Pruebas de laboratorio para la determinación de antígenos y anticuerpos.

ANTICUERPOS MONOCLONALES • KOHLER Y MILSTEIN 1975 • LB + CELULA MIELOMICA • ANTICUERPOS CONTRA UN SOLO DETERMINANTE ANTIGENICO

Las células de mieloma pierden la capacidad de sintetizar nucleótidos Hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa Síntesis de novo

Hipoxantina Guanina

Aminopterina Análogo Ac fólico

Mieloma pierden HGPRT Purinas Nucleótidos

AMPLIFICACION DE HIBRIDOMAS

ANTICUERPOS MONOCLONALES Poblacion de anticuerpos con isotipo e idiotipo idéntico, generados por un clon único •Purificar moléculas •Estudio de la estructura y diversidad de los anticuerpos •Identificar antígenos: Definir subpoblaciones celulares •Función celular: Detección de citocinas intracelulares •Cuantificar: Células que expresan un antígeno o cantidad de moléculas por célula

Este es un anticuerpo monoclonal o policlonal?

Especificidad

Capacidad de discriminar entre dos moléculas relacionadas, el antígeno frente al cual está dirigido. ANTICUERPO

Reactividad cruzada Capacidad de reaccionar con ligandos relacionados con el Antígeno.

ANTICUERPOS CATALITICOS Algunos acps tienen la capacidad de acelerar reacciones enzimáticas porque al unirse a una molécula puede disminuir la E necesaria para un cambio de estado. ACPS BIESPECIFICOS Y BIFUNCIONALES Redireccionar la actividad de las células citolíticas. ANTICUERPOS HUMANIZADOS Fusión de células humanas con mielomas animales o con cells tumorales humanas. Combinación de regiones variables de ratón con regiones ctes de humano.

APLICACIONES CLINICAS • Eliminación de células T de MO antes de transplante (con C’) • Anti-CD3 en pacientes con transplante de riñón como tratamiento para reacciones de rechazo. • En cancer para eliminación de células tumorales. • Anti LPS para el tratamiento de sepsis. • Anti IL-6 para TTo de mieloma múltiple • Anti IgE para tto de alergia • Anti TNFα para el to de artritis • Anti VSR en niños • Anti R- de IL-2 para la prevención del rechazo a los injertos. • Anti idiotipo en linfoma B

Afinidad

Número de interacciones no covalentes en el sitio de interacción entre el epítope y el idiotipo.

Avidez

ANTICUERPOS MONOCLONALES Poblacion de anticuerpos con isotipo e idiotipo idéntico, generados por un clon único •Purificar moléculas •Estudio de la estructura y diversidad de los anticuerpos •Identificar antígenos: Definir subpoblaciones celulares •Función celular: Detección de citocinas intracelulares •Cuantificar: Células que expresan un antígeno o cantidad de moléculas por célula

Que es un conjugado?

Marcador que permite revelar la reacción antígeno -anticuerpo

Ag

PRUEBAS DE INTERACCIÓN PRIMARIA: Requieren un sistema de visualización

FLUOROCROMOS

FLUORESCENCIA

ENZIMAS

ELISA

RADIOISOTOPOS

RIA

PARTICULAS DE ORO

MICROSCOPIA ELECTRONICA

¿Qué es un fluorocromo? 488 nm

HO

O

530 nm

CO2H

Luz Incidente

Molécula de

Luz Fluorescente Emitida

Fluoresceína

• El fluorocromo absorbe la luz del láser • El fluorocromo emite un rayo luminoso de diferente longitud de onda

INMUNOFLUORESCENCIA Utilizada para investigar la presencia y ubicación de antígenos presentes en las células IF DIRECTA DETECCIÓN DE ANTÍGENO

Se busca detectar el antígeno presente en la célula

IF INDIRECTA DETECCIÓN DE ANTÍCUERPO

Se busca detectar el anticuerpo específico para el antígeno presente en la célula

Los lavados permiten la eliminación de anticuerpos que no reaccionan

Microscopio de fluorescencia

Citómetro de flujo

Microscopio confocal

Inmunoensayo ligado a enzimas Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

ELISA Evans y Perlman en 1971

ELISA

LAVADOS

LAVADOS Ag

LAVADOS Ag

BLOQUEO

MUESTRA • Sobrenadante de cultivos – Libre de células

• Fluidos Biológicos – Plasma, suero, orina, materia fecal, saliva, lágrimas, líquido ascítico, LCF, etc. – Libre de detritos – Libre de contaminantes (hemoglobina) CONSERVACIÓN, PROTEASAS

EXPRESIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Absorbancia

• Determinar la concentración (µg/ml) CURVAS DE CALIBRACIÓN

1.0

10

20 30 40 50 60 70

Concentración µg/ml (patrón)

EXPRESIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS • Punto de corte – Muestras de individuos sanos – X+2S Valor de absorbancia al PC=positivo Absorbancia al PC= negativo Abs + ó – el 10% del PC = repetir

• Unidades arbitrarias de absorbancia • Diluciones

RESULTADOS ANTICIPADOS

Un ensayo de ELISA sandwich es generalmente la configuración más sensible de la prueba de ELISA y se espera la detección de antígenos proteicos con concentraciones entre: 100 pg/ml – 1 ng/ml Las ELISAS que utilizan antígeno directamente unido a la placa son generalmente un orden de magnitud menos sensibles que las pruebas en sandwich.

PRUEBAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA

Visible macroscópicamente

PRECIPITACION: Requieren un soporte

1. Se realiza la determinación de IgM específica por diferentes técnicas de ELISA y se encuentran niveles superiores al punto de corte frente a Virus de a Rubéola, antígenos de grupos sanguíneos, virus de hepatitis A.

PREGUTA: • Que es el punto de corte en las pruebas de ELISA y como se interpretan los resultados para cada uno de los antígenos evaluados.

2. Se realiza la determinación de IgM e IgG específica para Toxoplasma gondii y se encuentran los siguientes casos: a. Niveles de IgM negativos y de IgG positivosb. Niveles negativos de IgM cuantificados por b. ELISA sándwich y positivos por ELISA de captura c. Niveles de IgM positivos e IgG negativos d. IgG positivo débil en la primera muestra, aumento de 4 veces e título en la segunda muestra (15 días después de la primera) PREGUNTAS: • Cual es el significado en la clínica y en la respuesta inmune en cada uno de los casos • Como se explican los resultados divergentes en el punto b • A que se refiere la seroconversión

3. En diferentes individuos se detectan niveles altos de IgG frente al parásito trypanosoma cruzi, el virus del SIDA, el hongo C. albicans y la bacteria E. coli.

PREGUNTA: Que Significa este hallazgo en cada uno de los casos

4. Se realizó la determinación de IgG específica al virus de sarampión en niños nacidos de madres de la era prevacunal en el año 1997 y posvacunal en el año 2004. La edad de cuantificación en los niños fue 6, 9 y 12 meses de edad. Los resultados mostraron menores niveles de IgG específica en los hijos de madres de la era posvacunal e inclusive un alto porcentaje de negatividad en los niños de 9 y 12 meses. Posterior a la vacunación de los niños (recomendada al año de edad), se encontró una buena seroconversión en todos os casos.

PREGUNTA: Que significan estos resultados y de que forma podrían impactar la toma de decisiones en salud púbica.