Guía de Trabajos Prácticos

BIOLOGIA II

2009

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Biología II Segundo Cuatrimestre-año 2009 Coordinador de la materia Dra. Prof. Deborah R. Tasat Docentes Responsables de TP Dra. Andrea Gioffré Dra. Paola D`Atri Dr. Martin Radrizzani Ayudantes de Primera Lic. Mónica Palmieri Lic. Leonardo Storani Ayudantes de Segunda Marcos Bruno Romina Chiurazzi Sebastián Ferraro Verónica Delfosse

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INDICE

TP#1 TP#2

TP#3 TP#4 TP#5 TP#6 TP#7 TP#8 TP#9

Cronograma de la materia Programa Analítico Bibliografía Recomendada Características grales. de la Materia-Régimen de aprobación Normas para el trabajo en el laboratorio Pipetas de precisión de volumen variable Microscopio óptico: Descripción y Funcionamiento Microscopía Optica Técnicas cito-histológicas y Microscopía células eucariotas Microscopía óptica en el estudio de los microorganismos Pared Bacteriana Morfología bacteriana y Técnica de Gram Desinfección y Esterilización Crecimiento bacteriano Cuantificación en medio sólido y recuento celular Espectrofotometría Turbidimetría: evaluación del crecimiento bacteriano. Crecimiento bacteriano en medio líquido Cuantificación de Proteínas Centrifugación Permeabilidad de las membranas celulares Problemas: Guía de Problemas Cultivo de Tejidos Fagocitosis: Reseña histórica Fagocitosis en cultivos primarios de macrófagos Recuento Celular- Cámara de Neubauer

Pg. 1 Pg. 2 Pg. 4 Pg. 5 Pg. 6 Pg. 8 Pg. 10 Pg. 13 Pg. 14 Pg. 19 Pg. 21 Pg. 23 Pg. 25 Pg. 28 Pg. 30 Pg. 32 Pg. 35 Pg. 37 Pg. 40 Pg. 42 Pg. 68 Pg. 44 Pg. 47 Pg. 48 Pg. 50

TP#10 División Celular: Mitosis y Meiosis TP#11 Ácidos Nucleicos: Reseña histórica Extracción de ADN Electroforesis: Geles de agarosa TP#12- Análisis de ADN

Pg. 51 Pg. 53 Pg. 54 Pg. 57 Pg. 61

TP#13 Electroforesis: Geles de poliacrilamida Separación de Proteínas TP#14 Problemas TP#15 Problemas

Pg. 62 Pg. 65 Pg. 68

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Inicio de las clases: Finalización de las clases:

Miércoles 19 de Agosto Teóricos y TPs Miércoles 25 de Noviembre

Exámenes: Primer Parcial:

Miércoles 14 de Octubre

Segundo Parcial:

Miércoles 2 de Diciembre

Exámenes Recuperatorios: Primer y Segundo Parcial:

Miércoles 16 de Diciembre

Fechas de Finales: Serán establecidas por la Escuela de Ciencia y Tecnología

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Programa Analítico de la materia 1: Microscopías óptica y electrónica. Microscopio óptico simple y compuesto. Microscopios especiales de: fondo oscuro, fluorescencia, polarización, contraste de fase, interferencia, confocal. Electrónicos de transmisión y de barrido. 2: Métodos citológicos y citoquímicos. Fijación. Inclusión. Obtención de cortes. Coloración. Técnicas especiales: tejidos duros (descalcificación y desgaste), frotis de sangre, Impregnaciones metálicas. Histoquímica. Inmunohistoquímica: técnicas directa e indirectas. Técnicas para microscopía electrónica de transmisión y de barrido. Métodos citofotométricos. Métodos autoradiográficos. 3: El origen de las células. Evolución de las células procarionte y eucarionte. Estructura general de las células procarionte y eucarionte. Teoría de la Endosimbiosis. Niveles de Organización: Unicelulares, Multicelulares y Pluricelulares. Organización Celular. Células Procariontes: (Arqueobacterias y Eubacterias). Células Eucariontes (Reino Fungi: ascomycetes, deuteromycetes y basidiomycetes). 4: Células Eucariontes. Comparación entre célula animal y vegetal. Límites Celulares. Tamaño y forma celular. Organización subcelular: Membrana Plasmática y Pared Celular. Características de la célula animal y vegetal. Tipos de células: forma, tamaño, diferenciaciones. 5: Membrana Plasmática. Breve Reseña Histórica (Danelli, Singer). Composición Química: La Bicapa lipídica y Proteínas de Membrana. Propiedades. Transporte de Moléculas a través de la Membrana. Tipos de Transporte: Pasivo Simple, Facilitado y Activo (Cotransporte: Simporte y Antiporte). 6: Endomembranas I. Continuidad de Membrana. Compartimentalización Celular. El Retículo Endoplásmico Rugoso y Liso. Estructura y Funciones. 7: Endomembranas II. Sistema de Golgi. Estructura y Función. Sistema vacuolar: Lisosomas. Peroxisomas. Reciclado de la Membrana Celular: Vesículas cubiertas. Transporte de Macromoléculas: Exocitosis y Endocitosis. 8: Mitocondrias y Cloroplastos. Caracterización Morfológica y Estructural. Compartimentalización. Función de las Mitocondrias: Respiración Aeróbica y Fermentación. (Glucólisis, Cadena Respiratoria y Fosforilación Oxidativa). Función de las Cloroplastos. 9: Citoesqueleto I. Clasificación y funciones. Los Microfilamentos: actina y proteínas asociadas. Estructura y funciones. El Movimiento ameboide. Los Filamentos Intermedios: Estructura y funciones. Marcadores Específicos de Estirpe Celular. Anomalías genéticas de proteínas estructurales. Proteínas de los filamentos intermedios (queratinas). 10: Citoesqueleto II. Los Microtúbulos: tubulina y proteínas asociadas. Estructura y funciones. Organización molecular y funcional del aparato mitótico. Organoides microtubulares: cilias y flagelos.

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11: División Celular en eucariontes: Mitosis: Organización Molecular y rol Funcional del aparato mitótico. Descripción general de la meiosis: Etapas, Formación del Complejo sinaptonémico, recombinación génica entre cromátidas homólogas (crossing-over), separación de homólogos y de cromátides hermanas. Consecuencias genéticas de la meiosis. Comparación entre meiosis y mitosis. 12: Ciclo Celular: Períodos Go, G1, S, G2. Ciclinas y Factor Promotor de la Maduración (MPF). Factores regulatorios del ciclo celular (p21, p53, p16, etc.), cascadas regulatorias. 13: Núcleo I. La organización del ADN. Los cromosomas (nucleosomas – histonas – cromatina). Replicación. La envoltura nuclear. 14: Núcleo II. El Nucléolo. Tipos de ARN. Transcripción y procesamiento del ARN. Ribosomas y poli-ribosomas. Traducción. Proteínas intracelulares y de exportación.

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Bibliografía Recomendada A modo orientativo se citan a continuación algunos libros de referencia. Sin embargo, se recomienda optar por las ediciones actualizadas, en el caso de que se encuentren disponibles Biología Curtis and Barnes. Ed. Panamericana, 2001 H. Biología Molecular de la Célula B. Alberts y col. Ed. Garland, 1994. Biología Celular y Molecular De Robertis y De Robertis. Ed. El Ateneo,1994. Fundamentos de Biología Celular y Molecular De Robertis y De Robertis (h). Ed. Ateneo, 1995. Histología Genesser. Ed. Panamericana, 1996. La Célula 2da. Edición G. Cooper. Ed. Marbán, 2002 . Bioquímica Stryer. Ed. Reverté, 1995 Genes VII Lewis. Ed. Marbán, 2001 Biología Celular Smith y Wood. Ed. Adison – Wesley Iberoamericana, 1997 Recombinant DNA. 2da Ed. Watson JD, Gilman M, Witowski J, Zoller M (1992) Freeman, Scientific American Books Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. Búsquedas Bibliográficas Para buscar citas de trabajos originales publicados en revistas científicas en inglés mediante el uso de palabras presentes en sus títulos o resúmenes (abstracts) o el apellido de sus autores, o libros on-line (también en inglés), se puede consultar la base de publicaciones más importante en ciencias biomédicas y biotecnología, llamada PubMed, a la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ Publicaciones Periódicas Scientific American o su edición en español (Investigación y Ciencia) Mundo Científico Ciencia Hoy

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Características generales y Régimen de aprobación El curso se desarrollará en 15 semanas y comprende: Clases Teóricas de 2 horas (1 clase por semana) a dictarse los días miércoles de 15-17hs Trabajos Prácticos de 3 horas. Los mismos se llevarán a cabo los días miércoles de mañana: 9-12hs o de noche de 18-21hs. Exámenes parciales escritos a desarrollar. El examen final podrá ser oral o escrito. Clases Teóricas Teniendo en cuenta la imposibilidad material para desarrollar la totalidad de los temas debido a los avances crecientes en el conocimiento en Biología, las clases teóricas están dedicadas básicamente a la actualización de los temas fundamentales de la materia. No obstante, la totalidad de los tópicos del Programa Analítico deben ser estudiados utilizando la bibliografía aconsejada. Para facilitar la compresión de los contenidos desarrollados en las clases teóricas, es esencial el estudio previo de los temas a ser dictados. Clases Prácticas El Trabajo Práctico es una actividad de asistencia obligatoria, por lo tanto, se exige un 80 % de asistencia. La inasistencia a los TPs implica por lo tanto la pérdida de la regularidad de la materia. Las bases conceptuales de los temas de TP son desarrolladas previamente en las Clases Teóricas o durante el desarrollo de las prácticas. El alumno deberá poseer los conocimientos teóricos correspondientes al tema del día, los que serán evaluados mediante interrogatorios orales o escritos (parcialitos). La materia presenta distintas instancias de Evaluación 1-Trabajos Prácticos El alumno deberá poseer los conocimientos teóricos correspondientes al tema del día, los que serán evaluados mediante interrogatorios orales o escritos (parcialitos). Los parcialitos se aprueban con el 60 % de la nota total. Todos los parcialitos desaprobados serán recuperados en una fecha que dispondrá la cátedra, previa a cada parcial. Para acceder al exámen recuperatorio, los alumnos deberán tener aprobados no menos del 50 % de los parcialitos en cada módulo. Los alumnos que no aprueben los TPs, no podrán presentarse a rendir los exámenes parciales. Informes: Todos los resultados y observaciones de los TPs deberán presentarse en informes siguiendo los lineamientos establecidos por la cátedra. Los informes deberán ser entregados a más tardar, en la segunda clase posterior a la realización de la Práctica. Luego de esa fecha se considerará desaprobada la práctica. En caso de estar desaprobado el informe, el alumno deberá rehacerlo. 2-Exámenes Parciales Durante el curso lectivo se tomarán 2 (dos) exámenes parciales cada uno de los cuales se aprobará con el 60% de la nota. Recuperatorios de Parciales Se podrá recuperar, en las fechas previstas por la Cátedra, solamente uno de los exámenes parciales. 3-Exámen Final 8

Los alumnos que regularizan la materia, rendirán un examen final integratorio. El mismo puede ser escrito u oral. Promedio Final de la Materia La nota final surge de promediar la nota de los exámenes parciales, final y el promedio de los TP. Los alumnos que al finalizar la cursada se encuentren dentro de las siguientes situaciones: -desaprobación de los dos exámenes parciales - desaprobación del exámen recuperatorio. Estos deberán recursar la materia. En caso de recursar en el cuatrimestre siguiente, la nota de los TPs serán consideradas, debiendo cursar solamente los teóricos y rendir los respectivos exámenes parciales.

NOTA: Todo el material necesario será provisto por la cátedra. Sin embargo es obligación del alumno contar con: - Marcador indeleble trazo fino - Lápices de colores y hojas blancas

Normas para el trabajo en el laboratorio En el siguiente texto, mostramos una serie de ítems elementales para el trabajo en el laboratorio. 1. Se implementará el uso de guardapolvo, de preferencia que sea de algodón, largo y con mangas largas, asimismo es recomendable no usar faldas, shorts o zapatos abiertos. Las personas de cabello largo deberán sujetarlos mientras estén en el laboratorio. 2. No fumar, comer o beber en el laboratorio. Lavar bien las manos al salir del lugar. 3. Es importante conocer la localización de los accesorios de seguridad. -Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego pueden apagar. -Localizar las salidas de emergencia o salidas alternativas a las habituales. -Localizar la llave general de electricidad del laboratorio. -Localizar la manta anti-llama. -Localizar el lava-ojos y ducha más cercanos 4. Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse. Es necesario contar con un rotulador indeleble. 5. No devolver los reactivos a los frascos originales, así no hayan sido usados. Evitar circular con ellos por el laboratorio. 6. No usar ningún instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a 9

utilizar. 7. Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando los instrumentos no estén siendo usados deben permanecer desenchufados. 8. Nunca pipetear líquidos con la boca. En este caso usar peras de plástico o propipetas especiales para tal fin. * Material de Vidrio 1. Al usar material de vidrio, verificar su condición. Cualquier material de vidrio que esté astillado debe ser rechazado. 2. Los vidrios rotos así como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente apropiado. NUNCA DEJARLOS SIN IDENTIFICAR NI A LA MANO DE UN TERCERO. * Residuos Consultar siempre la vía de descarte de cada uno de los reactivos utilizados. * Microscopios Verificar siempre el estado de las lentes y recordar apagar la lámpara luego de realizada la observación. Siempre que use aceite de inmersión, limpiar al finalizar con el solvente adecuado. Al retirarse, verificar que el instrumental utilizado esté apagado, en su lugar, la mesada de trabajo debe quedar libre y limpia. Cualquier desperfecto, rotura o accidente deberá ser informado a los docentes

ANTE CUALQUIER DUDA SUGERIMOS SIEMPRE CONSULTAR A LOS DOCENTES A CARGO

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Pipetas de precisión de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento permite el pipeteo de pequeños volúmenes de líquidos con precisión y reproducibilidad. Es un instrumento de precisión que, como tal, es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo. Las mismas son autoclavables y utilizan un cono, punta o tip descartable, con el que se toman las muestras. Requerimos leer atentamente este apéndice para evitar una mala manipulación de las mismas. Descripción general de una micropipeta tipo.

