ANÁLISIS DE LA FUNCIÓN DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL EN LOS PACIENTES INFECTADOS POR EL VIH QUE DESARROLLAN HIPERLACTATEMIA DURANTE EL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL

Investigador principal: Dr. Òscar Miró Andreu Centro: Hospital Clínic i Provincial de Barcelona Duración: 3 años

MEMORIA FINAL

1. Resumen

1. Demostrar que, en los pacientes afectos por las distintas formas de hiperlactatemia que aparecen durante el tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA), la capacidad respiratoria está disminuida en los mitocondrios aislados a partir de músculo esquelético (ME). 2. Demostrar que, en los pacientes afectos por las distintas formas de hiperlactatemia que aparecen durante el TARGA, la actividad enzimática de uno o más complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM) está disminuida en el ME.

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3. Cuantificar el contenido de DNA mitocondrial (mtDNA) en el ME de los pacientes infectados por el VIH en TARGA y que presentan las distintas formas de hiperlactatemia. 4. Correlacionar el grado de depleción del mtDNA con los datos de disfunción de la CRM. 5. Demostrar que tanto la disminución de la capacidad funcional de la CRM como la depleción de mtDNA son mayores progresivamente cuanto más severa es la forma clínica de hiperlactatemia. 6. Comprobar si las alteraciones que se encuentran en el ME (un tejido diana para los trastornos mitocondriales) están asimismo presentes en los linfocitos de sangre periférica (LSP, una muestra biológica de más fácil obtención y estudio).

Diseño Estudio transversal de casos y controles. En los casos, también se realizará estudio longitudinal.

Casos (tres grupos): Grupo A: pacientes afectos de acidosis láctica sintomática (ALS; n=6+6, diseño longitudinal). Grupo B: pacientes infectados por el VIH en TARGA y afectos de hiperlactatemia sintomática (HLS; n=20+20, estudio longitudinal). Grupo C: pacientes infectados por el VIH en TARGA y afectos de hiperlactatemia asintomática (HLA; n=20+20, estudio longitudinal).

Controles (dos grupos): Grupo D: individuos controles infectados por el VIH, asintomáticos y que nunca han recibido antirretrovirales (n=20). Grupo E: individuos controles, no infectados por el VIH, asintomáticos (n=20). 2

Los estudios se realizarán en ME (patrón de oro) y en LSP. Se buscarán alteraciones mitocondriales a través de estudios histológicos (ME), estimación del contenido mitocondrial (ME y LSP), análisis de la capacidad respiratoria mitocondrial (ME y LSP), cuantificación de la actividad enzimática (ME y LSP) y determinación del contenido de mtDNA (ME y LSP).

Plan de trabajo Mes 0 al 6: adiestramiento en la metodología bioquímica para el análisis de la función de la CRM. Mes 7 al 30 (inclusión de enfermos): responsable directo de toda la metodología bioquímica para la valoración de la función de la CRM. Mes 31 al 32 (sigue la inclusión de enfermos): adiestramiento en la metodología genética para el análisis del mtDNA. Meses 33 al 36 (sigue la inclusión de enfermos): responsable directo de toda la metodología genética para el análisis del mtDNA.

Cronograma En total, son 86 los pacientes a incluir en el estudio (16 el primer año, 35 en el segundo y 35 en el tercero), a razón de un paciente cada 1-2 semanas. Los estudios bioquímicos se realizarán a medida que se incluyan los enfermos y se guardarán las alícuotas correspondientes a -70 ºC para la realización de los estudios genéticos al final del proyecto.

2. Resultados

Se ha incluido un total de 33 pacientes infectados por el VIH que han presentado incremento de lactato mientras estaban recibiendo TARGA, a 3

los cuales se les ha estudiado la función mitocondrial en linfocitos de sangre periférica. En 10 de ellos se han podido estudiar de forma concomitante los parámetros mitocondriales en músculo esquelético. En 25 de los 31 casos, se ha repetido el estudio en linfocitos una vez solucionado el episodio de hiperlactatemia. Adicionalmente, se han estudiado en detalle linfocitos de 5 pacientes no infectados por el VIH que han desarrollado hiperlactatemia mientras estaban recibiendo el antibiótico linezolid. Finalmente, el presente proyecto también ha incluido a 58 pacientes para poder formar los diferentes grupos controles. Los datos clínicos se presentan en la tabla siguiente.

