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MACROPROCESO

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR (POE) PROCEDIMIENTO DE ADMINISTRACION DE SUSTANCIAS Y TOMA DE MUESTRAS SANGUINEAS INCLUYENDO RUTAS Y VOLUMENES EN ROEDORES DE LABORATORIO

REVISADO POR

APROBADO POR

Presidente CICUAL-PUJ

Decanatura de Ciencias

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1. OBJETIVO El objetivo de este procedimiento es establecer lineamientos estandarizados para el desarrollo de técnicas correctas de administración de sustancias y extracción de muestras sanguíneas en animales de laboratorio. La aplicación de estas técnicas se desarrolla con base a guías y normativas internacionales. 2. ALCANCE Este procedimiento se inicia con la manipulación y sujeción del modelo animal y finaliza con la administración de la sustancia o la toma de una muestra sanguínea necesaria para el desarrollo de un procedimiento experimental. El procedimiento puede ser realizado en ratones, ratas, cobayos, jerbos, hámster y roedores silvestres usados con fines experimentales. 3. DEFINICIONES 

Volúmenes de Inoculación: cantidad de solución o substrato preparado en mililitros que debe ser inoculado a un modelo animal, los volúmenes varían según la vía y especie animal seleccionada y muchas veces deben asociarse a un adyuvante, solvente o vehículo.



Dosificación: calculo establecido para definir el volumen de inoculación asociado al peso vivo del modelo animal, este cálculo normalmente se expresa en mililitros por kilo.

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Rutas de administración: diferentes vías que pueden ser utilizadas para administrar sustancias en modelos animales. Generalmente se manejan las vías intramuscular (i.m.), intravenosa (i.m.), intraperitoneal (i.v.), subcutánea (s.c.), oral (p.o) e intradérmica (i.d.). La selección de la vía depende de múltiples factores, entre ellos se deben considerar:  pH, osmolalidad y estabilidad de la sustancia  efecto y tasa de absorción  compatibilidad y solubilidad  dosis única o múltiples

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Inoculaciones parenterales: se refiere a todas las vías de administración de sustancias asociadas a una inoculación que generara un efecto sistémico; sin importar la vía las sustancias serán distribuidas por el torrente sanguíneo a todos los sistemas corporales. En caso de inoculaciones parenterales, es posible que la cantidad del inoculo sea absorbido por el sistema portal-hepático lo que llevara a procesos metabólicos hepáticos sin alcanzar una totalidad de distribución sistémica.

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Vehículos: sustancias o sustratos que se utilizan para diluir un compuesto a administrar en un modelo animal dependiendo de las características físico químicas que este tenga. Por ejemplo, compuestos que son solubles en agua pueden ser vehiculizados con agua estéril o solución salina al 0.9%; compuestos oleosos o viscosos pueden ser diluidos con acetona o aceite de maíz.



Seroma: formación de masa cutánea de consistencia liquida que puede presentarse luego de una mala inoculación subcutánea. En este caso se presenta un acumulo de líquido asociado a la sustancia inoculada que suele ser benigno. Si es necesario el contenido puede drenarse si es persistente luego de 8 días pos inoculo.

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Flebitis: inflamación de vasos sanguíneos venosos luego de una punción para administrar sustancias o extraer muestras de sangre. La flebitis suele asociarse a malas prácticas o múltiples punciones en una misma zona. En la zona afectada se evidencia tumefacción de la zona con coloración rojiza violeta del lecho vascular respectivo.



Volumen sanguíneo circulante: es el volumen total que tiene un modelo animal expresado en mililitros por kilogramo de peso. Existen variaciones leves asociadas al linaje y sexo, dependiendo de la especie el volumen varía considerablemente. Los volúmenes se presentan como medias, por ejemplo en la especie conejo el volumen medio es 56 ml/kg con un rango de 44 a 70 ml/kg.



Volumen de extracción: con base al volumen total sanguíneo, el volumen de extracción es la cantidad máxima de sangre que puede tolerar un modelo animal en un procedimiento determinado. Este factor debe calcularse teniendo en cuenta si la extracción es en toma única o en tomas progresivas en tiempos determinados; por ejemplo la extracción máxima del 7,5 % del volumen sanguíneo varia las respuestas de recuperación (1 a 2 semanas) dependiendo del tiempo de extracción (1 minuto o 1 día).

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Microvacutainer: recipiente triangular de doble boca utilizado para la recolección y almacenamiento de muestras de sangre. Permite la recolección de bajos volúmenes asociados a muestras de rata y ratón.

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4. FUNDAMENTOS La administración de sustancias y la toma de muestras sanguíneas son procedimientos rutinarios en al manejo, cuidado y uso de modelos animales con fines científicos. Una buena y exitosa práctica debe garantizar una observación del efecto deseado asociado a la sustancia expuesta o inoculada. El desarrollo de una buena técnica debe disminuir el dolor y malestar percibidos por el animal durante el procedimiento. 5. CONDICIONES GENERALES 

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Estos procedimientos deben ser llevados a cabo por personal entrenado en la ejecución de los mismos. En caso de investigadores o usuarios sin experiencia, el desarrollo de las técnicas deben ser supervisadas por los investigadores principales o el personal técnico y veterinario de la unidad de Bioterios. Este procedimiento solo puede llevarse a cabo en áreas o laboratorios asociados a la unidad de Bioterios, en caso de zonas diferentes, estos procedimientos deben ser previamente aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL PUJ). Para la administración de sustancias en roedores de laboratorio, se debe tener en cuenta los volúmenes permitidos según la especie seleccionada (tabla 1), volúmenes excesivos puede llevar a una pérdida del bienestar de los animales, en cualquier caso los valores deben ser ajustados según los requerimientos farmacológicos. En caso de ser necesario administrar volúmenes mayores a los permitidos, el procedimiento debe ser consultado con el coordinador de la unidad de Bioterios y se deben manejar varios sitios de inoculación. En algunas ocasiones se deben utilizar vehículos para la dilución de las sustancias a administrar, estos compuestos deben ser biológicamente inertes y no alterar la estabilidad de la sustancia y formulado, así mismo no debe ser toxico para los animales. Algunos ejemplos de vehículos son soluciones isotónicas acuosas, soluciones bufferadas, suspensiones y aceites. Cuando se mezcla el vehículo y la sustancia a implementar se debe validar la viscosidad, el pH y la osmolalidad. En el caso de administración de sustancias por vía oral, en algunas ocasiones puede ser necesario restringir por periodos cortos de tiempo el consumo de agua o alimentos. Debe tenerse en cuenta que esta restricción no debe superar las 2 – 4 horas por la alta tasa metabólica de estas especies. La administración de altos volúmenes (≥40 ml/kg) puede llevar a distensiones severas del estómago y reflujo esofágico, lo cual puede afectar la absorción de la sustancia.