A- Push button, suele indicar el máximo Vol a pipetear B- Tambor móvil, a partir del cual se puede ajustar el Vol a dispensar. En un pequeño visor, se observa el Vol a calibrar. C- Conducto principal-vástago D- Eyector de tips, este es activado presionando el botón E. F- Tip descartable

Tabla: Límites operativos y lectura de volumen. Modelo P20

Rango de Volumen

ectura del indicador de V

2ul-20ul

P200 50ul-200ul

P1000 200ul-1000ul

1ul= 10-3 ml

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Utilización: Observar que el émbolo (push button) tiene tres posiciones. T0 (B-E), T1, primer tope (AC), T2 (D) Para la carga: 1. Calibración del V, tener mucho cuidado en no sobrepasar los límites operativos de cada pipeta. Colocar el tip. 2. Llevar el émbolo a la posición de carga T1 (ver A). 3. Dentro del líquido a pipetear, liberar el émbolo lentamente hasta la posición T0 (ver B). 4. Para la descarga: 5. Bajar el émbolo suavemente, este debe pasar por primer tope, para la descarga total, llegar hasta el final, posición T2 (ver C y D). 6. Finalmente, fuera del líquido dispensado, liberar el émbolo hasta T0 (ver E). 7. Descartar el tip.

T0 T1 T2

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MICROSCOPIA Descripción y funcionamiento del microscopio óptico La microscopía de luz es una forma de microscopía óptica que incluye lupas y microscopios compuestos. Un microscopio compuesto posee dos lentes: la lente objetivo, que se encuentra cerca del objeto que se observa y el lente ocular, colocado cerca del ojo. El aumento primario del objeto se produce por el lente objetivo, y la imagen que así se origina se transmite al ocular, donde ocurre el aumento final. La magnificación total es el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular. Una propiedad importante de un microscopio es su poder de resolución, es decir, la capacidad para mostrar como distintos dos puntos separados que se encuentran cercanos. Depende exclusivamente del poder del objetivo. El límite de resolución de un microscopio compuesto es directamente proporcional a la longitud de onda de la luz empleada (λ) e inversamente proporcional a la apertura numérica (AN), una propiedad óptica de las lentes objetivo. AN

= n x seno α, donde:

n seno α

= índice de refracción = seno del ángulo de abertura de la lente

El físico Ernst Abbe estableció la relación entre λ, AN del objetivo y distancia mínima de separación entre dos puntos. Si el Límite de resolución (LR) es la distancia mínima que separa dos puntos que pueden ser discriminados como tales entonces: LR = 0.61 x λ / AN donde λ = longitud de onda de la luz AN = apertura numérica del objetivo LR del

*el ojo humano = 0.1 mm *microscopio óptico = 0.2μm *microscopio electrónico = 2-10 A

Dado que la longitud de onda de la luz empleada está acotada en el rango 400-700 nm. En la práctica la resolución de un objeto es función de su apertura numérica. A mayor apertura numérica más pequeño será el objeto resuelto. Por otra parte, el medio por el cual se transmite la luz afecta también a la apertura numérica. Mientras el objetivo esté separado del objeto por aire, su apertura numérica nunca será mayor que 1. Para alcanzar aperturas numéricas mayores, el objetivo debe estar inmerso en un medio que posea un índice de refracción de la luz mayor que el del aire. Por ello se emplean aceites de varios tipos cuyos índices de refracción sean iguales al del vidrio. Los lentes objetivos diseñados para utilizarse con este tipo de aceites se denominan lentes de inmersión. La apertura numérica de una lente de este tipo oscila entre los valores 1.2 y 1.4.

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Principios Generales de Óptica Luz: Es una onda electromagnética que a partir de una fuente, se propaga en el vacío a una velocidad de 300.000 km /seg. La escala de medición de las longitudes de onda es desde los nanómetros hasta kilómetros. El espectro de luz visible se encuentra en el rango 380 nm (violeta) – 750 nm (rojo). Refracción: La refracción es el resultado de un cambio en la velocidad de propagación de la luz al pasar de un medio transparente a otro de diferente densidad. Como consecuencia se produce una desviación en el sentido de la propagación.

aire

aire θi

θi

θr

aire

θr

aceite de inmersión

Leyes de la refracción 1ra. Ley: Los rayos incidente, refractado y la normal están en el mismo plano. 2da. Ley: Cuando la luz atraviesa la superficie de separación de dos sustancias transparentes el cociente entre seno θi/seno θr es una constante y se denomina índice de refracción

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Diagrama de un Microscopio compuesto

Tipos de Microscopios: Ópticos Campo claro Contraste de fase Interferencia Campo oscuro Polarización Fluorescencia Confocal

Electrónicos Transmisión Barrido

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TP#1 Microscopía La Microscopía óptica en el estudio de las células eucariotas Métodos para obtener información morfo-funcional

1. Microscopios ópticos y electrónicos 2. Técnicas citológicas y citoquímicas 3. Marcadores específicos (Anticuerpos, Radioactivos) 4. Técnicas Inmunocitoquímicas (directas e indirectas) 5. Separación de componentes subcelulares (centrifugación) 6. Aislamiento y caracterización de macromoléculas (electroforesis, cromatografía) 7. Cultivo in vitro de células y/o tejidos 8. Manipulación embrionaria

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TP#2 Técnicas cito-histológicas Son los procedimientos que abarcan desde la obtención de una muestra de origen animal o vegetal, hasta su transformación en una preparación adecuada para su estudio microscópico. La técnica corriente para microscopía de campo claro es básica y sirve como patrón para casi todas las demás. La técnica histológica de rutina para estudiar las preparaciones con el microscopio óptico consta de los siguientes pasos: a.

Obtención de la muestra

b.

Fijación (tipos de fijadores, variación del tiempo de fijación)

c.

Deshidratación

d.

Inclusión (distintos medios)

e.

Corte (tipos de micrótomos)

f.

Montaje del corte

g.

Coloración (concepto de basofilia y acidofilia)

h.

Montaje final (deshidratación, aclaración)

Unidad de medida

Valor de la unidad (m)

milímetro (mm)

1x10 -3

micrómetro (μm)

1x10-6, 1x10-3 mm

nanómetro (nm)

1x10-9, 1x10-6 mm

Ángstrom (A)

1x10 -10, 1x10-7 mm

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Técnica Histológica 9 OBTENCIÓN DE LA PIEZA NECROPSIA: Son piezas que se obtienen de un cadáver. BIOPSIA: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida, con el objeto de estudiarlos a microscopio y efectuar el diagnostico histopatológico. 9 FIJACIÓN: es una operación que tiene por objeto matar las células y conservarlas en el estado en que se encontraban durante la vida. Tipos de fijadores: formol 10-2-%, Bouin (mezcla fijadora a base de ácido pícrico, formol y ácido acético). 9 DESHIDRATACIÓN: se realiza en grados crecientes de alcoholes (70, 96 y 100). 9 ACLARACIÓN: se utiliza un liquido intermediario (solvente orgánico) antes de la inclusión. Solventes utilizados: benzol o xilol. 9 INCLUSIÓN: el objetivo es aumentar y homogeneizar la consistencia del tejido. Masas de inclusión: parafina, celoidina, etc. 9 CORTE: el objetivo de la inclusión es preparar el material para realizar cortes del espesor necesario para permitir el paso de la luz y ser examinados por el microscopio. El corte se realiza con micrótomo. 9 DESPARAFINACION: El objetivo es extraer la parafina del corte. Se utiliza el xilol. 9 HIDRATACIÓN: se realiza en grados decrecientes de alcohol (100, 96, 70), luego los cortes se pasan por agua destilada. 9 COLORACIÓN: argénticas, etc.

Hematoxilina-eosina,

tricrómicos,

PAS,

impregnaciones

9 DESHIDRATACIÓN: se realiza con alcoholes en grados crecientes. 9 ACLARACIÓN: se utiliza benzol o xilol. 9 MONTAJE: con bálsamo de Canadá.

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Coloración Con Hematoxilina-Eosina Pasos 1.

Desparafinar el corte en xilol durante 10 minutos

2.

Hidratar en alcoholes 100, 96, 70 y 50.

3.

Pasaje por agua destilada

4.

Coloración con hematoxilina durante 10 minutos.

5.

Viraje en agua corriente

6.

Coloración con eosina durante 3 minutos

7.

Lavado rápido en agua corriente

8.

Deshidratar en alcoholes 50, 70, 96 y 100

9.

Aclaración en xilol

10.

Montaje con bálsamo de Canadá.

Observar los cortes al microscopio óptico: Dibujar las características principales y coloración de los mismos

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Objetivo: ™ Visualización y Caracterización de distintos tipos celulares Frotis Sanguíneo

Diferenciar células de la serie roja y de la serie blanca.

Materiales

Rata Wistar Jeringa Colorante May Grunwald-Giemsa o Hematoxilina-Eosina Porta y cubreobjetos Microscopio compuesto

Metodología

A partir de la muestra de sangre se obtendrán los extendidos según mostrará el docente a cargo del T.P. Dejar secar, fijar con alcohol 96% y colorear la muestra durante 5-15 min.

Observar bajo microscopio de campo claro. Se realizará la observación del preparado tratando de identificar los tipos celulares que se muestran a continuación:

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La Microscopía óptica en el estudio de los microorganismos Reseña Histórica La existencia de microorganismos era sospechada desde mucho antes del siglo XVII, pero no podía demostrarse, consecuencia de las limitaciones técnicas de la época. En 1664, Robert Hooke desarrolló un microscopio compuesto y lo utilizó para observar pulgas, esponjas, plantas y mohos entre otros. Su trabajo fue publicado en Micrographia siendo muy popular. Varios años más tarde, el trabajo de Anton van Leeuwenhoek, un “científico amateur” con gran habilidad para combinar lentes y obtener telescopios y microscopios, permitió la magnificación de muestras más de 200 veces, generando imágenes de mayor claridad. Pasó meses observando a través de su microscopio y envió sus observaciones a la Royal Society of London, causando sensación. Sorpresivamente el trabajo de estos investigadores fue abandonado por casi 200 años hasta la Revolución

industrial, cuando se dieron las condiciones técnicas y sociales para el desarrollo de la ciencia de los microorganismos. El trabajo posterior de Ferdinand Julius Cohn en la observación de microorganimos eucariotas y bacterias (procariotas) popularizó el uso de los microscopios en la microbiología y sentó las bases para el comienzo de la microbiología médica fundada por Robert Koch. La historia de la microbiología, como la historia del hombre, no es una colección de eventos de progreso lineal, sino un entramado de carreras de individuos brillantes y sus ideas. Cada nuevo descubrimiento, se basa en un descubrimiento previo y en retorno, permite otros cuestionamientos. La tabla siguiente, resume los avances que ayudaron al desarrollo de la práctica microbiológica, entre los que se encuentra el desarrollo de la técnica de Gram, que realizaremos en este TP.

“Through the microscope: A look at all things small”. Timothy Paustian and Gary Roberts, University of WisconsinMadison. http://www.microbiologytext.com

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AÑO

EVENTO

Robert Hooke es el primero en utilizar el microscopio para describir la esctructura 1664 reproductiva de los mohos. También acuñó el término “célula” a partir de la observación de corcho vegetal. 1673

Anton van Leeuwenhoek, un comerciante alemán y habilidoso constructor de lentes, es el primero en describir microorganismos en detalle.

1872

Ferdinand Julius Cohn publica un trabajo decisivo en bacterias y reciclado de los materiales. Aparece un esquema de clasificación utilizando el nombre Bacillus.

Oscar Brefeld reporta el crecimiento de colonias fúngicas a partir de esporas individuales 1872 en gelatine y el botánico alemán Joseph Schroeter crece colonias bacterianas pigmentadas en trozos de papa. 1877

Robert Koch desarrolla métodos de tinción de bacterias, fotografía especimenes y preparado de registro visuales permanente en cortes histológicos.

1881

Koch desarrolla medio de cultivo sólido y métodos para la obtención de cultivos puros de bacterias.

1882

Angelina Fannie and Walther Hesse en el laboratorio de Koch desarrollan el uso de agar como medio de soporte para el cultivo en medio sólido.

1884

Hans Christian Gram desarrolla un sistema de tinción para la identificación de bacterias. [la tinción de Gram].

1887 Primer reporte de la placa de Petri por Julius R. Petri. 1915

M. H. McCrady establece un método cuantitativo para el análisis de muestras de agua usando el “número más probable” .

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La Pared Bacteriana Las bacterias (procariotas) son los organismos vivos más pequeños que contienen toda la maquinaria requerida para el crecimiento y la autorreplicación a expensas de distintos nutrientes pudiendo ser auto o heterótrofos. Su tamaño promedio es de aproximadamente 0,5μm de diámetro. Casi todos los procariotas están rodeados por una pared celular rígida que rodea la membrana citoplasmática que da a los diferentes tipos su

morfología característica. Dado que la mayoría de las bacterias son hipertónicas en relación con su ambiente, se lisarían si no tuviesen dicha pared. Las paredes celulares de los procariotas son complejas y contienen muchos tipos de moléculas que están ausentes en los eucariotas. Están compuestas por polímeros complejos (peptidoglucanos), que son primariamente responsables de la resistencia mecánica de la pared.

GramNegativa Gram Positiva La clasificación de las bacterias depende principalmente de su tamaño, forma y propiedades de coloración, en consecuencia, el microscopio óptico ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del bacteriólogo. Las preparaciones no teñidas pueden ser observadas mediante un microscopio de contraste de fases, pero en general los bacteriólogos utilizan preparaciones fijadas al calor y por lo tanto coloreadas. Para las bacterias la coloración de Gram es la más utilizada. Este método fue desarrollado en forma empírica por el

bacteriólogo danés Christian Gram en 1884. En primer lugar, las células son fijadas al porta mediante calor y coloreadas con un colorante básico, cristal violeta. A continuación los portas son tratados con una mezcla de I2–KI (lugol) para fijar (mordiente) el colorante, posteriormente son lavados en acetona o alcohol y, finalmente se aplica una coloración de contraste, la safranina. Teniendo en cuenta lo descrito, se denomina en consecuencia organismo grampositivo a los que retienen el colorante violeta inicial, mientras que los organismos gramnegativos son 24

decolorados por el disolvente orgánico utilizado y presentan la coloración de contraste. Casi 75 años después de la introducción de este procedimiento tan útil se observó que las bacterias G+ y G-, diferían fundamentalmente en la estructura de la pared. Salton demostró que la pared grampositiva no se tiñe, sino que presenta una barrera de permeabilidad frente a la elusión del complejo colorante–I2 por el alcohol. La coloración de Gram se usa ampliamente como base para la clasificación de las bacterias, dado que refleja una diferencia fundamental en la arquitectura de la pared celular. En las células grampositivas, la pared esta formada por una capa homogénea de

peptidoglucanos y polisacáridos que miden entre 10 a 80 nanómetros de espesor. En las células gramnegativas, por el contrario, la pared está formada por dos capas: una interior de peptidoglucanos de solo 2 a 3 nanómetros de espesor, y una capa exterior de lipoproteínas y lipopolisacáridos. Estas moléculas están dispuestas en forma de una bicapa de unos 7 a 8 nanómetros de espesor similar en estructura a la membrana celular. De modo que, el límite de una célula gramnegativa es en realidad una membrana celular interna, una capa de peptidoglucanos delgada y una membrana externa.

