NOVA Lite® HEp-2 External EB Kits Para Diagnóstico In Vitro Código de Producto: 704230, 704235 Complejidad de CLIA: Alto

Aplicación Este producto (kit o portaobjetos) es para el uso en el screening y titulación de autoanticuerpos antinucleares mediante test de inmunofluorescencia. Debe utilizarse como apoyo en el diagnóstico y tratamiento de lupus sistemático eritematoso (SLE), síndrome de Sjögren, artritis reumatoide y otras enfermedades del tejido conjuntivo.

Sumario y Explicación de la prueba El anticuerpo antinuclear (ANA) es un término que describe una gran variedad de auto-anticuerpos contra componentes del núcleo celular, como p.ej. DNA, RNA y otras proteínas nucleicas1. Estos ANA se encuentran con elevada frecuencia en pacientes con enfermedades del tejido conjuntivo o reumáticas, particularmente en el lupus sistemático eritematoso (SLE). Existe una correlación grande de ANA positivo con SLE y la ausencia de ANA descarta esencialmente la enfermedad2. No obstante, pacientes con otras enfermedades de tejido conjuntivo tales como artritis reumatóide, esclerodermia y dermatomiositis presentan a menudo ANA positivo. También se han encontrado títulos bajos de ANA en otras enfermedades o en personas mayores sanas. El método de inmunofluorescencia indirecto es el mejor método de determinación para el screening de ANA circulantes. Se recomienda que todas las muestras de ANA positivas sean tituladas hasta el punto final y sean investigadas a autoanticuerpos contra DNA de doble filamento (dsDNA) y antígenos de núcleo extraibles (ENA). En el pasado, para la determinación de ANA se empleaba secciones del hígado de rata congelado pero, esto ha sido ya reemplazado por diferentes tipos de líneas celulares. Las células HEp-23 constituyen una línea celular epitelial y están caracterizadas por un núcleo extremadamente grande comparado con otras líneas celulares. Con la utilización de células HEp-2 en el screening se pueden observar tres ventajas diferenciales: 1. El substrato antigénico está estandarizado, por lo que existe una muy baja variabilidad entre lote y lote contrariamente que con el tejido de roedor. 2. Las células HEp-2 son más grandes que las del tejido de rata, permitiendo así una mejor visualización de la morfología de la célula y por tanto un aumento de la sensibilidad del test. 3. La mayoría de células HEp-2 se dividen activamente, exponiendo así antígenos que normalmente no se manifiestan en las células del tejido de rata3.

Procedimiento de trabajo El test se basa en la inmunofluorescencia indirecta4. Tanto las muestras de los pacientes como los controles correspondientes se incuban con células HEp-2, mediante lavado se eliminan los anticuerpos que no han reaccionado y después se aplica el conjugado de fluorescencia. El conjugado sobrante se elimina por medio del proceso de lavado. Los portaobjetos son examinados bajo un microscopio de fluorescencia dando las muestras positivas una fluorescencia de verde manzana en las áreas de unión entre las células HEp-2 y los anticuerpos.

Reactivos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Portaobjetos con substrato HEp-2 ANA en 6 o 12 portaobjetos/pocillos Suero de control positivo (patrón homogéneo, intensidad de coloración 3+), conteniendo azida sódica 0,09%. Listo para el empleo. Suero de control positivo (patrón centómero, intensidad de coloración 3+), conteniendo azida sódica 0,09%. Listo para el empleo. Suero de control negativo (negativo universalmente para todos los auto-anticuerpos), conteniendo azida sódica 0,09%. Listo para el empleo. FITC-IgG (H+L) conjugado de fluoresceína, conteniendo azida sódica 0,09%. Listo para el empleo. Azul de Evans 1%, como color de contraste opcional. Tampón PBS II, suministrado en forma liquida concentrado 40 veces, debe diluirse antes del empleo. Medio de montaje, conteniendo un agente anti-“fading” Cubreobjetos.

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Advertencias/ Precauciones Este producto (kit) es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro.Esta prueba solo deberá efectuarse para el propósito indicado y por personal de laboratorio adecuadamente instruido. El material de partida para la elaboración de los calibradores y controles proviene de sangre humana (sólo los kits). Cada una de las muestras han sido examinadas y libres de anticuerpos del virus del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (HIV 1 & 2), Hepatitis C así como antígenos superficiales de Hepatitis B (HBsAG). No obstante, hasta la fecha no existen métodos seguros para la exclusión de estos agentes infecciosos ni de otros. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Algunos kits contienen de azida sódica 0,09% y deben tratarse según las medidas de seguridad correspondientes. Debe evitarse tanto la ingesta como el contacto con la piel y las mucosas. En caso de contacto, aclarar con abundante agua y consultar a un médico. La azida sódica puede formar azidas metálicas explosivas en contacto prolongado con tubos de plomo o cobre. Tras la eliminación aclarar con gran cantidad de agua con el fin de evitar depósitos de azida.

