et al., 1995). Por lo que se considera factible, bajo condiciones de laboratorio, inducir la apogamia en gametofitos in vitro, con lo que se pretendería aumentar la producción de esporofitos.

1.4. Descripción de las especies en estudio. 1.4.1. Familia Aspleniaceae fam. Newman

Son plantas terrestres, rupícolas o epífitas; rizoma erecto o rastrero, escamoso; pecíolo con 2 haces vasculares; nervadudas libres o anastomosadas; esporas no clorofílicas, monoletes. Con 8 géneros y aproximadamente 700 spp. Se considera una familia Cosmopolita (Moran, 2006).

1.4.2. Género Asplenium L.

Agrupa a plantas terrestres, rupícolas o epífitas, con rizoma rastrero o erecto, las raíces fibrosas; escamas presentes por lo menos en el rizoma y en la base del pecíolo, con o sin tricomas; hojas pequeñas a medianas, monomorfas, dimorfas o polimorfas, agrupadas; pecíolo brillante u opaco; lámina simple a dividida, coriácea a membranacea; yemas prolíficas ausentes o presentes en la axila de las pinnas terminales, en la punta del raquis; esporas bilaterales o globosas con perisporio reticulado-crestado y a veces equinulado, o liso, espinuloso, verrugoso o papiloso. Aproximadamente 700 spp (Adams, 2006).

1.4.2.1. Asplenium muenchii A.R. Sm.

Planta herbácea terrestre; con rizoma erecto o rastrero; escamas extendiéndose al pecíolo pero escasamente al raquis o pinnas; frondas 19-42 x 5-11 cm, laxamente fasciculadas, ligeramente dimorfas (los segmentos de frondas juveniles más anchos); pecíolo 2.5-6 cm x 0.5-1.8 mm; lámina 16-36 x 5-11 cm, hasta 3-pinnado-pinnatífida, 10

ANTECEDENTES-JADE

elíptica; raquis 0.2-0.3 mm de ancho, glabro, pardo-castaño claro a oscuro, terminado en una yema escamosa al nivel de la última pinna apical; pinnas 20-26 pares, 1-7.5 x 0.5-2 cm, ovadas a ovado-lanceoladas, pediculadas menos de 1 mm en toda su extensión; pínnulas de las pinnas hasta 15 x 10 mm, anchamente ovadas a ovadas, alternas, delgadamente herbáceas, glabras; esporas reniforme-elipsoides, el perisporio laxo, finamente reticulado, equinulado. Especie que se encuentra en bosques templados y bosques mesófilos de montaña (Adams, 2006).

1.4.2.2. Asplenium sessilifolium Desv., Ges. Sinónimos: Asplenium potosinum Heron. var. incisum Hieron; A. sessilifolium Desv. var. guatemalense Hieron.

Terrestre, rupícola o epífita; rizoma erecto o ascendente; escamas extendiéndose hacia el pecíolo, alargado-deltadas a lanceolado-ovadas; frondas 11-50 x 1.4-6 cm, compactamente fasciculadas, monomorfas; pecíolo 1.5-7 cm x 0.5-1.8 mm, generalmente

recto,

pardo-grisáceo

a

pardo-púrpura,

ligeramente

lustroso,

quebradizo; lámina 9.5-43 x 1.4-6 cm, 1-pinnado-pinnatífida, estrechamente elíptica a linear-oblanceolada; raquis glabrescente, ocasionalmente con una yema o plántula subterminal; pinnas 22-50 pares, 0.5-3.5 x 0.3-1.3 cm, las medias o supramedias, oblicuamente lanceoladas, herbáceas, glabras o con tricomas glandulosos, a menudo verde oscuro, pediculadas menos de 1.0 mm a subsésiles, el ápice generalmente obtuso y dentado; esporas reniforme-elipsoides, el perisporio laxo, abiertamente reticulado, oscuramente crestado. Esta especie se encuentra en bosque de Quercus, bosque de coníferas y bosque mesófilo de montaña, entre los 1200 y 3100 msnm (Adams, 2006).

1.4.3. Familia Pteridaceae fam. E.D.M. Kirchn. Sinónimos: Adiantaceae fam. Newman; Parkeriaceae fam. Hook.

Plantas terrestres, rupícolas o acuáticas; rizomas erectos, escamosos o pilosos; pecíolo no articulado al rizoma; fronda simple a 4-pinnada, en algunas especies 11

ANTECEDENTES-JADE

ramificada; nervaduras generalmente libres; esporas triletes, no clorofílicas. Aproximadamente 40 géneros y con cerca de 1000 spp. Cosmopolita. Pteridaceae es una familia morfológicamente diversa, con más géneros que cualquier otra familia en Mesoamérica.

Consecuentemente,

es

difícil

citar

características

fácilmente

observables que la definan (Moran y Yatskievych, 2006).

1.4.4. Género Adiantum L. Se consideran plantas terrestres o rupícolas; rizoma corto a largamente rastrero, escamoso; ejes pardo-rojizos a negros, lustrosos; fronda 1-4-pinnada, raramente simple; últimos segmentos sésiles a pediculados; nervaduras libres y bifurcadas dicotómicamente o raramente anastomosadas; esporangios en la cara interna de un margen del segmento; esporas globoso-tetraédricas, triletes. Aproximadamente cuenta con 200 spp (Moran et al., , 2006). 1.4.4.1. Adiantum poiretii Wikstr. Sinónimos: Adiantum crenatum Poir; A. gratum Fee; A. pellucidum M. Martens et Galeotti; A. thalictroides Willd. ex Schltdl.

Rizoma rastrero o cortamente rastrero, las escamas 2-4 x 0.1-0.4 mm, lanceoladas a linear-lanceoladas, anaranjadas a castaño oscuro; pecíolo glabro; fronda 15-40 x 715 cm, deltada a lanceolada, 2-3-pinnada, glabra en ambas superficies, verde o glauco en el envés; pinnas 4-10 pares, la más grande 5-12 x 4-8 cm, pediculada; raquis glabro; últimos segmentos 5-10 x 5-8 mm, semicirculares a flabelados, en su mayoría simétricos, lobados, pediculados, el pedículo 2-6 mm; soros 2-8 por segmento, reniformes o lunulares, generalmente con farina amarilla entre los esporangios. En bosque de Quercus, bosque de coníferas, bosque mesófilo de montaña, a lo largo de arroyos o entre rocas (Moran, 2006).

12

ANTECEDENTES-JADE

1.5. Germinación y viabilidad de esporas.

Existen dos tipos de esporas en los helechos heterospóricos: las verdes o clorofílicas y las esporas no verdes o no clorofílicas, que son de color café en general. Las esporas verdes germinan en dos días o menos después de que son sembradas y tienen viabilidad corta, de 48 días en promedio. Aunque hay indicios de que las esporas verdes en el ambiente natural pueden permanecer viables por más tiempo. Las esporas no verdes generalmente tienen tasas de germinación más lentas, pero no se ha podido separar aquellas que son capaces de germinar en la oscuridad de las que no lo son (Sheffield, 1996). La primera mitosis de la espora da origen al rizoide primario y a la célula protonemal, estos son signos de germinación. Los factores que están involucrados en la germinación son: A. Agua: humedades relativas ambientales desde 15% hasta el 100%, son favorables. B. Temperatura: en general el intervalo ideal es de 15 a 30oC. C. Nutrientes minerales: las esporas aparentemente contienen suficientes nutrientes para completar la germinación con el agua disponible. D. pH: la mejor germinación se lleva en un intervalo de 5.0 a 7.5, las diferencias podrían estar relacionadas con el hábitat del helecho. E. Fuente de carbono: las pentosas en general inhiben la germinación; las hexosas la estimulan pero en algunos casos la inhiben, en otros pueden propiciar apogamia en los gametofitos formados. F. Factores bióticos: en especies como Thelypteris patens Schott, la germinación se favoreció por los hongos contaminantes del medio de cultivo. En experimentos realizados con esporas de Pteridium lobatum la germinación se incremento al estar en contacto con hongos como Pythium debaryanum Hess o Penicillium notatum Westling. G. Densidad: es un efecto no muy claro sobre la germinación, generalmente una densidad moderada es mejor, aunque en casos de esporas como las de Pteridium aquilinum (L.) Kunth., la germinación se favoreció al cultivarlas agrupadas.

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ANTECEDENTES-JADE

H. Luz: la mayoría de las esporas de helechos no germinan en oscuridad, pero existen casos como las esporas de Polypodium crassifolium L. que sólo germinan en oscuridad (Sheffield, 1996; Aguilar, 2005).

La viabilidad de las esporas (tiempo en que permanecen viables, esto es, que son capaces de llevar a cabo una germinación exitosa), es un factor básico para el establecimiento de los helechos en su hábitat natural (Pérez y Reyes, 1993). Esta viabilidad esta controlada por factores intrínsecos como el genotipo, edad y latencia y factores extrínsecos como el pH, humedad, temperatura, luz, competidores, entre otros. Contabilizando el número de gametofitos que aparecen en un cultivo de esporas, se puede tener una idea aproximada del número de esporas viables (Ramírez et al., 2000).

1.6. Propagación de helechos.

Los helechos son plantas que pueden reproducirse tanto de manera sexual como asexual (vegetativamente). El que lleven a cabo una de las dos formas de reproducirse depende de varios factores, entre los que se pueden citar: condiciones ambientales, época del año, estrategias adaptativas, entre otras.

La reproducción sexual es por esporas, que son estructuras unicelulares de resistencia. Dentro de la reproducción vegetativa están las yemas prolíficas ubicadas en el rizoma, la raíz o la fronde, dependiendo de la especie. De estas el rizoma ramificado es el mas frecuentemente. En las frondes las yemas pueden ser apicales o estar en la base del pecíolo. Existen especies de helechos que a partir de estípulas (escamas en la base del pecíolo) pueden generar plántulas (Pérez y Reyes, 1993).

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ANTECEDENTES-JADE

1.6.1. Propagación in vitro. 1.6.1.1. Cultivo de tejidos vegetales.

Las técnicas desarrolladas para el cultivo de tejidos vegetales in vitro se han utilizado con éxito en la producción rápida y uniforme de plantas libres de enfermedades y de alta calidad (IAEA, 2004). Se han aplicado para obtener plantas de ornato, plantas productoras de metabolitos industrializables, plantas haploides o de plantas híbridas (que por otras técnicas son difíciles de lograr), entre otras.

Con la tecnología alcanzada, por lo menos teóricamente es posible cultivar cualquier tejido o célula vegetal; se cultivan anteras, granos de polen, hojas, ovarios, protoplastos, meristemos, principalmente. El cultivo de tejidos da respuesta a incógnitas sobre el mecanismo de acción de reguladores del crecimiento y del desarrollo vegetal (Franco y García, 1995). La variabilidad genética también se expresa aquí y mientras algunas plantas dan origen a nuevas plantas por estas técnicas, otras sólo producen tejido indiferenciado o callos; y otras más no se han podido multiplicar in vitro.

Para el establecimiento de un cultivo de tejidos vegetales los principales aspectos que se deben determinar son: A. Tipo de explante: se llama explante a cualquier porción de tejido vegetal que sea utilizado para iniciar un cultivo. Se considera que cualquier tejido será capaz de responder, sin embargo es muy importante la edad y el grado de diferenciación, ya que mientras más joven y menos diferenciado tendrá mejor respuesta. B. Medio de cultivo: un medio de cultivo esta conformado básicamente por tres componentes principales: los nutrientes minerales, una fuente de carbono y otros compuestos inorgánicos. El más utilizado es el MS (Murashige y Skoog, 1962). C. Reguladores del crecimiento: también llamados fitohormonas o fitoreguladores, comprende a las

auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abcísico, etileno,

principalmente. Se relacionan con procesos de crecimiento celular y división celular.

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ANTECEDENTES-JADE

D. Condiciones ambientales: las más importantes son luz (fotoperíodo, tipo e intensidad), temperatura y humedad (Vanegas, 2003).

1.6.2. Propagación in vitro de helechos. 1.6.2.1. Germinación de esporas in vitro.

A partir de la germinación in vitro de esporas de helechos, se forman gametofitos que posteriormente formaran esporofitos, los cuales son factibles de propagarlos masivamente in vitro (Hutchinson y Knoxfield, 1995). Para lograr la desinfestación de las esporas se ha utilizado principalmente el hipoclorito de sodio a diferentes concentraciones, desde el 0.875% al 2% de cloro activo, con tiempos de exposición de 3 a 30 minutos; además se ha combinado con el uso de etanol, Tween 20, Twenn 80, Tritón X-100® y estreptomicina. El medio de cultivo mas empleado ha sido el MS (Murashige y Skoog, 1962), pero también se menciona el de Moore y el de Knudson; estudiándose también la influencia de factores como la gravedad, las condiciones de almacenamiento, la densidad de siembra, el protocolo de desinfestación, el pH, la temperatura, los niveles de humedad, la irradiancia y la calidad y cantidad de luz (Douglas y Sheffield, 1990; Camloh y Gogala, 1992; Fernández et al., 1993; Pangua et al., 1994; Fernández et al., 1997a; Fernández et al., 1997b; Edwards y Roux, 1998; Bertrand et al., 1999; De Paula et al., 1999; Pivetta et al., 2000; Cox et al., 2003; Nondorf et al., 2003; Namur, 2004; Renner y Randi, 2004; González et al., 2006).