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TP# 3 Morfología Bacteriana y Técnica de Gram El microscopio óptico revela dos formas principales de bacterias, organismos más o menos esféricos conocidos como cocos (en latín, baya) y otros cilíndricos denominados bacilos (en latín bastón). Los cocos incompletamente separados pueden aparecer en cierto número de formas diferentes, dependiendo de los planos en los que se dividen: cuando aparecen predominantemente por parejas se denominan diplococos, en cadenas, estreptococos, y en grupos reciben el nombre de estafilococos (racimo). Los cocos que permanecen adheridos tras dividirse sucesivamente en dos o tres direcciones perpendiculares, formando tetraedros cuadrados o formas cúbicas, se conocen por sarcinas. Los bacilos reciben el nombre de cocobacilos, cuando son excepcionalmente cortos, el de bacilos fusiformes cuando están afilados por ambos extremos, de formas filamentosas cuando crecen en forma de largos filamentos y de vibriones o espirilos cuando son curvados. Se muestra en el gráfico la diversidad morfológica. Puede distinguir las formas de la figura?

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Objetivos del Trabajo Práctico: ™ Observar la morfología de las distintas cepas bacterianas al microscopio óptico. ™ Observar comparativamente células eucariotas y células procariotas. ™ Identificar el tipo de pared bacteriana a partir de la tinción de Gram. Metodología Preparación del extendido. Los portaobjetos a utilizar deben estar limpios y desengrasados. Se coloca una gota de solución fisiológica por cada colonia a analizar, y allí se emulsionará una pequeña cantidad de cada colonia. En caso de trabajar con cultivo líquido se coloca una gota del cultivo directamente sobre el portaobjeto. Se realizará también un hisopado de la cavidad oral-encías y se procesará el extendido como se indica a continuación. Secado de la preparación. Se realiza colocando en posición horizontal sobre la corriente de aire caliente de un mechero. Puede realizarse también en estufa. Fijado de la preparación. Se efectúa pasando 3 veces el lado del portaobjeto que NO TIENE la preparación, sobre la llama del mechero para que la misma adquiera una temperatura de aproximadamente 80 0C. Coloración 1. Cubrir con VIOLETA para Gram las zonas del portaobjeto que tienen la preparación. Dejar 20 segundos. 2. Lavar con chorro fino de agua 10 segundos. 3. Cubrir con LUGOL para mordentar. Dejar 30 segundos. 4. Decolorar durante 10 segundos con DECOLORANTE haciendo presión en el frasco plástico, para que salga un chorro fino que arrastre el colorante. 5. Lavar con chorro fino de agua 10 segundos. 6. Cubrir con SAFRANINA. Dejar 20 segundos. 7. Secar

8. Nota: El tiempo de cada paso puede variar de acuerdo al kit utilizado. Por favor, verificar antes de comenzar Desinfección y Esterilización el protocolo.

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Desinfección y Esterilización Definiciones Se dice que un objeto es estéril cuando carece de todo germen viable, en este contexto, viable significa capaz de reproducirse. La esterilización es el proceso mediante el que se matan o eliminan todos los microorganismos viables, para lo que se utilizan métodos físicos o químicos destinados a eliminar los mismos de un objeto o matarlos in situ. Este término es un absoluto que implica la inactivación de todas las formas de vida microbiana. Los productos de descomposición tóxicos que a veces quedan en el objeto esterilizado se denominan: pirógenos. El término desinfección se suele emplear para los procedimientos que eliminan o matan a la mayoría de los microorganismos viables pero no a todos. Los desinfectantes reducen la biocarga, es decir la cantidad de microorganismos viables. Los procesos de esterilización y desinfección son costosos y por tanto, es de suma importancia elegir el método apropiado que cause el menor daño posible al material correspondiente. Las consideraciones siguientes influyen en la elección del método: • Es más fácil esterilizar un objeto limpio que otro físicamente sucio, una biocarga baja constituye un requisito previo para una esterilización con buena relación costo / beneficio. • La proporción de microorganismos muertos depende de la concentración del agente y del tiempo de exposición. El número de microorganismos supervivientes se puede expresar por la ecuación: N α 1/CT Donde N es el numero de supervivientes, C la concentración del agente y T el tiempo de exposición. Si una población de microorganismos es expuesta a una técnica de esterilización y el logaritmo del número de supervivientes se representa en función del tiempo, la pendiente de la curva define la tasa de muerte. • Las curvas pueden utilizarse con el fin de predecir las condiciones necesarias para conseguir la esterilidad • El mecanismo detallado del proceso de muerte de los microorganismos quizás varíe con la técnica de esterilización empleada pero el efecto neto es similar y consiste en la inactivación de constituyentes esenciales de la célula (ácidos nucleicos y proteínas). Factores que afectan la potencia desinfectante En contraposición con los agentes quimioterapéuticos que presentan un alto grado de selectividad para ciertas especies de bacterias, los desinfectantes son muy tóxicos para todos los tipos de células. La efectividad de un agente particular está determinada en gran parte por las condiciones en las cuales actúa. • Concentración del agente: Muchos agentes son letales para bacterias sólo cuando se los utiliza en concentraciones muy elevadas. Otros en concentraciones muy bajas pueden estimular, retardar, o hasta

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destruir al microorganismo. Sin embargo, la concentración necesaria varía con el desinfectante, el microorganismo y el método de ensayo. Mediante la siguiente expresión es posible relacionar la concentración de la droga empleada y el tiempo necesario para destruir una determinada fracción de la población: Cn t = K Donde C es la concentración de la droga, t es el tiempo necesario para destruir una determinada fracción de las células y n y K son constantes. • Tiempo de exposición a un agente • pH La concentración de ión hidrógeno influye sobre la acción bactericida al afectar tanto al microorganismo como al agente químico. • Temperatura La destrucción de las bacterias por los agentes químicos aumenta junto con la temperatura. • Naturaleza del microorganismo La eficacia de un agente determinado depende de las propiedades del microorganismo. Las más importantes son: especie, fase de cultivo, presencia de estructuras especiales (esporas o cápsulas), etc. • Presencia de materiales extraños La presencia de materia orgánica (suero, sangre, pus) influye sobre la actividad de muchos desinfectantes alterando su actividad y los transforma en inertes. Técnicas de esterilización Calor El calor, como forma de transferir energía, es el método preferido para la esterilización, debido a su fácil empleo, costo, control y eficacia. a) Calor Seco: El mecanismo esterilizador del calor seco es básicamente la oxidación de los componentes celulares. La incineración y el uso del mechero Bunsen son ejemplos de esterilización por calor seco. El instrumental de vidrio se puede esterilizar durante una hora en una estufa de aire caliente a 160-180 C. b) Calor húmedo: El agente más eficaz para la esterilización es el vapor de agua saturado a presión (autoclave). La destrucción de las enzimas y membranas esta influida por la disponibilidad de agua, que modifica los enlaces hidrógeno. El vapor a presión facilita la penetración del calor en el material que se quiere esterilizar. Existe una relación directa entre temperatura y presión de vapor. El vapor a presión tiene una temperatura superior a 100 ºC, lo que aumenta su capacidad de matar microorganismos. La duración del ciclo de la autoclave está determinada por el tiempo de actuación más un margen de seguridad y se calcula por las curvas de letalidad térmica para patógenos termo-resistentes como los clostridios. El ciclo usual de 121º C durante 15 minutos es suficiente para matar esporas de Clostridium botulinum con un margen adecuado de seguridad.

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Filtración Las soluciones termo-esterilizadas contendrán pirógenos. Esos productos termoestables de la descomposición de los microorganismos, capaces de inducir fiebre, resultan indeseables en preparados como los líquidos intravenosos. Los filtros modernos son de nitrocelulosa y actúan por la atracción electrostática y el tamaño de los poros, que retienen los microorganismos y otras partículas. Irradiación El empleo de la irradiación gamma constituye ahora el método de elección para esterilizar grandes lotes de dispositivos pequeño tamaño como agujas, jeringas, vías intravenosas, catéteres, guantes, etc. Aunque el costo inicial del equipo es muy alto, permite un funcionamiento continuo y proporciona una eficiencia del 100%. La técnica requiere instalaciones y personal especializado. El mecanismo de muerte consiste en la producción de radicales libres, que son eficaces para romper los enlaces del ADN. La irradiación, a una dosis mayor que la necesaria para las células vegetativas también mata las esporas. Este aumento en la dosis se debe a la falta relativa de agua en las esporas. Agentes químicos La necesidad de esterilización mediante sustancias químicas gaseosas y/o líquidas ha disminuido mucho gracias al éxito de la irradiación gamma. Sin embargo, aún se utilizan el óxido de etileno (gas) y el formaldehído (liquido). Ambos son agentes alquilantes y matan por lesión en las proteínas y ácidos nucleicos.

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Grupo Halógenos (agentes oxidantes)

otros metales pesados (modifican los grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos) Alcoholes (solvente orgánico que interactúa con las membranas lipídicas) Aldehídos (agentes alquilantes, modifican enzimas, acción irreversible)

Desinfectantes de uso hospitalario Ejemplos Ventajas e Inconvenientes Hipoclorito Económicos, eficaces, actúan por liberación de cloro libre. Activos contra virus, bactericida. yodo

Desinfectantes esporicidas

cutáneos

cloruro mercúrico

empleado tópico

preparado

Alcohol etílico Alcohol isopropílico

Desinfección cutánea y limpieza de superficies, usados a veces en combinación con yodo y clorhexidina. Alcohol 70% es mejor desinfectante que 96%, mayor poder bactericida. demasiado irritantes para uso como desinfectantes generales

Formaldehído formalina glutaraldehído

como

útiles, cutáneo

Destruye microorganismos vegetativos incluyendo micobacterias, lentamente pero de modo más eficaz, más activo y menos tóxico que el formaldehído, esporicida, algo irritante. Se mantiene estable 1-2 semanas en solución alcalina, de uso limitado, caros.

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Crecimiento bacteriano Introducción En un cultivo bacteriano homogéneo el crecimiento de una población bacteriana se puede predecir a través de la siguiente relación: dX/dt = μX

(1)

siendo dX el incremento en la masa celular (biomasa), dt es el intervalo de tiempo, X es la cantidad de biomasa, y μ es la velocidad de crecimiento específica (con unidades de tiempo inversa -1/t-). Si μ es constante, integrando la ecuación (1), queda claro que X va aumentando de manera exponencial con el tiempo: ln X/X0 = μt

(2)

donde ln es el logaritmo natural (en base e = 2.303) y X0 cuando t = 0, por lo tanto rearreglando la ecuación 2 se aprecia que la biomasa final será: X = X0 eμt

(3)

El crecimiento bacteriano que se comporta según esta relación es llamado crecimiento exponencial o crecimiento logarítmico. De estas ecuaciones puede deducirse el tiempo de duplicación (td) cuando X = 2Xo: td = ln 2/μ = 0.693/μ Estas ecuaciones predicen el comportamiento de una población bacteriana sσlo en la porción de la curva de crecimiento que no es influenciada por el crecimiento de la población (es decir la fase exponencial). En general y en este TP en particular se trabaja con cultivos bacterianos líquidos no se agrega ni quita nada del ambiente donde se crecen las bacterias luego de inocular las células a un medio de crecimiento adecuado con una composición mas o menos definidas. Esto significa que estos sistemas sólo permitirán la multiplicación celular por un período de tiempo limitado y en el que progresivamente se producirán cambios en el medio original y en el ambiente, producto justamente de los productos metabólicos y del consumo de los nutrientes por efecto de la masa celular en crecimiento. En este sentido podremos definir varias etapas en una curva de crecimiento normal, cuya validez se extiende a cultivos de células eucariotas. Fase lag: durante la cual la masa celular crece pero no aumenta el número de células. Fase de crecimiento o fase exponencial: Durante la fase log el crecimiento de microorganismos sigue un patrón exponencial. La razón de este comportamiento es que muchos microorganismos se reproducen formando dos células hijas a partir de una célula madre. Fase estacionaria: no hay aumento neto en el número de células debido a cambios químicos y físicos en el ambiente, pero donde aun requieren una fuente de energía que mantiene la viabilidad celular. Fase de muerte: caracterizada por una disminución exponencial en el número de las células vivas.

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La fase lag es debida a los cambios rápidos en los medios de cultivo, por ejemplo si transferimos un inóculo de una población en crecimiento estacionario a un medio de cultivo fresco el tiempo que tarde en llegar a fase exponencial dependerá del tamaño de dicho inóculo. Un inóculo de volumen pequeño que es transferido a un gran volumen de medio fresco puede resultar en la salida difusional de vitaminas, cofactores e iones que son necesarios para muchas actividades enzimáticas intracelulares. Si esta transferencia se realiza de un medio rico a un medio pobre, resultará en consecuencia en un aumento de la fase lag y también puede resultar en un crecimiento exponencial pero de μ menor. Medición de la masa celular Hasta aquí hemos venido hablando de masa celular que resulta proporcional al número de células sólo en la fase exponencial. La masa celular se puede medir en términos de peso seco, pero generalmente resulta más práctica y útil la medición por Turbidimetría en un espectrofotómetro o en un colorímetro, ya que permite seguir el aumento de la densidad del cultivo mientras esta creciendo. La λ de elección es 660nm ya que se evita la absorción de partículas coloreadas del medio de cultivo y en consecuencia el blanco hecho con medio de cultivo sin inoculo bacteriano es similar al blanco de agua. Cuantificación celular Para tener una idea precisa del número de células viables elegimos se utiliza el método de Plaqueo en medio sólido. Se efectúan diluciones que son distribuidas en el agar y luego de dejar incubando una noche a 370C se procede a contar colonias (ver nota y figura más abajo), cuyo número resulta directamente proporcional al número de células ya que cada una de ellas proviene de una célula individual. De este concepto deriva el término Unidad Formadora de Colonia (UFC). El cálculo de la concentración de células viables a un tiempo dado, se realiza como se indica:

•

N= número de colonias contabilizadas

•

FD=Factor de dilución (previo al plaqueo)

•

Vp= volumen plaqueado

UFC/ml= n x FD/Vp

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TP#4 Cuantificación celular en medio sólido 1. Realizar diluciones seriadas al 1/10 (ver figura) del cultivo a cuantificar, utilizando medio LB (Vf=1ml). Tener la precaución de homogenizar la suspensión celular antes de pipetear.

