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Práctica #3 PROPIEDADES DE LAS MACROMOLÉCULAS I. Objetivos

Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de: * Estudiar la estructura, clasificación y función de las distintas macromoléculas de importancia biológica. * Conocer distintas pruebas colorimétricas que permitan la detección de macromoléculas. * Discutir los efectos de condiciones ambientales como el pH y la temperatura sobre la actividad enzimática. * Observar la presencia de azúcares y almidón en alimentos. * Conocer las reacciones de importancia biológica para la identificación de las características de los lípidos.

II.

Introducción

Todos los organismos vivos poseen carbohidratos, proteínas, lípidos, y ácidos nucleicos. Estas moléculas son frecuentemente llamadas macromoléculas. Todas las macromoléculas son polímeros sintetizados a partir de la unión de bloques estructurales (compuestos orgánicos) más sencillos, denominados monómeros. Los polímeros pueden ser degradados en sus monómeros constituyentes mediante reacciones de hidrólisis. Las macromoléculas tienen diferentes estructuras y propiedades químicas. Por ejemplo, los lípidos (compuestos de ácidos grasos) poseen muchos enlaces C-H y relativamente poco oxígeno, mientras que las proteínas (compuestas de aminoácidos) poseen grupos amino(NH3+) y carboxilo(-COOH)s. Estas subunidades características y grupos químicos, le confieren diferentes propiedades químicas a las macromoléculas. Por ejemplo, los monosacáridos tales como la glucosa son polares y solubles en agua, mientras que los lípidos son compuestos no polares e insolubles en agua..En este laboratorio estudiaremos solamente los carbohidratos, lípidos y proteínas. Entre los distintos componentes de los alimentos, después del agua, los carbohidratos son las sustancias más abundantes y más ampliamente distribuidas en la naturaleza; siendo la celulosa la biomolécula que se encuentra en mayor cantidad en la biosfera, y el almidón, la fuente energética alimentaria más empleada en el mundo. Los carbohidratosson moléculas compuesta fundamentalmente de carbono, hidrógeno y oxígeno en una relación 1:2:1 (por ejemplo la fórmula química de la glucosa es C6H12O6). Todos los carbohidratos están formados por cadenas de carbono de tamaño variable, saturadas con grupos hidroxilo (-OH), que pueden tener una función aldehídica (-CHO) o cetónica (-C=0). Los carbohidratos pueden ser clasificados en: Monosacáridos: Ejemplos son la glucosa, fructuosa y galactosa. Son sólidos, cristalinos, incoloros o blancos, dulces y solubles en agua. Su solubilidad, se debe a que tanto los radicales hidroxilo, como el grupo Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