En México existen dos grupos de investigación que han realizado diversos estudios de la germinación in vitro de helechos; el primero se ha dedicado al estudio de la morfogénesis de la fase sexual de helechos silvestres de México, la cual incluye la germinación de las esporas, para ello ha usado con éxito el medio de Thompson (Reyes y Pérez, 1991; Pérez y Riba, 1993; Mendoza et al., 1999; Reyes et al., 2000; Pérez et al., 2001; Mendoza et al., 2002; Mendoza y Pérez, 2003; Granados et al., 2003; Reyes et al., 2003; Mendoza y Pérez, 2005). El segundo grupo ha enfocado sus estudios en el ciclo de vida de especies mexicanas de helechos silvestres, para 16

ANTECEDENTES-JADE

tal fin ha inducido la germinación usado diversos soportes como el maquique y el musgo (Montoya et al., 2000; Monroy, 2001; Sánchez, 2001; Potter, 2001; Díaz, 2002; Leal, 2002; Hernández, 2004; Herrera, 2004; Nazario, 2004).

En ambos casos no desinfestan las esporas y se han orientado a realizar estudios de la morfología de las mismas (tamaño, color, tipo de apertura, ornamentación de la pared, entre otras características), el tiempo en que se presenta la germinación (los días a partir de la siembra en los que se forma el rizoide y la primera célula protonemal), y el tipo de germinación (Nayar y Kaur, 1971).

1.6.2.2. Uso de explantes vegetativos in vitro.

La especie de helecho ornamental mas ampliamente estudiada es Nephrolepis exaltata (L.)Schott., mejor conocida como helecho “Boston” (por ser uno de sus cultivares mas reconocidos); de esta se han usado para su propagación in vitro explantes de estolones terminales (también llamados puntas del rizoma) y gametofitos, siendo desinfestados con hipoclorito de sodio con diferentes concentraciones, desde 0.5% a 1.5%, combinado con el uso de Tween 20 y etanol; siendo también sometidos al efecto de diversos reguladores del crecimiento vegetal como BA, AG, KIN, 2,4-D y ANA; así como a la influencia de diferentes concentraciones de sacarosa, sales minerales y nitrógeno; utilizando el medio MS (Murashige y Skoog, 1962), ya sea con el 100% de sales o menos (Loescher y Albrecht, 1979; Hvoslef, 1990; Pasqual et al., 1994; Guimarães et al., 1999; Ambrosio y De Melo, 2004; González et al., 2006). Se ha citado igualmente como afecta en el desarrollo in vitro de esta especie la irradiancia, la temperatura y el pH (Hvoslef, 1990; Ambrosio y De Melo, 2004).

Otra especie de helecho ornamental bien estudiada es Platiceryum bifurcatum (Cav.) C. Chr., llamado helecho cuerno de alce, del que se obtienen explantes de frondas, escamas del rizoma y rizoma (todos provenientes de cultivo in vitro establecido); los cuales fueron tratados con diferentes reguladores del crecimiento vegetal como BAP, 17

ANTECEDENTES-JADE

IAA, IB y ANA; y a diferentes concentraciones de sacarosa (Camloh y Gogala, 1991; Camloh et al., 1994; Dolinsek y Camloh, 1997; Dolinsek et al., 2002; Evangelista et al., 2003). Aunque de esta especie también se han hecho cultivos de células en suspensión, en donde se induce la aposporia variando la concentración de sacarosa, ANA y carbón activado (Teng, 1997; Teng y Teng, 1997, Dolinsek et al., 2002). Otro tipo de estudios en esta especie es el cultivo in vitro de gametofitos, donde se ha visto el efecto del pH, la concentración de sacarosa y agar o la inducción de apogamia por IAA (Camloh y Gogala, 1992; Kwa et al., 1995; Dolinsek y Camloh, 1997); también se indica la influencia de la estreptomicina y la penicilina en la regeneración de esporofitos en cultivos en suspensión (Teng y Teng, 2000).

Se encontraron trabajos de propagación in vitro para otras especies de helechos ornamentales o con algún grado de domesticación, en las que se usaron explantes foliares, rizoma, gametofitos, callos, entre otros; probándose además el efecto de reguladores del crecimiento vegetal tales como 2,4-D, BAP, KIN, BA, IAA y ANA (Hirsch, 1975; Furelli y De García, 1987; Janssens y Sepelie, 1989; Hegde y D´Souza, 1995; Thakur et al., 1998; Bertrand et al., 1999; Morini, 2000; Forbes, 2005; Martin et al., 2006).

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JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS, OBJETIVOS-JADE

2. J U S T I F I C A C I Ò N E H I P Ó T E S I S. J U S T I F I C A C I Ò N. El mercado de helechos ornamentales en la zona centro-sur de México, está acaparado por los de importación y un gran número de las especies mexicanas que se comercializan son saqueadas de su hábitat natural, lo que puede ponerlas en peligro de extinción (Monterrubio et al., 2001). Se carece de técnicas estandarizadas para la propagación de helechos, ya sea por esporas o vegetativamente. Una de las causas, es quizá, que los estudios de germinación de esporas, propagación masiva in vitro y ex vitro, se han centrado en especies ya cultivadas y se han dejado a un lado las especies silvestres (Sheffield, 1996). Es por ello que resulta apremiante trabajar todas las estrategias que permitan la conservación de los recursos filogenéticos, incluyendo a las especies con potencial de ser cultivadas; por lo que algunas estrategias biotecnológicas como el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales y el uso de sustratos hortícolas, son alternativas viables que se pueden dirigir hacia el rescate, conservación y multiplicación de las mismas (Red de Ornamentales, 2006). En el Estado de Morelos (principal proveedor de helechos para la zona centro-sur del País) se reportan especies de helechos silvestres que cumplen con las características fenotípicas para ser consideradas con potencial ornamental (Díaz, 1995; Riba et al., 1996; Red de Ornamentales, 2006), destacando los géneros Thelypteris, Asplenium, Adiantum, Cheilanthes, Pellaea y Pteris. Las especies que se seleccionaron para este trabajo son: Adiantum poiretii Wikstr., Asplenium muenchii A. R. Sm y Asplenium sessilifolium Des, por presentar características fenotípicas para ser comercializadas como plantas ornamentales; además de que pertenecen a géneros que son de los más distribuidos en México y a nivel mundial; así también, son abundantes en su hábitat original y no están incluidas en la NOM-059-ECOL-2000.

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JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS, OBJETIVOS-JADE

H I P Ó T E S I S.

A partir de la germinación de esporas y del empleo de explantes de helechos silvestres con potencial ornamental, se podrá obtener información básica para el establecimiento del cultivo in vitro de ellas.

20

JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS, OBJETIVOS-JADE

3. O B J E T I V O S

O B J E T I V O G E N E R A L.

Obtener información para el posible establecimiento del cultivo in vitro de helechos silvestres con potencial ornamental a partir de la germinación de esporas y de explantes de prefoliaciones y yemas apicales foliares.

O B J E T I V O S P A R T I C U L A R E S.

- Medir la abundancia de las especies en estudio en los sitios de su colecta.

- Desinfección de esporas.

- Determinar el medio de cultivo y sustrato adecuados para germinar esporas in vitro.

- Evaluar la viabilidad de esporas.

- Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro.

21

MATERIAL Y METÓDOS-JADE

4. M A T E R I A L Y M E T Ó D O S.

4.1. Selección del sitio de colecta para la elección de las especies en estudio, con base a antecedentes de tipos de vegetación y de pteridoflora del Estado de Morelos.

Teniendo como antecedente lo mencionado por Riba (1993), sobre la distribución de los helechos por tipo de vegetación; así como la información del INEGI (2005) y Rzedowski (2006), acerca de la vegetación presente en el Estado, se seleccionó como zona de colecta, los Altos de Morelos, específicamente los municipios de Ocuituco y Tetela del Volcán. Esta zona, se caracteriza por tipos de vegetación pertenecientes al bosque templado, con alto número de especies de helechos silvetres (Riba 1993).

La elección de los ejemplares estudiados se realizó con base al listado de la pteridoflora del Estado de Morelos, los principales géneros que se citan, por el número

de

especies

Elaphoglossum

y

son:

Asplenium,

Adiantum,

Polypodium,

Cheilanthes,

Thelypteris (Riba et al., 1996). La mayoría de estos géneros

tienen especies ornamentales (Akiko, 2005; Stigma, 2005), o con potencial ornamental (Díaz, 1995; Red de Ornamentales, 2005). Por ser los más relevantes se seleccionaron los géneros Asplenium y Adiantum.

4.2. Descripción del sitio de colecta y abundancia de las especies en estudio.

Los sitios de colecta seleccionados fueron la Barranca Agua Bendita de Jumiltepec municipio de Ocuituco (Figura 5) y el paraje El Salto, del municipio de Tetela del Volcán; lugares en que habitan las especies que se seleccionaron.

22

MATERIAL Y METÓDOS-JADE

A

B

Figura 5. Imágenes que muestran la fisonomía de uno de los sitios de colecta: Barranca Agua Bendita, Ocuituco, Morelos. A. Pendiente; B. Fondo.

Se describió el sitio de colecta y se registraron en cada visita las siguientes variables (se tomaron tres lecturas en cada sitio): -Humedad relativa (% HR) y Temperatura (T), para ambas variables se utilizó un higrótermometro (marca Taylor®, modelo 1455) (Figura 6 y Cuadro 1). -Intensidad luminosa (l) con un cuantómetro (marca Apogee® modelo QMSW-SS), el cual nos proporcionó la irradiancia o flujo cuántico (Figura 6 y Cuadro 1).

B

A

C

Figura 6. Imágenes de los equipos usados en campo para determinar temperatura, humedad relativa e intensidad luminosa. A. Higrotermómetro, B. Cuántometro y C. Sensores de los equipos.

Se colectaron muestras de suelo de aproximadamente ½ kg para determinar el pH, por especie elegida, siguiendo la metodología descrita por Valdés y Medina (2005), que consiste en tomar 10 g de la muestra por analizar y vaciarlos en un vaso de precipitados de 150 ml, en donde se agregan 20 ml de agua destilada, se mezcla 23

MATERIAL Y METÓDOS-JADE

perfectamente con ayuda de un agitador, se deja reposar durante 30 minutos, después de ese tiempo se agita y se hace la lectura con el potenciómetro (Cuadro 1).

Cuadro 1. Medición de las variables ambientales y el pH de los sitios de colecta. Especie Adiantum poiretii Wikstr.

Temperatura* O C 24.43±1.71

HR* % 59.66±5.50

I. luminosa* µmol.m-2s-1 12.33±3.05

pH** suelo 5.3±0.17

17.36±0.68

23.33±4.16

17.33±10.40

5.3±0.26

19.3±1.08

61.3±8.14

2.66±0.57

5.3±0.1

Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

Asplenium muenchii A. R. Sm. Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

Asplenium sessilifolium Desv. El Salto, Tetela del Volcán

*Promedios de tres lecturas de temperatura, humedad relativa e intensidad luminosa, ± error estándar. **Promedios de tres determinaciones de pH para cada una de las tres muestras de suelo, ± error estándar.

Se registró la ubicación geográfica mediante las coordenadas geográficas (latitud y longitud) y altitud con un GPS (marca Garmin® modelo GPS III Plus). (Cuadro 2); tomando en cuenta el valor de las coordenadas, los sitios de colecta son muy cercanos (Figura 7); por lo que comparten el mismo tipo de vegetación (bosque templado), aunque la localidad El Salto se localiza a mayor altitud, que se refleja en una menor temperatura y humedad (lo cual también depende del tipo de vegetación). (Cuadro 2).

Cuadro 2. Ubicación geográfica del sitio de colecta de las especies de helechos en estudio. Especie Adiantum poiretii Wikstr. Asplenium muenchii A. R. Sm. Asplenium sessilifolium Desv.

Sitio de colecta (Estado de Morelos) Barranca Agua Bendita Jumiltepec Barranca Agua Bendita Jumiltepec El Salto Tetela del Volcán

*msnm= metros sobre el nivel del mar.

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Coordenadas N 18o 55.22´ WO 098o 45.924 N 18o 55.21´ WO 098o 45.922’ N 18o 55.22´ WO 098o 45.924´

Altitud msnm* 2284 2305 2284

MATERIAL Y METÓDOS-JADE

Figura 7. Mapa del Estado de Morelos en donde se muestra el sitio de las colectas realizadas (GoogleEarth®, 2006).

La abundancia local de cada especie en estudio se valoró utilizando dos técnicas, por la escala de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet (Mermoz y Martín, 1993), en un área de 10 m2: 0= Pocos individuos, pequeña cobertura. 1= Numerosos individuos, pero cubren menos del 5% del área. 2= Cualquier número de individuos con cobertura entre 5 y 25%. 3= Cualquier número de individuos con cobertura entre 25 y 50%. 4= Cualquier número de individuos con cobertura entre 50 y 75%.

Y por la técnica del transecto, se realizaron 3 dirigidos de 10 m (con un flexómetro de 10 m marca Truper®), con el objeto de determinar el Índice de Densidad Lineal – DLi1- y la Cobertura Lineal -CL-1 (Guadarrama et. al, 1998; González y Sánchez, 2001). 1. El DLi se obtiene al dividir el número de intersecciones de organismos de una especie entre la longitud total de la línea o transecto, por lo que al aumentar el numero de organismos que interceptan esa línea el valor de DLi aumentara, siempre y cuando la longitud de la línea se mantenga. En el caso de la CL, esta se obtiene al dividir la longitud total de las intersecciones de una especie (es decir que longitud de la línea ocupa cada organismo), entre la longitud total de la línea, en este caso entre mayor sea la longitud de las intersecciones de los individuos, el valor de CL tendera a 1, al mantenerse fija la longitud de la línea (Guadarrama et. al, 1998).

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

La descripción del sitio de colecta proporcionó datos de las condiciones ambientales imperantes los que sirvieron como antecedente parta mantener en vivero las plantas donadoras de propágulos.

4.3. Colecta de esporas y especímenes de las especies en estudio para fuentes de propágulos, aclimatización y herborización.