VSv: 900µL

2. Plaquear seleccionando un volumen de plaqueo adecuado al tamaño de la placa (hta. 200 ul para placas de 10 cm; hta 50 ul para placas de 5 cm). 3. Incubar a 37 oC toda la noche 4. Cuantificación de colonias y cálculos de UFC/ml. (Nota: este paso se realizará durante el próximo TP) NOTA: Morfología de colonia: La multiplicación bacteriana en medio sólido, genera una colonia macroscópica que también puede presentar características particulares de acuerdo a la especie y al medio de cultivo. (http://www.bact.wisc.edu)

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ESPECTROFOTOMETRIA Introducción a la Espectroscopia de Absorción Transmitancia Cuando una solución es puesta en presencia de un haz de luz, debido a la interacción entre los fotones y las partículas absorbentes de la muestra, la potencia del haz se atenúa de P0 a P. La transmitancia T de la solución es por lo tanto, la fracción de radiación incidente transmitida por la solución. T = P/P0 Absorbancia La absorbancia de una solución se define por la ecuación: A = - log10T = log P0/P A diferencia de la transmitancia, la absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor es la atenuación del haz. Por lo tanto T y A son conceptos que definen la caída de la potencia radiante P0, luego de atravesar una capa de solución de una especie absorbente de concentración c y de b cm. de grosor. b P0

P

Solución absorbente de concentración c Absortividad y absortividad molar La absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de la solución, y a la concentración c de la especie absorbente. Estas relaciones se expresan por A = abc Donde a es una constante de proporcionalidad denominada absortividad, característica para cada solución en particular, tan invariable como el punto de fusión, de ebullición o los índices de refracción. La magnitud de a dependerá de las unidades utilizadas para b y c. Frecuentemente b se expresa en centímetros y c en gramos por litro. Entonces la absortividad tiene unidades de (g/l)-1 y cm-1. Cuando la concentración se expresa en moles por litro, la absortividad se denomina Absortividad molar. A = εbc

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Ley de Lambert – Beer La expresión: A = εbc o A = abc es una expresión que se conoce como ley de Beer y permite cuantificar una muestra medida por absorción. La ley de Lambert y Beer establece que la absorción de la luz es proporcional al número de moléculas de las sustancias en solución por donde pasa el haz luminoso. Por lo tanto la absorción varía con la longitud del trayecto que recorre el haz de luz en la solución y con la concentración del absorbente en una forma característica para cada sustancia absorbente y para una longitud de onda dada. La ley de Beer también se aplica a soluciones que contengan más de una clase de especie absorbente. Suponiendo que no haya interacción entre las distintas especies, la absorbancia total para un sistema multicomponentes se expresa como: Atotal = A1+A2+.........+An = ε1bc1+ε2bc2+.........+εnbcn Limitaciones propias de la ley de Beer La ley de Beer sólo describe bien el comportamiento de la absorción en soluciones diluidas. A concentraciones elevadas (en general > 0.01M) la distancia promedio entre las especies responsables de la absorción disminuye hasta el punto en que cada una afecta a la distribución de carga de sus vecinas. Esta interacción, a su vez puede alterar la capacidad de que las especies absorban a una determinada longitud de onda de radiación. Dado que el grado de interacción depende de la concentración, el hecho de que ocurra este fenómeno causa ciertas desviaciones de la relación lineal entre la absorbancia y la concentración. Instrumentos para mediciones de absorción: Espectrofotómetro El espectrofotómetro es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida. Consta de: a) Fuente de luz: lámparas que suministren una fuente continua y cuya potencia no varíe bruscamente en un intervalo considerable de longitudes de onda. b) Selector de longitud de onda: sistema óptico que separa el haz de luz en sus longitudes de ondas componentes, seleccionando una de ellas, la que luego atravesará la muestra (ver figura más abajo) c) Recipientes para la muestra (cubetas): deben ser de un material a través del cual pase la radiación de la región espectral de interés. Para trabajar en la región UV (por debajo de 350 nm) se necesita cuarzo. En la región entre 350 y 2000 nm se pueden usar vidrios o recipientes de plástico. Para los trabajos en las regiones ultravioleta y visible, la longitud de la cubeta es 1 cm. La calidad de los datos de absorbancia depende de manera crítica de la forma en que se usen y mantengan las cubetas. Las huellas dactilares, la grasa u otras manchas en las paredes, alteran de forma notable las características de transmisión de una cubeta. Por tanto es necesaria una limpieza a fondo, antes y después de usarlas, la superficie de las ventanas no debe tocarse durante su manipulación.

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d) Detectores de radiación: receptor que transforma la señal luminosa en corriente eléctrica. e) Sistemas de procesamiento y dispositivos de lectura de las señales: voltímetro que registra la corriente eléctrica en una escala general. Normalmente en los espectrofotómetros se pueden encontrar 2 escalas: 1) %T (transmitancia), 2) A (absorbancia). El espectrofotómetro puede emitir frecuencias luminosas que varían según el aparato y la fuente de luz. Normalmente suelen corresponder a la región del espectro visible, entre 400 y 700 mm, pudiendo abarcar también la región del ultravioleta (UV), entre 15 y 400 nm y del infrarrojo (IR), más de 700 nm.

UV

VISIBLE

IR

300 400 500 600 700 800 nm

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TP# 5 Cuantificación del Crecimiento Celular (Turbidimetría) OBJETIVOS ™ Evaluar el crecimiento bacteriano por turbidimetría MATERIALES -Cultivo de E. coli en fase exponencial -erlenmeyers/botellas de cultivo -caldo Luria Bertani (LB) -Placas de Petri con medio LB-agar -Baño termostatizado -espectrofotómetro, cubetas -pipetas, tubos tipo eppendorf y tips estériles, rastrillo de vidrio

DESARROLLO

Antes de comenzar la práctica: Encender el espectrofotómetro y calibrar a 600 nm

-Largar un cultivo en medio LB utilizando como inóculo el cultivo previamente crecido. Realizar una dilución 1/20 (Vf= 50 ml). Tomar una alícuota de 0.2 ml en un tubo eppendorf estéril, reservar en heladera. Pipetear un V de 0.5 ml y medir al espectro (descartar). Este dato de absorbancia constituye el to. Colocar el cultivo en agitación a 37 oC. -Realizar mediciones cada 30 min, reservando también un volumen de 0.2 ml como se explico más arriba. De esta manera se seguirá la curva de crecimiento a lo largo del TP, midiendo la DO600 a diferentes tiempos, en diferentes condiciones (que serán indicadas por los docentes) y se graficará los valores de absorbancia en función del t.

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Preparación de Medios de cultivo LB-caldo LB-agar 10g triptona (o hidrolisado de caseína) Al medio LB agregar 15 g de agar 5 g extracto de levadura 10g NaCl Autoclavar. Dejar enfriar (50-60 oC) Csp 1L antes del agregado de antibióticos si es (ajustar si es necesario a pH 7.4 con necesario, y luego del templado volcar NaOH 1N) en placas de Petri. Dejar solidificar y Autoclavar a 121 oC, 20 min. colocar unas h a 37 oC para eliminar el exceso de humedad y conservar en heladera. Si es necesario el agregado de antibióticos, hacerlo siempre post-autoclavado asegurándose, que el medio se haya templado. Ampicilina: 50 μg/ml

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TP# 6 Cuantificación de Proteínas Introducción Existen dos tipos de métodos que pueden ser empleados para estimar la concentración de proteínas en una muestra: Absorción de luz ultravioleta (UV) Métodos colorimétricos Absorción de luz ultravioleta (UV) Las proteínas absorben activamente la luz de la región ultravioleta con un pico máximo correspondiente a los 280 nm y otro a los 200 nm. El pico de 280 nm corresponde a la absorción de fotones por parte de los electrones de un anillo aromático. Los aminoácidos que tienen anillos aromáticos en su estructura son la fenilalanina, triptofano, histidina y tirosina. Los enlaces peptídicos absorben fotones por debajo de los 210 nm. Sin embargo la longitud de onda de elección es la de 280 nm debido a que son muy pocas las sustancias químicas que la absorben, disminuyendo las posibles interferencias. Los métodos de absorción de luz UV presentan las siguientes ventajas: Se llevan a cabo directamente en la muestra sin necesidad sin agregarle ningún reactivo. Se realizan rápidamente ya que no requieren incubación La relación entre la absorción y la concentración proteica es lineal (se cumple la ley de Lambert – Beer). Métodos colorimétricos Se fundamenta en el agregado de diferentes reactivos químicos que reaccionan con las proteínas dando lugar a un producto coloreado que será medido en el espectro visible, y cuya intensidad es lineal con respecto a la concentración proteica en un rango determinado (esta relación se aleja de la linealidad tanto en las altas concentraciones como en las muy bajas). Existen diferentes métodos que varían no solo en su fundamento sino también en su sensibilidad. La elección de uno u otro será acorde a la muestra biológica problema. Los ensayos colorimétricos siempre se llevan a cabo realizando al mismo tiempo una curva con diferentes diluciones de una solución de una proteína patrón de concentración conocida. Por lo tanto los valores obtenidos son siempre relativos a esta curva de referencia. La misma debe realizarse simultáneamente y en la misma solución empleada para la muestra incógnita, a fin de considerar las posibles interacciones de los reactivos con los componentes de la solución reguladora usada, la descomposición de los mismos, y las posibles variaciones de tiempo y temperatura.

Objetivo ™ Determinación de la concentración proteica de una muestra utilizando el método colorimétrico de Bradford.

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Materiales Solución madre de Albúmina bovina (BSA) Solución ácida del reactivo de color (Coomassie Blue G) NaOH 1 M Agua destilada Tubos de hemólisis Pipetas automáticas Espectrofotómetro Metodología Reactivo de color: Se disuelve 100 mg de Serva Blue G en una mezcla de 100 ml de 85% de ácido fosfórico y 50 ml de etanol 95%, después de la completa disolución del colorante se lleva el volumen a 1 litro con agua. Fundamento del método: El pico de absorción máxima del colorante en una solución ácida, se desplaza desde los 465 nm a los 595 luego del agregado de la proteína, debido a la estabilización de la forma aniónica del colorante por interacciones tanto iónicas como hidrofóbicas. El colorante reacciona principalmente con los residuos de arginina, y en menor proporción con histidina, lisina, tirosina, triptofano y fenilalanina. Procedimiento: Se realizarán previamente las diluciones correspondientes para la curva de calibrado y de las muestras incógnitas. 1- Prender el espectrofotómetro 15 minutos antes de usarlo 2- Poner 20 μl de la muestra en los tubos. Agregar 50 μl de NaOH a la muestra 3- Agregar 1 ml del reactivo de color e incubar durante 5 minutos 4- Medir la absorbancia a la longitud de onda correspondiente en una cubeta de plástico o de vidrio. Importante: Tener en cuenta el Vmin a emplear para cada cubeta, de lo contrario, el haz de luz no atravesará la muestra 5- Obtener la curva patrón (Cc vs A595) y a partir de esta, obtener la concentración de las muestras incógnita.

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Autoevaluación Confección de la curva de calibrado 1- Teniendo en cuenta que el rango de detección para este método va de 0.2 a 20 μg, calcular las diluciones que hay que preparar a partir de una solución madre de BSA de 1mg/ml, para construir una curva de calibrado de al menos 5 puntos. Dilución BSA (concentración)

Volumen a pipetear (μl)

Absorbancia (DO595)

2- ¿Cuál es la longitud de onda a la deberá leer las muestras luego de reaccionar con el reactivo de color? 4-Usted cuenta con una solución de albúmina pura y quiere determinar su concentración. Se le ha acabado el Coomassie y por problemas presupuestarios no puede comprarlo por ahora y no tiene nadie que le preste un poco. Sin embargo cuenta en el laboratorio con un espectrofotómetro que lee hasta 280 nm, cubetas de plástico y de cuarzo. ¿Podrá calcular la concentración de la solución? ¿Qué precauciones debería tener? ¿Podrá hacer lo mismo con una solución mezcla de proteínas? Conclusiones Confeccione un informe graficando la curva de calibración y calcule la concentración de la muestra incógnita. Coinciden los resultados observados con los esperados?.

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Centrifugación La sedimentación de una partícula por acción de la fuerza centrífuga, resulta de la aplicación de aceleración radial por movimiento rotacional. Las partículas más densas que el medio de suspensión se moverán rápidamente hacia la periferia del recipiente que contengan la mezcla sometida a centrifugación. Por el contrario las partículas o el líquido más liviano se moverán rápidamente hacia el interior. La fuerza centrifuga supera a las fuerza difusionales Brownianas que normalmente impiden o previenen la sedimentación de partículas finas por acción de la gravedad, permitiendo obtener la separación en 2 fases de (precipitado “pellet” y sobrenadante) en un tiempo corto. La velocidad de sedimentación Vg de una partícula en un fluido menos denso bajo la influencia de la fuerza gravitacional está dada por la Ley de Stokes

Vg = D 2

δ1 − δ 2 g 18μ

D: diámetro de la partícula δ1: densidad de la partícula δ2: densidad del líquido μ: viscosidad del fluido g: aceleración de la gravedad En una centrífuga g es reemplazada por w2r, donde r es la distancia de la partícula al centro de rotación y w es la velocidad angular de la centrífuga (radianes seg.–1). W = π n/30 n = velocidad rotacional en revoluciones por segundo Por lo tanto, la fuerza centrifuga aumenta la velocidad de sedimentación de Vg a Vs, es decir:

rw2 Vs = Vg g De esta ecuación se puede deducir que la velocidad de sedimentación de una partícula puede aumentar por: 1234-

aumento del diámetro de la partícula (D) aumento de la diferencia entre las densidades de la partícula y el fluido (δ1 - δ2) aumento de la velocidad de centrifugación (w) disminución de la viscosidad del liquido de la suspensión

Además aumentando el tiempo a que la partícula es sometida a la fuerza centrífuga, mayor será el desplazamiento de la misma desde el centro de rotación, de acuerdo a: Vs t = distancia recorrida Esto se logra aumentando el tiempo de centrifugación A bajas velocidades de centrifugación se podrán sedimentar células enteras pero quedarán en suspensión los componentes celulares como núcleos, mitocondrias y restos

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de membranas, a estos habrá que aplicarles, según su tamaño, mayor velocidad de centrifugación para sedimentarlos.