Condiciones de Almacenaje El kit sin estrenar es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el envase almacenándolo entre 2 y 8ºC. ¡NO CONGELAR! Tras la extracción de los portaobjetos de su envase deberán ser empleados inmediatamente. El tampón PBS II diluido es estable hasta 4 semanas a una temperatura entre 2 y 8ºC. El conjugado de fluoresceína debe mantenerse, en la medida de lo posible, al resguardo de la luz solar, fluorescente o ultraviolada. Todos los reactivos deben almacenarse entre 2 y 8ºC.

Recolección de Muestras Las muestras de suero se deben recolectar mediante extracción intravenosa y dejar coagular de forma natural. Separar rápidamente el suero del coagulo con el fin de evitar hemólisis. El suero puede conservarse a 2-8°C durante un máximo de 7 días antes del ensayo11, o para periodos más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura inferior. Evitar repetidas congelaciones y descongelaciones. No utilizar muestras de suero contaminado microbiológicamente o con partículas, ni tampoco sueros hemolíticos o lipémicos ya que puede darse un título inferior o patrones de fluorescencia poco claros.

Procedimiento Materiales Suministrados 704230 10 1 1 1 1 1 2 1 1

HEp-2 ANA Substrate slide (6-well) (Portaobjetos con substrato HEp-2 ANA, 6 pocillos) 1mL Homo. Ptn. (use w/Conj. 504070 or 504088) (ANA control positivo, Homo. Ptn. (Su oso con Conj. 504070 o 504088), prediluido) 1mL Centromere Positive Control (control positivo, centrómero, prediluido) 1mL IFA System Negative Control (Control negativo, prediluido) 7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein) (Conjugado FITC IgG (H&L) HEp de fluoresceína) 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans 1%) 25mL PBS II Buffer (x40 conc.) (Tampón PBS II, concentración x40) 3mL PVA Mounting Medium (Medio de montaje) 10 Coverslips (Cubreobjetos)

704235 20 1 1 1 1 1 2 1 1

HEp-2 ANA Substrate slide (12-well) (Portaobjetos con substrato HEp-2 ANA, 12 pocillos) 1mL Homo. Ptn. (use w/Conj. 504070 or 504088) (ANA control positivo, Homo. Ptn. (Su oso con Conj. 504070 o 504088), prediluido) 1mL Centromere Positive Control (control positivo, centrómero, prediluido) 1mL IFA System Negative Control (Control negativo, prediluido) 15mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (Conjugado FITC IgG humanas (H&L) de fluoresceína) 10mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans 1%) 25mL PBS II Buffer (x40 conc.) (Tampón PBS II, concentración x40) 10mL PVA Mounting Medium (Medio de montaje) 20 Coverslips (Cubreobjetos)

Material Necesario No Incluido 1. 2. 3. 4. 5.

Agua destilada o desionizada para diluir el concentrado de PBS II y para humidificar las tiras de papel impregnadas con el conjugado. Recipientes y botella de plástico para el tampón PBS II. Pipetas y tubos de reacción desechables. Cámara húmeda para los pasos de incubación Microscopio de campo oscuro con filtros para una longitud de onda de excitación de 450nm y emisión de 515nm.

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En caso de utilizar sólo portaobjetos con substrato, deberá adquirirse de INOVA el siguiente material: controles positivos p.ej. Homo. Ptn. (Su oso con Conj. 504070 o 504088) (504090), centrómero (508184), control negativo (508186), conjugado anti-IgG humanas (H&L) FITC (504088, 504070), purificado por afinidad o (504032) (diluir 1/50-1/200 para emplear), PBS II (508998), Azul de Evans (504049), medio de montaje (504046, 504047) y cubreobjetos.

