III-320

GENéTICA EN CáNCER DE COLON HEREDITARIO: ADENOPOLIPOSIS COLóNICA FAMILIAR (FAP) ANGELA SOLANO

ERNESTO PODESTA

Profesional Principal, CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas)

Profesor Regular Titular, Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires e Investigador Superior del CONICET

CáNCER HEREDITARIO

tilización cuando se forma la célula cigota con una gameta portadora de la mutación, todas las células del nuevo ser tendrán esa alteración genética. La mutación germinal en un gen clave es responsable de la transmisión de enfermedades, entre ellas el cáncer. El cáncer como resultado de una mutación germinal, se lo denomina cáncer hereditario. De este modo, el cáncer hereditario es el resultado de la herencia y la transmisión a la descendencia, de una mutación en un gen que se manifiesta con una alta predisposición a un tipo de cáncer y/o a tumores asociados. El tumor estará localizado en el tejido para el cual el gen mutado se expresa y codifica una proteína clave en la función de dicho tejido. Frecuentemente no es un solo tipo de tumor, sino que hay varios tipos de tumores asociados a la mutación en un mismo gen. Dado que una mutación germinal específica transmite

El proceso de transformación neoplásica de un tejido se inicia con un primer evento genético denominado mutación que, por producirse en una célula del tejido en proceso de malignización, se denomina mutación somática30-25. La acumulación de mutaciones somáticas es responsable de la formación y evolución de los tumores. En efecto, el proceso neoplásico (Fig. 1) se inicia en una célula con una primera mutación en un gen que codifica una molécula clave en el tejido en cuestión, y se llega al carcinoma después de varias alteraciones genéticas que se van acumulando, todas ellas somáticas, o sea sólo en las células del tejido. Hay otro tipo de mutación que se denomina mutación germinal (Cuadro 1), la cual está presente en el genoma de todas las células, incluídas las gametas; por ello, en la fer-

Genes afectados en mutaciones acumulativas en la Tumorigenesis Colorrectal ALTERACION APC GENETICA:

EPITELIO NORMAL

K-ras

EPITELIO HIPER PROLIFERATIVO

del 18q

ADENOMA TEMPRANO

ADENOMA INTERMEDIO

Adaptado de: Cell 1996, 87:15-170

p53

ADENOMA TARDIO

CARCINOMA

METASTASIS

Fig. 1. Tumorigénesis colorectal. Genes y mutaciones. SOLANO A y PODESTA E; Genética en cáncer de colon hereditario. Cirugía Digestiva, F. Galindo. www.sacd.org.ar, 2009; III-320, pág. 1-12. 1

III-320 Estudios genéticos que detectan predisposición a cáncer hereditario

MUTACIONES EN EL ADN: SOMATICA O GERMINAL Tipo de Mutación:

Presente en:

Se expresa en:

SOMATICA responsable de la tumorigenesis

Tumor

Tumor

GERMINAL responsable de la herencia

Todas las células del organismo

Organo/s blanco

Grupo 1. Aplicación de rutina, cambiará la indicación médica • FAP • Neoplasia Endocrina Múltiple 1 y 2 • Retinoblastoma • Von-Hippel-Lindau Grupo 2. Con posibles beneficios • Cáncer de mama y ovario (BRCA) • Cáncer de colon hereditario no polipósico • Li-Fraumeni • Cowden syndrome

Cuadro 1. Mutaciones en el ADN: somática y germinal.

Grupo 3. Estudios cuyo significado es poco claro

alta predisposición a un tipo de tumor (y a tumores relacionados), porque la proteína para la cual codifica el gen es importante o crucial en un órgano y no en otro, es de gran importancia conocer los cánceres diagnosticados en una familia, ya que esto define cuál será el gen a analizar. Existen ciertas evidencias que nos permiten pensar en la presencia de un cáncer hereditario en una determinada familia. Estas evidencias son:

• Melanoma • Tumor de Wilms • Carcinoma renal papilar familiar • Peutz-Jegger

Cuadro 2. Predisposición a cáncer hereditario. Estudios genéticos.

1. La existencia de dos o más miembros diagnosticados con tumores relacionados 2. La edad temprana de aparición de la enfermedad 3. La presencia de tumores múltiples o bilaterales 4. La evidencia de transmisión mendeliana

de la mutación familiar permite estudiar a los familiares y tomar medidas para una detección precoz de la manifestación de la enfermedad que define la conducta clínica a seguir. En la FAP el gen responsable se denomina “adenopoliposis coli gene” y se lo conoce con la sigla APC. Por lo que mencionamos, se considera el análisis genético del gen APC parte de la rutina clínica de los pacientes con FAP.

Hace ya varios años1, la Asociación Americana de Oncología Clínica (ASCO) clasificó (Cuadro 2) de acuerdo a su utilidad, los estudios genéticos para cáncer hereditario, en tres grupos para categorizar los estudios: a) en la primera categoría están los estudios que cambiarán la conducta médica y son de indicación clínica de rutina; b) en la segunda categoría están los estudios para síndromes hereditarios en los cuales el beneficio médico de identificar a los portadores de la mutación no está claramente establecido, y debe analizarse en cada caso en particular los posibles beneficios que podría dar el análisis genético y c) en la tercera categoría agruparon a los estudios genéticos que por el momento el significado de detectar una mutación germinal no es claro o que la mutación se halló en un número pequeño de familias. El análisis genético para adenopoliposis colónica familiar (FAP) está ubicado en el primer grupo, ya que la detección

ADENOPOLIPOSIS COLóNICA FAMILIAR (FAP) GENERALIDADES La adenopoliposis colónica familiar se conoce con la sigla FAP derivada de las iniciales de su nombre en inglés (Familial Adenomatous Polyposis). La FAP es una enfermedad de herencia autosómica dominante y fue descripta por primera vez en 18594. Aproximadamente hay 1 individuo afectado con FAP en 8000 individuos; esto representa menos del 1% de los cánceres colorrectales421 . Existen además de la FAP, otros dos sindromes, el de Gardner y el de Turcot's, que en la actualidad, como resultado del análisis del gen APC, se considera que son di2