Condiciones de centrifugación 1000 x g, 5 min. 4000 x g, 10 min. 15.000 x g, 20 min. 30.000 x g, 30 min. 100.000x g, 3 h

Fracciones sedimentadas Células, núcleos. Cloroplastos, restos celulares. Mitocondrias, peroxisomas. Lisosomas Ribosomas y polisomas, membranas

La velocidad de centrifugación puede estar definida en g (aceleración de la gravedad) y nos indica cuantas veces la aceleración de la gravedad debo aplicarle a una partícula para que sedimente en determinado tiempo de centrifugación o en rpm (revoluciones por minuto) las cuales dependerán del radio del rotor o radio de giro. Existen tablas que nos indican a cuantas rpm debemos centrifugar una muestra en un determinado rotor para someterla a los g necesarios para sedimentarla. En el caso de las ultracentrífugas, por ej. la velocidad de centrifugación alcanza a los 60000 rpm, que para una partícula localizada a 6 cm del eje rotacional corresponde a una fuerza 250.000 veces mayor que la gravitacional (250000 g) Diferentes tipos de centrífugas La parte fundamental de cualquier centrífuga es el rotor (donde se insertan los tubos conteniendo las muestras), y según el tipo de centrifuga puede poseer además refrigeración y un sistema para producir vacío. Existen diferentes tipos de centrífugas dependiendo de las velocidades de centrifugación: 1) Centrífuga tipo clínica. Para bajas velocidades (0 – 5000 rpm), normalmente se utiliza para separar células, algunas poseen refrigeración. 2) Centrífuga tipo Sorvall. Alcanza hasta 20.000 rpm y poseen refrigeración. 3) Ultracentrífugas. Para altas velocidades de centrifugación (hasta 80.000 rpm), poseen refrigeración y un sistema de vacío para disminuir la fuerza de rozamiento con el aire y lograr altas velocidades. Por otro lado según la finalidad de la centrifugación, las centrífugas pueden ser analíticas o preparativas. a) Las centrífugas analíticas son ultracentrífugas y se trabaja con muestras pequeñas. En general se emplean para determinar el peso molecular de las partículas. b) Las centrífugas preparativas son capaces de trabajar con grandes muestras (10 – 2.000 ml), se utiliza para separar diferentes fracciones subcelulares. Pueden ser tipo Sorvall o Ultracentrífuga.

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TP # 7

Permeabilidad de las Membranas Celulares

Introducción Las membranas biológicas tienen la propiedad de ser semipermeables y selectivas. Las sustancias pueden atravesar la membrana celular por difusión pasiva o por alguno de los mecanismos de transporte activo El transporte de las moléculas depende de su peso molecular, su carga eléctrica y del coeficiente de solubilidad en lípidos. La difusión se produce cuando existe un gradiente de concentración, y ocurre desde el lugar de mayor concentración hacia el de concentración menor. La membrana celular mantiene un balance entre la presión osmótica de los líquidos intracelulares e intersticiales. Las soluciones pueden ser isotónicas, hipotónicas o hipertónicas respecto al líquido intracelular. Objetivos Determinación de la hemólisis y resistencia globulares Materiales

Ratas Heparina ClNa Sacarosa Agua destilada Jeringas y agujas 23 G Alcohol 96% Gradillas con tubos de hemólisis Centrífuga Espectrofotómetro Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos

Metodología Obtener sangre de una rata mediante punción cardiaca con jeringa heparinizada. Preparar una batería de tubos de hemólisis con distintas soluciones de ClNa (5 mL volumen final) , como indica la tabla adjunta. Agregar 50 μl de sangre suavemente en cada tubo. Se agitan suavemente los tubos y se colocan en la gradilla en orden creciente de concentración. Luego de 10 minutos se centrifugan las distintas muestras (1500 rpm, 5 minutos).

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Tabla 1: SOLUCION SOLUTO SOLVENTE CONCENTRACION (NaCl) (AGUA) ml en %

MADRE 1 2 3 4 5 6 7

OBSERVACIONES

9 100 9 100 1:2 1:10 1:2 de 3 1:10 de 3 1:100 de3 Agua

Nota: complete el cuadro. Mr del NaCl = 58,5 Conclusiones Confeccionar un informe luego de observar la turbidez, tonalidad, microscopía de los sedimentos y lectura espectrofotométrica correspondiente al sobrenadante cada tubo (480nm). El mismo debe contener resultados obtenidos y conclusiones. Autoevaluación 1) Esquematice la estructura de la membrana plasmática. Mencione brevemente la función de cada uno de sus componentes. 2) Explique los mecanismos por los cuales son incorporados los siguientes elementos a las células considerando los componentes de la membrana involucrados y el requerimiento energético: glucosa, Na+, agua, bacterias, hormonas esteroideas, glicerol, Cl-, micropartículas inertes.

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Cultivo de Tejidos Se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células “in vitro”, conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Se podría hablar de tres tipos de cultivos: Cultivo de órganos: implica que la arquitectura característica del tejido “in vivo” se mantiene al menos en parte. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena replica del tejido de origen, aunque no permite su propagación. Explantes primarios: Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en el que proliferan las células de la periferia del explante. Cultivo de células: Supone una disgregación celular por medios enzimáticos o mecánicos. Este tipo de cultivo puede propagarse, aumentando la masa celular del mismo. Una vez que el cultivo se ha propagado por algunas generaciones, éste pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea ya que predominan en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento. CULTIVO PRIMARIO: cultivo de células provenientes de la disgregación de un tejido original tomado de algún órgano animal. Este tipo de cultivo se caracteriza por conservar la morfología celular de origen, ser diploides, poseer un crecimiento celular“in vitro” limitado y por tener inhibición por contacto (ej: hepatocitos, neuronas). Aquellos cultivos primarios que proliferan “in vitro” pueden ser replaqueados o subcultivados. Cuando esto ocurre se establece una LINEA CELULAR PRIMARIA o FINITA, con características similares a las del cultivo primario. En una línea primaria el cultivo se estabiliza y presenta mayor homogeneidad, ya que el tipo celular con mayor tasa de crecimiento desplaza a los otros tipos celulares. (Generalmente existen medios de cultivo selectivos para el tipo celular de interés). Tanto los cultivos primarios como las líneas primarias tienen un tiempo de vida limitado, finalmente las células entran en una fase de senescencia, con acumulación de numerosas anormalidades, perdida de funciones especializadas, etc. que conducen a la muerte del cultivo. (ej: fibroblastos, HUVEC) Ocasionalmente una línea primaria puede mantenerse en cultivo por más generaciones de las esperadas, esto se debe a la aparición en el cultivo de células inmortales. Estas células forman cultivos estables o LINEAS CELULARES CONTINUAS o

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INFINITAS. La razón de la inmortalización de estas células en muchos casos es desconocida generalmente están relacionadas con la perdida espontánea o inducida de las vías de control del ciclo celular. Las líneas celulares continuas están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de células derivadas de tumores o de una línea primaria que ha sido transformada mediante la transfeccion de oncogenes o el tratamiento con carcinogénicos. Este tipo de cultivo tiene la característica de ser aneuploide, de no tener inhibición por contacto y de crecer de manera indefinida. Entre las líneas mas conocidas se encuentran las HeLa, K-562, Meg-01. Condiciones de Cultivo Recipientes de cultivo: placas de petri, multiplacas, etc. Sustrato: Muchas líneas celulares crecen en monocapas unidas a un soporte más o menos sólido (vidrio, superficies plásticas, superficies tratadas con colágeno, fibronectina o gelatina). Aquellas líneas que para proliferar necesiten adherirse se conocen como dependientes de anclaje, las líneas que crecen en suspensión son por lo tanto independientes de anclaje. Fase gaseosa: a) Oxígeno: Las necesidades de oxigeno de la mayoría de los cultivos esta cubierta por la presión atmosférica de este gas. b) Dióxido de Carbono: Este gas es fundamental porque influye en la cantidad de CO2 disuelto el pH y la cantidad de iones HCO3Las reacciones que tienen lugar son: H2O + CO2 ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3- (1) NaHCO3 ⇔ Na+ + HCO3- (2) El incremento de la concentración del ion HCO3- desplaza la ecuación (1) hacia la izquierda de modo que el pH se establezca en 7.4. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y presión de CO2 para alcanzar el pH correcto. pH y capacidad buffer: El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de los tipos celulares es 7.4. El indicador de pH que se suele usar es rojo fenol. El medio de cultivo debe tener capacidad buffer, a fin de evitar cambios bruscos de pH. El sistema buffer mas utilizado es el del bicarbonato Temperatura

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Medio de cultivo: formado por los siguientes elementos: 1. Soluciones salinas equilibradas 2. Aminoácidos 3. Vitaminas 4. Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular 5. Hormonas y factores de crecimiento (suero) 6. Antibióticos y antifúngicos. Algunos de los medios mas utilizados son: Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM); RPMI 1640, MEM modificado (DMEM); Medio 199. Los medios no definidos son aquellos que deben ser suplementados con suero. Alguno de los mas empleados son: suero de ternera (calf serum, CF), fetal bovino (fetal calf serum, FCS); suero de caballo (horse serum, HS); y suero humano (Human serum, HuS). A pesar que la composición del suero es conocida, los componentes presentes pueden tener concentraciones variables que podrían influir en el cultivo. El tipo de medio de cultivo y como será suplementado depende de los requerimientos de la línea celular a cultivar. Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno celular como: actividad intracelular, ecología e interacciones celulares. Dentro de las áreas de estudio que más utilizan este tipo de tecnología se encuentran la virología, inmunología y aquellas disciplinas dedicadas a la investigación del cáncer.

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La Fagocitosis: Reseña histórica

En 1908, 20 años después de su incorporación al Intituto Pasteur, Elie Metchnikoff (1845-1916) compartió el premio Nobel en Fisiología & Medicina con Paul Ehrlich. Este premio fue otorgado a Metchnikoff por su descubrimiento de la fagocitosis como base de la inmunidad mediada por células y a Ehrlich por sus estudios en anticuerpos e inmunidad humoral. Metchnikoff contempló el proceso de fagocitosis dentro del amplio concepto de “Harmony and Disharmony” que describía la compleja relación entre los patógenos y sus hospedadores.

Introducción Los macrófagos pulmonares constituyen la primera línea de defensa del organismo evitando la entrada de una gran variedad de sustancias como: gases atmosféricos, partículas de polvo, aerosoles y microorganismos. A pesar del gran número de partículas infecciosas que son depositadas continuamente sobre las paredes alveolares del pulmón, su superficie generalmente se encuentra estéril. El poder bactericida del pulmón se debe al potencial fagocítico y lítico (proteasas, elastasas, etc.) de los macrófagos alveolares. Estas

Cien años después, la importancia del legado de Metchnikoff es más que evidente. Metchnikoff propuso que la fagocitosis era un mecanismo antigüo que se originó en los metazoos primitivos y que los proveyó de un sistema de defensa operativo de rápida acción contra los microorganismos. Hoy sabemos que los fagocitos también juegan un rol crucial en la inmunidad adaptativa de los organismos superiores, reconciliando así la inmunidad celular de Metchnikoff con la inmunidad humoral de Ehrlich. (2008; 120 aniversario, Institut Pasteur).

células ingieren el material extraño que llega al pulmón mediante el proceso de fagocitosis. Muchos patógenos infectan y replican dentro de los macrófagos, interfiriendo con los procesos celulares que eliminan a la mayoría de los microorganismos. En el siguiente sitio de la revista Nature, se muestran estos eventos en Listeria monocytogenes, Legionella pneumophila y M. tuberculosis: http://www.nature.com/nrmicro/ani mation/imp_animation/allthree_qt.m ov

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TP # 9 Fagocitosis de partículas por macrófagos alveolares Objetivos Objetivo 1. Obtener una población casi homogénea de macrófagos alveolares mediante lavado bronqueoalveolar (BAL) Objetivo 2. Estudiar el fenómeno de fagocitosis “in vitro” a distintas temperaturas. Objetivo 3. Cuantificación Celular: empleo de cámara de Neubauer Materiales

Ratas, ratones o hámsters Anestésico Cánulas nasofaringeas de polietileno Jeringa PBS y PBS libre de Ca+2 Mg+2 Material de cirugía Tubos de centrífuga Centrífuga de mesa Medio de cultivo Dulbecco o RPMI – 1640 Partículas de hierro Cápsulas de Petri Baño termostatizado o estufa a 37ºC Alcohol 96% Colorante vital azul de tripán o rojo neutro Colorante hematoxilina Microscopio óptico Cámara de Neubauer

Metodología ¾ Obtención de los macrófagos: Anestesiar al animal, exponer la tráquea e introducir una cánula adosada a una jeringa de 3ml que contenga PBS libre de Ca+ Mg+. Masajear suavemente la caja toráxica y recuperar la solución. Descartar este primer lavado alveolar. Repetir el procedimiento y guardar la solución recuperada en un tubo de centrífuga. Repetir este procedimiento 1012 veces. Centrifugar el material recolectado 10 minutos a 800 x g. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio RPMI-1640 y contar el número de células. Evaluar la viabilidad celular de los macrófagos alveolares obtenidos utilizando algún colorante vital. Sembrar las células en cápsulas de Petri e incubar en cámara de cultivo (37ºC, 5 % CO2). ¾ Exponer los cultivos celulares a las a partículas previamente sonicadas. El volumen a utilizar de la suspensión será indicado por los docentes. ¾ Incubar 1 h a 4°C, 20°C (T ambiente) y a 37°C. ¾ Descartar el medio, lavar las células con PBS y fijarlas con alcohol 96%. Teñir las células con hematoxilina ¾ Observar bajo microscopio. Nota 1: Partículas: Alternativamente se emplearan particulas de hierro, carbon o material derivado de la polución en el aire (ceniza residual de combustibles), denominado ROFA (residual oil fly ash).

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Análisis de Resultados - Graficar el número de células que incorporaron partículas de hierro vs las distintas temperaturas. Confeccionar un informe final analizando los resultados obtenidos.

Nota 2: Como consecuencia de los tiempos necesarios para el establecimiento del cultivo de macrófagos, los alumnos recibirán las cajas de Petri conteniendo células extraídas previamente. Durante la práctica, se realizará un BAL en animales de laboratorio, tal como indica el protocolo descripto. Las células obtenidas por los alumnos, serán utilizadas para evaluar el rendimiento de dicho protocolo mediante la cuantificación celular utilizando la cámara de Neubauer.

Autoevaluación -Complete el siguiente cuadro referido a los procesos involucrados en el transporte de sustancias hacia y desde el interior de la célula. Características

Ejemplo del elemento transportado

Difusión Fagocitosis Endocitosis ¿Cuáles son las características estructurales y funcionales de los filamentos intermedios? Señale los principales grupos en que fueron clasificados. Mencione qué técnicas utilizaría para visualizar microtúbulos y microfilamentos. Objetivo 3 Evaluar el rendimiento del protocolo de BAL mediante la cuantificación celular utilizando la cámara de Neubauer. Materiales -Cámara de recuento/ cámara de Neubauer/ hemocitómetro -Microscopio -Suspensión celular Procedimiento: -Realizar una dilución de la muestra utilizando en colorante azul de trypan. -Cargar la cámara con una micropipeta como se indica en la figura.

-

.

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Recuento Celular

Cada cuadrado del hemocitómetro (16 cuadrados menores) representa un volumen total de 0.1 mm3 o 10-4cm3. Como 1 cm3 es aproximadamente equivalente a 1 ml, la concentración celular por ml (y el número total de células) se determina realizando los siguientes cálculos: Células por ml: El promedio de células por cuadrado x el factor de dilución x 104 Células totales: Células por ml x el volumen original de la muestra Responda: Si el promedio de células por cuadrado es de 25 y para poder contar realizó una dilución 1/20: Cuántas células por ml recuperó de un BAL en rata?. Si recuperó un volumen de lavado de 5 mL: cuántas células totales obtuvo?