2 carbonilo son polares y establecen por ello enlaces de hidrogeno con las moléculas de agua también polares. Dentro de sus propiedades químicas destaca que poseen poder reductor frente a determinadas sustancias (por ejemplo el licor de Fehling), debido a la presencia del grupo carbonilo que puede oxidarse a ácido con facilidad por disoluciones alcalinas de plata o cobre. Esta propiedad es utilizada para detectar su presencia en medios biológicos. Disacáridos: son dulces, solubles en agua, cristalizables y por hidrólisis se descomponen en sus monosacáridos constituyentes. Entre los disacáridos de mayor interés biológico, se pueden citar como ejemplo maltosa formada por dos moléculas de -glucosa, lactosa formada por una molécula de -galactosa y otra de -glucosa y sacarosa formada por una molécula de -glucosa y otra de -fructosa. Polisacáridos: son los azúcares más abundantes en la naturaleza y los de mayor peso molecular, formados por más de diez monosacáridos, unidos entre sí. Son insípidos, amorfos e insolubles en agua. Algunos pueden formar dispersiones coloidales. Los polisacáridos realizan funciones biológicas de dos tipos: de reserva energética y estructural. Los primeros (almidón y el glucógeno) presentan enlaces de tipo , mientras los segundos (celulosa y la quitina), poseen enlaces de tipo . Las proteínas son las macromoléculas más versátiles de las células. Cumplen funciones estructurales, de catalizadores (enzimas), de transporte, de regulación, de protección y de almacenamiento Una de las funciones más importantes de las proteínas es la de participar como catalizadores biológicos de reacciones químicas importantes, es decir, compuestos que incrementan la velocidad de la reacción química sin alterarla. El material en el cual el catalizador reacciona se llama sustrato, y es modificado durante la reacción para formar un nuevo producto. El sitio activo de una enzima puede unirse con el sustrato, formando el complejo enzima-sustrato. Es aquí donde ocurre la catálisis. Cuando ésta se completa, el complejo se disocia en enzimas y productos. Los lípidos son un grupo muy heterogéneo de macromoléculas que se definen por el hecho de que son solubles en solventes en disolventes orgánicos como la gasolina, benceno, xilol, cloroformo, pero prácticamente insolubles en agua. Los lípidos tienen una gran importancia biológica al ser un componente estructural de las membrana biológicas; son una fuente importante de reserva energética, predominantemente en la forma de triglicéridos; tanto vitaminas y hormonas son ejemplos ejemplos de lípidos y sus derivados. El componente principal de las grasas o lípidos son los ácidos grasos, que son almacenados y transportados en forma de triglicéridos (3 ácidos grasos unidos a una molécula de glicerol). Cuando en su molécula contienen ácidos grasos insaturados, las grasas se presentan como aceites, tal es el caso de los vegetales. Si contienen ácidos grasos saturados dan lugar a grasas sólidas o semisólidas, como ocurre en los animales (sebos y mantecas). Desde el punto de vista nutritivo son la mayor fuente de calorías, siendo utilizadas como reserva energética de uso no inmediato. Además, son portadoras de vitaminas liposolubles (A, D, E, K) y contienen los llamados ácidos grasos esenciales, de gran importancia para el buen funcionamiento del organismo. Algunos lípidos como el colesterol, forman parte importante de las membranas celulares. Los lípidos se clasifican de varias formas, una de ellas es atendiendo a la presencia ácidos grasos (saponificables) o no (no saponificables) en su composición, dividiéndose así en dos grupos: LÍPIDOS SAPONIFICABLES A. Simples 1. Acilglicéridos (grasas o aceites) esteres de glycerol y triglicéridos 2. Céridos (ceras) B. Complejos 1. Fosfolípidos 2. Glucolípidos

LÍPIDOS NO SAPONIFICABLES A. Terpenos B. Esteroides C. Prostaglandinas

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3 Entre las grasas biológicamente importantes encontramos a los fosfolípidos, los carotenoides y esteroides. Los fosfolípidos son un componente importante de la membrana celular, otros lípidos actúan como hormonas y algunos funcionan como almacén de energía a largo plazo (1 gr de grasa almacena más del doble de energía que 1 gr de carbohidratos). En el laboratorio, es posible extraer conclusiones acerca de la identidad, composición (pureza, autenticidad) y calidad (frescura, vida útil) de una grasa/aceite empleando diferentes métodos químicos o físico-químicos y sensoriales. Entre los métodos químicos (índices) destacan el de saponificación (cantidad de hidróxido potásico necesaria para la saponificación de 1 g de grasa), yodo (cantidad en gramos de yodo que resulta ligada por cada 100 g de grasa), acidez (cantidad en miligramos de hidróxido potásico necesaria para la neutralización de los ácidos grasos libres presentes en1 g de grasa) y de peróxidos (cantidad en miligramos de oxígeno activo en 1 Kg de grasa).

III. Procedimiento Durante la sesión de laboratorio se realizarán cuatro experimentos que le permitirán conocer los métodos colorimétricos de detección y algunas propiedades químicas de las macromoléculas. . Para lograr éste objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesión de laboratorio, realizarán y analizarán un experimento, de acuerdo a las indicaciones del instructor. Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se reúnen para hacer una discusión de los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir sus resultados.