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Es recomendable que las sustancias se administren por medio de una sonda oro gástrica para garantizar una adecuada dosificación. Las inoculaciones parenterales pueden ser administradas por vía subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa. En estos casos se debe tener en cuenta la estabilidad de la formulación, pH, viscosidad, osmolaridad, esterilidad y biocompatibilidad. En la mayoría de los casos se deben usar agujas calibre 27 y 24 con jeringas de 1 mililitro; con sustancias muy viscosas y densas puede ser necesario usar agujas calibre 22. En ningún caso deben usarse agujas calibre 18 o inferior en roedores de laboratorio. En caso de administración de sustancias por vía subcutánea se debe tener en cuenta que esta ruta es de lenta absorción y dependiendo de la sustancia puede tardar 30 minutos aproximadamente en llegar al torrente sanguíneo Las agujas de inoculación no debe utilizarse para cargar jeringas atravez de sellos de recipientes. En estos casos debe utilizarse una aguja de mayor calibre para ello, con esto se garantiza que la aguja de inoculación no pierda filo y el procedimiento será menos doloroso para el animal. En caso de administración de sustancias por vía intraperitoneal debe tenerse en cuenta el riesgo de administrar sustancias irritantes que induzcan peritonitis química, así mismo la absorción puede llevarse a cabo por la circulación sistémica o el circuito portal hepático. En caso de administración de sustancias por vía intramuscular debe tenerse en cuenta la ubicación ya que existe riesgo de lesionar nervios. En roedores las inyecciones pueden colocarse en los músculos epaxiales, glúteos y semitendinoso. Por otro lado debe tenerse en cuenta que formulaciones aceitosas pueden tener bajas tasas de absorción por esta vía (≥24 hrs). En caso de multidosis puede presentarse inflamación en la zona. En caso de administración de sustancias por vía intravenosa, generalmente se utiliza las venas laterales de la cola en la rata y el ratón. En caso de cobayos se puede acceder por la vena cefálica o safena. Así mismo se debe valorar la administración como inyección por bolos, intravenosa lenta o infusión constante. La inyección por bolos se utiliza en estudios con múltiples dosis, en este caso cada dosis se administra en un periodo estimado de 1 minuto. Este método se debe utilizar con sustancias con una alta compatibilidad con la sangre y poco viscosas, así mismo, si se pretende administrar altos volúmenes la temperatura de la solución debe ser similar a la corporal. En roedores los bolos no deben exceder una tasa de 3ml/min. La inoculación intravenosa lenta se utiliza en dosis únicas, en estos casos el tiempo de inoculación es de 5 a 10 minutos, lo que resulta útil en caso de soluciones levemente irritantes o poco solubles. Dado este tiempo prolongado, en estos casos es necesario fijar un catéter mariposa o catéter de administración de fluidos. El protocolo de infusión continua se utiliza en estudios de valoración secuencial de fármacos o diferentes sustancias. En estos casos el volumen de administración debe

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ser menor al 10% del volumen sanguíneo circulante en un periodo de 2 horas (tabla 2). La administración de sustancias por vía intradérmica se utiliza normalmente para estudios de hipersensibilidad y evaluación de inflamación. En este caso se deben manejar volúmenes de 0,05 – 0,1 mililitros por sitio de punción. En el caso de extracción de muestras deben tenerse en cuenta los volúmenes circulantes en relación con su peso corporal (Tabla 2), extracciones excesivas pueden llevar a alteraciones cardiovasculares, patrones respiratorios anormales y cambios comportamentales. Dependiendo del volumen de extracción deben establecerse unos tiempos base de recuperación para que la hemodinámia del animal vuelva a niveles normales (Tabla 4 y Tabla 5). Debe tenerse en cuenta que altos volúmenes de extracción cercanos al 15 y 20% pueden tardar hasta 30 días en recuperar la línea base sanguínea normal. Los sitios de veno-punción son establecidos según la especie involucrada. En algunos casos pueden presentarse cambios hematológicos en estudios de patología clínica. La toma de muestras sanguíneas por la vena lateral de la cola puede desarrollarse en ratas y ratones, pueden tomarse múltiples muestras en el tiempo que deben desarrollarse de distal a proximal para no perder la integridad del vaso sanguíneo. Los volúmenes de extracción puede ser de 0,1-0,15 mililitros en el ratón y 0,5-1 mililitro en la rata. La toma de muestras sanguíneas por las venas safenas pueden desarrollarse en ratas, ratones, hámster, gerbil y cobayos. Por este método pueden obtenerse volúmenes hasta del 5% del volumen sanguíneo circulante. La punción cardiaca siempre debe realizarse bajo anestesia general o como procedimiento terminal luego de practicar la eutanasia. La punción cardiaca siempre debe considerarse como un procedimiento terminal y no se debe permitir la supervivencia de los animales ya que pueden generarse sangrado pericárdico o tamponamiento cardiaco. La amputación de porciones distales de la cola solo puede utilizarse cuando se hayan descartado todas vías citadas. Esta técnica permite obtener volúmenes de extracción de 0.1-0.2 mililitros. Durante el procedimiento debe removerse un máximo de 5 milímetros y los animales debe estar sometidos a un plano anestésico. La toma de muestras por el plejo retro bulbar no es recomendable en ningún caso ya que suele generar complicaciones y se pueden generar pérdidas significativas de bienestar. La vena lateral de la oreja es una vía de extracción de sangre usada en cobayos, conejos y minipigs. Ofrece la ventaja de la arteria central de la oreja que puede permitir muestras de sangre arterial útiles en diferentes estudios.