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TP # 10 División Celular: Mitosis División Celular El crecimiento, reparación y renovación de todos los organismos multicelulares depende de la formación de nuevas células a través de la división de las células preexistentes. Existen dos mecanismos para la división celular: la mitosis en las células somáticas y la meiosis en las células germinales. Ambas formas de división presentan muchas características comunes, aunque difieren en el comportamiento de los cromosomas durante las fases iniciales de la división. Mitosis: La división mitótica da lugar a dos células hijas que poseen copias idénticas del genoma de la célula original. El ADN se replica antes del inicio de la división celular (periodo S). El periodo entre los episodios sucesivos de división celular se denomina interfase. La secuencia de acontecimientos que ocurren durante la mitosis se ha dividido en cinco fases: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. Objetivo ™ Observar las distintas fases de la mitosis en meristema apical de raíz de cebolla (Allium cepa)

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División Celular: Meiosis Como hemos visto en el TP anterior la mitosis da como resultado la formación de dos núcleos hijos, cada uno de los cuales recibe una copia exacta de los cromosomas de las células progenitoras. Durante la meiosis cada núcleo diploide se divide dos veces produciendo un total de cuatro núcleos, cada uno de los núcleos contiene la mitad del número de cromosomas presentes en el núcleo original. Los núcleos haploides obtenidos durante la meiosis contienen nuevas combinaciones de cromosomas. Los cromosomas homólogos derivados originalmente de los padres del organismo están distribuidos al azar entre los cuatros nuevos grupos haploides. La meiosis consiste en dos divisiones nucleares sucesivas: Meiosis I y Meiosis II En la Meiosis I los cromosomas homólogos se aparean y luego se separan (etapa reduccional). Las etapas de la Meiosis I son: profase I, prometafase I, metafase I, anafase I y telofase I. En la Meiosis II se separan las cromátides de cada homólogo. Las etapas se denominan: profase II, prometafase II, metafase II, anafase II y telofase II. La profase II no está precedida por la duplicación del material genético. Objetivo ™ Esquematizar las diferentes fases de la meiosis en cortes histológicos de testículo de rata y/o vizcacha.

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El ADN: Reseña histórica El ácido desoxiribonucleico (ADN) fue aislado por primera vez en 1869 por el científico suizo Friedrich Miescher. Para finales de los 1940s, los científicos conocían la composición del ADN: fosfato, azúcar y cuatro “bases” que contenían nitrógeno (adenina, timina, guanina y citosina). Gracias a los experimentos de Frederick Griffith y Oswald Avery, se sabía que el ADN era la molécula de la herencia de los caracteres, planteada por Gregor Mendel en el siglo anterior. Los experimentos de Erwin Chargaff, mostraron que la cantidad de adenina en una célula era

casi idéntica a la cantidad de timina, asimismo, la cantidad de guanina era comparable a la cantidad de citosina (A=T, y G=C). Sin embargo, nadie imaginaba la estructura de la molécula. En 1953, Linus Pauling sostuvo que había descubierto la estructura del ADN, sin embargo cuando Watson vio el trabajo de Pauling, que aún no se había publicado, supo que no era correcto. Unos días después, llegó a las manos de Watson una fotografía de difracción de rayos X tomada a partir de cristales de ADN por Rosalind Franklin. Más tarde Watson escribía:

"The instant I saw the picture, my mouth fell open and my pulse began to race" Watson, The Double Helix (1968).

El descubrimiento de la doble hélice fue publicado en Nature el 25 de Abril de 1953 'A Structure for Deoxyribonucleic Acid' by Watson, J.F., and Crick, F.H.C. Los autores comprendieron que del modelo de apareamiento de bases específico que proponían, se desprendía directamente un posible mecanismo de copiado del material genético. En 1962, Watson and Crick recibieron el premio Nobel de Fisiología y Medicina, junto a Maurice Wilkins, quien había publicado junto a R. Franklin el importante trabajo de cristalografía, en el mismo número de Nature. Rosalind Franklin, cuya fotografía dió un indicio importante a Watson, murió en 1958. Los científicos se preguntan si hubiese sido distinguida con el premio si hubiera estado viva. La primer ADN polimerasa, la ADN polimerasa I de E. coli, fue descubierta en el año 1955 en el laboratorio de Arthur Kornberg. “Discovery of DNA polymerase”. Lehman, 2003 disponible en http:// www.jbc.org

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Extracción de ADN Introducción Mediante la utilización de distintos protocolos se puede obtener ADN de al menos tres clases diferentes. 1. ADN cromosómico celular Este ADN celular puede ser obtenido a partir de un cultivo de bacterias, de plantas, de células animales o de cualquier otro tipo de organismo que este siendo estudiado. 2. ADN plasmídico. La preparación de ADN plasmídico a partir de un cultivo de bacterias sigue los mismos pasos básicos de purificación de ADN cromosómico celular, con la crucial diferencia que en algunos pasos, el ADN plasmídico debe ser separado del ADN cromosómico, que también está presente en la célula bacteriana. 3. ADN de bacteriófagos o fagos (virus que infectan bacterias), ampliamente usado como vehículo de clonado. Fundamentos de la extracción de ADN celular Los procedimientos para la preparación de ADN cromosómico a partir de un cultivo celular bacteriano pueden ser divididos en 4 etapas: 1) 2) 3) 4)

Cultivo y recolección. Lisis celular. Eliminación de los restos celulares. Concentración de ADN puro.

Luego se centrífuga para eliminar el sobrenadante que contiene el medio de cultivo, y se continua con el pellet, que contiene las bacterias. 2-Lisis celular: Todos las células bacterianas están rodeadas por una rígida pared celular. Para liberar los componentes celulares de estas barreras, se utiliza la lisis química. Esta lisis química, suele involucrar un agente que ataca a la pared y otro que rompe la membrana. 3-Eliminación del debris celular: Este proceso puede llevarse a acabo por centrifugación, dejando el extracto celular como un sobrenadante claro que contiene ADN; ARN; y algunas proteínas y el pellet con restos de membrana celular. Los procedimientos estándar para eliminar los contaminantes del ADN son los siguientes: 1. Para eliminar las proteínas se adiciona una mezcla de fenol: cloroformo (1:1) que producen la precipitación de las proteínas, pero dejan a los ácidos nucleicos (ADN y ARN) en solución acuosa. 2. Para eliminar ARN, se trata la muestra con la enzima RIBONUCLEASA (RNAsa). Ésta degrada rápida y completamente todas las moléculas de RNA hasta dejarlo reducido a sus subunidades ribonucleotídicas.

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En este punto hay que hacer una importante distinción entre la purificación de ADN cromosómico y la purificación de ADN plasmídico: en una preparación de plásmido, siempre es necesario separar el ADN plasmídico de la gran cantidad de ADN cromosómico bacteriano que está también presente en las células. Actualmente existen varios métodos para la separación de ambos tipos de ADN, basados en diferencias físicas entre el ADN plasmídico y al ADN cromosómico. De estas diferencias, la más utilizada es el tamaño. Los plásmidos más grandes son solamente el 8% del tamaño del cromosoma de E. coli, y la mayoría de los plásmidos son mucho más pequeños. Generalmente se utilizan técnicas como la lisis alcalina, esta condición desnaturaliza los ácidos nucleicos, luego por tratamiento renaturalizante el ADNp se renaturalizará mas rápida y eficientemente que el ADNc debido a la diferencia de tamaño entre ellos, permitiendo su separación, pudiéndose obtener de modo efectivo ADN plasmídico. 4-Concentración de ADN puro: generalmente la concentración de ADN obtenida luego de los pasos arriba mencionados es baja. Para concentrarlo se utiliza más frecuentemente la precipitación con etanol o isopropanol. En presencia de sal y a una temperatura de –20ºC o menos, el etanol absoluto precipita eficientemente los polímeros de ácidos nucleicos. El precipitado puede ser recolectado por centrifugación, eliminación del sobrenadante y resuspensión del pellet en un volumen adecuado de agua o buffer.

Qué son los Plásmidos? Además de un cromosoma, las células bacterianas, habitualmente contienen plásmidos. Estos son moléculas de ADN que están presentes en prácticamente todo tipo de bacterias y juegan un rol crítico en la capacidad de adaptación y en la evolución de las mismas. Su replicación es autónoma y aunque no este sincronizada con la del cromosoma, depende de factores del hospedador para llevarse a cabo. El número de copias de plásmidos por célula es variable y depende de las características del mismo (plásmidos de alto o bajo número de copias) y a su vez, una misma célula puede contener más de un tipo de plásmido. Al igual que los cromosomas, los plásmidos codifican para ARN y proteínas, pero, sin embargo, no codifican para funciones esenciales del crecimiento bacteriano. En cambio, proveen productos que pueden beneficiar a la bacteria bajo circunstancias especiales; por ejemplo, sobrevivir en condiciones adversas del medio o competir con otros microorganismos que ocupan el mismo nicho ecológico.

TP # 11: Protocolo de Extracción de ADN genómico A-Soluciones: 1- Buffer TE 10 X: EDTA Tris-HCl 100mM pH 8,0 2- Dodecil sulfato de sodio (SDS) 10% 3- Proteinasa K, 10 mg/mL 4- Cloroformo/alcohol isoamílico 24:1 5- NaCl 5M 6- Isopropanol B- Materiales 1- Cultivo en fase exponencial E. coli DH5α 58

2- Tubos eppendorf de 2 mL: 3 por grupo 3- Baño termostatizado regulado a 65° C 4- recipientes con hielo granizado 5- guantes 6- pipetas automáticas 7- capilares o varillas de vidrio Previo al inicio del protocolo: Preparar el baño a 65°C, dispensar 2mL del cultivo en los tubos eppendorf. Sellar uno de los extremos de los capilares (se usará 1 por grupo). Poner en hielo o congelador el isopropanol. Tener preparado por cada grupo un tubo con 200 uL de buffer TE 1X. Procedimiento 1) Centrifugar por 2 min los tubos con células. Descartar el SN y eliminar las trazas de medio en papel absorbente. 2) Resuspender el pellet en 400 uL de buffer TE, asegurándose de que no queden grumos. 3) Agregar 50 uL de SDS 10 % y 10 uL de PK, mezclar el tubo por inversión e incubar 20 min a 65°C (la suspensión se torna transparente). 4) Agregar 100 uL de NaCl, mezclar. 5) Agregar 600 uL de Cloroformo/alcohol isoamílico. Mezclar repetidas veces por inversión hasta tener una solución homogénea (1 fase) y blanquecina. 6) Centrifugar a 12.000xg por 10 min (se forman dos fases). 7) Transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo. Hacerlo cuidadosamente con pipeta, evitando levantar la capa blanquecina que se encuentra en la interfase. 8) Agregar suavemente con pipeta 400 uL de isopropanol frío (evitando que se mezclen las fases). 9) Introducir suavemente un capilar en el tubo hasta la interfase y realizar muy suavemente movimientos circulares en la interfase, y comenzarán a visualizarse las hebras de ADN de color blanquecino. 10) Pese a que la idea es que por los movimientos circulares y la carga de la varilla, el ADN se enrolle a esta; esto es difícil de lograrlo en microtubos. Por lo tanto, luego de haber realizado esta observación, retirar la varilla, cerrar el tubo e invertir cabeza-cola unas 15-20 veces. De esta manera el ADN formará una masa algo más compacta y visible. Abrir el tubo, y con la misma varilla, retirar el ADN, colocándolo suavemente, agitando la varilla en un tubo conteniendo EDTA 1X. 11) Conservar a 4 °C para permitir su completa resuspensión.

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ELECTROFORESIS: Geles de Agarosa INTRODUCCIÓN En una separación electroforética, las partículas cargadas, migran en un medio determinado con dirección al electrodo de signo opuesto. Esto ocurre, bajo la influencia de un campo eléctrico externo, aplicado en una corrida electroforética. Los movimientos de las partículas son retardados por la interacción con una matriz sólida, porosa e inerte en la que están inmersas, la cual, actúa como un tamiz. Todo este fenómeno, se lleva a cabo a su vez, en un medio acuoso (buffer) con iones que transmiten la corriente eléctrica. La oposición de la interacción eléctrica y del tamiz molecular resulta en una velocidad de migración diferencial que permite separar los componentes de una mezcla de macromoléculas (tanto ácidos nucleicos como proteínas), basándose en el tamaño, forma y carga neta de las macromoléculas. Una electroforesis puede realizarse en geles de agarosa o en geles de poliacrilamida dependiendo del material a resolver. La agarosa es un polímero lineal de hidratos de carbono, extraído de un alga marina, los geles se preparan fundiendo la agarosa en el buffer elegido. Los geles de poliacrilamida se generan por la polimerización de la acrilamida y la bis-acrilamida mediada por un catalizador. Ambos métodos son utilizados para la separación, identificación y purificación de fragmentos de ADN. En el caso de los geles de poliacrilamida también se utilizan para separar proteínas a partir de un extracto celular. La técnica es simple y rápida de realizar, es capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse por otros métodos. Además, la localización del ADN dentro del gel puede determinarse directamente mediante tinciones con bajas concentraciones de un colorante fluorescente intercalar, llamado: Bromuro de Etidio (BrEt). Así, las bandas que contengan tan solo de 1 a 10 ng de ADN podrán ser visualizadas por examen directo del gel bajo luz ultravioleta. Si resulta necesario las bandas pueden recuperarse del gel para ser utilizadas posteriormente con otros propósitos. Los geles pueden confeccionarse de varias formas, tamaños y porosidad, y pueden correr horizontales los agarosa y verticales los de poliacrilamida, en un campo eléctrico de fuerza y dirección constante. La elección dentro de estos parámetros depende principalmente del tamaño de los fragmentos que se desean separar. Los geles de poliacrilamida son más efectivos para separar fragmentos pequeños de ADN (5 a 500 pb), y su poder de resolución es extremadamente grande, pudiendo separar fragmentos que difieren en 1 pb. Los geles de agarosa, poseen un poder resolutivo menor respecto de los geles de poliacrilamida, pero poseen un rango mayor de separación. Mediante concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50 kb de longitud.