Para la obtención de esporas se siguió la metodología descrita por Montoya et al. (2000), la cual consistió en colectar muestras de frondas fértiles fraccionadas (con soros maduros) por la mañana las que se guardaron en sobres. En el laboratorio se cambiaron a otro sobre para permitir su rápido secado, permaneciendo 15 días en la oscuridad, a una temperatura de 21.9±2.1 oC; lo anterior se realizó con la finalidad de que los esporangios expulsaran a las esporas.

En cuanto a la colecta de las plantas como fuentes de propágulos (plantas madre), se tomaron en consideración a aquellas que cubrieran las características fenológicas típicas de cada especie como el número, forma y disposición de los frondes; forma, tamaño y separación de las pinnas, apariencia y color del raquis; ya que son las características relevantes en helechos ornamentales (Infoagro, 2006). En la colecta se siguieron las normas establecidas por el Laboratorio de Propagación ex vitro del CeProBi (Evangelista, 2005*), que consistió en:

Con una pala de jardinería limpia se excavó por debajo del rizoma y se sacó la planta completa (con cepellón), cubriéndola inmediatamente con papel absorbente, previamente humedecido y se colocó dentro de una bolsa de polipapel de 40X50 cm., esto se realizó con la finalidad de evitar la deshidratación y disminución del estrés durante el transporte. Se colectaron 3 plantas por especie, llevándose a cabo tres colectas en diferentes épocas del año (que correspondieron a las estaciones de invierno, primavera y verano). *Evangelista Lozano S. 2005. Comunicación personal. Profesor Investigador del CeProBi-IPN.

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

Las plantas madres colectadas en campo se aclimatizaron siguiendo las normas establecidas por el Laboratorio de Propagación ex vitro del CeProBi (Evangelista, 2005). Estas condiciones consistieron en mantener las plantas de campo en vivero. Se les aplicó fungicida al 0.1 % (Benlate® o Tecto 60®) (Anexo 1) y en los casos en que se presentó infestación por insectos Malathion 1000® al 0.1 % (Anexo 1). Se colocaron en macetas de plástico de 8 pulgadas con turba Sunshine® (Anexo2), sustrato del sitio de colecta, vermiculita Hummert® (Anexo 2) y agrolita Polinal® (Anexo 2), en una proporción 2:2:1:1 v/v respectivamente, ajustándose el pH a 6.0 usando óxido de calcio Tolteca® (Anexo 3) y se colocaron dentro de una bandeja con una solución nutritiva y promotora del enraizamineto (Raizal® 4000), al 0.1 % (Anexo 1). Se mantuvo el sustrato húmedo con riego a capacidad de campo, y se les colocó una bolsa de polipapel de 40X50 cm. con orificios para mantener una humedad relativa alta (mayor del 50%). Después de una semana se trasladaron a la cámara de cultivo del Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos. Esta metodología se utilizó para la primera colecta, efectuada en invierno (plantas colocadas en condiciones de vivero), en la segunda y tercera, que correspondieron a primavera y verano, las plantas se colocaron directamente en la cámara de cultivo, debido a la respuesta manifestada en la primera colecta.

Tanto en el vivero como de la cámara de cultivo se monitorearon las siguientes variables ambientales (realizándose el registro tres veces por semana): Humedad relativa (% HR), Temperatura (T) e Intensidad luminosa (l); utilizándose el mismo equipo de campo.

El nivel de aclimatización, se valoró con una escala cualitativa (EC1), basada en la fenología general de las plantas en campo: persistencia y/o pérdida de frondas de campo, generación de nuevas frondas (prefoliaciones) y el tiempo del desarrollo de éstas (partiendo de lo propuesto por la FAO, 2005). Las evaluaciones se realizaron a los 15, 30, 45 y 60 días, después de la colecta. La escala fue la siguiente:

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

0= Planta muerta en los primeros 15 días. 1= Planta que perdió las frondas de campo, generó nuevas frondas (prefoliaciones), pero no terminó su desarrollo, muere a los 30 días. 2= Planta que perdió las frondas de campo, generó nuevas frondas (prefoliaciones), terminó su desarrollo, pero de manera lenta, a los 60 días. 3= Planta que no perdió las frondas de campo, generó nuevas frondas (prefoliaciones), a los 60 días.

También se llevó a cabo la evaluación del desarrollo de las frondas, utilizando la clave ilustrada propuesta por Strandberg (2003), en la que se describen siete estados de desarrollo de las frondas, usando como modelo el helecho cuero Rumohra adiantiformis (G. Forst.) Ching (Anexo 3).

La colecta de los especimenes para su herborización y montaje se realizó siguiendo las medidas descritas en el Manual de Herbario del Consejo Nacional de la Flora de México (Lot y Chiang, 1986) y por el INEGI (2005). La identificación de los ejemplares se realizó de acuerdo con la obra de Mickel y Smith, 2004, y se corroboró la identificación por comparación en el herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, bajo la asesoría de la curadora del herbario, la M. en C. María de la Luz Arreguín Sánchez. 4.4. Desinfección de esporas.

Las esporas colectadas de plantas silvestres colocadas en sobres y almacenadas en oscuridad, se tomaron muestras para el desarrollo de los protocolos de desinfestación (Cuadro 3), para su posterior siembra in vitro.

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

Cuadro 3. Protocolos de desinfección de esporas de helechos. Desinfectante tipo y concentración Número 1* 2 3 4 5

NaOCl 1% NaOCl 1% + 1ml Tween 80 NaOCl 0.5% + 1 ml Tween 80 NaOCl 0.5% + Tween 80 + Estreptomicina (Cox et al., 2003) Aspersión con etanol al 96 %

Tiempos de exposición (min) 3

5

10

15

20

30

40

9

9

9 9 9 -

9

9 9 9 -

9 9 -

9 9 -

Se dejo evaporar

*Corresponde al protocolo de desinfestación para esporas del helecho cuerno de alce (Evangelista et al., 2001). -NaOCl al 1% de cloro activo: 17 ml de cloro comercial (Clorox®) por cada 100 ml de agua desionizada estéril. -NaOCl al 0.5% de cloro activo: 8.5 ml de cloro comercial (Clorox®) por cada 100 ml de agua desioniozada estéril. -Tween 80 (Hycel®): 3 gotas (aprox. 1 ml), por cada 100 ml de agua. -Estreptomicina (Sulfestrep®): 2 mg/ml.

En los protocolos del 1 al 3, las muestras de esporas se colocaron en bolsas de aproximadamente 5 x 5 cm., hechas de tela tipo Magitel®, que se cerraron con un clip. En el caso del protocolo 1 (P1) se colocaron tres bolsas en un vaso de precipitado de 200 ml, con solución de NaOCl al 1% de cloro activo, manteniéndose por 10 minutos, se sacaron y enjuagaron en agua desionizada estéril. De manera conjunta se hizo otra prueba, pero manteniendo las bolsas en la solución de NaOCl durante 20 minutos (Evangelista et al., 2001).

Después de evaluar los resultados del P1 se implementó el protocolo 2 (P2): tres bolsas se colocaron en una solución de NaOCl al 1 % de cloro activo, que contenía 1 ml de Tween 80® (Anexo 3); con la finalidad de romper la tensión superficial y permitir que el NaOCl penetre en los esporangios; se mantuvieron durante 10 minutos enjuagándose con agua desionizada estéril. Se repitió el procedimiento a 20, 30 y 40 minutos.

El protocolo 3 (P3), se estableció al evaluar la respuesta de las esporas con el P2, este consistió en colocar tres bolsas en una solución de NaOCl al 0.5 % de cloro activo mas 1 ml de Tween 80® (Anexo 3); se mantuvieron durante 10 minutos,

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

lavándose con agua desionizada estéril. Se repitió el procedimiento a 20, 30 y 40 minutos.

La metodología descrita por Cox et al. (2003), para la desinfección de esporas del helecho Schizaea dichotoma fue la que se usó como protocolo 4 (P4), que consistió en colocar 6 muestras de las esporas de cada especie en tubos Eppendorf® a los que se les agregó 1.5 ml de agua desionizada estéril, con micropipetas de 1000 µL, se centrifugaron a 10,000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se desechó. Enseguida se agregó una solución de NaOCl al 1 % de cloro activo, la exposición de las esporas al mismo fue de 5 minutos, posteriormente se centrifugaron a 10, 000 rpm durante 2 minutos, el sobrenadante se eliminó. Se les agregó 1.5 ml de una solución de estreptomicina a 2 mg/L, se dejo actuar durante 3 minutos, al término de estos se centrifugaron a 10, 000 rpm durante 2 minutos, eliminando el sobrenadante. Finalmente se agregó a los tubos 1.5 ml de agua desionizada estéril y se centrifugaron durante 3 minutos a 10,000 rpm. Se sellaron los tubos y se almacenaron en refrigeración 4-5 oC, para su posterior utilización.

En el último protocolo (P5), se abría el sobre que contenía a los fragmentos de frondes con esporas, estos se colocaban sobre una tapa de caja de Petri, se asperjó etanol al 96 %, con un atomizador de gota fina de 250 ml, dejándose evaporar por 10 minutos.

Todos los protocolos de desinfección se llevaron a cabo bajo condiciones asépticas en una campana de flujo laminar horizontal.

4.5. Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas in vitro.

Los medios de cultivo que se utilizaron para inducir la germinación de esporas in vitro, fueron el medio de Knudson (MK) (Knudson, 1946), el medio de Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962); y el medio de Thompson (MT) (Klekowski,

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

1969), debido a que estos fueron utilizados para germinar esporas de otras especies de helechos (Fernández y Revilla, 2003; Mendoza y Pérez, 2005; González et al., 2006). El medio MS usado fue de la marca Sigma®, a este medio se le adicionó sacarosa a dos concentraciones y carbón activado, como agente gelificador se utilizó Phytagel®; así también la concentración del MS fue al 100 y al 50%; se manejaron dos valores de pH (Cuadro 4). Cuadro 4. Medio de cultivo MS. Componente del medio de cultivo MS (por L) Sales 4.4 g Sacarosa 30 g Carbón activado 2.2 g pH 5.7-5.8

MS1* 9 9 9 9

Trataminetos MS2 MS3 2.2 20 9

2.2 20 4.8

MS4 2.2 9

*MS1: medio para la propagación in vitro de cuerno de alce (Evangelista, et al., 2001).

En el caso del medio de Knudson, se utilizó de la marca Sigma®, a una concentración de 21 g/L, con un pH de 5.8, sustituyéndose el agar por Phytagel® a una concentración de 2.2 g/L. El medio de Thompson se elaboró según lo mencionado por Mendoza (2001) (Anexo 3), a un pH de 5.8 y el agar también se sustituyó por Phytagel® a una concentración de 5.5 g/L.

Se decidió usar Phytagel® para todos los medios, con la finalidad de tener el mismo agente gelificante y evitar así posibles variaciones en la germinación de las esporas; ya que se cita en la bibliografía que aun utilizando un mismo agente gelificante en diferentes concentraciones interfiere en la respuesta de explantes in vitro del mismo origen (Scholten y Pierik, 1998). En el caso del medio MT la concentración en la que gelificó fue a 5.5 g/L, posiblemente por el tipo y concentración de las sales del medio (principalmente por el Cloruro de Calcio (CaCl2) y el Sulfato de Magnesio (MgSO4), según Sigma, 2005), a diferencia de los medios MS y MK, en los que la gelificación se da en la concentración de 2.2 g/L. La sacarosa utilizada fue de la marca Sigma®.

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

Para ajustar el pH se usaron NaOH y de HCl, con dos soluciones de cada uno, cuyas concentraciones eran de 1 N y de 0.1 N.

En la inducción de germinación en sustratos en condiciones in vitro, se emplearon los siguientes (Anexo 2): -Agrolita Polinal® (AGR). -Maquique (MAQ)*. -Sustrato para germinar esporas de helechos (SEH), según Luna (2002). -Turba Sunshine® (TUR). -Vermiculita Hummert® (VER). *Capa formada por las raíces adventicias y por parte de las bases de los pecíolos de algunos helechos arborescentes.

Los sustratos que se mencionan en la literatura son: el maquique (Montoya et al., 2000), la mezcla de agrolita, turba y vermiculita (6:1:1 v/v) (Luna, 2002), y la turba sola (Naour, 2004), aunque para otras especies de helechos. En este trabajo se probaron estos y por separado la agrolita y la vermiculita. Se determinó el pH de cada sustrato siguiendo la metodología descrita por Valdés y Medina (2005), realizándose tres determinaciones por sustrato.

Para los medios de cultivo y sustratos se utilizaron frascos tipo “Gerber®”, conteniendo aproximadamente 20 ml en el caso de los medios y aproximadamente 10 g y 30-40 ml de agua desionizada estéril en los sustratos, en el caso de los frascos con medio de cultivo el tiempo de esterilización fue de 20 minutos a una temperatura de 121oC (presión de 15 lb/pulg2), y en los frascos con sustratos el tiempo fue de 60 minutos.

La siembra de las esporas en los protocolos de desinfección P1 a P3 se realizó de la siguiente forma: después de desinfectar a los sobres se les quitó el clip, se abrieron con pinzas de disección y se colocaron sobre cajas de Petri. Con una aguja de disección se tomó una muestra de las esporas y se dispersaron dentro del frasco 32

MATERIAL Y METÓDOS-JADE

Gerber con medio de cultivo. En el P4 la siembra de las esporas fue directamente de los tubos Eppendorf® a los medios de cultivo.

La siembra de las esporas utilizadas en el protocolo 5 (P5), se llevó a cabo siguiendo la metodología descrita por Montoya et al. (2000), tanto en medios como en sustratos: las esporas se mezclaron con arena de río, tamizada con malla calibre 230, esterilizada; esta mezcla se disperso en frascos Gerber, tanto de medios como de sustratos. De cada medio y sustrato se hicieron tres repeticiones, cada una con seis frascos Gerber. Todo el proceso de siembra de las esporas tanto en los medios como en sustratos se llevó bajo condiciones asépticas, en una campana de flujo laminar horizontal.