Experimento1 Reconocimiento y propiedades de proteínas (A) Reconocimiento colorimétrico de proteínas Los componentes más importantes del reactivo de Biuret son NaOH y CuSO4, siendo el ión Cu2+el que reacciona con el grupo amino del enlace peptídico produciendo una coloración violeta. La intensidad de la coloración está relacionada con el número de enlaces peptídicos (cantidad de proteínas) presentes y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. Sin embargo, la sensibilidad del método es muy baja y no se recomienda para cuantificación de proteínas excepto en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). 1. Prepare 5 tubos de ensayos limpios y secos. Si hay disponibilidad, los tubos de ensayo pueden sustituirse por placas de reacción 2. Rotule cada tubo y dispense las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4 5

Contenido 2 ml de albúmina 2 ml de leche 2 ml de solución de gelatina 2 ml solución de aminoácidos 2 ml de agua destilada

3. Agregue a cada tubo, 5 gotas del reactivo de Biuret y agite. 4. Observe cuidadosamente el cambio en la coloración en cada tubo. Describa sus observaciones en el reporte. Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

4 (B) Propiedades de las enzimas: Velocidad de reacción de la catalasa y el efecto del pH en la reacción enzimática La enzima catalasa es muy activa en todas las células. Cataliza la reacción que disocia el peróxido de hidrogeno (agente oxidante fuerte) producto del metabolismo celular. En este experimento se usara una suspensión de la enzima catalasa (cultivo de Saccharomyces cereviciae al 1.5 % , extracto de papa o macerado de hígado) y el H2O2 como sustrato. 1. Formule una hipótesis de trabajo que relacione la presencia o no de la enzima catalasa en el cultivo de levadura y el uso del H2O2 como sustrato. Prediga los resultados 2. Prepare 5 tubos de ensayos con la siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4

Contenido H2O H2O2 (3%) H2O2 (6%) H2O2+ HCI

H2O

H2O2

5.0 ml 4.5 ml 4.0 ml 3.5 ml

0.0 ml 0.5 ml 1.0 ml 0,5 ml

H2O2/HCl H2O2/NaOH (0,1 M) (0.1 M) 0.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 1,0 ml 0,0 ml

H2O2+NaOH 3.5 ml 0,5 ml 0,0 ml 5 Nota: utilice la probeta graduada para H2O2, HCl y NaOH. Complete con dH2O hasta obtener el volumen final (5 ml)

1,0 ml

3. Mida el pH en cada uno de los tubos de ensayo y anótelo en el reporte en el cuadro respectivo. 4. Tome con una pinza 1 disco de papel de filtro y sumérjalo por 5s en la suspensión de catalasa Verifique que extrae sólo un disco y que éste se encuentre libre de residuos. Evite tocarlo con las manos. 5. Déjelo secar al aire ligeramente por unos 10 segundos. 6. Con otra pinza tome el disco y déjelo caer en uno de los tubos de ensayo que preparó anteriormente con la concentración de sustrato y pH conocido (no toque la solución con la pinza). 7. Tan pronto el disco detenga la caída en el tubo, marque ése punto e inicie el cronómetro. 8. Al iniciarse la reacción observe cuidadosamente el movimiento del disco. Cuando el disco alcance la superficie de la solución detenga el cronómetro. Anote el tiempo transcurrido. 9. Mida la distancia (mm) que recorrió el disco. Con ese valor y el tiempo transcurrido en el movimiento del disco, calcule la velocidad de reacción como: Velocidad de reacción = (mm/s)

Distancia recorrida por el disco (mm) / tiempo (seg).