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Factores que afectan la tasa de migración del ADN en geles de agarosa 1) Tamaño molecular del ADN Las moléculas de ADN de doble cadena, migran a través de la matriz del gel, a tasas que son inversamente proporcionales al número de pares de bases que ellas contienen. En consecuencia, las moléculas más grandes, migran mucho más lentamente debido a que sufren una gran fricción y resistencia. 2) Concentración de Agarosa Un fragmento lineal de ADN, de un tamaño determinado, migra a diferentes tasas a través de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa. A medida que se aumenta la concentración de agarosa, los poros formados en la matriz del gel de agarosa disminuyen en tamaño. Así, mediante la utilización de geles con diferentes concentraciones de agarosa, es posible resolver un amplio rango de tamaños de moléculas de ADN. 3) Conformación del ADN La molécula de ADN puede presentarse en varias conformaciones. En primer lugar, puede estar en su forma lineal como existen en los eucariotas. En segundo lugar, también existen moléculas de ADN circulares, las cuales pueden presentar varias formas dependiendo del superenrrollamiento que posean o debido a la presencia de algún “nick” en la doble hélice. De este modo, si tenemos las diferentes formas de ADN, pero del mismo tamaño molecular, las tasas de migración de las diferentes formas a través del mismo gel serán distintas. 4) Voltaje aplicado A bajo voltaje, la tasa de migración de fragmentos lineales de ADN, es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, a medida que la fuerza del campo eléctrico se incrementa, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto PM incrementa diferencialmente; por lo tanto, el rango efectivo de separación en geles de agarosa decrece cuando el voltaje se incrementa. 4) Dirección del campo eléctrico, composición de bases y temperatura El comportamiento del ADN en geles de agarosa, a diferencia de lo que ocurre con los geles de poliacrilamida, no esta afectado significativamente por su composición de bases ni por la temperatura a la cual se corre el gel. Por lo tanto, en geles de agarosa en un campo eléctrico de dirección constante, la movilidad electroforética de fragmentos de ADN de diferentes tamaños no cambia entre 4 ºC y 30 ºC.

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6) Presencia de colorante intercalares: El BrEt, es el colorante fluorescente utilizado para detectar ADN en geles de agarosa y poliacrilamida. Afecta la tasa de migración reduciendo la movilidad electroforética del ADN lineal en un 15%. El colorante se intercala entre las bases apiladas de las moléculas de ADN haciéndolas mas rígidas, lo cual, produce la disminución de la movilidad. “El bromuro de etidio es un agente altamente mutagénico y debe manipularse con mucho cuidado, utilizando guantes. Todas las soluciones conteniendo BrEt deben decontaminarse (con carbón activado) antes de ser descartadas”. 7) Composición del buffer de corrida: La movilidad electroforética del ADN, está afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (por ejemplo si se omitiera el buffer de corrida por error) la conductividad eléctrica seria mínima y el ADN no migraría o lo haría muy lentamente. Por otro lado, en buffers con elevada fuerza iónica (por ejemplo, si se utiliza un buffer de corrida al 10X) la conductividad eléctrica es muy eficiente, generándose calor, pudiéndose alterar la matriz y desnaturalizarse el ADN. Existen diferentes buffers de corrida electroforética de ADN de doble cadena, entre otros el TAE (Tris Acetato + EDTA), TBE (Tris Borato + EDTA) y TPE (Tris Fosfato+EDTA). Generalmente en las corridas es necesario utilizar “marcadores de peso molecular”. Estos, son fragmentos de ADN de tamaño conocido, obtenidos comercialmente, y que deben sembrarse en el gel en un pocillo vecino al de la muestra y deben correrse conjuntamente. Esto facilita la determinación del tamaño de los fragmentos de ADN contenidos en la muestra, por comparación de las bandas de la muestra con los marcadores de peso molecular. Geles de agarosa : corrida Una vez efectuada la siembra de todas las muestras, se procede a tapar la cuba de electroforesis y a conectar los cables correspondientes para aplicar el voltaje deseado. Así el ADN migrará hacia el ánodo (rojo). El voltaje aplicado será de 1-5V/cm (medido como la distancia entre los electrodos). Si los electrodos se colocaron correctamente, se formarán burbujas en el ánodo y el cátodo y en unos pocos minutos el azul de bromofenol comenzará a migrar desde el lugar de siembra. El gel se corre, generalmente, hasta que el “frente de corrida” (formado por los colorantes del loading buffer) haya migrado una distancia apropiada a través del mismo. La presencia de BrEt permite que el gel pueda ser examinado bajo luz U.V. en cualquier momento durante la corrida. En principio, la corrida puede efectuarse en presencia o en ausencia del BrEt tanto en gel como en buffer. Si se efectúa en ausencia del colorante, es necesario teñir el gel una vez finalizada la electroforesis (sumergiendo el gel en una solución de BrEt (0.5μg/ml en buffer de corrida al 1X)

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Geles de Agarosa: Visualización del ADN La visualización del ADN en geles de agarosa teñido con el colorante fluorescente bromuro de etidio, es debido, a que el grupo planar de esta molécula se intercala entre las bases apiladas del ADN. La posición fija de este grupo y su cercanía a las bases causa la unión del colorante al ADN que muestra una fluorescencia comparablemente mayor a aquella que posee el colorante libre en solución. La radiación U.V. a 254nm es absorbida por el ADN y transmitida al colorante, por otro lado la radiación a 302nm y 366nm es absorbida por el colorante unido al ADN. En ambos casos, la energía es re-emitida a 590nm en la región del rojo-naranja del espectro visible. En consecuencia, dado que la fluorescencia impartida por el complejo ADN: BrEt es mayor a aquella emitida por el colorante libre, es posible detectar pequeñas cantidades de ADN en presencia de BrEt libre en el gel. Así, como la unión del BrEt al ADN es directamente proporcional, la intensidad de la banda nos puede dar una estimación de la cantidad de ADN presente en la muestra. Esto implica, que a mayor concentración de ADN, la banda observada tendrá una luminosidad mas intensa.

NOTA: El BrEt se utiliza para la visualización tanto de ADN como de ARN simple o doble cadena. No obstante, la afinidad del colorante por los ácidos nucleicos de simple cadena es menor y por lo tanto la fluorescencia impartida es más pobre.

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TP #12 Análisis del ADN Objetivo ™ Evaluar el rendimiento de la extracción de ADN ™ Evaluar la integridad del producto obtenido ™ Evaluar la copurificación de otros ácidos nucleicos PREPARACION DE GEL DE AGAROSA AL 1% 1. Pesar 0.5 gr. de agarosa 2. Diluir en 50 ml de TAE 1X 3. Calentar en microondas hasta disolver. Luego, enfriar a 60 ºC aprox. 4. Volcar en el molde o cama, previamente obstruidos sus bordes y colocado el peine. Evitar la presencia de burbujas. Dejar solidificar unos minutos a temperatura ambiente. 5. Llenar la cuba con buffer TAE 1X 6. Una vez solidificado el gel, (quitar la obstrucción y el peine del gel) y sumergirlos en la cuba. Dejar equilibrar unos minutos. 7. Mezclar en un parafilm 5 ul muestra + 5ul loading buffer. Sembrar con micropipeta P20 en el gel. 8. Conectar la cuba a la fuente de energía y correr 5minutos a 90 V, luego 15 minutos a 65 V. 9. Visualizar exponiendo el gel a la luz U.V.

Solución Stock Buffer TAE 25X • • •

121 gr. Tris-base 28.55ml. ácido acético glacial 50 ml 0.5 M EDTA (pH: 8)

Nota 1: El BrEt, en esta práctica se encuentra mezclado en el loading buffer para mayor seguridad. Es de suma importancia usar guantes durante la práctica. Nota 2: Los loading buffers son utilizados para: 1. Incrementar la densidad de la muestra, con lo cual evita que el ADN difunda en el buffer en el momento de la siembra, además facilita la carga de la muestra en cada pocillo. 2. Otorgar color a la muestra. Poseen colorantes que en un campo eléctrico migran hacia el ánodo a tasas predecibles independientemente de la concentración de agarosa.

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Electroforesis: Geles de Poliacrilamida

PAGE (PoliacrylAmide Gel Electrophoresis)

Introducción La separación electroforética de proteínas ha sido introducida en los años 1960s por Samuel Raymond. Modificaciones posteriores como la utilización de SDS y un agente reductor como el -mercaptoetanol han optimizado esta técnica, convirtiendo al SDS-PAGE en una de técnicas más utilizadas en la actualidad para estudios bioquímicos y de biología molecular. Básicamente, la técnica consiste en someter a una muestra compleja a un campo eléctrico que se establece entre un par de electrodos de platino a través de una solución acuosa. La muestra migrará en una matriz (poliacrilamida) de acuerdo a distintas propiedades, tal como se explica a continuación. Las proteínas son moléculas anfotéricas, su carga neta está determinada por el pH del medio. De esta manera, en una solución con un pH por encima de su punto isoeléctrico, la proteína tiene carga neta negativa y migra hacia el ánodo (+). Contrariamente, debajo su punto isoeléctrico, está positivamente cargada y migra hacia el cátodo (-).

La carga por unidad de masa difiere de proteína en proteína. A un pH determinado y bajo condiciones nativas, la separación electroforética de proteínas está determinada por el tamaño y la carga de las moléculas. Casi la totalidad de las electroforesis de proteínas analíticas se realizan bajo condiciones que aseguran la disociación de de las proteínas en sus subunidades polipeptídicas individuales y que minimizan su agregación (condiciones desnaturalizantes). Comúnmente se emplea el detergente aniónico SDS en combinación con un agente reductor y calor para disociar las proteínas antes de su siembra en el gel. El polipéptido desnaturalizado une al SDS y queda homogéneamente cargado. Como la cantidad de SDS unido es proporcional al peso molecular del polipéptido e independiente de su secuencia, el complejo SDS-polipéptido migra a través del gel de poliacrilamida de acuerdo al tamaño (ver figura). Como la distancia de migración está relacionada con la masa molecular del polipéptido, entonces el SDS-PAGE no solo separa una mezcla compleja de proteínas en bandas individuales, sino que también permite estimar la masa molecular de cada banda que representa un polipéptido.

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Los geles son preparados utilizando armadores especiales donde se monta el dispositivo de la figura de más abajo. Se vuelcan las soluciones de gel separador (A) y posterior a la polimerización se vuelca sobre éste, el gel concentrador (B) y se coloca el peine que formará los lugares de siembra (wells). Una vez polimerizado el gel, el peine se retira. Se muestra también una cuba donde se coloca el gel, se siembra la muestra, se cubre con el buffer de corrida y se conecta a la fuente de poder. Los modelos varían de acuerdo al fabricante.

Cátodo Peine Well/calle Vidrio posterior Spacer (entre los 2 vidrios) Vidrio anterior

A

B

Compartimento para buffer

Ánodo

Para realizar la calibración de cada gel, se utilizan estandares de peso molecular (marcadores de peso molecular), que son mezcla de proteínas de masa molecular conocida. Esto ayuda a estimar la masa de las bandas incógnita. La unidad de masa se denomina Dalton (Da). La figura siguiente, muestra la resolución de una muestra de proteínas en geles con distinta concentración de poliacrilamida. La densidad del gel establece un rango de masas moleculares que serán resueltas de manera óptima en una corrida. Para la visualización se realizó una tinción con azul de Coomassie.

MPM

60 kDa >

7%

10%

12 %

TP # 13 Separación de Proteínas Objetivo: ™ Evaluar distintas muestras de proteínas mediante SDS-PAGE ™ Analizar semicuantitativamente la concentración de una muestra conteniendo una proteína purificada 1. Obtención del extracto celular de de proteínas bacterianas. Se obtendrán las proteínas totales mediante la lisis térmica de bacterias. Los docentes entregarán dos cultivos crecidos de dos especies bacterianas distintas. Con el fin de obtener las proteínas a partir de un mismo número de células, se procederá como se indica: -Medir la DO600 de los cultivos y ajustar la concentración celular a 10 % de transmitancia. -Tomar 1 mL de estas suspensiones bacterianas y peletear las células por centrifugación (5 min, 10.000xg). Resuspender en 100 L de PBS -Agregar 100 L de buffer de siembra 2X (cracking buffer) y someter a 100 ºC las muestras por 5 min utilizando un baño de agua. Reservar en hielo hasta la siembra de los geles. 2. Semicuantificación de la concentración de proteínas de una muestra Se sembrará en un gel una curva patrón (de concentración conocida) y la muestra incógnita. Las muestras serán preparadas con el mismo V del buffer de siembra, y se sembrará el mismo V de todas las muestras. Nota: -No es necesario trabajar en esterilidad -Preparar con anterioridad el baño de agua y asegurarse de contar con flotadores para tubos eppendorf. 2.

Preparación de geles de poliacrilamida

Sn. Acrilamida-Bisacrilamida Buffer Agua bidestilada 10 % SDS TEMED 10% Persulfato de Amonio

Gel Separador al 12% (5ml) 2 ml 1.3 ml (pH8.8) 1.7ml 50 ul 2 ul 50 ul

Gel Stacking al 4% (1ml) 0.17ml 0.13 ml (pH6.5) 0.68 ml 10ul 1 ul 10 ul

Nota: Preparar las soluciones de cada tipo de gel sin Persulfato de Amonio, este se agrega en el momento de utilizarlo. Precaución: La acrilamida y la bisacrilamida son neurotioxinas potentes y se absorben a través de la piel. Su efecto es acumulativo. Utilizar guantes en la preparación de las mezclas. 65

Primero colocar el gel separador. Cubrir la superficie con etanol 96%, nbutanol o agua. Dejar polimerizar a temperatura ambiente (el tiempo depende de la T ambiental). Remover el etanol. Agregar el gel stacking y colocar el peine. Dejar polimerizar a temperatura ambiente unos minutos. Colocar el gel en la cuba de corrida. Remover el peine. Agregar el buffer de corrida hasta cubrir las calles. ¾ Sembrar las muestras (Vmax=15ul) NOTA: asegurarse que los vidrios se encuentren totalmente limpios, de lo contrario, realizar una limpieza con etanol. 3. Condiciones de corrida: Setear la fuente de poder 50mA/150 Volt. Cortar la corrida cuando el colorante llegue al final del gel.

4.

Tinción con Coomassie blue

Finalizada la corrida electroforética, se procederá al desarmado del cassette trabajando con sumo cuidado para evitar la rotura de los vidrios. - Incubar el gel en la solución de azul de Coomassie 30’ con agitación. Descartar la solución, lavar rápidamente con agua para eliminar el exceso de colorante. - Incubar con la solución de desteñido. Decolorear hasta que sean visibles las bandas y que el background sea el adecuado. -Transferir el gel a un recipiente con agua para la hidratación del mismo. Guardar en heladera. NOTA: Los geles pueden secarse en secadores de geles especiales para su conservación.