Para evaluar los protocolos se consideró cual de ellos no permitió contaminación por algas, bacterias u hongos tanto en los medios como en los sustratos. Asignándose el valor de 0 a los protocolos en los que se observó contaminación, y un valor de 1 para los no contaminados; a los 5 días después de la siembra, escala cualitativa 2 (EC2).

El Índice de Germinación de las esporas (IG), se obtuvo de manera indirecta de acuerdo al grado de cobertura de los gametofitos, usando una estimación porcentual subjetiva, adaptación de la escala de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet (Mermoz y Martín, 1993), se evaluó a los 60 días después de la siembra. La escala fue la siguiente (EC3): 0= Sin germinación. 1= Numerosos gametófitos cubrieron 5% del frasco de cultivo. 2= Cualquier número de gametofitos con cobertura entre 5 y 25% del frasco de cultivo. 3= Cualquier número de gametofitos con cobertura entre 25 y 50% del frasco de cultivo. 4= Cualquier número de gametofitos con cobertura entre 50 y 70% del frasco de cultivo.

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

Los frascos con medio de cultivo y con sustratos se incubaron en la cámara de Cultivo del Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos Vegetales del CEPROBI, a la que se monitoreó la Temperatura (T); la Humedad relativa (% HR), e Intensidad luminosa (l). Se realizó el registro tres veces por semana durante 3 meses.

4.6. Evaluación de la viabilidad de esporas.

Los reactivos utilizados en esta parte del estudio fueron: azul de Evans (ADE), cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) y diacetato de fluoresceína (DAF) (Anexo 3), son recomendados para valorar la viabilidad de semillas en angiospermas y células o tejidos de diversos tipos de organismos (Pritchard, 1985;Vázques, 2003) y en el caso del reactivo de Mutzing (RM) (Anexo 3) para viabilidad de granos de polen (Andrada et al., 1998).

Las muestras de esporas, proveniente de los sobres almacenados, se pasaron por tamices (Scienceware®), colocados en el siguiente orden: número de malla 120, 60 y 45, se recolectó el tamizado de la malla 45, y se colocó en viales de vidrio de 5 ml que se sellaron y se almacenó en refrigeración (4-5 oC). Posteriormente se tomó una muestra de las esporas, se colocó en tubos Eppendorf® de 1.5 ml (3 por cada especie), se les agregó 0.5 ml de los siguientes reactivos:

-Azul de Evans, solución al 1% (ADE). -Cloruro de trifenil tetrazolio, solución al 1 % (TTC). -Diacetato de fluoresceína, solución al 1% (DAF). -Reactivo de Mutzing (RM).

Se dejó actuar 24 horas en el ADE, RM y TTC, y 10 minutos en el DAF. Se realizaron observaciones en un microscopio óptico a 10 y 40X; el criterio de viabilidad se basó en la tinción o no de las esporas (Andrada et al., 1998; Mendoza et al., 2006). En el tratamiento donde se tiñeron se realizaron dos repeticiones más. En cada repetición se contaron 50 esporas, se tomó este número como el 100%,

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

separando las esporas en viables cuando la tinción fue total y no viables cuando no se observó tinción o fue parcial; expresándose los resultados como el promedio de los porcentajes de las esporas viables (Andrada et al., 1998).

Estas pruebas se realizaron en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Unidad de Biología, Tecnología y Prototipos de la FES-Iztacala, UNAM, con la asesoría del Dr. Ernesto Aguirre León y en el Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos Vegetales del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional, con la asesoría de la M. en C. María de la Luz Arreguín Sánchez del Laboratorio de Fanerógamas del Departamento de Botánica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN.

4.7. Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro.

La selección de las especies para establecer el protocolo de desinfestación y medio de cultivo para propagación vegetativa in vitro, fue con base a la disponibilidad de explantes de calidad, prefoliaciones y yemas apicales foliares. Para tal fin se colectaron por la mañana prefoliaciones de plantas de campo en estados de crecimiento 1 y 2 (Strandberg, 2003) y yemas apicales. Se cortaron con tijeras de disección y con unas pinzas de disección se colocaron en cámara húmeda (contenedores de plástico con base y tapa, con papel absorbente humedecido , la base contenía 300 ml de agua estéril); para ser transportados al laboratorio se asperjaron con una solución que contenía Rovral®, Bayfolian®, Confidor® y AgrexF® (Anexo 1), todos al 0.1% (Flores, 2006*), con la finalidad de combatir hongos, insectos y mantener al tejido viable por lo menos 24 horas.

*Flores Olascoaga R. 2006. Comunicación personal. Técnico responsable de la Unidad de Laboratorio de Micropropagación del CDT-Tezoyuca del FIRA.

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

En el laboratorio se trataron con los siguientes protocolos de desinfestación:

Protocolo A (PA): se colocaron de 10 a 15 explantes en frascos tipo Gerber®, que contenían 2/3 partes de solución jabonosa (aproximadamente 2 g de detergente Roma® por litro) durante 5 minutos, se les retiró la solución jabonosa y se llevaron a una campana de flujo laminar horizontal (marca Veco®) en donde se llenaron con solución de NaOCl al 10%* de cloro comercial (marca Clorox®), se dejó actuar durante 15 minutos, se quitó la solución de NaOCl y se llenaron hasta la mitad con agua destilada estéril y se vació el agua de los frascos (Flores, 2006).

Protocolo B (PB): se colocaron de 10 a 15 explantes en frascos tipo Gerber®, que contenían 2/3 partes de solución jabonosa (aproximadamente 2 g de detergente Roma® por litro), con NaOCl al 3 %** de cloro comercial, durante 5 minutos, se les retiró la solución y se llevaron a una campana de flujo laminar en donde se llenaron con solución de NaOCl al 10%* de cloro comercial, se dejó actuar durante 15 minutos, se quitó la solución de NaOCl y se llenaron hasta la mitad con agua destilada estéril y se vació el agua de los frascos (Flores, 2006). Se repitió el procedimiento a los 18 minutos.

En estos protocolos el *NaOCl al 10 % se preparó usando 10 ml de cloro comercial (Clorox®) por cada 100 ml de agua desionizada estéril y el **NaOCl utilizando 3 ml de cloro comercial (Clorox®) por cada 100 ml de agua desionizada estéril. El medio de cultivo que se utilizó para establecer in vitro las prefoliaciones y yemas foliares apicales fue

el de etapa I (MEI) para helecho “Boston” (Flores, 2006)

(Cuadro 5).

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

Cuadro 5. Componentes del Medio MEI. Componente Sales de MS Inositol ANA KIN Fosfato de sodio monobásico Sacarosa comercial (SC) Carbón activado Agar grado bacteriológico

Cantidad por litro 100% 100 mg 0.2 mg 2.0 mg 60.0 mg 30.0 g 0.2 g 7.0 g

-MS: medio Murashige y Skoog, 1962, preparado a partir de soluciones madre. -ANA: Acido naftanelacético -KIN: Cinetina.

Para el aislamiento de explantes in vitro se utilizaron modificaciones del MEI (Cuadro 3), las cuales ha sido han sido probadas en la propagación de variedades comerciales de helechos (Flores, 2006). Cuadro 6. Modificaciones del MEI. Componentes del medio MEI (por litro) Ácido ascórbico 20 mg/L Ácido cítrico 20 mg/L Agar grado bacteriológico Almidón de maíz (AM)

Tratamientos MEIA*

MEIB

MEIC

MEID

MEIE

MEIF

MEIG

MEIH

7.5 g/L -

6.5 g/L -

9 9 7.5 g/L -

9 9 6.5 g/L -

-

-

9 9 -

9 9 -

80 g/L

70 g/L

80 g/L

70 g/L

-Maizena®-

*Corresponde al MEI original. -MS: medio Murashige y Skoog, 1962, preparado a partir de soluciones madre. -ANA: Acido naftanelacético -KIN: Cinetina

La sacarosa utilizada fue azúcar estándar. Para ajustar el pH se usaron NaOH y HCl, con dos soluciones de cada una, cuyas concentraciones eran de 1N y de 0.1 N. Se utilizaron frascos tipo “Gerber®” conteniendo aproximadamente 25 ml de medio y el tiempo de esterilización fue de 18 minutos a una temperatura de 121oC y una presión de 15 lb/pulg2.

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

La siembra de las prefoliaciones y yemas foliares apicales después de los protocolos de desinfestación PA y PB, se realizó de la siguiente forma: con pinzas de disección se tomaron dos explantes, colocándose sobre cuadros de papel bond estéril (aproximadamente de 10 x 15 cm.), con un bisturí (no. 4; navaja no. 22) se cortó la base de las prefoliaciones y en las yemas se cortaron las prefoliaciones dañadas; posteriormente se colocaron dos explantes de manera vertical en los frascos. Se sembraron 3 frascos de cada modificación del MEI para cada especie. Todo el proceso de siembra se realizó bajo condiciones asépticas, en una campana de flujo laminar horizontal (marca Veco®). Los frascos sembrados se incubaron en la Cámara de Cultivo de la Unidad de Laboratorio de Micropropagación del Centro de Desarrollo Tecnológico Tezoyuca del FIRA, a una temperatura de 25oC y una intensidad luminosa de 33 µmol.m-2s-1.

Para evaluar los protocolos se consideró, cual de los protocolos de desinfestación de prefoliaciones y yemas apicales foliares no permitió contaminación por algas, bacterias u hongos tanto en los medios como en los sustratos. Asignándose el valor de 0 a los protocolos en los que se observó contaminación, y un valor de 1 para los no contaminados; a los 5 días después de la siembra, escala cualitativa 2 (EC2).

Para valorar la sobrevivencia de los dos tipos de explantes, se uso una escala cualitativa (EC4), en la que el valor de 0 correspondió a aquellos explantes que al cabo de 15 días se oxidaban y el valor de 1 a los que no se oxidaban, que presentaban todavía una coloración verde y eran turgentes.

Se realizó una repetición, con el protocolo de desinfestación y los medios que mejor respuesta dieron. Esta repetición también se evaluó con la escala cualitativa EC4.

Para la resiembra de los explantes, se utilizaron otras variantes del MEI, en la concentración de las sales MS, específicamente nitrato de amonio y nitrato de potasio al 50 % (MEII) y al 30 % (MEIJ).

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MATERIAL Y METÓDOS-JADE

La evaluación de la respuesta de los explantes al cambio de medio se realizó con la escala cualitativa EC4.

Estos ensayos se realizaron en el Centro de Desarrollo Tecnológico Tezoyuca del FIRA, en la Unidad de Laboratorio de Micropropagación, bajo la asesoría del Biól. Ricardo Flores Olascoaga, de Marzo a Julio del 2006.

39

RESULTADOS-JADE

5. R E S U L T A D O S.

5.1. Abundancia relativa de las especies en estudio. En la parte de la estimación de la abundancia de cada especie de estudio, utilizando la escala de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet y el Índice de Densidad Lineal -DLi- y la Cobertura Lineal -CL-, obtenidos por transectos (Mermoz y Martín, 1993; Guadarrama et. al, 1998; González y Sánchez, 2001) (Figura 8); los valores mas altos de estos fueron

para las especies de Asplenium (Cuadros 7 y 8), siendo

menores para la especie Adiantum poiretii Wikstr.; relacionándose estos resultados posiblemente a su tipo reproducción vegetativa, ya que el género Asplenium se caracteriza por presentar

yemas prolíficas (Adams, 2006), lo que aumenta la

cantidad de individuos dentro de una población. Los resultados que se mencionan como medianas corresponden a una sola evaluación, la cuál se realizó en la colecta de verano.

Figura 8. Transecto realizado en campo para Asplenium muenchii A. R. Sm.

40

RESULTADOS-JADE

Cuadro 7. Abundancia-cobertura (Braun-Blanquet*), de las especies de helechos en estudio. Especie

Mediana

Adiantum poiretii Wikstr. Barranca Agua Bendita, Jumiltepec Asplenium muenchii A. R. Sm. Barranca Agua Bendita, Jumiltepec Asplenium sessilifolium Desv. El Salto, Tetela del Volcán

2 3 4

*0: Pocos individuos, pequeña cobertura; 1: numerosos individuos, cubren menos del 5% del área; 2: cualquier número de individuos con cobertura entre 5 y 25%; 3: cualquier número de individuos con cobertura entre 25 y 50%; 4: cualquier número de individuos con cobertura entre 50 y 75% y 5: cualquier número de individuos con cobertura mayor del 75%. -Los datos son medianas de frecuencias de la valoración de tres áreas de 10 m2.

Cuadro 8. Índice de densidad lineal (DLi) y cobertura lineal (CL), de las especies de helechos en estudio.

Especie Adiantum poiretii Wikstr.

DLi 1.03±0.51

(CL 0.73±0.25

1±0.2

0.8±0.1

1.3±0.2

0.8±0.26

Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

Asplenium muenchii A. R. Sm. Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

Asplenium sessilifolium Desv. El Salto, Tetela del Volcán

-Los datos son promedios de tres repeticiones, ± error estándar.