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5 10. Repita este experimento (pasos 3 - 8) con otros 2 discos, utilizando el mismo sustrato. Si sus resultados no son consistentes, repita el procedimiento hasta obtener valores similares. En cada prueba debe utilizar una solución sustrato nueva

11. Repita el experimento en los otros tubos de ensayo utilizando otros discos (3 discos para cada tubo) 12. Reporte los datos obtenidos en el experiemnto, en un cuadro que diseñó previamente su grupo de trabajo. Complete el cuadro en el reporte. Responda las preguntas del reporte. Al finalizar el experimento, dispense el contenido de los tubos de ensayo en las botellas debidamente rotuladas.

Experimento 2 Reconocimiento de carbohidratos

Algunos azúcares (mono y disacáridos con un grupo libre aldehído y cetónico) son agentes reductores en soluciones alcalinas. El reactivo de Benedict es una solución alcalina que contiene iones cobre, los cuales pueden oxidar grupos aldehídos. A su vez lo iones Cu se reducen a óxido cuproso que forma un precipitado rojo. Cuando el reactivo de Benedict está en presencia de un azúcar reductor, éste produce cambios en la coloración de la solución que varía de amarillo a verde o rojo dependiendo de la cantidad y el tipo del azúcar presente, siguiendo la siguiente escala: azul

verde

naranja

(-)

(+)

(++)

rojo

rojo-marrón

(+++)

(++++)

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6 El reactivo de Barfoed también reconoce azucares reductores. Sin embargo, no es tan reactivo como el Benedict por lo que la velocidad con la que se forma el precipitado puede ser un indicativo entre mono o disacáridos: un precipitado rojo que se forma en 5-7 min es indicativo de la presencia de monosacáridos mientras, los disacáridos generalmente causan un precipitado entre 10-15 min. de calentamiento Por otra parte, el reactivo de Seliwanoff es frecuentemente usado para discriminar entre cetosas y aldosas. En ésta prueba el HCl concentrado actúa como agente dehidratante mientras el resorcinol actúa con el grupo cetona para producir un precipitado color rojo. En presencia de aldosas , frecuentemente no se produce ningúa cambio de coloración, aunque en ocasiones reaccionan produciendo un leve color rosa. Otro reactivo frecuentemente utilizado para discriminar entre pentosas y hexosas es el reactivo de Bial. Nuevamente, el agente dehidratante es el HCl concentrado, que en del compuesto orcinol y hierro, produce un precipitado azul si una pentosa está presente en la solución. Finalmente, compuestos a base de iodo reaccionan con polisacáridos que producen soluciones de diferentes colores. Específicamente, la amilosa rinde un color azul–negro oscuro, mientras la celulosa forma un precipitado rojo-marrón y el glicógeno produce rojizo. Monosacáridos y disacáridos son demasiado pequeños para reaccionar con el I2/KI. Es así que esta prueba permite distinguir entre mono/disacáridos y polisacáridos. También permite evaluar el curso temporal de la hidrólisis de algún polisacárido. Consideraciones de seguridad Reactivo de BENEDICT Irritante de ojos, piel y tracto respiratorio,si es ingerido produce problemas estomacales serios Reactivo de BARFOED, BIAL y SELIWANOFF Son corrosivos de ojos y piel; si son ingeridos producen graves problemas estomacales

DETECCIÓN DE POLISACÁRIDOS 1.

Prepare 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4

Contenido dH2O Almidón (1%) Glucosa (1%) Sustancia desconocida (1%)

2.

A cada uno de los tubos de ensayo, añada 3 gotas de reactivo de Lugol y mezcle ligeramente.

3.

Anote en el reporte la coloración final obtenida a los 20 minutos.