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6. MATERIALES Y/O EQUIPOS Inoculación oral  Sonda oro-esofágica  Jeringas 1,2 o 5 mililitros  Sustancia a administrar  Vehículo (asociado a la sustancia)  Elementos de protección personal asociados al personal  Solución salina 0,9% (casos de comprobar ubicación de la sonda) Inoculación subcutánea  Aguja calibre 24  Aguja calibre 22 (soluciones acuosas o aceitosas)  Jeringas 1,2 o 5 mililitros  Sustancia a administrar  Vehículo (asociado a la sustancia)  Elementos de protección personal asociados al personal  Clorhexidina 2% (desinfección de la zona de inoculación) Inoculación intraperitoneal  Aguja calibre 24  Aguja calibre 22 (soluciones acuosas o aceitosas)  Jeringas 1,2 o 5 mililitros  Sustancia a administrar  Vehículo (asociado a la sustancia)  Elementos de protección personal asociados al personal  Clorhexidina 2% (desinfección de la zona de inoculación) Inoculación Intravenosa Elementos varían según la técnica empleada  Aguja calibre 24 o 27  Catéter calibre 24 (técnica 2)  Jeringas 1,2 o 5 mililitros  Sustancia a administrar  Vehículo (asociado a la sustancia)  Elementos de protección personal asociados al personal  Agua tibia  Cepo inmovilizador  Banda elástica (ocluir vena)  Vaselina estéril  Alcohol 70%  Lanceta

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Cuchilla minora Jabón hipo alergénico Infusión continua (venoclisis de micro goteo, bomba de infusión o buretrol)

Inoculación intradérmica  Aguja calibre 24  Jeringas de 1 mililitro  Sustancia a administrar  Vehículo (asociado a la sustancia)  Elementos de protección personal asociados al personal  Clorhexidina 2% (desinfección de la zona de inoculación) Extracción de muestras sanguíneas (Vena Safena y Cefálica)  Aguja calibre 24 o 22  Recipiente de recolección (tubos capilares o microvacutainer)  Cuchillas minora  Alcohol 70%  Vaselina estéril  Gaza  Elementos de protección personal asociados al personal  Cepo de inmovilización (opcional) Extracción de muestras sanguíneas (Plejo Submandibular)  Aguja calibre 24 o 22  Recipiente de recolección (tubos capilares o microvacutainer)  Cuchillas minora  Alcohol 70%  Vaselina estéril  Gaza  Elementos de protección personal asociados al personal Extracción de muestras sanguíneas (Vena lateral de la cola)  Aguja calibre 24 o 22  Catéter calibre 24  Recipiente de recolección (tubos capilares, jeringas o microvacutainer)  Alcohol 70%  Vaselina estéril  Gaza  Agua tibia  Banda elástica de oclusión  Elementos de protección personal asociados al personal

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Extracción de muestras sanguíneas (Punción Cardiaca)  Aguja calibre 24 o 22  Jeringas de 1 o 2 mililitros  Recipiente de recolección (vacutainer)  Alcohol 70%  Gaza  Elementos de protección personal asociados al personal Extracción de muestras de la vena marginal y la arteria central de la oreja       

Aguja calibre 22 o lancetas Recipiente de recolección (Microvacutainer, capilares) Alcohol 70% Gaza Pomada anestésica Cuchillas minora Elementos de protección personal asociados al personal

7. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO 7.1.

7.1.1.

PROCEDIMIENTO DE ADMINISTRACION DE SUSTANCIAS Y TOMA DE MUESTRAS SANGUINEAS INCLUYENDO RUTAS Y VOLUMENES EN ROEDORES DE LABORATORIO Administración de sustancias por vía oral en roedores

No.

DESCRIPCIÓN

1

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En caso de ratones el animal debe ser sujetado realizando una pinza en la base de la cola con el dedo meñique y la palma de la mano. Luego se debe tomar el pliegue cutáneo dorsal del cuello con los dedos índice y anular (figura 1). Se debe garantizar con la cavidad oral y el cuello estén en un ángulo igual o mayor a 60 grados.  En caso de ratas el animal debe ser sujetado realizando una pinza en la zona del cuello con los dedos índice y anular dirigiéndose de

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CARGO

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No.

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DESCRIPCIÓN

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CARGO

lateral a medial. Con el resto de la mano y dedos se sujeta al animal de la porción proximal del abdomen (figura 2).  En caso de cobayos el animal debe sujetarse con las dos manos, con una mano se le da base parte posterior del animal con la palma extendida y con la otra mano se sostiene el cuerpo del animal extendiendo los dedos desde la zona toraxica proximal hasta la zona abdominal media (figura 3). Preparación de la jeringa y sonda: La jeringa debe ser precargada con el volumen de sustancia a administrar, ver tabla 1. Una vez se complete el volumen la sonda debe acoplarse a la jeringa y se debe presionar levemente el embolo para garantizar que la sustancia quede al tope de la boquilla de la sonda y con esto evitar la introducción de aire en el estómago. Posteriormente se debe medir el largo de la sonda y compararlo con el aspecto ventral del tórax hasta el cartílago xifoides (aproximadamente hasta allí llegara la sonda). Ubicación de la sonda-jeringa: Para las tres especies la sonda debe iniciar su entrada con la boquilla hacia arriba atravez de la comisura labial. Se debe ir introduciendo lentamente la sonda lateral a la lengua y permitir que el animal exponga la lengua por acción refleja. Una vez la sonda llegue a la faringe y se sienta una leve obstrucción por los cartílagos traqueales, se deben hacer leves movimientos giratorios de la jeringa con el fin de facilitar la introducción de la sonda atravez de la porción proximal del esófago. Es poco probable en ratón y rata que la sonda se desplace a través de la tráquea, sin embargo dependiendo del calibre de la sonda esta puede palparse ventral a la tráquea a lo largo del cuello (Figura 4). Instilación de la sustancia: Una vez esté ubicada la sonda oro esofágica, se debe iniciar la administración de la sustancia, esta debe hacerse a una velocidad media observando si hay algún tipo de reacción anormal en el animal. Retiro de sonda y observación del animal: una vez se termine la instilación, la sonda debe ser retirada del animal, esto no suele presentar complicaciones. En caso de sentir resistencia en la extracción, deben realizarse movimientos giratorios leves de la