Procedimiento de Ensayo Control de Calidad Cada vez que se realice una serie de analisis deberán usarse controles positivo y negativo. 1. Medio de montaje: Antes de su empleo, sacar el medio de montaje de la nevera y dejar que llegue a temperatura ambiente (18-28ºC) por sí solo. 2. Preparación PBS II concentrado. Diluir el PBS II concentrado con agua destilada o desionizada (1 parte PBS II + 39 partes de agua destilada o desionizada) y mezclar. Nota: Preparar la totalidad del kit, solo si va a utilizarse en un plazo de un mes a partir de la fecha de la preparación. El PBS II se emplea para la dilución de las muestras de suero y como tampón. 3. Dilución muestras de pacientes. Screening: Diluir muestras de pacientes 1/40 (p.ej. 25µL de suero + 975µL de tampón PBS II). Titulación: Hacer diluciones en serie de las muestras positivas examinadas por screening con (p.ej. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640 etc.). Ejemplo: Tomar 500µL de la dilución 1/40 y mezclar con 500µL de PBS II para obtener una dilución de 1/80 y así sucesivamente. 4. Preparación de los portaobjetos. Sacar los portaobjetos de la nevera aproximadamente 30 minutos antes de su empleo para que alcancen la temperatura ambiente (18-28ºC). ¡Abrir el embalaje, solo antes de su utilización inmediata! Manipular con cuidado los portaobjetos con el fin de evitar daños en el substrato. Colocar los portaobjetos correspondientemente marcados en la cámara húmeda y colocar una gota de los controles positivos en 2 pocillos, una gota de control negativo en otro y en los restantes 25µL de cada muestra de los pacientes. 5. Incubación de los portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-28ºC). (Unas toallitas de papel humedecidas en la base de la cámara mantendrán la humedad.) 6. Lavado con PBS II. Extraer el/los portaobjetos de la cámara húmeda y aclarar con cuidado con el frasco lavador. ¡No dirigir el chorro directamente a los pocillos! Coloque los portaobjetos en un frasco Coplin de PBS II diluido o en una gradilla sumergida en PBS II durante 5 minutos como máximo. 7. Adición del conjugado fluorescente. Sacudir el exceso de PBS II y volver a introducir los portaobjetos inmediatamente en la cámara húmeda. NO DEJAR LOS POCILLOS SIN TAPAR MAS DE 15 SEGUNDOS. SI SE LLEGARA A SECAR EL SUBSTRATO, LOS RESULTADOS SE VERÍAN SERIAMENTE AFECTADOS. 8. Incubación de los portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en la cámara húmeda a temperatura ambiente (18-28ºC) y a oscuras. 9. Lavado con PBS II. Lavar otra vez tal y como se describe en el paso 6. Color de contraste opcional: añadir 2-3 gotas de Azul de Evans 1% por 100mL de PBS II antes del lavado. 10. Colocación del cubreobjetos. Sacar de uno en uno los portaobjetos del PBS II. Secar rápidamente alrededor de los pocillos y añadir una gota del medio de montaje a cada pocillo. Cubrir con cuidado el portaobjetos con el cubreobjetos evitando la formación de burbujas. ¡En caso de formarse burbujas, no intente quitarlas! 11. Visión de los portaobjetos bajo el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos deberán visionarse lo más pronto posible, pero pueden guardarse a una temperatura de 2-8ºC durante 1 semana sin pérdida significativa de fluorescencia.

Control de Calidad Con cada prueba realizar simultáneamente un control positivo y negativo. El control positivo homogéneo deberá dar un brillo verde manzana de 3+ en el núcleo de la célula. El control positivo centrómero deberá dar un brillo de 3+ de patrón moteado discreto (generalmente en múltiplos de 46). El control negativo deberá dar una coloración verde sin brillo en todas las células HEp-2 sin llegar a percibirse fluorescencia. En caso de no asemejarse los controles a lo antes descrito, el test no es valido y deberá repetirse. Nota: En caso de emplear Azul de Evans como color de contraste, la muestra negativa deberá dar un color rojo-naranja sin brillo. En la muestra positiva el núcleo brillará verde manzana y las áreas celulares no coloreadas serán de un color rojo apagado.

Interpretación de los Resultados Negativo Una muestra se considera negativa si la coloración del núcleo es igual o menor al control negativo

Positivo Una muestra es positiva si la coloración del núcleo es mayor al control negativo y se perciba claramente un patrón. Los controles del kit tienen por regla general una intensidad de 3+. Pueden encontrarse una gran variedad de patrones en relación con la cantidad y clases de autoanticuerpos. En el siguiente cuadro se pueden identificar los patrones descritos.

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PATRON DE FLUORESCENCIA

DESCRIPCIÓN

ANTIGENOS NUCLEARES dsDNA ssDNA Histonas Scl-70

Homogéneo

Coloración fuerte del núcleo de la célula (Scl-70 puede presentar un aspecto moteado)

Moteado

Motas finas o toscas: generalmente sin coloración de los núcleos

SS-A SS-B Sm RNP y otros

Nucleolar

Manchas grandes y toscas (generalmente menos de 6 manchas por núcleo, con o sin patrón moteado fino)

Pm-Scl Nucleolin Ku y otros antígenos nucleolares desconocidos

Centrómero

Mitocondrial

Jo-1

Manchas discretas (generalmente múltiplo de 46) Coloración moteada toscamente de filamento citoplasmático alrededor del núcleo y de todo el citoplasma Coloración fina moteada concentrada alrededor del núcleo

ENFERMEDADES ASOCIADAS Títulos altos: SLE Títulos bajos: SLE u otras enfermedades del tejido 5 conjuntivo Títulos altos: SLE Síndrome de Sjögrencomplejo sicca Enfermedad del tejido conjuntivo mixto Escleroderma Títulos bajos: otras enfermedades de tejido conjuntivo Títulos altos: Scleroderma & síndrome de 6 Sjögren

Centrómeros cromosomales Síndrome de CREST

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M2

Cirrosis biliar primaria (común) Escleroderma (40%) y algunas veces en síndromes solapados

Jo-1 (histidil-tRNA sintetasa)

Polimiositis, dermatomiosítis asociada con enfermedad pulmonar intersticial

9,10

Limitaciones del Procedimiento 1.