DETECCIÓN DE AZUCARES REDUCTORES 1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3

Contenido dH2O Lactosa (1%) Sacarosa (1%) Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

7 4

Sustancia desconocida (1%)

2. A cada uno de los tubos, añada 3 gotas del reactivo de Benedict y mezcle ligeramente. 3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 5-10 min y observe regularmente los cambios en la coloración de la solución. Anote en el reporte sus observaciones. 4. Al finalizar los 10 min, remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla. DETECCIÓN DE AZUCARES SIMPLES 1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4

Contenido dH2O Glucosa (1%) Sacarosa (1%) Sustancia desconocida (1%)

2. A cada uno de los tubos, añada 4 gotas del reactivo de Barfoed. Mezcle ligeramente 3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 5-10 min y observe cuidadosamente el tiempo y los cambios en la coloración del precipitado. Anote las observaciones 4. Luego de 10 min remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla. DETECCIÓN DE PENTOSAS 1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4

Contenido dH2O Ribosa (1%) Fructosa (1%) Sustancia desconocida (1%)

2. A cada uno de los tubos, añada 4 gotas del reactivo de Bial. Mezcle ligeramente 3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 1-3 min y observe cuidadosamente la coloración del precipitado. Anote las observaciones 4. Al finalizar la prueba, remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla. DETECCIÓN DE CETOSAS 1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4

Contenido dH2O Fructosa (1%) Glucosa (1%) Sustancia desconocida (1%) Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

8 2. A cada uno de los tubos, añada 4 gotas del reactivo de Seliwanoff. Mezcle ligeramente 3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 1-3 min y observe cuidadosamente la coloración del precipitado. Anote las observaciones 4. Al finalizar la prueba, remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla. Al finalizar el experimento, complete el cuadro en el reporte y describa los resultados obtenidos. Dispense el contenido de los tubos de ensayo en las botellas debidamente rotuladas y lave completamente todo el material utilizado.

Experimento 3 Reconocimiento y propiedades de lípidos

Este experimento está organizado para que lo realicen dos subgrupos de trabajo y consta de tres partes: detección colorimétrica de lípidos en solución, descripcíon de dos propiedades generales (saponificación y emulsificación) y, descripción de una propiedad específica de los lípidos. (A) Reconocimiento de lípidos El reconocimiento de los lípidos se realiza con el colorante Sudán III, un colorante liposoluble que tiñe las grasas selectivamente de color rojo-anaranjado. En presencia de una mezcla de lípidos y agua, Sudán III se mueve hacia la capa de lípidos, formando una banda roja. 1. Prepare 5 tubos de ensayo con las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4

Contenido 1 ml dH2O 1 ml aceite vegetal 1 ml leche regular 1 ml de solución desconocida

2. A cada uno de los tubos de ensayo, añada 5 gotas de Sudan III. 3. Mezcle el contenido de cada tubo y anote en el reporte el color del contenido del tubo. 4. Para comprobarla solubilidad de los lípidos en disolventes orgánicos, coloque en un tubo de ensayo: 1 ml de aceite+ 1 gota de Sudán III + 10 ml de acetona. 5. Tape y agite enérgicamente. Espere unos segundos. Describa sus resultados. (B) Propiedades generales de lípidos Los lípidos más abundantes son los que posen ácidos grasos, es decir, los lípidos saponificables. De ellos los triglicéridos (grasas y aceites) son los más característicos En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicas (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina. En este caso, la enzima lipasa es hidrosoluble pero su sustrato (triacilgliceroles) no lo es, por lo que se hace importante la participación de agentes emulsificantes (sales biliares) que reducen la tensión superficial de las grasas, separando las grasas en gotas mas pequeñas, aumentando así el área superficial de exposición a la acción enzimática.