5.2. Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para fuentes de propágulos, aclimatización y herborización. De cada especie se obtuvieron de 10 a 15 sobres conteniendo una fronda fértil (con soros maduros), estas muestras fueron las que se usaron para los ensayos de germinación in vitro y en las pruebas de viabilidad. Se obtuvieron 2 ejemplares de cada especie en campo para su herborización, se llenaron las formas LABC-01 (información del sitio de colecta (Anexo 3)) y LABC-02 (información de cada ejemplar (Anexo 3)), ambas propuestas por el INEGI (2005) para colectas de plantas en

41

RESULTADOS-JADE

campo. A los ejemplares herborizados y montados, con base a lo establecido en Manual de Herbario del Consejo Nacional de la Flora de México (Lot y Chiang, 1986), se les anexaron las formas antes mencionadas. Los ejemplares se depositaron en el Herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Los ejemplares herborizados se identificaron con ayuda de bibliografía especializada (Mickel y Smith, 2004) y por comparación, con la asesoría de la curadora del Herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, la M. en C. María de la Luz Arreguín Sánchez. Las especies identificadas fueron: -Adiantum poiretii Wikstr.(Figura 9). -Asplenium muenchii A. R. Sm.(Figura 10). -Asplenium sessilifolium Desv.(Figura 11).

B A C

Figura 9. Aspecto general de un individuo de Adiantum poiretii Wikstr. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis.

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RESULTADOS-JADE

C

B

A Figura 10. Aspecto general de un individuo de Asplenium muenchii A.R. Sm. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis.

B C

A

Figura 11. Aspecto general de un individuo de Asplenium sessilifolium Desv., Ges. A. Fronda, B. Pinna y C. Raquis.

La arquitectura de las frondas de las diferentes especies colectadas (Figuras 9, 10 y 11); sobresalieron por su tamaño, forma y color, características importantes para ser consideradas con potencial ornamental (Díaz, 1995).

43

RESULTADOS-JADE

La condiciones ambientales en el vivero fueron: temperatura 38.7oC, humedad relativa 25.3% e intensidad luminosa de 150 µmol.m-2s-1; en el caso de la cámara de cultivo la temperatura fue de 20.1oC, humedad relativa 47.4% e intensidad luminosa 40 µmol.m-2s-1. Los ejemplares colectados en campo como fuentes de propágulos, manifestaron resultados poco satisfactorios, al emplear la escala EC1* para la aclimatización (Figura 12), las especies de Asplenium no respondieron a la aclimatización en la colecta de invierno, mejorando en la de verano sólo para la especie de Asplenium muenchii A. R. Sm.; para la especie Adiantum poiretii Wikstr. los resultados de la aclimatización fueron favorables en las tres colectas (Cuadro 9).

A

B

C

Figura 12. Proceso de aclimatización en cámara de cultivo de individuos de Asplenium muenchii A. R. Sm. A. Planta colocada en maceta, B. Bolsa de polipapel cubriendo a la planta y C. Disposición final de las plantas en la cámara de cultivo.

44

RESULTADOS-JADE

Cuadro 9. Respuesta de las plantas madre de campo a la aclimatización.

Especie Asplenium muenchii A. R. Sm. Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

No. de colecta 1*

Nivel de aclimatización*** Mediana

0

Invierno

2**

1

Primavera

3**

3

Verano

1* Asplenium sessilifolium Desv. El Salto, Tetela del Volcán

0

Invierno

2**

0

Primavera

3**

1

Verano

1* Adiantum poiretii Wikstr. Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

3

Invierno

2**

3

Primavera

3**

3

Verano

*Plantas en vivero y cámara de cultivo. **Plantas en cámara de cultivo. ***EC1: 0=Plantas muertas en los primeros 15 días; 1=Plantas que perdieron las frondas de campo, generaron nuevas frondas (prefoliaciones), pero no terminaron su desarrollo, finalmente la planta muere; 2=Plantas que perdieron las frondas de campo, generaron nuevas frondas (prefoliaciones), terminaron su desarrollo, y 3=Plantas que no perdieron las frondas de campo, generaron nuevas frondas (prefoliaciones). -Los datos son medianas de frecuencias de la valoración de tres plantas en cada colecta.

Sin embargo al evaluar el desarrollo de las prefoliaciones utilizando la clave ilustrada propuesta por Strandberg, 2003 (Anexo 3) (Cuadro 11 y Figura 13); la cantidad y calidad de las que se formaron durante el ensayo no cubrieron las características para usarse como explantes para su establecimiento in vitro. La calidad se determinó con base al estado de crecimiento de las prefoliaciones, el cual debería de estar entre el estado 1 y 2 (Strandberg, 2003) (Anexo 3), ya que con ese tamaño resistirían el protocolo de desinfestación por el estado de madurez del tejido; y con una adecuada turgencia y coloración verdosa, señales de que se trata de un tejido sano (Flores, 2005).

45

RESULTADOS-JADE

Cuadro 10. Evaluación del desarrollo de las prefoliaciones de las plantas madre provenientes de campo en el proceso de aclimatización. Especie

No. de colecta

1 Asplenium muenchii A. R. Sm Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

2 3 1 2

Asplenium sessilifolium Desv. El Salto, Tetela del Volcán

3 1

Adiantum poiretii Wikstr. Barranca Agua Bendita, Jumiltepec

2 3

No. de planta 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Estado de desarrollo de las prefoliaciones* (mediana**) 15 30 45 60 días días días días 1 1 1 1.5 1 1.5 1 1.5 1 2.0 2.5 2.5 1 1.5 2.0 2.5 1 2.0 2.5 3.0 1 1 1 1 1 1.5 1 1 1 1 1 2.0 2.5 3.5 1 1.5 2.5 3.0 1 1.5 2.0 2.5 1 1 1.5 2.5 1 1.5 2.0 3.0 1 1.5 2.5 2.5 1 1.5 2.0 2.5 1 2.0 3.0 3.5 1.5 1.5 2.0 2.5

*Escala de Strandberg (Anexo 3). ** Las medianas son resultado de la valoración de las prefoliaciones formadas en cada planta, por lo que el número de las mismas es diferente para cada planta.

46

RESULTADOS-JADE

A

B

C

D

Figura 13. Prefoliaciones en diferentes estados de crecimiento en plantas de Adiantum poiretii Wikstr: A. Estado de crecimiento 1; B. Estado de crecimiento 2; C. Estado de crecimiento 4 y D. Estado de crecimiento 6 (con base a la escala de Strandberg, 2003).

5.3. Desinfección de esporas. Se observó germinación únicamente en el protocolo 5; en los protocolos 2, 3 y 4, se aprecio que a mayor tiempo de exposición no se presentó ningún tipo de contaminación, pero no germinaron las esporas; es posible se debiera al NaOCl (Cuadro 12). Cuadro 11. Evaluación de los protocolos de desinfestación de esporas de helechos. Protocolo de desinfestación 1 (NaOCl 1%) 2 (NaOCl 1% + Tween 80)

3 (NaOCl 0.5% + Tween 80)

4 (NaOCl 0.5%+Tween80+Estreptomicina -Cox et al., 2003-) 5 Aspersión con etanol al 96 % *EC2: 0= con contaminación; 1= sin contaminación. ** Esporas germinadas.

47

Tiempos 10 20 10 20 30 40 10 20 30 40 3 5 15 -

Evaluación* 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1**

RESULTADOS-JADE

5.4. Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas in vitro. La germinación de las esporas se evalúo por medio del Índice de Germinación (IG) (Cuadro 13); usando la escala EC3*, en la que se considera la cobertura de los gametofitos desarrollados, que es un indicativo de germinación de las esporas (Ramírez et al., 2000). Se mencionan las evaluaciones para el protocolo 5, debido a que fue en el que se observó germinación (Cuadro 13). De los medios de cultivo ensayados en el que se presentó un mayor IG en las tres especies de helechos en estudio, fue el MS4; en el caso de los sustratos, el maquique y la vermiculita indujeron también un alto IG en las tres especies (Cuadros 13, 14 y 15). Otro de los sustratos utilizados fue la turba, en el que lG fue igual a cero (dato no reportado en cuadros), posiblemente por el pH ácido que presenta (3.8), y a la rápida proliferación de hongos, bacterias y algas. Los datos se sometieron a un análisis de varianza de una vía con un α= 0.005 (Kruskal-Wallis) (SigmaStat V. 3.0®)

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RESULTADOS-JADE

Cuadro 12. Índice de germinación (IG)* de las esporas de las especies de helechos en estudio en medios y sustratos.

IG Mediana

Adiantum poiretii Wikstr.

Asplenium muenchii A. R. Sm

superior Asplenium sessilifolium Desv.

1.0≥1.0≤1.0

1.0≥2.0≤2.0

1.0≥1.5≤2.0

MS:2.2g/L, sin sacarosa, sin carbón activado, pH:5.7-5.8

1.0≥2.0≤2.0

1.0≥3.0≤4.0

2.0≥3.0≤4.0

MT

0.0≥1.0≤2.0

2.0≥2.0≤3.0

1.0≥2.0≤3.0

0.0≥1.0≤2.0

1.0≥1.5≤2.0

1.0≥2.5≤3.0

1.0≥1.0≤2.0

2.0≥3.0≤4.0

1.0≥2.5≤3.0

Sustrato para germinar esporas de helechos Luna (2002)

0.0≥1.0≤1.0

0.0≥1.5≤2.0

0.0≥1.0≤2.0

VER

1.0≥1.5≤2.0

1.0≥2.0≤3.0

1.0≥3.0≤3.0

intervalo inferiror ≥mediana≤intervalo

Medio de cultivo o sustrato

MK Medio de Knudson

MS4

Medio de Thompson

AGR Agrolita

MAQ Maquique

SEH

Vermiculita *EC3: 0=Sin germinación, 1=numerosos gametófitos cubrieron 5% del frasco de cultivo., 2=cualquier número de gametofitos con cobertura entre 5 y 25% del frasco de cultivo, 3=cualquier número de gametofitos con cobertura entre 25 y 50% del frasco de cultivo, 4= cualquier número de gametofitos con cobertura entre 50 y 70% del frasco de cultivo. -Los datos son medianas de frecuencias de la evaluación de tres repeticiones con seis frascos c/una.

Los gametofitos de las dos especies de Asplenium presentaron un menor porte (Figura 14 B), comparados a los de Adiantum poiretii Wikstr., tanto en medio de cultivo como en sustrato (Figura 14 A), pero fueron más numerosos. En cuanto a la tonalidad, los gametofitos más verdes fueron los que crecieron

en el MS4, el

maquique y la vermiculita (Figura 14D); el MS4 contenía sales de MS al 50%, Phytagel (2.2 g/L) y un pH de 5.7-5.8, sin fuente de carbohidratos; estas condiciones posiblemente fueron ideales para que los gametofitos realizaran una eficiente fotosíntesis para producir su fuente de carbono. Con respecto al maquique, al ser de origen orgánico proporciona nutrientes minerales y en cuanto a la vermiculita, esta aporta iones potasio y magnesio, considerados elementos mayores. Así también, la

49

RESULTADOS-JADE

vermiculita puede retener mayor humedad, ya que su estructura es a base de pequeñas placas de mica. Los gametofitos formados en los medios de MK y MT, presentaron una tonalidad verde pálido y su cobertura fue menor; estas características fueron muy semejantes a lo observado en la agrolita (Figura 14C). En el SEH, los gametofitos presentaron una tonalidad verde pálido, pero su cobertura fue menor. Lo anterior fue similar en las tres especies de helechos estudiadas. El pH de los sustratos hortícolas fue el siguiente: agrolita: 6.0; maquique 5.3; sustrato para germinar esporas de helechos: 4.8; turba: 3.5 y vermiculita: 5.7.

B A

C

D

Figura 14. Formación de gametofitos, como resultado de la germinación de las esporas, en medios de cultivo semisólidos y en sustratos hortícolas: A. Gametofitos de Adiantum poiretii Wikstr en medio MS; B. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. creciendo en medio MS; C. Gametofitos de Asplenium muenchii A. R. Sm en agrolita y D. Gametofitos de Asplenium sessilifolium Desv. sobre vermiculita.

50

RESULTADOS-JADE

5.5. Evaluación de la viabilidad de esporas. Los resultados al someter las esporas de las especies de helechos estudiadas a los diferentes reactivos para evaluar la viabilidad fueron negativos en azul de Evans (ADE), diacetato de fluoresceína (DAF) y cloruro de trifenil tetrazolio (TTC); obteniéndose una reacción positiva solamente con el Reactivo de Mutzing (RM) (Cuadro 14 y Figura 15). La respuesta al RM se consideró como positiva cuando las esporas se tiñeron de rojo (Figura 15C), lo cual indico que atravesó la pared y membrana celular, permitiendo la reacción con las estructuras que contenían los ácidos nucleicos en la célula germinal (el RM contiene carmín, reactivo usado para teñir ácidos nucleicos). Cuando no se llevo a cabo esta reacción, no se presentó pigmentación (Figura 15 A y B). Los datos se sometieron a una Ji cuadrada con un α= 0.005 (SigmaStat V. 3.0®)

Cuadro 13. Viabilidad de las esporas de los helechos en estudio, utilizando el Reactivo de Mutzing.

Especie Asplenium muenchii A. R. Sm

% Viabilidad 68.5±12.3b

Asplenium sessilifolium Desv. Adiantum poiretii Wikstr

73.4±7.85ab 54.3±4.56a

-Los datos son promedios de tres repeticiones, ± error estándar. -Datos con misma letra no son diferentes estadísticamente.

51

RESULTADOS-JADE

1

A

3

2

4

B

C

Figura 15. Imágenes de la esporas sometidas al reactivo de Mutzing: A. Espora no viable de Asplenium muenchii A. R. Sm. (10X), B. Espora no viable de Asplenium sessilifolium Desv.(40X) y C. Espora viable de Asplenium sessilifolium Desv. (40X) 1. Perisporio, 2. Exosporio, 3. Endosporio y 4. Célula germinal.

5.6. Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro. Se utilizaron solo las especies de Asplenium, debido a que son las que presentaron una buena fuente de explantes, en cuanto a la calidad fisiológica y cantidad de los mismos. El protocolo que en el que no se presentó contaminación y que permitió la sobrevivencia de las prefoliaciones y yemas apicales foliares fue el PB de 18 min (Cuadro 14).

