Proyecto Final

Sistema para el registro del potencial de acción de células cardíacas con Microelectrodos Intracelulares

Autor: Cristian Pablo Pennisi Director: Dr. Leonardo Nicola Siri Comisión Evaluadora : Ing. Federico Falco Bioing. Gabriel Gentiletti Arq. Enzo Grivarello Ing. José Vilá

Universidad Nacional de Entre Ríos Facultad de Ingeniería - Bioingeniería Oro Verde - Entre Ríos - Argentina Diciembre de 1998

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Indice Analítico RESUMEN

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ORGANIZACIÓN GENERAL DEL DOCUMENTO

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SECCIÓN 1: OBJETIVOS Y ANTECEDENTES

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1. CAPÍTULO UNO: OBJETIVOS

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1.1 OBJETIVOS GENERALES 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

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2. CAPÍTULO DOS: ANTECEDENTES

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2.1 ACTIVIDAD ELÉCTRICA DEL CORAZÓN 2.1.1 El corazón : breve descripción anatómica y fisiológica 2.1.2 Origen de la actividad eléctrica del corazón 2.1.2.1 Potencial de membrana. 2.1.2.2 Modelo de las conductancias en paralelo 2.1.2.3 La ecuación de Nernst 2.1.2.4 La ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz 2.1.3 Potencial de acción cardíaco 2.1.3.1 El potencial de acción en el miocardio ventricular 2.1.3.2 El potencial de acción en el nódulo sinusal 2.1.4 Registro de la actividad eléctrica del corazón 2.1.4.1 Métodos in vivo 2.1.4.2 Métodos in vitro 2.2 METODOLOGÍA PARA EL REGISTRO DEL POTENCIAL DE ACCIÓN CON MICROELECTRODOS

11 11 12 12 13 14 14 14 15 16 18 18 20

INTRACELULARES

22 22 22 24 27 27 28 28 29 30 30 30 35 37 38 39 40 41

2.2.1 Sistema ambiental 2.2.1.1 Perfusión de solución fisiológica 2.2.1.2 El control de la temperatura 2.2.1.3 Perfusión de oxígeno 2.2.2 Sistema óptico 2.2.3 Sistema mecánico 2.2.3.1 Mesa antivibratoria 2.2.3.2 Micromanipulador 2.2.3.3 Elementos de fijación 2.2.4 Sistema para el registro analógico de la señal 2.2.4.1 Microelectrodos 2.2.4.2 Preamplificador 2.2.4.3 Guarda electrostática 2.2.4.4 Compensación de capacitancia 2.2.4.5 Circuito amplificador 2.2.4.6 Estimulación del preparado 2.2.4.7 Eliminación de interferencias

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2.2.4.8 Voltímetro 2.2.4.9 Osciloscopio 2.2.5 Sistema de adquisición digital de la señal 2.2.5.1 Requisitos del hardware 2.2.5.2 Requisitos del software 2.3 DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO 2.3.1 El diseño de puestos de trabajo 2.3.2 Elección de la postura de trabajo óptima 2.3.3 El espacio de trabajo para personal sentado 2.3.3.1 Dimensiones del espacio de trabajo 2.3.3.2 Area de la superficie horizontal de trabajo 2.3.3.3 Altura de la superficie horizontal de trabajo 2.3.4 Espacio físico y distribución [18] 2.3.4.1 Principios guía de distribución 2.3.4.2 Métodos de análisis 2.3.4.3 Situación general de los componentes 2.3.4.4 Distribución específica de los componentes

42 42 42 42 44 45 45 45 46 46 46 47 48 49 49 50 50

SECCIÓN 2 : DESARROLLO DEL PROYECTO

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3. CAPÍTULO TRES : SISTEMA AMBIENTAL

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3.1 PERFUSIÓN DE SOLUCIÓN FISIOLÓGICA 3.2 EL CONTROL DE LA TEMPERATURA 3.2.1 Características del sistema 3.2.2 Fuente de alimentación 3.2.3 Controlador de temperatura 3.2.4 Termómetro digital 3.3 SISTEMA DE PERFUSIÓN DE OXÍGENO 3.4 SISTEMA AUXILIAR DE VACÍO 3.5 DISTRIBUCIÓN DE LOS DISTINTOS SISTEMAS

4. CAPÍTULO CUATRO : SISTEMA ÓPTICO 4.1 LUPA BINOCULAR 4.2 SISTEMA DE ILUMINACIÓN 4.2.1 Lámpara 4.2.2 Fuente de alimentación

5. CAPÍTULO CINCO : SISTEMA MECÁNICO 5.1 MESA ANTIVIBRATORIA 5.1.1 Superficie de trabajo 5.1.2 Estructura de acoplamiento 5.2 MICROMANIPULADOR 5.3 ELEMENTOS DE FIJACIÓN 5.3.1 Bases magnéticas 5.3.2 Estructura metálica

6. CAPÍTULO SEIS : SISTEMA PARA EL REGISTRO ANALÓGICO DE LA SEÑAL 6.1 MICROELECTRODOS 6.1.1 El electrodo indiferente 6.1.2 Vidrio 6.1.3 Estirador de micropipetas 6.1.4 Llenado