III-320 Gen APC: Fenotipo asociado a la posición de la mutación en el codón del gen: Exón 1

2

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400

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800

1000

2845

Codón Atenuado: 1-163

y CHRPE: 463-1387

1860-1987 Tumores desmoides: 1445-1578

Hepatoblastoma: 457-1309

Severo:

1249-1330

Adaptado de: Human Molecular Genetics, 2001, Vol 10, No. 7, pg 721-733

Fig. 2. Gen APC.

ferentes manifestaciones del mismo desorden genético. Los individuos afectados de FAP desarrollan pólipos adenomatosos (cientos o miles) a edades tempranas (segunda y tercera década de la vida) que inevitablemente progresarán a carcinomas colorrectales (CCR), de no mediar la colectomía24-27. Se estima que el 100% de pacientes con FAP con más de 60 años desarrollarán cáncer de colon si no se practica la colectomía profiláctica. En pacientes con FAP existen además de los pólipos manifestaciones extracolónicas benignas como pólipos gástricos, lipomas, fibromas23, hipertrofia congénita del epitelio pigmentario de la retina (CHRPE)28 y manifestaciones malignas como cáncer gástrico, de tiroides, tumores desmoides, tumores de tiroides y sistema nervioso central7-5. A pesar de la heterogeneidad fenotípica15-13 se considera la FAP como una enfermedad monogénica causada por una mutación germinal, cuya expresión fenotípica diferiría como resultado de la influencia de otros factores genéticos o ambientales. El gen (Fig. 2) hasta ahora conocido como responsable de la FAP es el familial adenomatous polyposis coli gene (APC), localizado en el cromosoma 5, específicamente en el brazo largo: 5q21. Fue identificado en 199115-10 y es uno de los primeros genes de herencia a predisposición a cáncer que fue clonado. Es un gen de gran tamaño que

contiene 15 exones con 2843 codones; la posición del codón mutado dio lugar a algunos primeros intentos de correlacionar la ubicación de la mutación con la manifestación (fenotipo) de la enfermedad. La figura 2 es un esquema del gen APC con sus correlaciones fenotípicas estimadas17, las cuales están en permanente actualización con la información obtenida de los estudios que se realizan en los distintos grupos de trabajo de todo el mundo. Una mutación se denomina “deletérea” cuando produce un cambio trascendental en la proteína para la cual codifica el gen, cambiando la función de la proteína, siendo ésta la causa por la cual se inicia el proceso neoplásico. También existen mutaciones en el gen que no producen cambios en la proteína para la cual codifican, que se denominan mutación silenciosa o polimorfismo. La inserción o la deleción de bases son tipos de mutación (muy común en la FAP), que pueden producir cambios de marco de lectura del ARN y ser deletéreo en la proteína. Existe además otro tipo de mutación, el cambio puntual de una base por otra que puede ser deletéreo y manifestarse con un cambio radical de aminoácido, o por el contrario, puede ser un cambio de aminoácido no trascendental en la proteína. Además, cualquiera de estos tipos de mutaciones puede provocar codones de terminación prematuros (codones “stop”) y como resultado 3

III-320 de ello se produce una terminación prematura de la síntesis, resultando una proteína de menor peso molecular (una proteína truncada), siendo éste el fenómeno deletéreo más común en la FAP ya que 80% de las mutaciones resultan en proteínas truncadas. El gen APC codifica una proteína crucial en el control de la proliferación del epitelio gastro intestinal y actúa como gen supresor. En el complejo proceso de la carcinogénesis colónica (Fig. 1) el primer evento es la mutación del gen APC, y por ello se lo denomina “gen guardián”. Una vez mutado el gen APC, los eventos posteriores para llegar a la neoplasia20 ocurrirán con mucha mayor probabilidad lo cual implica un papel muy importante de la proteína expresada como producto del gen APC en la integridad del epitelio intestinal. Por ser el primer evento en el proceso tumoral y al estar presente en todas las células se explica que los pacientes con una mutación en el gen APC desarrollen cientos o miles de pólipos. Este primer evento está disparado en todas las células del epitelio intestinal donde la proteína codificada por el gen APC es crucial en el control del crecimiento y al sintetizarse una proteína que no cumple con su función, el crecimiento se altera y así se desencadena este primer evento displásico. El proceso biológico es muy complejo y se especulan con varias posibilidades de control farmacológico de la enfermedad. En estudios recientes en ratones transgénicos que reproducen experimentalmente el fenotipo clásico de la FAP con cientos de pólipos, se describió que cuando se los trata con una droga que suprime un represor de la metilación de ADN34, los ratones desarrollan muy baja cantidad de pólipos. Estos hallazgos representan otra esperanza futura para la quimioprevención y/o tratamiento de la enfermedad. El paciente con FAP es portador de un alelo mutado del gen APC y, heredó ese alelo del padre o de la madre; sin embargo, es importante mencionar que existe la mutación espontánea en un 25% de pacientes con FAP y son los casos denominados de novo. Tanto el paciente que heredó la mutación como el paciente con mutación de novo, en las células epiteliales del colon (como en todas las células del individuo) tienen una copia funcional (o sea normal) del gen APC y la otra copia mutada, por eso la iniciación del proceso neoplásico es un evento altamente probable de ocurrir y el resultado es el número dramático de cientos o miles de pólipos tapizando el colon y a veces también el duodeno y estómago. En los casos de novo no hay historia familiar de la patología y el estudio genético sigue siendo indicado para ser aplicado en los descendientes del caso índice. En estos casos el resultado también es útil para el mismo caso índice, que en esta circunstancia es el primero en la familia que porta la mutación en el gen APC. El análisis del gen APC tal como vimos hasta ahora se