Cuadro 14. Evaluación de los protocolos de desinfestación de prefoliaciones y yemas foliares. Protocolo de desinfestación PA (NaOCl al 10%) PB (NaOCl al 3 %+ Detergente -3 min.- +NaOCl al 10%)

*EC2: 0= con contaminación; 1= sin contaminación. **Permitió sobrevivencia de prefoliaciones y yemas foliares.

52

Tiempo de exposición min. 15 15 18

Evaluación* 0 0 1**

RESULTADOS-JADE

Al valorar la sobrevivencia de los dos tipos de explantes a los 25 días después de la siembra, en las modificaciones del MEI (Cuadro 4); para el protocolo de desinfestación PB de 18 min; esta fue adecuada en las modificaciones del MEIA al MEIH (Cuadro 6). Se realizó una segunda siembra de ambos tipos de explantes, a los 30 días, obteniéndose los mismos resultados. La segunda resiembra se efectuó modificando la cantidad de nitratos del MS (medios MEII y MEIJ). A los 10 días después de la resiembra continuaban vivos, sin embargo a los 20 días se oxidaron y murieron, por lo que la modificación del MS no resultó favorable.

53

DISCUSIÓN-JADE

6. D I S C U S I Ó N.

6.1. Abundancia de las especies en estudio.

La especie Asplenium muenchii A. R. Sm fue la que se encontró a la menor humedad relativa, esto por encontrarse expuesta a la mayor intensidad luminosa (Cuadro 1). Para las especies de Asplenium sessilifolium Desv. y Adiantum poiretii Wikstr., las condiciones de humedad y temperatura fueron semejantes, aun siendo de localidades diferentes; no así en el caso de la intensidad luminosa, siendo más alta en Adiantum poiretii Wikstr. y menor en Asplenium sessilifolium Desv., debido a que la segunda especie se desarrolla en lugares protegidos (Flora Mesoamericana, 2006; Figura 6). Estas variaciones de temperatura, a pesar de que la colecta de las especies se llevó a cabo en el mismo tipo de vegetación (bosques templados: bosque de Quercus y bosque de coníferas, según Rzedowski, 2006); se explican en parte, a que el hábitat de las poblaciones visitadas son barrancas, y dentro de estas se pueden encontrar microclimas.

Respecto al pH del suelo, fue semejante en las muestras de las tres especies, debido posiblemente a que las zonas de colecta se encuentran, desde el punto de vista fisiográfico, en la misma zona: la vertiente sur del sistema volcánico transversal (Rzedowski, 2006), cuyos suelos son similares, tanto en sus propiedades físicas como químicas.

Se estimó la abundancia de las especies en estudio en sus sitios de colecta (Cuadro 7). La primera técnica que se aplicó fue la de la escala de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet, la cual al tratarse de una estimación porcentual subjetiva, se utiliza para censos rápidos de vegetación (Mermoz y Martín, 1993). Esta escala tiene un intervalo de valores que van del 0 al 5, dependiendo del porcentaje de cobertura por parte de los individuos de la especie a evaluar.

54

DISCUSIÓN-JADE

La abundancia-cobertura fue un dato que nos indicó, que las dos especies silvestres del género Asplenium, con valores que van del 3 al 4 (Cuadro 8), presentaron una cobertura mayor al 50%, en las dos localidades; que se considera intermedia a alta (Mermoz y Martín, 1993), siendo importante mencionar que los individuos de estas especies crecen formando “manchones”, por lo que al ampliar el área de muestreo (se hizo para un área de 10m2), es posible que estos valores cambien. Con Adiantum poiretii Wikstr, los valores de su abundancia-cobertura se ubicaron entre 1 y 2 (Cuadro 7), es decir una cobertura no mayor del 25 %, por lo que se considera baja a intermedia, esto explica en parte a que los individuos de esta especie crecen esparcidamente.

La segunda técnica que se aplicó fue la del transecto, la cual es utilizada en los inventarios de vegetación para obtener información rápida, debido a su fácil aplicación. Esta técnica está basada en la medición de todas las plantas interceptadas por un plano vertical de líneas, localizadas aleatoriamente y de igual longitud (González Uribe y Sánchez Pérez, 2001). Los parámetros que se obtienen son el Índice de Densidad Lineal (DLi) y la Cobertura Lineal (CL).

El valor del DLi obtenido para las dos especies de Asplenium (Cuadro 9), nos indica que la cantidad de individuos que interceptaron la línea es baja; pero los valores de la CL (Cuadro 8), que el espacio que cubrieron en la misma fue amplio (González Uribe y Sánchez Pérez, 2001). Los valores más bajos de ambos parámetros correspondieron a Adiantum poiretii Wikstr. En los tres casos los valores de los dos parámetros concordaron con lo obtenido con la escala de abundancia-cobertura de Braun-Blanquet (Cuadro 9).

Al considerar la abundancia-cobertura, el

DLi y la

CL de las tres especies de

helechos colectados, la población de estos en los sitios de colecta es óptima para poder obtener de manera constante plantas para fuentes de propágulos o explantes.

55

DISCUSIÓN-JADE

6.2. Colecta de esporas y especimenes de las especies en estudio para fuentes de propágulos, aclimatización y herborización.

El propósito de seguir las recomendaciones para el proceso de herborización del Manual de Herbario del Consejo Nacional de la Flora de México (Lot y Chiang, 1986), fue para poder llevar a cabo la preservación de los ejemplares colectados, lo que facilitó la identificación taxonómica de los mismos. Además permitió que estos sean depositados en el Herbario ENCB de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Los sobres en que se colectaron y las condiciones ambientales (temperatura: 21 oC; humedad relativa: 47.4%), del lugar en que se almacenaron las frondas con los esporangios, fueron las indicadas para su conservación (Montoya et al., 2000), lo que permitió su uso posterior.

En lo referente a la aclimatización de las plantas madre de campo, los individuos que mejor respondieron en las tres colectas, fueron los de Adiantum poiretii Wikstr (Cuadro 9); desarrollando prefoliaciones de calidad (Flores, 2006), que corresponden al estado 1 y 2 de la escala de Strandberg (2003). Esto puede deberse a las condiciones de temperatura (21oC) y humedad relativa (47.4%) de la cámara de cultivo, que fueron más cercanas a las que prevalecieron en su sitio de colecta (Cuadro 1), y a que algunas especies de este género, pueden desarrollarse en climas cálidos (Mickel y Smith, 2004); pero la cantidad de prefoliaciones fue escasa.

Los ejemplares de las especies de Asplenium en la primera colecta no lograron aclimatarse (Cuadro 9); debido a que las plantas se colocaron en cuarentena en vivero, en donde las condiciones de temperatura y la humedad relativa (38 oC y 25.3% respectivamente), no se asemejaron a las encontradas en campo para estos individuos (Cuadro 1); aun cuando después de la cuarentena se trasladaron a cámara de cultivo, en las que las condiciones (temperatura: 21oC; humedad relativa: 47.4%), fueron más cercanas a las que prevalecieron en su sitio de colecta. Para la

56

DISCUSIÓN-JADE

segunda y tercera colecta se decidió colocar a las plantas directamente en la cámara de cultivo, Asplenium sessilifolium Desv. mejoró su respuesta al igual que Asplenium muenchii A. R. Sm. (Cuadro 9), pero sin formar prefoliaciones de calidad, ni en cantidad adecuada.

En lo que toca al uso de la escala propuesta de Strandberg (2003), que clasifica en 7 estadios de crecimiento a las prefoliaciones en cultivos del helecho cuero Rumohra adiantiformis (G. Forst.) Ching (Anexo 3), fue útil debido a que la cantidad de prefoliaciones que formaron las plantas en este ensayo fueron insuficientes para establecer una escala para cada especie de helecho en estudio. Por lo que se recomienda su uso en la evaluación del crecimiento de otras especies de helechos, sean silvestres o domesticadas (como las ornamentales), siempre y cuando la división de la fronda sea parecida a la del helecho cuero.

6.3. Desinfección de esporas.

El establecimiento del protocolo adecuado para la de desinfestación de las esporas representó la mayor parte del trabajo de esta tesis. De inicio se partió de

la

experiencia que se tiene en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional, en la desinfestación de las esporas del helecho cuerno de alce Platycerium bifurcatum (Cav.) C. Chr. (Evangelista et al., 2001), del que su cultivo in vitro esta establecido.

En la mayor parte de la literatura encontrada con respecto a la desinfestación de esporas de helechos se menciona el uso del hipoclorito de sodio (NaOCl) como agente desinfectante, teniendo resultados favorables en concentraciones bajas de cloro activo en tiempos largos; y en concentraciones altas en tiempos cortos, en ambos complementando con el uso de etanol o agregando Tween 20 o Tween 80 en la solución de NaOCl (Douglas y Sheffield, 1990; Camloh y Gogala, 1992; Pangua et al., 1994; Fernández et al., 1997; Edwards y Roux, 1998; Bertrand et al., 1999; De Paula Fiilippini et al., 1999; Pivetta y Gomes, 2000; Cox et al., 2003; Nondorf et al.,

57

DISCUSIÓN-JADE

2003; Rogge Renner y Randi, 2004; González Rosas et al., 2006). En este sentido, en cuatro de los cinco protocolos de desinfestación implementados en este trabajo se manejaron concentraciones de cloro activo que coinciden con lo mencionado en la literatura, además se uso Tween 80 y en uno de ellos estreptomicina (Cuadro 3); logrando en los protocolos 2, 3 y 4 frascos de cultivo sin contaminantes, en los tiempos de exposición altos, pero no se observó germinación de las esporas (Cuadro 11).

Posiblemente se deba a que el Tween 80 al ser un detergente favoreció el rompimiento de la tensión superficial, permitiendo que el NaOCl penetrara por la abertura de las esporas, en donde la pared celular es mas delgada (Rhagavan, 1988), destruyendo las estructuras celulares internas y haciéndolas inviables. Aunque en la literatura se cita la germinación de esporas de helechos sometidas a concentraciones similares de NaOCl, Tween 80 y tiempos de exposición, se debe considerar que la mayoría de las especies de helechos son ornamentales o tienen algún grado de domesticación (individuos aclimatizados); esto sugiere que tienen un manejo fitosanitario, es decir, están expuestas a agroquímicos que favorecen la resistencia de las esporas a tratamientos de desinfestación, y por otro lado disminuyen los posibles contaminantes en condiciones in vitro (Flores, 2006).

En el caso de las esporas de especies silvestres se ha observado que no es recomendable el uso del hipoclorito de sodio (NaOCl) para su germinación in vitro, puesto que en la mayoría de los casos no se presenta germinación de las esporas (Arreguín, 2006), como ocurrió en las especies de helechos en estudio.

El etanol ha sido utilizado como complemento a la desinfestación de esporas de helechos con NaOCl, pero en tiempos muy cortos y sumergiendo las muestras de las esporas (Camloh y Gogala, 1992; González et al., 2006); en este trabajo sólo se asperjó, dejándose evaporar (protocolo 5 de desinfestación, Cuadro 3), obteniéndose resultados satisfactorios, debido a que fue el único que permitó tener frascos de cultivo libres de contaminantes y la germinación in vitro de las esporas de las tres

58

DISCUSIÓN-JADE

especies de helechos seleccionadas (Cuadro 12); lo que sugiere que el etanol no disminuye la viabilidad de las esporas, es decir no las daña en su estructura interna, al menos en el tiempo en que estuvieron en contacto, ya que puede alterar la composición química de la pared celular y el sistema de la membrana (Salisbury y Ross, 1994); además de que resulta efectivo para controlar problemas de contaminación en los medios de cultivo y sustratos utilizados.

6.4. Medio de cultivo y del sustrato adecuado para la germinación de esporas in vitro.

Este ensayo se realizó a la par que el anterior, es decir, para probar que protocolo de desinfestación era el adecuado, las esporas desinfestadas se sembraron en los medios de cultivo y sustratos hortícolas seleccionados. Por lo que sólo se evaluó la germinación de las esporas desinfectadas con el protocolo 5, debido a que fue en el que se observó germinación y no se presentaron contaminantes (Cuadro 11). La evaluación se expresó a través de un Índice de Germinación (IG) (Cuadro 13); el cual considera la cobertura de los gametofitos desarrollados, como un indicativo de germinación de las esporas (Ramírez et al., 2000).

En la mayor parte de los datos se utilizó el MS4 (desde el 100% hasta el 25% de las sales del medio de Murashige y Skoog, 1962), el medio de Knudson (MK) y el medio de Thompson (MT), para la germinación de esporas de helechos los resultados fueron favorables al observarse la formación de gametofitos (Douglas y Sheffield, 1990; Camloh y Gogala, 1992; Pangua et al., 1994; Fernández et al., 1997; Edwards y Roux, 1998; Bertrand et al., 1999; De Paula et al., 1999; Pivetta y Gomes, 2000; Cox et al., 2003; Nondorf et al., 2003; Rogge y Randi, 2004; González Rosas et al., 2006; Fernández y Revilla, 2003; Mendoza Ruiz y Pérez García, 2005; González Rosas et al., 2006 ); al igual que en este trabajo, puesto que el medio de cultivo en el que se registró un mayor IG en las tres especies de helechos, fue el MS4, el cual contenía el 50% de las sales del medio MS (Murashige y Skoog, 1962), sin sacarosa y carbón activado y a un pH de 5.7-5.8; características que al parecer fueron las

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DISCUSIÓN-JADE

adecuadas para inducir la germinación de las esporas; en cuanto a los medio de MK y MT, si se observó germinación, pero el valor del IG fue menor respecto al MS4 (Cuadro 12).