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DESCRIPCIÓN

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CARGO

jeringa. Cuando la sonda es retirada se debe observar al animal, su patrón respiratorio y si se desarrollan ruidos inspiratorios anómalos. Esto signos pueden indicar broncoaspiración y en tal caso se debe consultar con el veterinario de la unidad.

7.1.2.

Administración de sustancias por vía subcutánea en roedores

No.

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7

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DESCRIPCIÓN

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CARGO

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En caso de roedores el animal debe ser sujetado realizando una pinza en el pliegue cutáneo dorsal del cuello con los dedos índice y anular (figura 5). El animal debe permanecer en posición horizontal sobre una mesa y con el resto de la mano se debe hacer una leve fuerza para garantizar la inmovilidad del animal. Luego el pliegue dorsal debe dirigirse levemente con los dedos en dirección vertical con lo cual se formara un triángulo cutáneo con la piel estirada y el aspecto dorsal del cuello (figura 6). Preparación de la jeringa y sonda: La jeringa debe ser precargada con el volumen de la sustancia a administrar, ver tabla 1. Una vez se complete el volumen la aguja debe acoplarse a la jeringa. Ubicación de la aguja-jeringa: Una vez el animal este inmovilizado, el investigador debe sujetar la jeringa con la mano libre. Para ello debe tomar la jeringa con los dedos índice y anular en dirección latero medial, el dedo pulgar debe ubicarse en el mango del embolo (Figura 7). Con esta ubicación se debe observar que el embolo de la jeringa este hacia arriba, así la aguja-jeringa debe dirigirse en ángulo de 45 grados con relación al aspecto dorsal del animal, se realiza un movimiento suave de la mano que sostiene la jeringa en dirección caudal y se va percibiendo como la aguja atraviesa las capas de la piel que ofrecen una leve resistencia. Cuando se han penetrado estas capas la aguja se siente libre en el espacio subcutáneo (Figura 8).

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7.1.3.

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Instilación de la sustancia: Una vez esté ubicada la aguja-jeringa, se debe iniciar la administración de la sustancia, esta debe hacerse a una velocidad media observando si hay algún tipo de reacción anormal en el animal. Si durante la administración se empieza a formar un abultamiento debe detenerse el procedimiento y reubicar la aguja a un espacio subcutáneo libre (el abultamiento indica que el inoculo está acumulándose en las capas de la piel o en las fascias musculares). Una mala administración de la sustancia puede desarrollar un seroma en donde se perderá el efecto deseado por la inoculación (Figura 9). Retiro de aguja-jeringa y observación del animal: una vez se termine la instilación, la aguja-jeringa debe ser retirada del animal, esto no suele presentar complicaciones. En algunas ocasiones puede observarse un poco de sangrado por rasgadura de tejidos o perforación de vasos sanguíneos, en ese caso se debe hacer presión en la zona y devolver al animal a su jaula cuando sea evidente que el sangrado no perdura.

Administración de sustancias por vía intraperitoneal en roedores

No.

DESCRIPCIÓN

11

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En caso de ratones el animal debe ser sujetado realizando una pinza en la base de la cola con el dedo meñique y la palma de la mano. Luego se debe tomar el pliegue cutáneo dorsal del cuello con los dedos índice y anular (figura 1).En este procedimiento el animal debe ser dirigido desde la cabeza en dirección ventral, para garantizar que las vísceras intestinales se desplacen hacia el tórax y disminuya el riesgo de perforar el intestino (Figura 10).  En caso de ratas el animal debe ser sujetado realizando una pinza en la zona del cuello con los dedos índice y anular dirigiéndose de lateral a medial. Con el resto de la mano y dedos se sujeta al animal de la porción

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proximal del abdomen (figura 2). Cuando se trabaje con ratas de más de 250grms es recomendable realizar el procedimiento entre dos personas, la persona que sujeta al animal debe inmovilizar con una mano y con la otra estirar al animal desde el mango de la cola (Figura 11). En este procedimiento el animal debe ser dirigido desde la cabeza en dirección ventral, para garantizar que las vísceras intestinales se desplacen hacia el tórax y disminuya el riesgo de perforar el intestino. En caso de cobayos el animal debe sujetarse con las dos manos, con una mano se le da base parte posterior del animal con la palma extendida y con la otra mano se sostiene el cuerpo del animal extendiendo los dedos desde la zona toraxica proximal hasta la zona abdominal media (figura 3). En este procedimiento el animal debe ser dirigido desde la cabeza en dirección ventral, para garantizar que las vísceras intestinales se desplacen hacia el tórax y disminuya el riesgo de perforar el intestino.

Preparación de la jeringa y sonda: La jeringa debe ser precargada con el volumen de la sustancia a administrar, ver tabla 1. Una vez se complete el volumen la aguja debe acoplarse a la jeringa. Ubicación de la aguja-jeringa: Una vez el animal este inmovilizado, el investigador debe sujetar la jeringa con la mano libre. Para ello debe tomar la jeringa con los dedos índice y anular en dirección latero medial, el dedo pulgar debe ubicarse en el mango del embolo (Figura 7). Con esta ubicación se debe observar que el embolo de la jeringa este hacia arriba, así la aguja-jeringa debe dirigirse en ángulo de 45 grados con relación al aspecto ventral del animal. Se traza un cuadrante abdominal imaginario, en donde se ubicaría una línea en dirección cráneo-caudal desde el cartílago xifoides hasta el orificio urogenital, así mismo se ubica una línea que cruce por la mitad de la primera línea en dirección latero-lateral. Con esto el abdomen queda dividido en cuatro cuadrantes (Figura 12). La inoculación debe realizarse en el cuadrante inferior

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No.