2. 3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Un título alto de ANA sugiere con gran probabilidad una enfermedad del tejido conjuntivo, pero antes de hacer un diagnóstico, se deberá tener en cuenta el historial clínico y otros resultados de análisis serologicos del paciente. Un pequeño porcentaje de pacientes con SLE pueden dar ANA negativo por inmunofluorescencia indirecta, pero positivo con otros métodos.8 Pacientes con SLE inducido por fármacos suelen dar ANA positivos homogéneos o periféricos. Contrariamente, pacientes sujetos a terapia con esteroides suelen dar con otros métodos ANA negativos8. En una muestra de paciente pueden haber diferentes autoanticuerpos. Por medio de diluciones del suero se puede alcanzar una diferenciación de los distintos patrones. De modo parecido, con títulos muy elevados puede darse un efecto prozona el cual puede enmascarar el título real. Todas las muestras sospechosas o con títulos aparentemente bajos deberán diluirse más veces. La sensibilidad de la prueba está influida por la fuente de luz, filtros así como la óptica de las distintas marcas de microscopios de fluorescencia. El buen funcionamiento del microscopio está significativamente influido por un correcto mantenimiento, centrándose especialmente en la lámpara de mercurio y el cambio de la lámpara después del tiempo recomendado. Un nivel bajo de ANA se puede notar en pacientes que tienen condiciones clínicas diferentes de las enfermedades reumáticas y del tejido conectivo. En individuos normales, la incidencia de resultados positivos de ANA aumenta con la edad. Al interpretar las estructuras, se deberá tener siempre en cuenta la posible presencia de más de un autoanticuerpo. La combinación de varios autoanticuerpos pueden influir en el patrón homogéneo o moteado. Se recomienda, por lo tanto, que todas las muestras con patrones homogéneos de fluorescencia sean analizadas a dsDNA así como ENA. Aunque generalmente para el screening se utiliza una dilución del suero del paciente de 1/40, es posible que algunas veces, a diluciones bajas de la muestra, se pueda ver un nivel bajo de coloración no específica de los núcleos. Este test de ANA no es suficiente para un diagnóstico por sí solo, sino que debe utilizarse como un medio más. Debe tenerse en cuenta el cuadro clínico así como otros análisis.

Los portaobjetos comercializados por separado se clasifican como “reactivos específicos para los analitos”. Salvo que se trate de componentes del kit, las características analíticas y de rendimiento no están establecidas.

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Características de Rendimiento Precisión El control de calidad de cada lote se basa en ensayos múltiples de los portaobjetos, con el uso de una muestra control conocida diluida hasta el punto final. Cada lote da, al punto final, un título predeterminado, demostrando que no hay diferencias significativas en el rendimiento de los portaobjetos del mismo lote o de distintos lotes.

Sensibilidad La sensibilidad de los tests y el límite de detección dependen del microscopio utilizado. No hay un calibrador internacional disponible para poder estandarizarlo.

Especificidad Se ensayó un grupo de más de 50 muestras clínicas con diversas especifidades, incluídas 10 muestras negativas, con el uso del kit HEp-2 de The Binding Site y un kit HEp-2 equivalente comercialmente disponible. El rendimiento del kit The Binding Site fue comparable a aquello del kit equivalente en términos de especificidad e intensidad.

Resumen del procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Dejar que el medio de montaje alcance la temperatura ambiente. Diluir 1/40 el tampón PBS II con agua destilada o desionizada. Diluir 1/40 las muestras de suero con PBS II. Extraer los portaobjetos del refrigerador y dejar que alcancen la temperatura ambiente (18-28°C). Sacar los portaobjetos del envase y colocarlos en la cámara húmeda. Aplicar 25µL de cada control y de suero. Incubar a temperatura ambiente (18-28°C) durante 30 minutos. Lavar los portaobjetos con PBS II: primero con el frasco lavador y después sumergiendo los portaobjetos en la bandeja de o cubeta de coplin coloración durante 5 minutos. Volver a colocar en la cámara húmeda, dispensar el conjugado fluorescente. Incubar otros 30 minutos. Lavar otra vez según descripción en el punto 6. Extraer los portaobjetos, poner medio de montaje sobre cada pocillo y cubrir con los cubreobjetos. Evaluar los portaobjetos bajo el microscopio de fluorescencia.

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Referencias 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

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Rev. 5 January 2014

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