aplica al estudio de pacientes con FAP y sus familiares; sin embargo, es interesante mencionar los resultados de la aplicación del análisis genético en el tumor en pacientes con FAP20, o sea el análisis de la mutación somática del gen APC. En pacientes con FAP siempre un alelo está mutado en determinada posición del gen APC; analizados los tumores de pacientes con FAP20 se encontró que el otro alelo también sufrió otra mutación. De acuerdo a la posición en el gen de la mutación germinal y a la posición en el gen de la segunda mutación, o sea la encontrada en el tumor, podría predecirse la presencia o no de la alta probabilidad de desarrollar tumores desmoides condicionando de esta manera la decisión clínico-quirúrgica, de acuerdo a la manifestación clínica predominante29. DETECCIóN DE LAS MUTACIONES La primera aplicación de la revolución genética en investigación en cáncer sería muy justo decir que es el diagnóstico pre-sintomático de pacientes con historia familiar de cáncer. Los grandes adelantos de la última década en las técnicas moleculares de análisis genético y el conocimiento reciente de la secuencia del genoma, han hecho posible la detección de mutaciones en un 75% de pacientes con signos clínicos de FAP, quedando por dilucidar si el 25% restante corresponde a mutaciones presentes en zonas del gen que no ha sido posible detectar con los análisis disponibles o queda aún por conocer otro gen responsable de las FAP que presentan el gen APC normal. La primera persona que se analiza es una persona con la enfermedad; se la denomina caso índice y este estudio es el más complejo porque se debe estudiar todo el gen hasta encontrar la alteración genética. Una vez detectada la mutación en el caso índice, el estudio de los demás miembros de esa familia es mucho más simple porque se secuencia exclusivamente la zona de ADN correspondiente a la mutación hallada en el caso índice. La mutación hallada en el caso índice también se la conoce como mutación familiar. Hay descriptas al menos 400 mutaciones diferentes3; más del 80% resultan en codones de terminación prematuros (codones “stop”) que dan lugar a una proteína truncada (o sea más corta que la proteína codificada por el gen normal), la cual no puede cumplir con su función. Este fenómeno biológico se utilizó como ensayo de detección y es así que el análisis del gen se inicia con el denominado ensayo de la proteína truncada “PTT” (Protein Truncation Test)32. Brevemente, en el ensayo de PTT se analiza el gen por sectores como se describe en la Fig. 3; el ensayo de PTT se puede utilizar para el estudio de cualquier gen que se presuma puedan producirse codones de terminación 4

III-320 ENSAYO DE PROTEINA TRUNCADA (PTT) ADN:

TGC TGA

: Gen APC alelo normal : Gen APC alelo mutado (TGA: codón STOP)

AMPLIFICACION POR PCR de un segmento del gen APC 1

2 Producto del alelo NORMAL

Peso molecular

TRANSCRIPCION A ARN y TRADUCCION A PROTEINA “in vitro”

ANALISIS ELECTROFORETICO DE LA PROTEINA SINTETIZADA “in vitro” 1. Sujeto Normal

(ambos alelos en secuencia normal)

Producto truncado del alelo MUTADO

2. Paciente o portador de mutación en APC (un alelo normal y otro mutado)

Fig. 3. Ensayo de proteína truncada (PTT)

prematuros. Cuando como resultado del PTT de un sector del gen se obtiene una proteína de tamaño menor al esperado, se presume que hay un codón de terminación prematuro en esa zona, que es la que subsecuentemente se analiza en más detalle para definir la mutación. Para ello, con el resultado del PTT que identifica una zona del gen, se contínua el estudio de ese segmento con otra técnica: la de análisis electroforético de polimorfismos conformacionales (SSCP) que acota la zona con la alteración genética para que la reacción más compleja, que es la de secuenciación, se realice en una zona delimitada a pocas bases del genoma. Con esta combinación de técnicas se simplifica mucho el estudio ya que se va delimitando progresivamente la zona del gen en que se encuentra la alteración, y se acota la longitud de ADN a secuenciar. De este modo el resultado final de la secuenciación es la identificación precisa del cambio de base/s que caracteriza a la mutación familiar. Los pasos del análisis genético del gen APC se resumen en la Tabla 3. El estudio se realiza en ADN y ARN extraído de glóbulos blancos aislados de sangre anticoagulada con EDTA.

genéticos en cáncer hereditario del Departamento de Bioquímica (Laboratorio HRDC) de la Facultad de Medicina (UBA) 108 casos índice con FAP, referidos en su gran mayoría por el Departamento de Cirugía del Hospital de Gastroenterología Dr. Carlos Bonorino Udaondo y en menor número del Hospital Posadas-Servicio de Gastroenterología. De estas familias hemos finalizado el estudio genético en 51, de las cuales 39 casos resultaron con “mutación detectada”, y 13 de ellas fueron mutaciones noveles, o sea descriptas por primera vez8 (Cuadro 4), ampliando así el espectro de mutaciones del gen APC. Las mutaciones detectadas en el gen APC en casos índice argentinos se encuentran entre los codones 216 y 1630. La gran dispersión de las mutaciones dentro del extenso gen APC es característica en los pacientes con FAP; sin embargo, el codón 1309 es el más frecuentemente mutado25 y se asocia a un fenotipo clínico más agresivo. En nuestra serie el 25,6% de las familias presentaron la mutación en el codón 1309. Comparando esta mutación en distintos grupos étnicos se observa que en nuestro caso el número de mutaciones en el codón 1309 es más alto que en otras poblaciones, a saber: españolas 0%33 y 8%14; australianas 0%35; alemanas 5,7%11; UK 4,9%39; holandesas 5,7%27; israelíes 7%12 e italianas 17%38. Siendo los habitantes argentinos mayormente de origen español e italiano, merita analizar más profundamente el 25,6% de mutación en el codón 1309 que ha-

MUTACIONES HALLADAS EN PACIENTES ARGENTINOS Los autores han incorporado al programa de análisis 5