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derecho ya que al lado izquierdo está ubicado el ciego y existe un riesgo de perforación.

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7.1.4.

Instilación de la sustancia: Una vez esté ubicada la aguja-jeringa, se debe iniciar la administración de la sustancia, esta debe hacerse a una velocidad media observando si hay algún tipo de reacción anormal en el animal. Normalmente el animal no debe tener ninguna reacción durante la administración. Retiro de aguja-jeringa y observación del animal: una vez se termine la instilación, la aguja-jeringa debe ser retirada del animal, esto no suele presentar complicaciones. Con algunas sustancias los animales pueden presentar manifestaciones leves de dolor que pueden durar unos cuantos segundos.

Administración de sustancias por vía intravenosa en roedores VENAS LATERALES DE LA COLA (Rata y Ratón) VENAS CEFALICA Y SAFENA (Cobayos)

No.

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DESCRIPCIÓN

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CARGO

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En caso de ratones y ratas el animal debe ser inmovilizado por medio de un cepo específico de especie (figura 13). Este sistema permite una adecuada exposición de la cola que facilita el procedimiento.  En caso de cobayos el animal debe sujetarse con las dos manos, con una mano se sujeta la zona caudal del animal y con la otra se sujeta el miembro anterior o posterior ocluyendo a la altura de la articulación humero radio-cubital o fémur tibia-peroné. Este procedimiento debe hacerse entre dos personas (inmovilización y aplicación) (Figura 14). Preparación de materiales y exposición de la zona de inoculación: Para la inoculación en las venas laterales de la cola se debe colocar una banda de oclusión en el mango de la cola o contar con apoyo de una persona que ocluya con los dedos índice y pulgar. Al hacer esta oclusión se debe girar

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CARGO

levemente la mano para mejorar la exposición de la vena. Posteriormente la cola es inmersa en agua tibia para mejorar la vasodilatación por 1 minuto aproximadamente. Luego se pasa una gaza con alcohol al 70% sobre la zona de inoculación y el observador identifica la ubicación de la vena que discurre sobre los aspectos laterales de la cola de forma paralela (no confundir con la arteria que discurre por el aspecto medial y se observa más profunda) (Figura 15). En caso de cobayos, la primera opción son las venas cefálicas. Estas pueden ser ubicadas sobre la superficie dorsal del radio en su aspecto medial-proximal. Cuando el personal de apoyo hace la oclusión es palpable la ubicación de la vena, en tal caso se realiza una leve depilación de la zona con ayuda de una cuchilla y jabón hipo alergénico. Luego se aplica una gaza con alcohol al 70% para mejorar la dilatación del vaso sanguíneo (Figura 16). Para la exposición de las venas safenas el procedimiento es similar pero en este caso se busca la vena que discurre desde el aspecto lateral del corvejón atravez de la tibia hasta el aspecto proximal de los metatarsos. En todos los protocolos, la jeringa debe ser precargada con el volumen de la sustancia a administrar, ver tabla 1. Una vez se complete el volumen la aguja debe acoplarse a la jeringa. Ubicación de la aguja-jeringa: En las venas laterales de la cola, la persona debe sujetar la punta distal de la cola con una mano y sostener la jeringa-aguja con la otra, la jeringa debe sujetarse de tal forma que una vez se introduzca la jeringa con el dedo pulgar pueda realizar la administración. En general las venas discurren superficiales lo que lleva a que solo se debe introducir la aguja unos milímetros, la aguja es ubicada con el orificio hacia arriba en ángulo 10 grados aproximadamente, esto es posible por el leve dobles de la cola que se hace con la mano que la sujeta (Figura 17). Una vez se ubica la jeringa, puede observarse un poco de sangre en la jeringa lo que garantiza que la ubicación ha sido exitosa (esto no se observa en todos los casos). En los cobayos el procedimiento es similar pero con una mano se palpa la vena y se coloca el dedo como guía y con la otra se ubica la aguja-jeringa.

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR PROCEDIMIENTO DE ADMINISTRACION DE SUSTANCIAS Y TOMA DE MUESTRAS SANGUINEAS INCLUYENDO RUTAS Y VOLUMENES EN ROEDORES DE LABORATORIO

No.

19

20

DESCRIPCIÓN

CODIGO:

[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Ubicación del catéter: La ubicación de catéteres es similar, sin embargo en este caso se utiliza una aguja que sirve de guía. Se toma el catéter desde el mango y se inserta lateral o dorsal a la vena, inmediatamente se observa salida de sangre atravez de la aguja cuando el procedimiento ha sido exitoso. Luego se deja fija la aguja y con el dedo pulgar se introduce el catéter el cual debe desplazarse sin ofrecer mayor resistencia. Una vez se ha introducido el catéter la aguja se retira y el catéter se tapa y fija con ayuda de esparadrapo. La fijación es importante ya que malas fijaciones llevan a extravasación de soluciones a inocular (Figura 18). Instilación de la sustancia: Una vez esté ubicada la aguja-jeringa o catéter, se debe iniciar la administración de la sustancia, esta debe hacerse a una velocidad media o lenta observando si hay algún tipo de reacción anormal. Si la aguja o catéter no están en el lecho vascular se va a observar extravasación de la solución con un abultamiento de la zona y palidez del tejido circundante. En estos casos se debe detener el procedimiento y buscar otra vena para iniciar de nuevo. En inoculaciones exitosas se puede observar y palpar como el inoculo se desplaza atravez de la vena (percepción del flujo). Instilación en infusión continua: En casos de infusiones continuas o intravenosas muy lentas es necesario ubicar y fijar catéteres. Esto puede ser difícil en ratones por el tamaño de las venas, por tal razón estos procedimientos son útiles en ratas y cobayos. Para el desarrollo del protocolo se debe implementar la vía con ayuda de un venoclisis de micro goteo conectado a un buretrol o bomba de infusión. El cálculo de la tasa y velocidad de infusión debe realizarse minuciosamente, teniendo en cuenta que el desarrollo de sobre hidrataciones es frecuente por administraciones demasiado rápidas (Tabla 3). Retiro de aguja-jeringa y observación del animal: una vez se termine la instilación, la aguja-jeringa debe ser retirada del animal, esto no suele presentar complicaciones. En algunas ocasiones debe hacerse presión en la zona para evitar un leve sangrado. Los catéteres pueden fijarse y utilizarse máximo