Análisis de resultados 1. Se realizará el análisis comparativo entre los perfiles proteicos obtenidos a partir de las bacterias. Incluya en el informe fotos de los geles junto a sus observaciones y comentarios. 2. Se informará la concentración proteica de la muestra incógnita

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Soluciones -10X Buffer de corrida (Tris glicina) 32 g Tris base 144 g Glycine AguaCsp/1L Preparar para la corrida el buffer 1XSDS 10 %

-2X Buffer de siembra (cracking buffer) Tris-Cl pH 6.8 125 mM glycerol 20% bromophenol blue 0.2 % SDS 4% B-mercaptoetanol 200 mM

-Azul de Coomassie 0.1% coomassie R-250 (Sigma) 40% etanol 10% ácido acético

-Solución de desteñido 7.5% ácido acético 20% etanol (o metanol)

-Acrilamida-Bisacrilamida 30 g Acrilamida 0.8 g Bisacrilamida Agua csp 1L

-1.5 M Tris HCl pH 8.8 -1M Tris-HCl HCl pH 6.8

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PROBLEMAS

http://www.sciam.com/article.cfm?id=what-are-we-thinking-when

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PRIMERA PARTE SOLUCIONES 1) a) b) c) %

Cómo prepararía: 1000 ml de una solución NaCl 0,32 M 500 ml de NaCl al 0,9 % Una solución de NaCl que sea isoosmolar con una solución de CaCl2 al 0,9

2) a) b)

Cuántos ml de una solución de NaCl al 5 % se precisan para preparar: 1500 ml de NaCl al 0,9 % 1500 ml de NaCl 0,15 M

3) Ud. desea preparar 1000 ml de una solución de NaCl al 0,9 % que contenga PMSF 1 mM. El PMSF (P.M. = 174,2) es poco soluble en agua y muy soluble en etanol. ¿Cómo resuelve el problema? 4) ¿Cuál es la concentración mínima que debe tener una solución de PMSF en etanol para preparar una solución acuosa que contenga una concentración final de 2 mM de PMSF y la concentración de etanol no exceda el 0,1 %? 5) A partir de una solución madre de NaCl al 25 % se desea preparar las siguientes soluciones: Concentración final deseada 0,05 M 0,075 M 0,1 M 0,15 M 0,2 M 0,25 M 0,30 M 0,35 M

Cantidad En ml 200 200 200 200 200 200 200 500

Volumen de NaCl necesario

a) Complete el cuadro indicando la cantidad en ml de NaCl al 25 % necesaria para preparar cada solución. b) Calcule la osmolaridad de cada solución. 6) ¿Cuántos ml de una solución madre necesito preparar para obtener 10 ml de cada una de las siguientes diluciones: 1:2, 1:5, 1:25, 1:50? 7) De una solución madre (A) 1 M se realizó primero una dilución 1:2 (B), luego se diluyó 1:50 obteniéndose de este modo la solución C y por último se diluyó la solución C 10 veces obteniéndose D. a) ¿Cuáles son las concentraciones finales de las soluciones A, B, C y D? b) ¿Cuántas veces respecto de la solución A se diluyó B, C y D? 69

c) 8)

¿Cuántas veces respecto de la solución B se diluyó C y D?

Se desea preparar 500 ml de una solución de NaCl (PM: 58) 10-1 M: a) ¿Cuanta droga sólida debo pesar? b) ¿Cuántas veces debo diluir la solución madre para obtener una solución 10-4 M?

9) Necesito para mi experimento 10 ml de una solución de K (OH) 50 mM y poseo una solución madre 2 M. Para realizar las diluciones dispongo de pipetas de 10, 5 y 1 ml. ¿Cómo prepararía esta solución teniendo en cuenta que el volumen mínimo a pipetear es de 1 ml? Molaridad = Número de moles/litro de solución Normalidad = Número de equivalentes/litro de solución Osmolaridad = Número de osmoles/litro de solución

Problema 1. a) Cuales son los dos procesos celulares esquematizados? b) Requieren de energía? c) Como se une las vesículas a la membrana plasmática? Explique brevemente

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SEGUNDA PARTE Problema1- Laboratorio: Controles experimentales Un experimento es llevado a cabo generalmente, para poner a prueba una hipótesis acerca del rol de una variable (variable independiente) sobre otra (variable dependiente). La experimentación científica requiere, de un diseño experimental y de ciertas condiciones para que los ensayos tengan validez, como ser la realización de réplicas de las muestras, y la implementación de controles positivos y negativos. Un control positivo es un procedimiento, que tiene condiciones similares al experimento principal, pero que se conoce por la experiencia previa, que el resultado del ensayo es positivo. Un control negativo, es el ensayo del que se espera el resultado negativo. El control positivo confirma que las condiciones del experimento son capaces de generar un resultado positivo. El control negativo muestra la línea de base (“background” o “ruido”) que se obtiene cuando la prueba no produce un resultado positivo. Muchas veces este valor, se sustrae al resultado experimental de las muestras. Cualquier resultado distinto al esperado de los controles, invalida el experimento, cualquiera haya sido el resultado de este. Lea atentamente las siguientes situaciones experimentales e indique en cada caso cual es la variable estudiada y qué ensayos CONTROL necesita. 1) Análisis de la presencia de bacterias en la orina de un paciente mediante la técnica de Gram. 2) Evaluación de la presencia de proteínas en una muestra diluída en PBS, utilizando el método de Bradford 3) Evaluación del efecto de una mutación en el crecimiento de una bacteria. 4) Análisis de la capacidad de inhibir la fagocitosis de un compuesto aislado de un extracto vegetal 5) Se quiere demostrar que una dieta hipocalórica incrementa la supervivencia en ratones 6) Se quiere evaluar la hipótesis de que un incremento de T de 37 °C a 39 °C, trae aparejado

un incremento en la producción de ácido láctico en

Lactococcus lactis. 7) Evaluación de la fagocitosis de una bacteria a pH 4. 8) Evaluación de la inducción de la síntesis de una proteína recombinante en un cultivo de E.coli cuando se utiliza 10 veces menos del inductor IPTG. 9) Evaluación del efecto de una droga en pacientes

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Problema 2. Durante los años 50 existía un gran debate con respecto a cuál de las macromoléculas era la encargada de portar la información genética. Dos macromoléculas se disputaban la función, las proteínas y los ácidos nucleicos. Con el objetivo de dilucidar ese debate, los investigadores Martha Chase y Alfred D. Hershey realizaron el siguiente experimento. Utilizaron unos virus capaces de infectar células baterianas, denominados bacteriófagos, que consisten en una cápisde proteica que engloba a una única molécula de ADN.

La cápside proteica de una población viral fue marcada radiactivamente con S35. El ADN de otra población viral fue marcado con P32. Luego cada preparación de bacteriófagos se utilizó para infectar bacterias. Una vez procedida la infección se lavó para eliminar la marca que no fue incorporada al interior celular, y se cuantificó la marca que quedó retenida dentro de la célula, observándose los siguientes resultados:

Fracción marcada Proteína marcada con S35 ADN marcado con P32

Nivel de radiactividad Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3 Cultivo 4 5 2 10 4 87 89 95 90

1) Cuáles son las hipótesis del momento? 2) Qué resultados obtuvo el grupo de investigación? 3) Cuál es la conclusión más importante? 4) Grafique los resultados si el paso de lavado se hubiese obviado.

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Problema 3. El Vibrio cholerae es la bacteria responsable de la diarrea aguda característica del cólera. El proceso infeccioso implica supervivencia de V. cholerae al pH ácido del estómago, su motilidad a través del intestino y la secreción por parte del vibrión de una toxina proteica (CT) de 87 kilodaltons (KDa) compuesta por los productos de 2 genes (cistrones) llamados ctxA (río arriba) y ctxB (río abajo), que forman parte de un mismo operón bicistrónico. El producto de ctxA es un polipéptido de 27 KDa y el de ctxB, uno de los 12KDa. El polipéptido A sufre una modificación post-traduccional. Se realizaron los siguientes geles de poliacrilamida con la toxina purificada: Sin SDS Sin β-Me

Con SDS y β-Me

Con SDS

Toxina pH 7

MPM

CT

MPM

Polo 40KDa

40KDa

22KDa

22KDa

10KDa

10KDa

5KDa

5KDa

CT

Polo + a. Dibuje la molécula de toxina que muestre el n° de subunidades de cada clase, el tipo de unión entre las mismas y la característica saliente del producto del gen ctxA. b. ¿Cuál es la carga eléctrica neta de la proteína a ph=7? c. ¿Qué modificación post-traduccional sufre “in vivo” el producto de ctxA para explicar el resultado del gel con SDS y mercaptoetanol? d. Se le ocurre alguna manera para identificar específicamente cada tipo de subunidad???

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Problema 4. La toxina colérica (CT) es el principal factor de virulencia producido por V. cholerae. Es una proteína oligomérica constituída por una unica subunidad A y 5 subunidades B que forman un anillo pentamérico con la subunidad A unida al core pentamérico B. La acción biológica de CT es iniciada por la unión de las subunidades B al receptor en la membrana de las células epiteliales intestinales. Esta unión induce un cambio conformacional en la molécula, que permite la internalización de la subunidad A (CTA) a la célula. Esta subunidad tiene actividad ADP-ribosil transferasa, adiciona un residuo de ADP-ribosa a la subunidad α de la proteína G (Gα) -ver material suplementario al final de la guía-. Esto provoca la activación constitutiva de la adenilato ciclasa. Como consecuencia, se acumula excesiva sal y agua en el lumen intestinal que finaliza en las diarreas características de la enfermedad. Las formulaciones “Kampo”, son medicinas tradicionales utilizadas en Oriente hace más de 2000 años. Las formulaciones son de origen natural, incluyendo hojas de plantas, raíces y hongos. El tipo de prescripción varía de acuerdo al diagnóstico. Estas formulaciones han sido empleadas para el tratamiento de la diarrea de origen bacteriano, por ese motivo se examinó su efecto en la actividad de CT estudiando loops ligados de íleon de ratón o conejo y actividad ADP-ribosil-transferasa. A continuación se muestran algunos de los resultados obtenidos, evaluando las distintas

formulaciones

transferasa)

y

en

sobre asas

cultivos ligadas

celulares de

ratón

(actividad

ADP-ribosil

(fluído

acumulado):

74

:

75

1-¿Qué tipo de modificación representa la ADP-ribosilación?. Proponga un mecanismo que explique el efecto observado (activación constitutiva de la adenilato ciclasa)¿Qué efecto espera en la célula?. 2-¿Cuál de los preparados es el más efectivo?

3- Cuál es el objetivo del segundo experimento en asas ligadas, mostrado en la figura 2? Por qué se utiliza conejo en lugar de ratón? 4- La ADP-ribosilación se realiza a partir del precursor NAD+ (ver material suplementario del problema). Para analizar la ADP-ribosilación producida por la CTA y el posible efecto de los taninos de RG, se realiza un ensayo incubando las proteínas totales (membrana) de células intestinales Caco-2 en presencia de NAD+ marcado radiactivamente y CTA. A partir de los resultados de la fig. 3. -Explique la técnica de análisis. -¿Podría decir sobre qué evento actúa el compuesto estudiado (RG-tannin)? 76

-Para este experimento podría haber utilizado otra línea celular? Justifique.

En base a los resultados obtenidos, se pudo conocer el fundamento de la medicina tradicional china en la utilización de Kampo para el tratamiento del cólera? Problema 5. Para que los espermatozoides sean funcionales (y ser capaces de fecundar los oocitos) luego de la liberación del tracto reproductivo de los mamíferos, se requieren desde unas pocas a varias horas, dependiendo de la especie. A través del tiempo, el espermatozoide sufre una serie de eventos de maduración post-liberación colectivamente conocidos como “capacitación”. El péptido promotor de la fertilización (FPF), la adenosina y calcitonina, presentes en el

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plasma seminal, son moléculas que promueven y regulan la capacitación. La evidencia actual señala a estas moléculas como “primeros mensajeros” que regulan la producción de un segundo mensajero, cAMP por la adenilato ciclasa (AC).

-

¿Dónde se encuentran los Receptores para estas moléculas y cuál es su estructura?. Dibuje.

-

¿Cuál es la molécula que “transduce” la señal?

La Calcitonina es una hormona peptídica de 32 aa involucrada en la homeostasis ósea. Sin embargo, se encuentra en cantidades muy superiores en el líquido seminal respecto del plasma sanguíneo. El siguiente experimento muestra el efecto de la Calcitonina (Cal) y FPP sobre suspensiones de espermatozoides:

¿Qué puede decir del gráfico?? ¿Cómo explica la disminución del cAMP en los espermatozoides capacitados?

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El calcio es un ión que actúa como segundo mensajero. Puede decír quién es el transductor de la señal en este tipo de mecanismo?. Sin embargo, este catión bivalente puede actuar también a partir de otros mecanismos. En el siguiente experimento se analizó la producción de AMPc en espermatozoides no capacitados, así como también la capacidad de fecundar oocitos.

-¿Cuál es el objetivo del experimento? - ¿Qué estrategia experimental podría utilizar para verificar el resultado?? Dibuje el resultado esperado. -¿Qué se puede concluir a partir de la figura? Puede hipotetizar algún mecanismo con estos elementos?.

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Material suplementario Problema 4: 1) ADP-ribosilación

2) Leyendas de figuras Fig1. Efectos inhibitorios de R. rhizoma sobre la ADP-ribosilación catalizada por CT. Se agregó 1 ug de CT con las cantidades indicadas de R. rhizoma (●), Taninos de RG (▲), gallato epigallocatecin (■), emodina (□) y seredina(∆). Los valores representan duplicados de un experimento representativo de tres. B) Efectos de R. rhizoma en la acumulación de fluidos en loops del íleon. Cada ratón fue inyectado con 0,1 ml de una solución conteniendo 100 ng de CT y las cantidades indicadas de R. rhizoma (●), Taninos de RG (▲), gallato epigallocatecin (■), emodina (□)y seredina(∆). El ratón fue sacrificado a las 6 horas y se determinó la proporción de la acumulación de fluídos (mg/cm). Fig 2. Efectos inhibitorios de los taninos de RG en la acumulación de fluidos inducidos por CT en los loops de íleon (ratón). Los loops contenían: 1) sin aditivos; del 2 al 7: 250 ng de CT; 3 y 8: 10 ug de taninos de RG; 4: 3 ug de taninos RG; 5: 1 ug de tanino RG; 6: 300 ng de tanino RG y 7: 100 ng de tanino RG. Los experimentos fueron repetidos por quintuplicado. Fig 3. Efecto de los taninos de RG sobre la ADP-ribosilación catalizada por CTA en membranas de células Caco-2. Línea 1: sin aditivos, líneas 2-5, 2,5 ug de CTA; líneas 3 y 6, 15 ug de taninos de RG, líneas 4 y 7, 10 ug de taninos RG, y líneas 5 y 8, 5ug de taninos RG. 3) La línea celular Caco-2 es una línea celular inmortalizada generada a partir de células epiteliales humanas de adenocarcinoma colorectal.

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