III-320 toma, detectamos la mutación deleción TC en el codón 1362, que no coincide con la zona asociada con hepatoblastoma (codones 457 a 1309) (Fig. 2); sin embargo, el fenotipo de alta agresividad para esta zona del gen APC, coincide con el presentado por este paciente y su hermano, que también resultó portador de la mutación y antes de los 15 años, ambos presentaron más de 1000 pólipos. Esto indicaría que la zona asociada a hepatoblastoma podría extenderse a esta mutación. 3. Una paciente diagnosticada a los 14 años con FAP presentó la mutación germinal en el codón 1272 del exón 15 (resultando el cambio de un codón que codifica el aminoácido serina por un codón de terminación) y sorpresivamente presentó otra mutación novel en el codón 130 del exón 3, que produce cambio de serina por glicina; esta última mutación bien podría ser considerada un polimorfismo, ya que el cambio de aminoácido parecería no ser deletéreo; en contraste, la mutación serina por stop en 1272 es un cambio deletéreo del cual resulta una proteína truncada y se la considera responsable de la enfermedad. 4. Las mutaciones que provocan codones stop en posiciones 1468, 1523 y 1557 están en una región que se asocia a tumores desmoides, sin embargo ninguno de estos pacientes tuvo esta manifestación extracolónica y los tres presentaron osteomas. Esto indicaría que en esta zona pueden existrir mutaciones que no tienen tumores desmoides como manifestación extracolónica. 5. El paciente con codón stop en 1649 presentó CHRPE, siendo éste fenotipo no esperado mas allá del codón 1387.

Mutaciones en el gen APC • Métodos de detección: combinación de PTT (ensayo de proteína truncada = Protein Truncation Test) SSCP (cambios polimúrficos de cadenas simples de ADN) Secuenciación • Se detecta la mutación en el 70% de los casos • Hay más de 400 mutaciones identificadas • Se pudo establecer una cierta relación geno-fenotipo Cuadro 3. Gen APC. Mutaciones.

llamos en nuestro primer estudio9, muy parecido a la serie italiana. En cuanto al fenotipo, estas familias con mutación en el codón 1309 comparten las características fenotípicas asociadas al codón (Fig. 2). El otro codón frecuentemente mutado es el 1061 detectado en 3 familias de nuestra serie, y junto al 1309 suman aproximadamente el 33% de las mutaciones que se detectan. Del análisis de las mutaciones conocidas en nuestros pacientes8, resulta una alta coincidencia con las características fenotípicas asociadas ya descritas (Fig. 2). En nuestros pacientes hemos detectado 33% de mutaciones noveles. El porcentaje internacional de mutaciones noveles reportado es variable de acuerdo a la población estudiada: 11% en series canadienses2, 45% en holandeses37, 13% en familias portuguesas10-18, 43% en belgas40, 40% en italianos21, 60% en chinos41 y 50% en coreanos25. Es interesante resaltar algunas observaciones en nuestros pacientes con mutaciones noveles, que demuestran la complejidad de la relación genotipo-fenotipo, a saber: 1. Deleción de T en el codón 841 en una mujer con 41 años al diagnóstico, CCR y quistes ováricos. Este codón está en una zona que se asocia al fenotipo clásico de FAP; sin embargo, realizado el estudio genético en una hija adolescente resultó ser positivo y el fenotipo fue de alta agresividad dado que presentó pólipos colónicos, duodenales y gástricos a la edad muy temprana de 15 años. Este caso muestra la variación intrafamiliar, que es otra característica de la FAP. 2. Analizado el ADN de un niño, hijo de padre fallecido de FAP, que a los 2 años presentó un hepatoblas-

Estas observaciones remarcan la complejidad de la manifestación de la enfermedad y seguramente con la contribución de los resultados de los estudios geneticos de los grupos de investigadores, el espectro de la expresión del gen APC será comprendido en un futuro no muy lejano. En los pacientes con FAP en los cuales no se detecta mutación en el gen APC, se han descrito que pueden presentar deleción de grandes zonas del gen y por ello no se detecta mutación9; para descartar esta posibilidad todos los pacientes en los cuales no se halló mutación en el gen APC, fueron analizados para grandes deleciones en el gen APC que no fueron halladas. En un pequeño porcentaje de pacientes con FAP con el gen APC normal se ha descrito una mutación en otro gen denominado MYH26, en base a esto nosotros hemos analizado también el gen MYH en todos los pacientes con mutación no detectada en el gen APC y no se ha detectado mutación en dicho gen.

6

III-320 Mutaciones halladas en los pacientes argentinos analizados con diagnóstico de FAP Paciente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23-32 33 34 35 36 37 38 39 40-51

Exón

Cambio nucleotídico

Cambio proteico

Referencia

6 11 12 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15

646 C>T 1438 C>T 1621 C>T 2522 del T 2626 C>T 2800-03 del ACTT 2802-2815 del 2805 del C 3081-2 del TA 3183-3187 del ACAAA 3186-87 del AA 3186-87 del AA 3202-05 del TCAA 3367 C>T 3510 del A 3577 C>T 3717 ins G 3749-50 del AA 3768-69 ins A 3783-84 del TT 3790 ins G 3815 C>G 3927-31 del AAAAGA 4084-85 del TC 4280 del C 4348 C>T 4393-04 del AG 533-34 ins TGAGCCTO 4669-70 del AT 4888-91 del GTTA Mutación NO detectada

R216X Q480X Q541X stop at codon 841-42 R876X stop at codon 954-55 stop at codon 984-85 stop at codon 935-36 stop at codon 1027-102 stop at codon 1063-64 stop at codon 1063-64 stop at codon 1063-64 stop at codon 1125-26 Q1123X stop at codon 1181-82 Q1193X stop at codon 1254-55 stop at codon 1254-55 stop at codon 1274-75 stop at codon 1274-75 1274stop1275 S1272X stop at codon 1313-14 stop at codon 1373-74 stop at codon 1472-73 R1450X stop at codon 1467-68 stop at codon 1522-23 stop at codon 1557-58 stop at codon 1649-50

Lamlum 1999 This work Miyoshi 1992a This work Miyaki 1994 Armstrong 1997 This work This work This work Miyoshi 1992a Gismondi 1997 Gismondi 1997 Paul 1993 Resta 2001 This work Olshwang 1993 This work Miyoshi 1992a Friedl 2001 Tamura 1993 This work This work Miyoshi 1992a This work Miyoshi 1992a Mori 1993 Miyoshi 1992a This work This work This work

Cuadro 4. Poliposis adenomatosa familiar. Mutaciones halladas (Argentina).