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR PROCEDIMIENTO DE ADMINISTRACION DE SUSTANCIAS Y TOMA DE MUESTRAS SANGUINEAS INCLUYENDO RUTAS Y VOLUMENES EN ROEDORES DE LABORATORIO

No.

DESCRIPCIÓN

CODIGO:

[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

por tres días, periodos más prolongados llevan a cuadros de flebitis.

7.1.5.

Administración de sustancias por vía intradérmica en roedores

No.

21

22

23

DESCRIPCIÓN

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En caso de roedores el animal debe ser sujetado realizando una pinza en el pliegue cutáneo dorsal del cuello con los dedos índice y anular (figura 5). El animal debe permanecer en posición horizontal sobre una mesa y con el resto de la mano se debe hacer una leve fuerza para garantizar la inmovilidad del animal. Luego el pliegue dorsal debe dirigirse levemente con los dedos en dirección vertical con lo cual se formara un triángulo cutáneo con la piel estirada y el aspecto dorsal del cuello (figura 6). Preparación de la jeringa y sonda: La jeringa debe ser precargada con el volumen de la sustancia a administrar, ver tabla 1. Una vez se complete el volumen la aguja debe acoplarse a la jeringa. Ubicación de la aguja-jeringa: Una vez el animal este inmovilizado, el investigador debe sujetar la jeringa con la mano libre. Para ello debe tomar la jeringa con los dedos índice y anular en dirección latero medial, el dedo pulgar debe ubicarse en el mango del embolo (Figura 7). Con esta ubicación se debe observar que el embolo de la jeringa este hacia arriba, así la aguja-jeringa debe dirigirse en ángulo de 45 grados con relación al aspecto dorsal del animal, se realiza un movimiento suave de la mano que sostiene la jeringa en dirección caudal y se va percibiendo como la aguja queda ubicada entre las capas de la piel que ofrecen una leve resistencia. Debe sentirse esta resistencia para garantizar una adecuada ubicación.

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR PROCEDIMIENTO DE ADMINISTRACION DE SUSTANCIAS Y TOMA DE MUESTRAS SANGUINEAS INCLUYENDO RUTAS Y VOLUMENES EN ROEDORES DE LABORATORIO

No.

24

25

7.1.6.

DESCRIPCIÓN

27

VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Instilación de la sustancia: Una vez esté ubicada la aguja-jeringa, se debe iniciar la administración de la sustancia, esta debe hacerse a una velocidad media observando si hay algún tipo de reacción anormal en el animal. Es normal que se forme una pequeña masa o poca difusión de la sustancia ya que la solución se almacena entre la dermis y epidermis. Dependiendo de la velocidad de absorción esta hallazgo ira desapareciendo. Retiro de aguja-jeringa y observación del animal: una vez se termine la instilación, la aguja-jeringa debe ser retirada del animal, esto no suele presentar complicaciones. En algunas ocasiones puede observarse un poco de sangrado por rasgadura de tejidos o perforación de vasos sanguíneos, en ese caso se debe hacer presión en la zona y devolver al animal a su jaula cuando sea evidente que el sangrado no perdura.

Extracción de muestras sanguíneas por las venas laterales de la cola

No.

26

CODIGO:

[Codigo_Documento]

DESCRIPCIÓN

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En caso de ratones y ratas el animal debe ser inmovilizado por medio de un cepo específico de especie (figura 13). Este sistema permite una adecuada exposición de la cola que facilita el procedimiento. Preparación de materiales y exposición de la zona: Para la toma de muestras en las venas laterales de la cola se debe colocar una banda de oclusión en el mango de la cola o contar con apoyo de una persona que ocluya con los dedos índice y pulgar. Al hacer esta oclusión se debe girar levemente la mano para mejorar la exposición de la vena. Posteriormente la cola es inmersa en agua tibia para mejorar la vasodilatación por 30 segundos aproximadamente. Luego se pasa una gaza con alcohol al 70% sobre la zona de punción y el observador identifica la

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR PROCEDIMIENTO DE ADMINISTRACION DE SUSTANCIAS Y TOMA DE MUESTRAS SANGUINEAS INCLUYENDO RUTAS Y VOLUMENES EN ROEDORES DE LABORATORIO

No.

28

DESCRIPCIÓN

CODIGO:

[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

ubicación de la vena que discurre sobre los aspectos laterales de la cola de forma paralela (no confundir con la arteria que discurre por el aspecto medial y se observa más profunda) (Figura 15). Se debe tener en cuenta que por esta vía se pueden obtener hasta 0,15 ml en ratones y 1ml en ratas. Ubicación de la aguja-jeringa o lanceta: En este procedimiento se pueden utilizar jeringas y catéteres en ratas y agujas o lancetas en el ratón para la exposición de la muestra. En las venas laterales de la cola, la persona debe sujetar la punta distal de la cola con una mano y sostener el instrumento con la otra, la jeringa debe sujetarse de tal forma que una vez se introduzca la jeringa con el dedo pulgar pueda realizar la extracción de la muestra. En general las venas discurren superficiales lo que lleva a que solo se debe introducir la aguja unos milímetros, la aguja es ubicada con el embolo hacia arriba en ángulo 10 grados aproximadamente, esto es posible por el leve dobles de la cola que se hace con la mano que la sujeta (Figura 17). Una vez se ubica la jeringa, puede observarse un poco de sangre en la entrada de la jeringa lo que garantiza que la ubicación ha sido exitosa (esto no se observa en todos los casos). Cuando se asegura la ubicación en el lumen de la vena se debe iniciar la extracción lentamente para evitar colapsar el vaso sanguíneo. En el caso de ratones se debe aplicar en la zona de punción una capa de vaselina estéril, esto favorecerá que la sangre no se adhiera a la piel. Luego se realiza la punción de la vena y el contenido de sangre que se empieza a obtener puede ser recolectado con ayuda de un microvacutainer. Ubicación del catéter: La ubicación de catéteres es similar, sin embargo en este caso se utiliza una aguja que sirve de guía. Se toma el catéter desde el mango y se inserta lateral o dorsal a la vena, inmediatamente se observa salida de sangre atravez de la aguja cuando el procedimiento ha sido exitoso. Luego se deja fija la aguja y con el dedo pulgar se introduce el catéter el cual debe desplazarse sin ofrecer mayor resistencia. Una vez se ha introducido el catéter la aguja se retira y se empieza a obtener la muestra sanguínea que pasa por el catéter por

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No.

DESCRIPCIÓN

CODIGO:

[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

acción capilar, se ubica en la boca posterior un tubo de recolección (Figura 19).

29

7.1.7.

Retiro del instrumento y observación del animal: una vez se termine la extracción, el instrumento debe ser retirado del animal, esto no suele presentar complicaciones. En algunas ocasiones debe hacerse presión en la zona para evitar un leve sangrado.

Extracción de muestras sanguíneas por las venas safenas y cefálicas

No.

30

31

32

DESCRIPCIÓN

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En el caso de ratones, ratas y cobayos animal debe sujetarse con las dos manos, con una mano se sujeta la zona caudal del animal y con la otra se sujeta el miembro anterior o posterior ocluyendo a la altura de la articulación humero radio-cubital o fémur tibia-peroné. Esto también puede hacerse con ayuda de un de un cepo de inmovilización (Figura 20). Así mismo, Este procedimiento debe hacerse entre dos personas (inmovilización y aplicación). En el caso de ratones la sujeción debe hacerse con una suave presión de las áreas. Preparación de materiales y exposición de la zona: Las venas safenas se ubican como una proyección lateral de la vena tarsal. En la observación la vena discurre desde el aspecto lateral del corvejón atravez de la tibia hasta el aspecto proximal de los metatarsos. Cuando el personal de apoyo hace la oclusión es palpable la ubicación de la vena, en tal caso se realiza una leve depilación de la zona con ayuda de una cuchilla y jabón hipo alergénico. Luego se aplica una gaza con alcohol al 70% para mejorar la dilatación del vaso sanguíneo. Ubicación de la aguja-jeringa o lanceta: Con la ubicación de la zona el último paso es aplicar una capa de vaselina estéril sobre la zona de exposición, esto permitirá evitar que la sangre se adhiera a la piel. La punción debe realizarse en ángulo de 90

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No.

CODIGO:

[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

RESPONSABLES

DESCRIPCIÓN

UNIDAD

CARGO

grados con una leve presión, esto llevara a una salida de gotas gruesas de sangre que pueden ser recolectadas con un capilar o micovacutainer (Figura 21). En el caso de las venas cefálicas el procedimiento es similar pero los vasos sanguíneos son ubicados sobre la superficie dorsal del radio en su aspecto medial-proximal.

33

Retiro del instrumento y observación del animal: una vez se termine la extracción se debe hacer presión de la zona para detener el sangrado

7.1.8. Extracción submandibular No.

34

35

36

37

de

muestras

sanguíneas

DESCRIPCIÓN

por

el

plejo

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  En el caso de ratones y ratas, el animal se sostiene del pliegue dorsal de la cabeza y cuello generando una leve extensión de la piel, lo que desarrollara una buena exposición de la zona del musculo macetero y comisura labial (Figura 22). Preparación de materiales y exposición de la zona: La zona debe ser depilada manualmente o con ayuda de una cuchilla minora, luego se pasa una gaza con alcohol al 70% y se coloca una capa de vaselina estéril. La vena se ubica en el aspecto latero-ventral con relación a la comisura de la boca, se pueden observar los plejos venosos con una tonalidad de azul oscuro. Ubicación de la aguja o lanceta: la aguja debe ubicarse en ángulo de 90% directamente sobre el plejo. Se debe puncionar con un movimiento suave y se observara la salida de una gota gruesa que debe ser recolectada rápidamente. Esta zona se caracteriza por un buen flujo sanguínea lo que permite obtener una buena muestra (Figura 23). Retiro del instrumento y observación del animal: una vez se termine la extracción se debe hacer presión de la zona para detener el sangrado.

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7.1.9.

39

40

41

VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

Extracción de muestras sanguíneas por punción cardiaca

No.

38

CODIGO:

[Codigo_Documento]

DESCRIPCIÓN

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Sujeción e inmovilización: El modelo animal “roedor” debe ser sujetado de la siguiente manera:  El animal debe ubicarse en decúbito supino y se debe garantizar ausencia de reflejos (corneal y podal). Preparación de materiales y exposición de la zona: Se debe palpar la zona external con los dedos índice y pulgar a nivel de la 4 costilla aproximadamente. El dedo pulgar se ubica en el costado lateral izquierdo y el anular en el derecho. Lentamente se ubica el punto de mayor intensidad cardiaca (PMI) y el dedo pulgar se coloca caudal a este. Ubicación de la aguja-jeringa: Con la otra mano se sostiene la jeringa y se ubica la aguja en ángulo de 45% directamente sobre el PMI. Lentamente se introduce la aguja un centímetro aproximadamente y se observa si hay salida de sangre atravez de la aguja por capilaridad. En caso negativo se puede reubicar la aguja con muy leves movimientos, direccionando la aguja hacia craneal y caudal. Con una adecuada ubicación, lentamente se empieza a succionar la sangre con el dedo pulgar, la mano debe estar fija y solo debe moverse el dedo para evitar malas reubicaciones (Figura 24). Retiro del instrumento y observación del animal: una vez se termine la extracción se debe hacer presión de la zona para detener el sangrado, se debe garantizar la eutanasia del animal y confirmar la muerte por los medios respectivos.