Los anteriores resultados se pueden deber, en parte, a que las sales del MS4 fueron las suficientes para que después de la germinación, el gametofito en desarrollo (protalo), pudiese llevar a cabo la síntesis de sus nutrimentos (Izco et al., 1998), reflejándose en la mayor cobertura de los gametofitos; lo que al parecer no ocurrió con las sales del medio de Kundson (MK) y el medio de Thompson (MT), medios en los que la concentración de sales es menor (Fernández y Revilla, 2003; Mendoza y Pérez , 2005), que el MS4.

Las esporas contienen sustancias de reserva y al formarse los gametofitos, que son autótrofos, no requieren en general la presencia de sacarosa (Cronquist, 1971; Rhagavan, 1988; Izco et al., 1998); aunque se ha citado en algunas especies de helechos que la presencia de hexosas, como la sacarosa, estimulan el desarrollo de los gametofitos pero en otros casos los inhiben o pueden propiciar apogamia, lo que retrasa la aparición de esporofitos, pero podría aumentar la producción de estos (Sheffield, 1996;Rogge y Randi, 2004; Aguilar , 2005).

Con respecto a los sustratos hortícolas los que presentaron un mayor índice de germinación (IG) fueron el maquique (MAQ) y la vermiculita (VER), siendo la agrolita (AGR)y el sustrato para germinar esporas de helechos (SEH) los que obtuvieron un IG menor (Cuadro 12), es decir, permitieron el adecuado desarrollo de los gametofitos. El MAQ al ser de origen orgánico, raíces secundarias de helechos arborescentes (Palacios, 2007), contiene una mayor cantidad de nutrientes; la VER al aportar iones potasio y magnesio, considerados elementos mayores, y retener una mayor humedad, por su estructura a base de mica (Martínez, 1994). La AGR se considera un sustrato inerte y con mediana retención de humedad (Martínez, 1994), características que se vieron reflejadas al observarse un bajo desarrollo de los gametofitos formados, que finalmente se murieron.

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DISCUSIÓN-JADE

Otro factor relevante en los sustratos hortícolas fue el pH, se ha reportado que el intervalo ideal para la germinación de esporas en diferentes especies de helechos esta entre 5.0 y 7.5 (Sheffield, 1996; Aguilar, 2005). Aunque el pH óptimo para la germinación dependerá de la especie, por ejemplo en un estudio hecho por Douglas y Sheffield en 1990, sobre germinación de esporas de Platycerium bifurcatum (Cav.) C. Chr., el peso fresco de los gametofitos formados fue dependiente del pH, obteniéndose el peso más alto en el pH de 5.5, observándose una disminución del mismo conforme se aumentó; por otro lado en Cheilanthes feii (Nondorf et al., 2003), el más alto porcentaje de germinación se presento en el pH de 4.5, disminuyendo casi a la mitad en el de 8.5. En este trabajo la agrolita (AGR) el maquique (MAQ), el sustrato para germinar esporas de helechos (SEH) y la vermiculita (VER) tenían un pH de 6.0, 5.3, 5.3, 4.8 y 5.7 respectivamente; a excepción del SEH, los demás presentaron valores que cayeron dentro del intervalo de pH de 5.0 a 7.5 antes mencionado, lo que se reflejo en los valores de IG obtenidos para estos sustratos, además de que el pH fue muy similar al registrado en los lugares de colecta de las especies en estudio (Cuadro 1); el pH del SEH fue poco adecuado para la germinación de esporas, como se ve en el IG obtenido para las tres especies (Cuadro 12), a pesar de haber funcionado para otras especies de helechos (Luna, 2000). Se considera en general, que las variaciones en el pH afectan la capacidad por parte de los gametofitos de absorber nutrientes del medio en el que se desarrollan (Rhagavan, 1988).

Otros factores que se ha observado son importantes en la germinación de esporas y desarrollo de gametofitos en helechos son la temperatura y la intensidad luminosa (Edwards y Roux, 1998; De Paula et al., 1999; Pivetta et al., 2000; Nondorf et al., 2003; Rogge y Randi, 2004; Hvoslef-Eide, 1990), los cuales en este trabajo se mantuvieron constantes, por lo que es factible que la respuesta para cada medio y sustrato se hubiese visto modificada (se realizó un ensayo probando el protocolo 5 en los medios y sustratos en oscuridad, sin embargo no se observó germinación, datos no reportados).

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DISCUSIÓN-JADE

En cuanto al tamaño de los gametofitos, de menor porte en las dos especies de Asplenium (Figura 13 B) y de mayor porte en los de Adiantum poiretii Wikstr. (Figura 13 A), es posible que sea reflejo de las características del medio en el que se desarrollaron (medio de cultivo o sustrato) y de la información genética propia de cada especie; puesto que en menciones de otras especies de Asplenium y de Adiantum, el porte que presentaron es similar a lo que se observó en las especies estudiadas (Pangua et al., 1994; Fernández et al., 1997b; Potter, 2001; Sánchez, 2001; Hernández, 2004). La diferencia en tonalidades en los gametofitos en los medios y sustratos, se puede deber al aporte de nutrientes minerales para que estos realizaran la fotosíntesis (Rhagavan, 1988; Izco et al., 1998).

A pesar de obtener germinación adecuada tanto en medios de cultivo como en sustratos, la mayoría de los gametofitos formados no formaron esporofitos (sólo unos cuantos en MAQ, AGR y VER, sin terminar su desarrollo, datos no publicados); o que exclusivamente formaron gametangios masculinos (observaciones realizadas en microscopio óptico evidenciaron únicamente la presencia de anteridios, datos no publicados). Pero si se observó el fenómeno de apogamia (al realizar observaciones al microscopio óptico se evidenció la formación de gametofitos apogámicos, datos no publicados), lo cual se puede deber a varias causas: por influencia del medio o sustrato, de las condiciones ambientales, por la información genética propia de cada especie (Nayar y Kaur, 1971); por lo que no se logró obtener explantes de hojas o rizomas de origen in vitro.

Cabe mencionar que se hicieron ensayos (datos no citados), de transplante de gametofitos de sustratos al medio MS4, obteniéndose resultados favorables en los provenientes de vermiculita, ya que resistieron mejor la desinfestación y se adaptaron más rápidamente al cambio, en comparación de los que provenían de los demás sustratos.

Con respecto a los sustratos se debe considerar que el maquique esta protegido en nuestro país (NOM-004-RECNAT-1996, 2005; NOM-059-ECOL-2001, 2005), por lo

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DISCUSIÓN-JADE

que es más recomendable seguir las indicaciones para su aprovechamiento, o el uso de la vermiculita para seguir con los estudios de germinación de esporas de helechos silvestres.

6.5. Evaluación de la viabilidad de esporas.

Los resultados negativos, al someter las esporas de las especies de helechos estudiadas, en azul de Evans, diacetato de fluoresceína y cloruro de trifenil tetrazolio, posiblemente se deban a que estos reactivos no penetraron al interior celular de las esporas, por varios factores; ya sea por la barrera que forman en conjunto la pared y membrana celular de las esporas (al ser estructuras de resistencia la pared es gruesa), al tiempo de exposición o a la concentración de los mismos (aspectos que no se manipularon más al dar una respuesta positiva el Reactivo de Mutzing ).

La respuesta del RM, permitió separar las muestras de esporas en viables, cuando se tiñeron de rojo, y en no viables cuando no se pigmentaron o la tinción fue parcial (Andrada et al., 1998); lo que es indicativo de que atravesó la pared y membrana celular, reaccionando con las estructuras celulares que contenían ácidos nucleicos (el RM contiene carmín, reactivo usado para teñir ácidos nucléicos).

El porcentaje de viabilidad obtenido corresponde a lo observado en la germinación in vitro de cada especie de helecho en estudio (Cuadro 13). Aunque se debe tomar en cuenta que esta viabilidad sólo es para la muestra de esporas colectadas (que son las que se usaron para la germinación in vitro), pudiendo variar con el tiempo y fecha de colecta.

La viabilidad de las esporas en helechos es una característica muy variable, la cual depende no sólo del tipo de espora o de la especie, sino también de otras características fisiológicas como por ejemplo la edad, genotipo y latencia, así como factores ambientales que prevalecen en el suelo: pH, humedad, temperatura, luz, competidores y depredadores (Ramírez et al., 2000).

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DISCUSIÓN-JADE

6.6. Desinfección y medio de cultivo adecuado para prefoliaciones y yemas apicales foliares in vitro.

Debido a que la calidad y cantidad de los propágulos de las plantas madre de campo aclimatizadas no fue la adecuada, ni se obtuvieron plántulas in vitro de la germinación de esporas, se optó por colectar de plantas de campo tomando explantes de prefoliaciones (de las dos especies de Asplenium) y yemas apicales foliares (de Asplenium sessilifolium Desv.). En el caso de Adiantum poiretii Wikst., no forma yemas apicales foliares y la cantidad de prefoliaciones fue muy baja (1 o 2 por individuo); decidiéndose no colectar para evitar afectar a la población natural.

Las condiciones de transporte de los dos tipos de explantes fueron las óptimas para su conservación: se colocaron en contenedores (cámara húmeda) con papel absorbente humedecido y se asperjaron con una solución que contenía Rovral®, Bayfolian®, Confidor® y Agrex-F® (Anexo 1),

todos al 0.1% (Flores, 2006);

permitiendo que las prefoliaciones se mantuviesen turgentes, y en el caso de las yemas apicales foliares permitió que después de 3 meses en el contenedor formaran de manera constante nuevas prefoliaciones (se considera prometedor a este tipo de explante para en un futuro inducir la brotación múltiple in vitro); sin crecimiento importante de contaminantes (datos no citados).

Antes de realizar los protocolos de desinfestación, se observó que los explantes tanto prefoliaciones como yemas foliares apicales, presentaban una alta turgencia (evaluación visual; Flores, 2006), por lo que existía la posibilidad de daño en la desinfestación y una deshidratación en la siembra in vitro. Para evitar esto se utilizaron los tiempos de desinfestación con hipoclorito de sodio (NaOCl) más bajos utilizados para diferentes especies ornamentales propagadas in vitro en la Unidad de Laboratorio de Micropropagación del Centro de Desarrollo Tecnológico Tezoyuca del FIRA; que corresponde al protocolo de desinfestación PA, pero permitió la contaminación de los explantes in vitro (Cuadro 15); por lo que se decidió aumentar el tiempo de exposición de los explantes al NaOCl, obteniendo resultados favorables

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DISCUSIÓN-JADE

en el protocolo PB de 18 minutos, logrando establecer in vitro las prefoliaciones y las yemas apicales foliares, teniendo una buena turgencia por más de 25 días después de la siembra.

En la literatura se menciona el uso del rizoma, estolones del rizoma y hoja para inducir la brotación múltiple in vitro en diferentes especies de helechos, desinfectando con hipoclorito de sodio NaOCl, a diferentes concentraciones de cloro activo, combinándolo con el uso de Tween 20 y complementándolo con etanol; logrando el establecimiento de los explantes, hasta la brotación múltiple (Loescher y Albrecht, 1979; Hvoslef Eide, 1990; Pasqual et al., 1994; Guimaraes et al., 1999; Hvoslef-Eide, 1990; Ambrosio y de Melo, 2004; González Rosas et al., 2006); en este trabajo debido a las características de las especies (el rizoma es corto, para obtener una buena cantidad de explantes se tendría que colectar una gran cantidad de plantas; no forman estolones y las hojas son membranáceas, lo que las hace muy susceptibles al NaOCl y etanol; las hojas de las especies de los helechos usados en los reportes citados son coriáceas, más resistentes a los desinfectantes); se utilizaron prefoliaciones y yemas foliares apicales, sin lograr inducir brotación; no se ha encontrado reportes del uso de este tipo de explantes.

Como se mencionó la turgencia de los explantes, sugería que estos se deshidratarían in vitro, así es como se utilizó diferentes agentes gelificantes en diferentes concentraciones cada uno (Cuadro 6). Uno de ellos fue el agar, ampliamente utilizado para el cultivo in vitro, además se reporta que en diferentes concentraciones

puede alterar las respuesta in vitro de diferentes explantes

(Debergh, 1993; Pierik y Scholten, 1998). El otro agente gelificante fue el almidón de maíz (Maizena®), este se ha probado con éxito en el FIRA para establecer el helecho Boston, además existen citas en donde se ha utilizado almidón de otras especies de plantas como agente gelificante, obteniéndose resultados favorables, además de reducir los costos del cultivo in vitro (Henderson y Kinnersley, 1988; Zimmerman et al., 1995; Romay et al., 2006). En ambos casos lo que se buscó fue modificar el potencial osmótico del medio de cultivo, para evitar la perdida de agua

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DISCUSIÓN-JADE

(turgencia). A la par se trató de evitar la oxidación de los explantes, para tal fin se utilizaron el carbón activado y los ácidos cítrico y ascórbico, a diferentes concentraciones (Cuadro 4); sustancias que se reportan como antioxidantes (Phyto Technology Laboratories™, 2004; González, 2005).

Como resultado de estas combinaciones, en todos los medios utilizados los explantes mantuvieron una adecuada turgencia y la oxidación tuvo una baja incidencia, pero al cabo de 25 días la perdida de turgencia se presentó en la mayoría de estos, por lo que se cambiaron a medios en los que se modificó la concentración de nitratos (al disminuir la cantidad de nitratos, la conductividad eléctrica del medio de cultivo también disminuye, de un valor de 4 µs en los nitratos al 100% llega hasta 3.0 µs en el caso de los nitratos al 50%; y a 2.5 µs en los nitratos al 30%, esto disminuye el potencial osmótico del sistema, lo que en teoría evita la perdida de turgencia (agua) del tejido del explante (Flores, 2006)); los explantes transplantados respondieron bien, al seguir turgentes, pero después de 15 días empezaron a morir.