INTERPRETACIóN DE LOS RESULTADOS DE LOS ESTUDIOS GENéTICOS (Cuadro 4)

liza la zona de la mutación familiar y no todo el gen como se analizó en el caso índice. El resultado en un familiar puede ser “mutación detectada” o “mutación NO detectada”, o sea la persona en estudio puede o no ser portadora de la mutación familiar. Si es portador de la mutación desarrollará FAP en casi el 100% de los casos y deben iniciarse en esta persona todas las medidas de detección precoz de la enfermedad y prevención del cáncer, objetivo del estudio genético; si el resultado es la secuencia normal, o sea no se detecta la mutación familiar, esta persona no desarrollará FAP y tendrá el riesgo de cáncer de colon de la población general. Es importante remarcar que la secuencia normal del individuo familiar del caso índice, es un resultado de gran valor porque significa que no heredó la mutación responsable de transmitir alta predisposición a la enferme-

El primer individuo que se analiza en una familia se lo denomina caso índice. El caso índice es una persona que presenta la enfermedad, en este caso adenopoliposis colónica familiar, y en cuyo ADN se estudia la secuencia del gen APC. El resultado de este estudio, en el 75% de los casos, es la detección de una mutación y en el 25% restante, no se detecta ninguna mutación, o sea la secuencia analizada es normal. Cuando el informe es “mutación detectada”, este resultado se puede aplicar de inmediato al estudio de los familiares con riesgo de haber heredado la mutación. Aquí es importante resaltar que al estudiar un familiar en una familia con “mutación detectada”, el análisis, como mencionamos, es mucho más simple porque sólo se ana7

III-320 Resultado del análisis genético en cáncer hereditario

Etapas y requerimientos sugeridos en el estudio genético para la detección de predisposición a cáncer hereditario

Caso Indice 75% “Mutación detectada”

• Análisis documentado de la historia familiar de cáncer • Determinar el gen a analizar • Asesoramiento genético-clínico individual y familiar previo al estudio • Antes de solicitar el estudio determinar claramente que decisiones se tomarán con un resultado “mutación detectada” y “mutación no detectada” en ambos casos posibles: caso ínfice y familiar • Firma del consentimiento para el estudio genético • Extracción de sangre para el análisis • Mantener el asesoramiento durante y posterior a la realización del estudio genético • Tener en cuenta los criterios y consenso establecidos en reuniones con expertos en las Instituciones Nacionales e Internacionales

25% “Mutación NO detectada” = No informativo

• Mutación identificada • Decisiones clínicas • Se detecta secuencia normal • Estudio genético a familiares • Mutación en otro gen? • No se estudian familiares

“Mutación detectada” >Mutación identificada >Decisiones clínicas

“Mutación NO detectada” >NO heredó la mutación >Riesgo de la población general

Cuadro 5. Análisis genético a partir del caso índice.

Cuadro 6. Estudio genético para la detección de predisposición hereditario. Etapas y requerimientos.

dad; este resultado debe diferenciarse de la secuencia normal del caso índice que significa que no se pudo encontrar la mutación, ya sea porque está en zonas del gen no analizadas con las técnicas utilizadas o porque la mutación está en otro/s gen/es responsable/s de la FAP todavía por descubrir. Por esta razón, el resultado de mutación no detectada en el caso índice es un resultado “no informativo” en términos genéticos. En contraste, el resultado de mutación no detectada (o sea secuencia normal) en un familiar de familia con mutación detectada, es un resultado de gran trascendencia dado el alivio que significa no haber heredado la mutación familiar. Estos conceptos están resumidos en el Cuadro 5. Algunas veces se presenta la situación de una persona con historia familiar de FAP (u otro cáncer hereditario) pero sin ningún familiar vivo que presente la enfermedad y que desea realizarse el análisis genético para conocer si heredó o no la alta predisposición a la enfermedad hereditaria. Estudiar a esta persona puede resultar un tanto conflictivo porque sólo es concluyente el análisis si se encuentra una mutación con características deletéreas, ya que se puede inferir que tiene altas probabilidades de desarrollar la enfermedad; en cambio, si la mutación no se encuentra no sabemos si es el caso de una mutación que no se detecta (el 25% que mencionamos antes para los casos índice) o si es una persona que no heredó la mutación familiar y por ello se detecta secuencia normal. Por lo tanto la “secuencia normal” como resultado del estudio genético en la primera persona de una familia en ausencia de un caso índice para la enfermedad, no asegura la ausencia de alta predisposición al cáncer en estudio; en ausencia del caso índice sólo la “mutación detec-

tada” define la situación ya que identifica la mutación familiar y el alto riesgo. IMPLICANCIAS DEL ESTUDIO GENéTICO Como se mencionó, la aplicación de los estudios genéticos en el diagnóstico pre-sintomático de pacientes con historia familiar de cáncer es una las primeras aplicaciones de los adelantos en genética de la última década. Aunque algunos puntos acerca de los estudios genéticos necesitan esclarecimiento y/o solución, estos análisis pueden mejorar sensiblemente la atención médica y psicológica de pacientes afectados y sus familias e incluso salvar vidas, siempre dentro de un marco de utilización prudente. Un estudio genético es importante solicitarlo cuando sabemos en cada caso y antes de solicitarlo, la utilidad que le daremos al resultado “mutación detectada” y “mutación no detectada” (Cuadro 5). Si no hay medidas definidas a tomar con el resultado del estudio genético, en general se acepta que no es adecuado solicitar el análisis ya que el resultado positivo generaría angustia e impotencia. Cuando se piensa en solicitar un análisis genético es adecuado estar preparado para algunas reacciones que se manifiestan con cierta asiduidad por ejemplo: a) un análisis genético genera gran expectativa y ansiedad a las personas que se someten al estudio porque al ser de aplicación reciente no se han difundido el suficiente tiempo que permita facilitar la interpretación del resultado en 8