VIH(n=20)

Edad (años)

VIH+ sin tratamiento

VIH+ en TARGA y lactato normal (n=18)

VIH+ en TARGA e hiperlactate mia asintomática

VIH+ en TARGA e hiperlactate mia sintomática

(n=18)

(n=11)

VIH+ en TARGA y acidosis láctica (n=2)

49±12

36±6

43±10

45±9

46±100

44±1

80

100

89

92

86

100

Lactato suero (normal: 0,4-2 mmol/Ll)

1,2±0,4

2,8±0,3

3,0±0,9

6,9±4,2

Linfocitos CD4+ (cel/mm3)

560±231

640±200

279±202

286±321

Carga viral (log copias RNA/mL)

217±0,7

2,3±0,3

3,7±1,2

5,4±1,4

TARGA que incluye ITIAN (%)

100

100

100

100

Tiempo en TARGA (años)

7±4

6±2

7±3

8±4

Sexo masculino (%)

Los estudios han consistido en cuantificar el contenido de DNA mitocondrial (mtDNA), la actividad enzimática de los diferentes complejos de la cadena respiratoria mitocondrial y la capacidad oxidativa con diferentes sustratos. Puntualmente, se ha determinado la abundancia

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mitocondrial, de RNA codificado por el mtDNA y de determinadas proteínas codificadas por este DNA. De forma global, podemos decir que hemos demostrado la presencia de grados variables de depleción del mtDNA que condicionan un descenso en la actividad enzimática de complejos codificados por él (en concreto el CIII en músculo esquelético y el C-IV en linfocitos) y que en el caso del músculo esquelético, ello se asocia a un descenso en la capacidad de oxidación del piruvato, que es un sustrato que da electrones al complejo I, y por tanto explora la cadena de transporte electrónico que forman C-I + C-III + C-IV. A pesar de que el número de estudios en músculo esquelético ha sido más limitado que en estudios en linfocitos, parece ser que los efectos tóxicos hacia la mitocondria son más manifiestos en el músculo, que de hecho es un tejido diana clásico donde valorar patología mitocondrial. La figura de la derecha ilustra estos resultados (ref. 1,2).

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El grado de correlación entre la depleción de mtDNA y el resto de parámetros funcionales mitocondriales estudiados ha sido escaso, indicando que probablemente existan de forma concomitante otros mecanismos lesivos en la fisiopatología de la hiperlactatemia debida a los antirretrovirales. En este sentido, recientemente se ha descrito que los análogos de nucleósidos, además de la inhibición de la gammapolimerasa que replica el mtDNA, también podrían actuar inhibiendo la transcripción de mtRNA y por tanto producir una afectación funcional en algunos casos superior a la que se observaría sólo por los efectos de la gammapolimerasa. Éste es un punto donde diferentes grupos (entre ellos el nuestro) están intensificando su investigación y, sin duda, será materia de futuras comunicaciones en los próximos años. En cambio, lo que sí hemos podido determinar es la existencia de una clara gradación entre la magnitud de la clínica que presentan los pacientes y el grado de afectación de los parámetros mitocondriales que hemos hallado alterados en este síndrome, tal como puede observarse en la figura inferior.

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Otro dato que apoya la participación mitocondrial en la patogenia de la hiperlactatemia asociada a TARGA es la reversibilidad de las alteraciones mitocondriales al finalizar el TARGA (o sustituirlo por otro esquema menos “mitotóxico”) y desaparecer la hiperlactatemia, fenómeno que ha ocurrido de forma estadísticamente significativa en los estudios en linfocitos realizados a los enfermos incluidos en el presente proyecto. Además, llama la atención que esta mejora sea más importante en cuanto al funcionalismo que respecto a la recuperación de la depleción de mtDNA (figura siguiente), lo que abunda en el sentido de que probablemente existan otros mecanismos lesivos más allá de la mera depleción del mtDNA.

A lo largo de este proyecto se ha explorado la posibilidad de utilizar pruebas no cruentas para diagnosticar el trastorno mitocondrial que presentan tales enfermos, por lo que se han incluido, de forma piloto, 2 de estos enfermos para realizar una prueba de ejercicio aeróbico en el antebrazo y se ha obtenido una muy buena correlación entre los resultados de dicha prueba y la alteración mitocondrial hallada en músculo y linfocitos de estos dos casos (ref. 3, 4). Como puede apreciarse en la siguiente figura, existe un descenso de la actividad del complejo IV y del contenido de mtDNA tanto en músculo como en linfocitos (PBMC), que se recuperan parcialmente con la normalización del lactato (izquierda) y que

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coincide con una utilización defectuosa del oxígeno durante la hiperlactatemia, que posteriormente se corrige y pasa a ser normal (zona grisácea, derecha).