7.1.10. Extracción de muestras sanguíneas por venas laterales y arteria central de la oreja en cobayos No.

DESCRIPCIÓN

42

Sujeción e inmovilización: El cobayo o conejo puede ser inmovilizado con un cepo o con un campo, envolviendo el cuerpo del animal y dejando expuesta la cabeza (Figura 25).

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No.

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44

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-

DESCRIPCIÓN

CODIGO:

[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

FECHA: XXXX de XXXX

RESPONSABLES UNIDAD

CARGO

Preparación de materiales y exposición de la zona: La oreja puede ser depilada con una cuchilla sobre la zona adyacente a los márgenes laterales y distales, se administra una pomada anestésica y se deja actuar por 20 minutos. Se aplica una gaza con alcohol y se hacen movimientos de la oreja para favorecer la vasodilatación. Ubicación de la aguja-jeringa: Previamente se prepara una aguja calibre 22 o una lanceta, su ubica la vena en su aspecto latero-distal y se realiza una punción introduciendo el instrumento en ángulo de 45 grados. Se observa salida de sangre y esta debe ser recolectada con un tubo, capilar o microvacutainer. En algunas ocasiones se puede instalar y fijar un catéter intravenoso calibre 24, lo que facilita múltiples tomas de muestras. La arteria central también puede utilizarse siguiendo el mismo procedimiento ubicando la arteria en el margen central de la base de la oreja dirigiéndose hacia el ápice medio. Retiro del instrumento y observación del animal: siempre debe aplicarse presión por 5 varios minutos (arteria) para evitar la formación de hematomas. No suelen presentarse complicaciones en los animales.

Figura.

Figura 1. Sujeción del ratón (tomada de Newcastle University).

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CODIGO:

[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

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Figura 2. Sujeción de la rata (Tomada de Newcastle University).

Figura 4. Sujeción paso de sonda oro-esofágica.

Figura 5. Sujeción del ratón (tomada de Newcastle University).

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[Codigo_Documento] VERSIÓN: X

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Figura 6. Inoculación subcutánea (tomada de Newcastle University).

Figura 6b. Inoculación subcutánea (tomada de Newcastle University).

Figura 12. Inoculación intraperitoneal (tomada de Newcastle University).

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Figura 13. Cepo inmovilizador (Tomada de Newcastle University).

Figura 18. Ubicación catéter venas laterales cola (Tomada de Newcastle University).

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Tablas.

Tabla 1. Volúmenes de administración (volúmenes máximos tolerables)¹ Especie

Rutas y Volúmenes (ml/Kg) Oral

S.C.

I.P.

I.M.

I.V. (bolos)

I.V. lento

Ratón

10 (50)

10 (40)

20 (80)

0.05 (0.1)²

5

(25)

Rata

10 (40)

5 (10)

10 (20)

0.1 (0.2)²

5

(25)

¹Para inyecciones acuosas se debe considerar el tiempo de absorción antes de re dosificar. No se pueden administrar más de dos inyecciones intramusculares por sitio una vez al día. Las inyecciones sub cutáneas no pueden ser más de tres por sitio por día. ²Valores en mililitros por sitio de inoculación.

Tabla 2. Volúmenes sanguíneos circulantes Especie

Volumen sanguíneo (ml/Kg) Media recomendada¹

Rango de medias

Ratón

72

63 - 80

Rata

64

58 - 70

¹Las medias recomendadas corresponden a el punto medio del rango de las medias.

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Tabla 3. Infusión intravenosa con repeticiones: dosis (volumen/tasa)¹ Ratón

Rata

Volumen diario total (ml/kg) 4 horas

20

24 horas

96(192)

60(96)

Tasa (ml/kg hora) 4 horas

5

24 horas

4(8)

2.5(4)

¹Se incluyen valores máximos tolerados ().

Tabla 4. Volúmenes limite y periodos de recuperación Toma de muestra única % del volumen sanguíneo removido

Toma de muestras múltiples

Periodo aproximado de recuperación

% del volumen sanguíneo removido en 24 horas

Periodo aproximado de recuperación

7.5%

1 semana

7.5%

1 semana

10%

2 semanas

10-15%

2 semanas

15%

4 semanas

20%

3 semanas

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Tabla 5. Volúmenes sanguíneos totales y volúmenes máximos de extracción por peso corporal Especie

Volumen sanguíneo (ml)

7.5%

10%

15%

20%

(ml)

(ml)

(ml)

(ml)

Ratón (25g)

1.8

0.1

0.2

0.3

0.4

Rata (250g)

16

1.2

1.6

2.4

3.2

Conejo (4kg)

224

17

22

34

45

8. RELACIÓN DE REGISTROS NOMBRE

CÓDIGO

9. DOCUMENTOS ASOCIADOS

IDENTIFICACIÓN DEL DOCUMENTO

NOMBRE

INTERNO

EXTERNO

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10.

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DOCUMENTOS DE REFERENCIA



Heinz Karl, Hull Robin, Morton David. A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes. J. Appl. Toxicol. 21, 15-23 (2001).



Hull RM. Guideline limit volumes for dosing animals in the preclinical stage of safety evaluation. Hum. Exp. Toxicol. 14, 305-307 (1995).



D. B. Morton, M. Jennings, A. Buckwell, R. Ewbank. Refining procedures for the administration of substances. Lab Anim January 1, 2001 35: 1-41

11.

ANEXO

ANEXOS

NOMBRE DEL ANEXO

ANEXO 1 ANEXO 2 ANEXO 3 ANEXO 4

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