III-320 forma adecuada; b) frecuentemente, la primera sensación en el caso índice al recibir el resultado de una mutación detectada es de una gravedad mayor al confirmar la naturaleza genética de la enfermedad, inquietud que es importante disipar de inmediato ya que no es correcta y es un dato que, al contrario, permite aplicar medidas de prevención a los familiares y en algunos casos también en el mismo caso índice, aún cuando ya presente la enfermedad; c) puede generar sentimiento de culpa al descubrir que el portador de la mutación la transmitió a sus hijos; d) puede generar sentimiento de culpa en las personas que NO heredaron la mutación, al ver que otros miembros de la familia sí la heredaron. Todos estos conceptos y un resumen lo más claro posible es lo que debe contener el consentimiento que debe firmar el paciente o toda persona que será sometida al análisis genético. El cuadro 6 es un resumen de las etapas sugeridas para indicar un estudio genético. Los beneficios clínicos para quienes se someten al estudio genético son claros para la FAP (Cuadro 2); en los portadores asintomáticos las medidas de detección precoz y prevención del cáncer tienen gran implicancia en la salud de la persona y en la mejor calidad de vida. Incluso en términos económicos es altamente favorable ya que los tratamientos del cáncer y sus recaídas son de muy alto costo, con deterioro de la calidad de vida. En estas familias, antes de la disponibilidad del estudio genético, el control clínico y colonoscópico se indicaba a todas las personas con probabilidad de haber heredado la enfermedad; en cambio, con el advenimiento del estudio genético, los familiares con “mutación NO detectada” no se exponen a todos los estudios y controles que son indicados en los portadores de la mutación. Es muy importante tener presente que el asesoramiento clínico-genético-psicológico debe ofrecerse antes, durante y después del análisis genético para asegurar la mejor interpretación del significado del mismo.

camente en una célula del tejido que será afectado por la neoplasia. Cáncer hereditario: es el cáncer cuyo primer impacto genético es una mutación presente en todas las células del organismo (ver mutación germinal); por esta razón, a través de esta mutación se hereda y se transmite a la descendencia (ya sea por óvulo o espermatozoide) la alta predisposición a cáncer. Caso índice (proband): es la primera persona enferma en una familia que se presenta para ser estudiada. El caso índice (proband en inglés) es la persona más conveniente e indicada para el análisis genético que investiga la presencia de mutación germinal responsable de la alta predisposición a cáncer. Célula cigota: es la célula resultante de la fertilización de un óvulo por un espermatozoide. Codón: es el triplete de bases de ácidos nucleicos que especifica un determinado aminoácido o que especifica detener la síntesis de proteínas (ver codón de terminación). Hay 64 codones (incluídos 3 de terminación) para 20 aminoácidos. Codón de terminación (codón “stop”): son codones de ARN que indican a un ribosoma que detenga la traducción de un ARN mensajero y libere la proteína en síntesis, normalmente, cuando la síntesis está concluída. En el código genético estos codones que indican la terminación de la síntesis de proteínas son UAG, UGA y UAA. Codón de terminación prematuro: es la presencia de un codón de terminación anormal o sea ubicado antes del fin de la secuencia para una proteína. Esto ocurre cuando hay una mutación (inserción, deleción, cambio de marco de lectura) que genera un cambio en la secuencia y resulta uno de los tres codones de terminación (ver codón de terminación; ver mutación sin sentido). Deleción: es la eliminación de una base (deleción puntual) o de varias bases en el genoma.

GLOSARIO Alelo: es una versión específica de un gen; en una célula somática (que son todas excepto las células germinales) hay dos alelos para cada gen, una versión materna y una paterna. El alelo ocupa un lugar determinado en el genoma, en un cromosoma específico. Las células germinales (óvulo y espermatozoide) contienen un solo alelo de cada gen.

Deleción de grandes zonas del gen: cuando una parte importante del gen está eliminado; pueden ser cientos o miles de bases ausentes. Enfermedad monogénica: es la enfermedad en que la mutación heredada (o la mutación de novo) está en un gen codificante de una proteína que al estar alterada o ausente es la causa directa de la enfermedad.

Cáncer esporádico: es el cáncer cuyo primer impacto genético (que es una mutación -ver mutación somatica- responsable del inicio del proceso malignizante) ocurre úni-

Ensayo de la proteína truncada “PTT” (Protein trun9

III-320 cation test): Es el ensayo que utiliza la presencia de un codón de terminación prematuro como fundamento de su técnica. De este modo se amplifica el ADN de la zona del gen que se sospecha pueda contener un codón de terminación prematuro y se transcribe y traduce a proteína en un ensayo in vitro. Por electroforesis se analizan los péptidos resultantes. En la electroforesis se observa una banda de la proteína de peso molecular normal resultante del alelo normal y, en caso de tener el otro alelo mutado, se detecta una banda extra de la proteína de menor peso molecular, que es la proteína truncada.

dones se traducen cada tres bases en un aminoácido. Cualquier alteración en esa secuencia de tripletes puede potencialmente producir un cambio de marco de lectura, por ejemplo con la inserción o deleción de una o dos bases. Mutación: cualquier cambio de la secuencia de nucleótidos del ADN genómico. Este cambio de base/s de una célula es heredado por las células hijas. Mutación deletérea: la mutación en el gen que se traduce en un cambio trascendental en la proteína codificada, alterando la función de esta proteína.

Exón: es la región codificante de un gen que se traduce a proteína. El nombre se debe a que los exones son las únicas partes del transcripto de ARN que se encuentra fuera del núcleo. Además de exones un gen contiene intrones.

Mutación de novo: es la mutación germinal que no fue heredada; es la primera persona portadora de la mutación germinal en una familia, la cual la transmitirá a su descendencia.

Fenotipo (expresión fenotípica, manifestación): son las características medibles o visibles de un organismo o ser. La expresión fenotípica de una enfermedad son las anomalías que se observan, por ejemplo en FAP las manifestaciones colónicas y extracolónicas.

Mutación germinal (familiar): es la mutación presente en todas las células del organismo. Esta mutación se transmite a la descendencia. Es frecuente que una mutación germinal en un gen, esté asociada a una alta predisposición a una enfermedad. Una vez detectada la mutación germinal en el caso índice se la denomina la mutación familiar, que es la que se investiga en sus familiares.