A pesar de realizarse de forma colateral, se han estudiado las posibilidades terapéuticas, que básicamente pasan por detener el tratamiento (en algunos casos sustituir el esquema TARGA por otro con menor interacción mitocondrial) y administrar durante siete días una combinación de vitaminas y cofactores mitocondriales (tiamina, piridoxina, hidroxicobalamina, ácido ascórbico y carnitina) que se han utilizado esporádicamente en el tratamiento de alteraciones mitocondriales congénitas. Los resultados de esta aproximación han sido satisfactorios (ref. 5). Por último, hemos profundizado en el mecanismo fisiopatológico que causa hiperlactatemia durante el tratamiento con otro fármaco, el linezolid. En este caso, hemos demostrado que el linezolid no altera el contenido de mtDNA, sino que la hiperlactatemia se produce por una disfunción mitocondrial asociada a un descenso en la síntesis proteica, y hemos podido poner de manifiesto en el caso de la subunidad COX-II del complejo IV, cuya síntesis se halla disminuida (y asociada a una actividad del propio complejo IV muy baja) a pesar de que la cantidad de RNA mensajero que la codifica se halla aumentada y el contenido de mtDNA

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intacto (ref. 6, 7). La siguiente figura presenta un resumen de los hallazgos.

3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos

El presente proyecto ha puesto de manifiesto la existencia de una alteración en el funcionalismo mitocondrial de los pacientes infectados por el VIH que desarrollan hiperlactatemia durante el TARGA, y que esta alteración es reversible al detener (o sustituir) el TARGA. El establecimiento de esta relación ha sido uno de los factores que ha llevado en los últimos dos o tres años a modificar las combinaciones de antirretrovirales del TARGA hacia esquemas con menor actividad “mitotóxica”. Ello ha sido posible por la existencia, paulatinamente, de más antirretrovirales en el mercado, y esta posibilidad de cambio ha permitido el descenso progresivo en la incidencia de este síndrome. Por

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tanto, una parte de las implicaciones clínicas de este proyecto ya se han ido manifestando a lo largo del mismo. Los datos presentados permiten asimismo una mejora en la aproximación terapéutica a los enfermos afectos de hiperlactatemia basada en la suspensión/sustitución del TARGA y de la administración de diferentes vitaminas y cofactores mitocondriales. Finalmente, y conforme a los datos de un estudio piloto realizado en el curso del presente proyecto en pacientes con hiperlactatemia por TARGA, es posible que en el futuro podamos disponer de técnicas no cruentas que permitan evaluar el funcionalismo mitocondrial de los pacientes que presentan alteraciones en la homeostasis del ácido láctico.

4. Publicaciones

Miró O, López , Martínez E, Rodríguez-Santiago B, Blanco JL, Milinkovic A, et al. Reversible mitochondrial respiratory chain impairment during symptomatic hyperlactatemia associated with antiretroviral therapy. AIDS Res Human Retrovir 2003; 19:1027-1033.

Garrabou G, López S, Sanjurjo E, Infante AB, Larrousse M, Milinkovic A, et al. Mitochondrial function in HAART-related hyperlactatemia. Antivral Ther 2005; 10:L43 (abstract 70, presentado en el 7th International Workshop on Adverse Drug reactions and Lipodystrophy in HIV, celebrado a Dublín del 13 al 16 de noviembre de 2005; está en proceso de redacción como original para remitir a una revista internacional).

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Garrabou G, Sanjurjo E, Miró O, Manrtínez E, Infante AB, López S, et al. Non-invasive diagnosis of mitochondrial dysfunction in HAART-related hyperlactatemia. Clin Infect Dis 2006; 42:584-585.

Casademont J, Sanjurjo E, Garrabou G, Miró O. Diagnosis of mitochondrial dysfunction in HIV-infected patients under highly active antiretroviral therapy: possibilities beyond the standard procedures. Antiviral Ther 2005; 10(suppl. 2):M65-M71.

Pedrol E, Ribell M, Deig E, Villà MC, Miró O, Garrabou G, et al. Tratamiento de la hiperlactatemia sintomática y de la acidosis láctica en pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana en tratamiento con inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de los nucleósidos. Med Clin (Barc) 2005; 125:201-204.

Soriano A, Miró O, Mensa J. Mitochondrial toxicity associated with linezolid. N Engl J Med 2005; 353:2305-2306.

Garrabou G, Soriano A, López S, Guallar J, Giralt M, Villarroya F, et al. Reversible inhibition of mitochondrial protein synthesis during linezolidrelated hyperlactatemia. Antimicrob AgentsChemother 2007 (en prensa).

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