Por último se hicieron ensayos con rizoma y hojas, en los se logró controlar la contaminación in vitro, pero no se consiguió mantener la viabilidad (datos no citados).

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CONCLUSIONES, SUGERENCIAS-JADE

7. C O N C L U S I O N E S Y S U G E R E N C I A S.

C O N C L U S I O N E S.

-Se registro la abundancia-cobertura (escala de Braun-Blanquet), el índice de densidad lineal y la cobertura lineal para cada especie en su localidad.

- Se implemento un protocolo de desinfestación de esporas de los

helechos

estudiados, asperjando etanol sobre las frondas y dejándolo evaporar.

- Se estableció como medio de cultivo mas adecuado para la germinación de las esporas de las especies de helechos en estudio, el medio denominado MS4 (50% de las sales del medio MS (Murashige y Skoog, 1962), sin sacarosa, sin carbón activado y a un pH de 5.7-5.8), por presentar el más alto índice de germinación (IG).

-Se establecieron como los sustratos hortícolas mas adecuados al maquique y la vermiculita, debido a que obtuvieron los IG más altos.

-Se estableció un protocolo para la evaluación de la viabilidad de las esporas de helechos en estudio, que consistió en utilizar el reactivo de Mutzing, poniéndolo en contacto con las muestras de esporas durante 10 minutos, pudiendo separar en viables aquellas que se teñían por completo y en no viables a las que se teñían parcialmente o no se teñían.

-Se estableció un protocolo de desinfestación para el establecimiento in vitro de prefoliaciones y yemas apicales foliares.

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CONCLUSIONES, SUGERENCIAS-JADE

S U G E R E N C I A S.

-Llevar a cabo una evaluación más completa de la abundancia de las especies en estudio, para determinar las características poblaciones que permitan un manejo mas adecuado del recurso.

-Tener un mayor control de la temperatura y humedad relativa en el proceso de la aclimatización de plantas de campo, para poder tener individuos que proporcionen propágulos de calidad y en cantidad adecuada.

-Adicionar a los medios de cultivo y sustratos hortícolas, reguladores del crecimiento vegetal, fuentes de carbono, vitaminas, entre otros; con la finalidad de poder generar esporofitos in vitro.

-Probar el protocolo establecido para la evaluación de la viabilidad en muestras de esporas con diferente fecha de colecta y/o tiempo de almacenamiento; además de utilizarlo para otras especies de helechos.

-Establecer el protocolo de desinfestación que permita que las yemas apicales foliares se establezcan in vitro, debido a que en condiciones de cámara húmeda formaron nuevas prefoliaciones y se mantuvieron viables por mas de 3 meses.

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81

ANEXOS-JADE

ANEXO 1. COMPOSICIÓN DE AGROQUÍMICOS: BACTERICIDAS, FERTILIZANTES Y FUNGICIDAS \ Agrex-F® Adherente, dispersante, humectante. Coadyuvante agrícola no iónico acelera la penetración de agroquímicos al eliminar la espuma que generan las mezclas de aspersión y mejora la dispersión de las gotas. Potencializa la acción de plaguicidas, biorreguladores y fertilizantes (filsa.com.mx/plm/prods/398.htm). Composición Ingrediente activo: Mezcla de tensoactivos no iónicos Dioctil sulfosuccinato Diluyentes y acondicionadores Total:

% en peso 29.9% 2.3% 67.8% 100.00%

\ Bactrol® Bactericida,

con

alta

humectación

y

suspensibilidad.

Ingrediente

Activo:

estreptomicina y oxitetraciclina (filsa.com.mx/plm/labs/labs/84.htm). \ Bayfolan® Fertilizante líquido inorgánico, regula y mejora las condiciones generales de la planta, aporta nutrientes vía foliar. Tamponea el pH hacia valores neutros a ligeramente ácidos. Ingredientes activos: elementos mayores (nitrógeno, fósforo, potasio), elementos menores (fierro, manganeso, boro, cobre, zinc, níquel, cobalto, molibdeno, cloro, sodio y azufre), vitamina B1, auxinas de crecimiento y sustancias tampón (www.bayercropscience.cl/folletos/a_bayfolan.pdf) \ Benlate® Benlate®, fungicida sistémico de amplio espectro, perteneciente al grupo de los bencimidazoles, polvo humectable (www.dupontagricola.com.co/descprodnew.asp? nompais=Colombia&codpais=1&codprod=14&tipo=Fungicidas; dupont/hojaSeguridad5.pdf). Composición:

I

www.afipa.cl/afipa/

ANEXOS-JADE

\

Ingrediente activo Benomil: Metil-1 (butilcarbamoil)-2 bencimidazol-2-ilcarbamato: Ingredientes Inertes: Total:

% en peso 50% 50% 100%

Confidor® Insecticida,

en

suspensión

concentrada,

perteneciente

al

grupo

de

los

cloronicotinilos, cuyo ingrediente activo es el imidacloprid (1-(6-cloro-3-piridin-3ilmetil)-n-nitroimidazolidin-2-ilidenamina), al 30.20 %. Actúa por contacto, ingestión y de

forma

sistémica,

especial

contra

insectos

chupadores

(www.bayercropscience.com.mx/bayer/cropscience/bcsmexico.nsf/id/Confidor_BCS. \ Malathion 1000® Insecticida

organofosforado

concentrado

emulsionable

(www.anajalsa.com.mx/

malathion.html). Composición: Ingrediente activo

% en peso

Malathion: 0,0-dimetil fosforoditioato de dietil mercaptosuccinato mercaptosuccinato-S-ester con 0,0 dimetil fosforoditioato No menos de: Equivalente a 1,000 grs de I.A/Lt a 20°C Ingredientes Inertes: Disolventes, Emulsificantes y Compuestos Relacionados No más de: Total

ó

dietil

88.7%

11.3% 100.00%

\ Raizal 400 ® Fertilizante

arrancador

para

plántulas

y

trasplantes,

(filsa.com.mx/plm/prods/632.htm). Composición: Ingredientes activos Nitrógeno total: Fósforo disponible: Potasio: Magnesio: Azufre: Fitohormonas:

% en peso 9.0% 45.0% 11.0% 0.6% 0.8% 400 ppm

II

cristales

solubles

ANEXOS-JADE

\ Rovral® Fungicida de contacto con limitado efecto sistémico, de acción preventiva y curativa; polvo huemectable, perteneciente al grupo de las Dicarboxamidas. Ingrediente activo:

iprodiona

al

50.0

%

(Tris-(O-etil

fosfonato)

de

aluminio)

(www.bayercropscience.com.mx/bayer/cropscience/bcsmexico.nsf/id/Rovral_BCS; www.bayercropscience.com.mx/.../bcsmexico.nsf/id/4EED3729D5B7DAA4C1256FE0 00769275/$file/ind_rovral.pdf). \ Tecto 60® Es un fungicida sistémico, de amplio espectro, perteneciente al grupo de los bencimidazoles; suspensión concentrada. Ingrediente activo: thiabendazol 2-(4tiazolil)- 1H – bencimidazol 500 g/L, materias inertes y adyuvantes hasta completar 1 L (www.syngenta.cl/prodyserv/fitosanitarios/prod/etiqueta_fitosanitarios/Tecto500SC. pdf; www.syngenta.cl/prodyserv/Hoja/Engeo.pdf)

PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE AGROQUÍMICOS.

Para todos los casos se utilizo una solución al 0.1 %: dependiendo de la presentación del agroquímico se disolvía 1g o 1ml por cada litro de agua.

III

ANEXOS-JADE

ANEXO 2. SUSTRATOS HORTÍCOLAS. \ Agrolita (perlita). Es un mineral de sílice de origen volcánico que es calentado a 982.2 oC para expandir la partícula, debe ser cribado para eliminar el polvo. Presenta partículas grandes, buena aireación, se usa para mejorar el drenaje, baja retención de humedad, muy baja densidad, ingrediente que aligera mucho la mezcla, pH cercano a neutro, no tiene capacidad amortiguadora, baja en sales solubles, libre de sustancias tóxicas de plagas y/o enfermedades, químicamente inerte, fácil de mezclar (puede incorporarse hasta un 80 % de la mezcla), hay uniformidad entre lotes, fácil disponibilidad, precio intermedio (Martínez Martínez, 1994; Florián Martínez, 1997). \ Maquique.

La palabra maquique parece derivar de “malque”, nombre que los nahuas del estado de Puebla atribuyen a los helechos arborescentes. También se usa para denominar a la capa formada por las raíces adventicias y por parte de las bases de los pecíolos de algunos helechos arborescentes (principalmente las especies Alsophila firma (Baker) Conant, Sphaeropteris horrida (Liebm.) R.M. Tryon y Dicksonia sellowiana Hook.). Presenta una consistencia similar a la madera porosa, tiene buen drenaje y se mantiene húmeda por mucho tiempo. Sirve como sostén para plantas epifitas, principalmente orquídeas y helechos (Palacios Ríos, 2007). \Sustrato para germinar esporas de helechos.

De acuerdo con Luna (2000), el sustrato que utilizo para germinar esporas de helechos consiste en una mezcla de turba, agrolita y vermiculita, en una proporción 6:1:1 v/v.

IV

ANEXOS-JADE

\ Turba, musgo o peat moss.

Se extrae de yacimientos en las zonas cercanas a los polos y está constituido en un 98 % por materia orgánica. El tipo más común es el Sphagnum moss, el cual presenta un bajo grado de descomposición y una alta resistencia a la misma. Por lo anterior, es un ingrediente que reacciona poco y que no proporciona ni quita ningún nutriente a las plantas. Se caracteriza por su alta retención de humedad (hasta un 70%, de su volumen en agua), partículas de tamaño intermedio, aeración pobre, no mejora el drenaje, densidad muy baja (ayuda a aligerar la mezcla), pH bajo: 3.5-4.0, baja capacidad amortiguadora, libre de plagas, enfermedades y de sustancias tóxicas, fácil de mezclarse de manera homogénea (puede incorporarse en un 70%) y uniformidad de lote a lote (Martínez Martínez, 1994). \ Vermiculita. Mineral de estructura en forma de mica calentado a 1000 oC, que aporta potasio y magnesio a las plantas. Con el manejo se puede romper su estructura, eliminando sus propiedades benéficas. Partículas grandes para producción y chicas para germinación, buena aireación, buena retención de humedad, baja densidad, pH cercano a neutro, excelente capacidad amortiguadora, bajo contenido de sales solubles, libre de plagas y/o enfermedades, libre de sustancias tóxicas, fácil de mezclar (puede usarse hasta en un 60 % de la mezcla), uniformidad entre lotes, no se le encuentra fácilmente, ingrediente caro (Martínez Martínez, 1994).

V

ANEXOS-JADE

ANEXO 3. VARIOS. \ Forma LABC-01 Información del sitio de colecta (INEGI, 2005).

VI

ANEXOS-JADE

\ Forma LABC-02 Información por ejemplar (INEGI, 2005).

\ Medio de Thompson. Soluciones madre utilizadas para la preparación del medio de cultivo semisólido de Thompson (Mendoza Ruiz, 2001).

MACROELEMENTOS Nitrato de amonio (NH4NO3) Fosfato de potasio (K2HPO4) Sulfato de magnesio (MgSO4 7 H2O) Cloruro de calcio (CaCl2) MICROELEMENTOS Sulfato de magnesio (MnSO4) Sulfato cúprico (CuSO4 5H2O) Sulfato de zinc (ZnSO4 7H2O) Acido bórico (H3BO3) Molibdato de sodio (Na2MoO4 2H2O) Sulfato ferroso (FeSO4 7H2O) Sodio EDTA (etilendinitrilotetracetato disódico)

VII

Peso gr/100 ml de agua destilada 2.5 2.0 1.0 1.0 Peso gr/1000 ml de agua destilada 0.0220 0.0240 0.0290 0.1860 0.0035 2.5000 3.7000

ANEXOS-JADE

Componentes del medio de cultivo de Thompson (Mendoza Ruiz, 2001). MACROELEMENTOS Nitrato de amonio (NH4NO3) Fosfato de potasio (K2HPO4) Sulfato de magnesio (MgSO4 7 H2O) Cloruro de calcio (CaCl2) MICROELEMENTOS Sulfato de magnesio (MnSO4) Sulfato cúprico (CuSO4 5H2O) Sulfato de zinc (ZnSO4 7H2O) Acido bórico (H3BO3) Molibdato de sodio (Na2MoO4 2H2O) Sulfato ferroso (FeSO4 7H2O) Sodio EDTA (etilendinitrilotetracetato disódico)

Volumen en ml 5 25 12 2 (ml) 10 10 10 10 10 10 10

Agar Agua destilada

10 g 1000

\ Tween 80®. Polioxietilén-20 sorbitán monooleato; detergente industrial. \ Cal Tolteca®. Compuesta principalmente por carbonato de calcio, reduce y neutraliza la acidez de la tierra o sustratos; además de proporcionar calcio y magnesio a las plantas (www.cemexmexico.com/pr/pr_po_ca.html). \ Reactivo de Mutzing.

Elaborado a partir de glicerina y carmín acético. Para preparar el carmín acético se disuelven 2 g de carmín en 100 ml de ácido acético al 45%, en baño María. Posteriormente se le agrega glicerina. Al hacer este reactivo hay que reflujar, por que a temperatura ambiente no se disuelve y calentando se cristaliza (Arreguín Sánchez, 2006).

VIII

ANEXOS-JADE

\ Clave ilustrada para evaluar el crecimiento de las frondas (prefoliaciones) del helecho cuero (Rumohra adiantiformis (G.Forst.) Ching), propuesta por Strandberg, 2003.

IX