Gametas; ovocito y espermatozoide. Gen APC: es el gen responsable de la FAP, son las iniciales de la denominación en inglés “adenopoliposis coli gene”

Mutación puntual: es el cambio de una base por otra que puede ser deletéreo o no.

Genoma: conjunto de toda la información genética contenida en una célula (o en un organismo o en un virus)

Mutación silenciosa: es el cambio de base/s que no produce cambio de aminoácido en la proteína codificada.

Genotipo: es la constitución genética específica de una célula (o en un organismo o en un virus)

Mutación sin sentido: ver codón de terminación prematuro.

Herencia autosómica dominante: es la herencia para la cual es suficiente la presencia de la mutación del gen responsable en sólo uno de los dos alelos para su manifestación fenotípica.

Mutación somática: es la mutación que se produce en una célula del organismo que no es una célula germinal. Esta mutación puede afectar al tejido en que se produce pero no se transmite a la descendencia.

Inserción: es la mutación que resulta de intercalar una o más bases en la secuencia normal. Una inserción puede provocar un codón de terminación prematuro, o un cambio de marco de lectura, o un cambio de aminoácido.

Mutación novel: es una mutación descripta por primera vez. Polimorfismo: es el cambio de base/s que no produce cambios trascendentales en la proteína codificada.

Intrón: es la región codificante de un gen que no se traduce a proteína. Los intrones se eliminan del transcripto de ARN antes de que sea traducido a proteína. Marco de lectura: es la secuencia del ARN mensajero limitado por los codones de inicio y de terminación, el cual se procesa de manera contínua de modo que los co-

Portador asintomático: es el individuo que heredó la mutación que predispone a una enfermedad, pero que aún no tiene ninguna manifestación clínica de ella. Relación geno-fenotipo: identificadas las mutaciones 10

III-320 (genotipo) que predisponen a una enfermedad, se van estableciendo, siempre que sea posible, las manifestaciones clínicas específicas (fenotipo).

Tejido blanco (target): es el tejido para el cual una proteína (o droga o molécula) es el principal o el único sitio de acción.

BIBLIOGRAFíA 1.

ASCO Subcommittee on Genetic Testing for Cancer Susceptibility: Statement of the American Society of Clinical Oncology. Genetic testing for cancer susceptibility. J ClinOncol 1996, 14:1730-1736. 2. BAPAT B, BERK T, MITRI A y colab. : Characterization of two novel adenomatous polyposis coli gene mutations in patients with FAP. Hum Mut 1994; 4: 253-6. 3. BEROUD C, SOUSSI T: APC gene: Database of germline and somatic mutations in human tumors and cell lines. Nucl Acids Res 1996; 24: 121-24. 4. BOLAND CR. Neoplasia of the gastrointestinal tract, in: Textbook of Gastroenterology, Yamaha T (ed), 2nd. Ed Philadelphia, Lippincott, 1995, pp. 578-595. 5. CETTA F, CURIA MC, MONTALTO M, GORI M, CAMA A y colab.: Thyroid carcinoma usually ocuurs in patients with familial adenomatous polyposis in the absence of biallelic inactivation of APC gene. J Clin Endocrinol Metab 2001, 86:427-432. 6. CHARGELAIGUE A. These pour le Doctorat en Medicine. Des Polyps du Rectum. Rignoux, Paris, 1859; 1-42 7. DAVIES DR, ARMSTRONG JG, THAKKER N, HORNER K, GUY SP, CLANCY T, SLOAN P, BLAIR V, DODD C, WARNES TW, HARRIS R AND EVANS DG: Severe Gardner syndrome in families with mutations restricted to a specific region of the APC gene. Am J Hum Genet 1995, 57:11511158. 8. DE ROSA M, DOURISBOURE R, MORELLI G, GRAZIANO A, GUTIERREZ A, THIBODEAU S, HALLING K, COLLIA AVILA K, DURATURO F, PODESTA EJ, IZZO P, SOLANO AR: First genotype characterization of Argentinean FAP patients: identification of 14 novel APC gene mutations. Hum Mutat, Mutation in brief #24, issue 5, 2004 Online. 9. DE ROSA M, SCARANO MI, PANARIELLO L, CARLOMAGNO N, ROSSI GB, TEMPESTA A, BORGHERESI P, RENDA A, IZZO P: Three submicroscopic bdeletions at APC locus and their rapid detection by quantitative PCR analysis. European Journal of Human Genetics 1999, 7: 695703. 10. FIDALGO PO, MAIA LC, CRAVO ML y colab.: Seven novel mutations in the APC gene of Portuguese families with Familial adenomatous polyposis: correlation with phenotype. Cancer Genet Cytogenet 1999; 111: 152-6. 11. FRIEDL W, CASPARI R, SENTEGELLER M, UHLAAS S, LAMBERTI G, JUNGCK M, KADMON M, WOLF M,

12.

13.

14.

15.

16.

17. 18.

19.

20. 21.

22.