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Los ésteres de ácidos grasos reaccionan en caliente con el hidróxido de sodio o potasio descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones (saponificación). En este experimento demostraremos dos propiedades generales de las grasas: saponificación y emulsificación por detergentes

(a) Saponificación 1. Prepare 2 tubos de ensayo. Dispense las siguientes soluciones: Tubo 1 2 3 4

Contenido 1 ml dH2O 1 ml aceite vegetal 1 ml aceite de coco 1 ml de solución desconocida

2. En un tubo añada 1ml de aceite (sin pipetearlo). En al otro, añada 1 ml de una solución desconocida. 3. Añada 5 ml de NaOH 0.5 M a cada y agite enérgicamente. Observe la apariencia y coloción de la solución. Anote sus observaciones 4. Caliente al baño María por unos 20-30 minutos. Al finalizar este tiempo, retire los tubos de ensayo y colóquelos en la gradilla. 5. Describa en el reporte, la apariencia y coloración de la preparación resultante.

(b) Emulsificación 1. Dispense 3ml de aceite a dos tubos de ensayo. A uno de ellos añada 3 ml de dH2O (puede teñir el agua con cualquier colorante vegetal para facilitar la observación). Describa que pasa en la mezcla agua: aceite. 2. Al segundo tubo de ensayo con aceite, añada 3 ml de agua y 2 gotas de solución de detergente liquido. 3. Tape ambos tubos y agite enérgicamente. Observe qué pasa en cada tubo inmediatamente después de agitar. Luego haga observaciones al transcurrir 1 min, 5 min y 30 min. Haga un registro de sus observaciones.

(c) Prueba de Acetato de cobre La presencia en partes iguales de acetato de cubre y éter, permite diferenciar entre lípidos saturados (origen animal) , insaturados (origen vegetal) y neutros. En el caso de acidos grasos saturados, una sal cúprica del acido graso no se disuelve en el éter de petróleo y precipita en el fondo del tubo de ensayo, mientras la sal cúprica del ácido graso insaturado, se disuelve en el éter de petróleo, formando una banda superior de coloración azul-verdosa 1.

En un tubo de ensayo, dispense las siguientes soluciones: Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

10 Tubo 1 2 3 4

Contenido 1 ml dH2O 1 ml aceite de oliva 1 ml aceite de coco 1 ml de solución desconocida

2.

Añada a cada tubo, 3 ml de éter de petróleo e igual volumen de acetato de cobre (1%).

3.

Tape la boca del tubo de ensayo y mezcle, inviertiendo el tubo de ensayo una sóla vez.

4.

Coloque cada tubo de ensayo en la gradilla y observe la separación de bandas.

5.

Describa el número y características de las bandas que se forman. Anote sus observaciones en el reporte

Experimento 4 Reconocimiento de macromoléculas en alimentos En la semilla, proteínas, carbohidratos y lípidos, se encuentran en diferente proporción y son importantes para el desarrollo del embrión que dará pie a la germinación de la planta. Este experimento utiliza semillas de maní, frijol, maíz y arroz para aplicar las pruebas colorimétricas de reconocimiento de macromoléculas. Se utilizarán las mismas pruebas descritas en los experimentos previos para identificar la presencia y la abundancia relativa de las macromoléculas en las semillas. 1. Seleccione 6 semillas de las que se encuentren disponible (girasol, maní, frijol, maíz, arroz, almendra). 2. Realice un corte longitudinal cerca de la mitad del grano, y coloque la parte con el mejor corte de cada semilla en una fila de la placa de reacción o en tubos de ensayo separados y rotulados para cada semilla. 3. Por filas, en la placa de reacción, agregue 2-5 gotas de los siguientes reactivos en cada espacio: reactivo de Biuret, lugol, Sudán III y reactivo de Benedict previamente calentado. En el caso de trabajar con tubos de ensayo, coloque las gotas de reactivo de manera que todas las semillas sean probadas con cada reactivo. 4. Espere unos segundos. Elabore un cuadro, anote sus resultados y responda las preguntas especificadas en el reporte.

Al finalizar los experimentos de esta práctica, debe prestar especial atención en dejar limpios todos los materiales utilizados y el área de trabajo. Los tubos de ensayo deben quedar limpios, sin residuos y colocados boca-abajo en sus respectivas gradillas para permitir el secado rápido.

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