11

FAHMENTISH J, GEBERT J, MOLSTEIN G, MANGOL E, PROPPING P. APCmutation analysis contributes to therapeutic decisions in familial adenomatous polyposis? Experience from 680 FAP families. Gut 2001, 48:515-521 GAVERT N, YARON Y, NAIMAN T, BERCOVICH D, ROZEN P, SHOMRAT R, LEGUM C, ORR-UTREGER A: Molecular análisis of bthe APC gene in 71 israeli familias: 17 novel mutations. Hum Mut 2002, 19(6):664-668. GIARDIELLO FM, PETERSEN GM, PIANTADOSI S y colab.: APC gene mutations and extraintestinal phenotype of familial adenomatous polyposis. Gut 1997; 40: 521-5. GONZALEZ ROMERO S, BLANCO I, ARIAS S, LLORT G, YAGUE C, BRUNET J, OBRADOR A, PERIS M AND CAPELLA G: Molecular Characterization of the APC gene mutation in Spanish famnilial adenomatous polyposis. 4th Joint Meeting of the Leeds Castle Polyposis Group and the International Collaborative Grup on Hereditary NonPolyposis Colorectal Cancer, Clevelan, USA 4-6 september 2003, 81A GRODEN J, GELBERT L, THIVERIS A y colab.: Mutational analysis of patients with adenomatous polyposis: identical inactivations in unrelated individuals. Am J Hum Genet 1993; 52: 263-72. GRODEN J, THLIVERIS A, SAMOWITZ W y colab.: Identification and characterization of the familial adenomatous polyposis coli gene. Cell 1991; 66:589-600. HUMAN MOLECULAR GENETICS, 2001, Vol 10, No. 7, pg 721-733 ISIDRO G, MATOS P, ALMEIDA S y colab.: Eleven novel APC mutations identified in Portuguese FAP families. Hum Mutat 2000; 16: 178. KINZLER K, NILBERT M, SU LK y colab.:. identification of FAP locus genes from chrosome 5q21. Science 1991; 253: 661-665. KINZLER K, VOGELSTEIN B. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 1996, 87: 159-170. KINZLER KW AND VOLGELSTEIN B: Corectal Tumors in: The Genetic Basis of Human Cancer, Volgelstein B and Kinzler KW (ed), McGraw-Hill, 1998, pp 567-587. LAMLUM H,ILYAS M, ROMAN A, CLARK S, JOHNSON V, BELL J, FRAYLING I, EPSTATHIOU J, PACK K, PAYNE S, ROYLANCE R, GORMAN P, SHEER D, NEALE K, PHILLIPS R, TALBOT I, BODNER W AND TOMLINSON I: The type of somatic mutation at APC in familial adenomatous polyposis is determined by the site of the germline mutation: new facet to Knudson's 'two hit"hypothesis. Nature Medicine 1999, 5:1071-1075

III-320 23. LYNCH HT, SMYRK TC, LANSPA SJ y colab.: Upper gastrointestinal manifestations in families with hereditary flat syndrome. Cancer 1993; 71: 2709-14. 24. LINDOR NM, GREENE MH: The concise handbook of family cancer syndromes. Mayo Familial Cancer Program. J Natl Cancer Inst 1998:90, 1039-1071 25. MANDL M, PAFFENHOLZ R, FRIEDL W y colab.: Frequency of common and novel inactivating APC mutations in 202 families with FAP. Hum Molec Genet 1994; 3: 181-4. 26. MIYOSHI Y, NAGASE H y colab.: Somatic mutations of the APC gene in colorectal tumors: mutation cluster region in the APC gene. Hum Mol Genet 1992; 1: 229-33. 27. NUGENT KP, PHILLIPS RKS: Rectal cancer risk in older patients with adenomatous polyposis and ileo-rectal anastomosis: a cause of concern. Br J Surg 1992; 79: 1204-1206. 28. OLSCHWANG S, TIRET A, LAURENT-PUIG P, MULERIS M, PARK R, THOMAS G: Restriction of ocular fundus lesions to a specific subgroup of APC mutations in the adenomatous polyposis coli patients. Cell 1993, 75:959-968. 29. PHILLIPS ROBIN KS: "Evolution of surgery for inherited colorectal cancer syndromes", Jagelman Lecture. 4th Joint Meeting of the Leeds Castle Polyposis Group and the International Collaborative Grup on Hereditary NonPolyposis Colorectal Cancer, Clevelan, USA 4-6 september 2003. 30. POWELL SM, ZILZ N y colab.: APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature 1992; 359: 253-257. 31. RESTA N, STELLA A, SUSCA F y colab.: Nine novel mutations in Italian FAP patients. Hum Mutat 2001; 17: 434-5. 32. ROEST PA, ROBERTS RG, SUGINO S, VAN OMMEN GJ AND DEN DUNNEN JT: Protein truncation test (PTT) for rapid detection of translation terminating mutations. Hum Mol Gen 1993, 2 (10): 1719-1721. 33. RUIZ-PONTE C, VEGA A y colab.:. Mutation análisis of the adenomatous polyposis coli gene in the Northwest Spanish

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

12

patients with familial adenomatous polyposis and sporadic colorectal cancer. Hum Mutat 2001; #444 on line. SANSOM OJ, BERGER J, BISHOP SM, HENDRICH B, BIRD A, CLARKE AR:. Deficiency of Mbd2 supresses intestinal tumrigenesis. Nat. Genet. 2003, 34:145-147. SCOTT R, MELDRUM C y colab.: Familial adenomatous polyposis: more evidence for disease diversity and genetic heterogeneity. Gut 2001; 48: 508-14. SIEBER OM, LIPTON L, GABTREEN M, HEINIMANN K, FIDALGO P, PHILLIPS RKS, BISGAARD ML y colab.: Multiple Colorectal adenomas, classic adenomatos polyposis and germline mutations in MYH. N Eng J Med 2003, 348:791799. VAN DER LUIJT RB, KHAN PM, VASEN HF y colab.: Molecular analysis of the APC gene in 105 Dutch kindreds with familial adenomatous polyposis: 67 germ-line mutations identified by DGGE, PTT, and Southern analysis. Hum Mutat 1997; 9: 7-16. VARESCO L, GISMONDI V, JAMES R y colab.: identification of APC mutations in Italian adenomatous polyposis patients by PCR-SSCP analysis. Am J Hum Genet 1993; 52: 2805. WALLIS YL, MORTON DG, MC KEOWN CM, MACDONALD F: Molecular Analysis of the APC gene in 205 families extended genotype-phenotype correlations in FAP and evidence for the role of APC amino acid changes in colorectal cancer predisposicion. J Med Gen 1999, 36:14-20. WALON C, KARTHEUSER A, MICHILS G: Novel germline mutations in the APC gene and their phenotypic spectrum in Familial adenomatous polyposis kindreds. Hum Genet 1997; 100: 601-5. WON Y, PARK K, KWON H y colab.: Germline mutations of the APC gene in Korean Familial adenomatous polyposis patients. J Hum Genet 1999; 44: 103-8.