53 55 55 56 58 59 59 60 60

62 62 63 63 63

65 65 65 65 66 67 68 68

71 71 71 72 72 74

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6.2 CIRCUITO ELECTRÓNICO DE REGISTRO 6.2.1 Preamplificador 6.2.1.1 Conexión física del microelectrodo 6.2.1.2 Descripción del circuito 6.2.2 Compensación de capacitancia 6.2.3 Circuito amplificador 6.2.4 Filtro pasabajo 6.2.5 Estimulador 6.2.6 Eliminación de interferencias 6.2.7 Voltímetro digital 6.2.8 Osciloscopio 6.2.9 Comparación de las características del amplificador con modelos comerciales

7. CAPÍTULO SIETE : SISTEMA DE ADQUISICIÓN DIGITAL DE LA SEÑAL 7.1.1 Características del hardware 7.1.1.1 Computadora personal (PC) 7.1.1.2 Placa conversora A/D 7.1.2 Características del software : 7.1.2.1 Descripción del LabVIEW 7.1.2.2 Estrategias y técnicas de adquisición con LabVIEW 7.1.2.3 Descripción del programa de adquisición

8. CAPÍTULO OCHO : DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO 8.1 UBICACIÓN FÍSICA 8.2 SUPERFICIE DE TRABAJO 8.2.1 Mesa antivibratoria 8.2.1.1 Área 8.2.1.2 Altura 8.2.2 Escritorio 8.2.2.1 Área 8.2.2.2 Altura 8.2.3 Espacio físico y distribución 8.2.3.1 Situación general de los componentes 8.2.3.2 Situación específica de los componentes

75 75 75 75 77 77 78 81 81 82 82 82

85 85 85 86 88 88 89 89

94 94 95 95 95 95 96 96 96 97 97 99

SECCIÓN 3 : PRUEBAS DEL SISTEMA

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9. CAPÍTULO NUEVE : PRUEBAS DE BANCO

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9.1 CONTROL DE TEMPERATURA 9.1.1 Prueba en circulación por gravedad 9.1.2 Prueba en recirculación 9.2 SISTEMA MECÁNICO 9.3 SISTEMA ELECTRÓNICO DE REGISTRO 9.3.1 Microelectrodos 9.3.2 Amplificador y sistema de eliminación de interferencias

10. CAPÍTULO DIEZ VITRO”

103 103 104 105 108 109 111

: VERIFICACIÓN DEL SISTEMA MEDIANTE UN EXPERIMENTO “IN

10.1 USO DEL SISTEMA COMPLETO 10.1.1 Preparación del experimento 10.1.2 Realización de los registros 10.1.3 Registros obtenidos

113 113 113 114 115

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SECCIÓN 4 : ASPECTOS ECONÓMICOS

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11. CAPÍTULO ONCE : ANÁLISIS DE COSTOS

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11.1 COSTOS DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO 11.1.1 Costo de I+D real 11.1.1.1 Personal 11.1.1.2 Equipamiento 11.1.1.3 Materiales 11.1.1.4 Gastos preoperativos 11.1.1.5 Costo total 11.1.2 Costo de I+D a precio de mercado de los factores 11.1.2.1 Personal 11.1.2.2 Equipamiento 11.1.2.3 Materiales 11.1.2.4 Gastos preoperativos 11.1.2.5 Costo total 11.1.3 Comparación de los costos de I+D 11.2 ESTIMACIÓN DEL PRECIO DE VENTA 11.2.1 Producción en la Universidad 11.2.2 Producción fuera de la Universidad 11.2.3 Comparación de precios

119 119 119 120 121 122 122 122 122 122 123 123 123 123 124 124 125 126

SECCIÓN 5 : APÉNDICES

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1. APÉNDICE UNO : CONCEPTOS TEÓRICOS ASOCIADOS CON EL CONTROL DE LAS VIBRACIONES.

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1.1 CARACTERIZACIÓN DE UN SISTEMA ANTIVIBRATORIO 128 1.2 FUNDAMENTOS DE VIBRACIÓN 129 1.2.1 Movimiento armónico simple 129 1.2.2 Frecuencia natural 130 1.2.3 Compliancia 130 1.2.4 Transmisibilidad 131 1.3 ESTRUCTURA DE ACOPLAMIENTO ENTRE SOPORTE DEL MICROELECTRODO Y LA SUPERFICIE [] 132 DE TRABAJO 1.4 ESTRUCTURA DE ACOPLAMIENTO ENTRE LA SUPERFICIE DE TRABAJO Y EL SUELO[42] 134

2. APÉNDICE DOS : DESCRIPCIÓN DEL PROGRAMA REALIZADO EN LABVIEW

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SECCIÓN 6 : BIBLIOGRAFÍA

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Resumen La electrofisiología cardíaca permite estudiar el funcionamiento del corazón a partir de las señales eléctricas de las células que lo componen. Los potenciales de acción de las células cardíacas constituyen uno de los tipos de señales más importantes para la investigación básica. El estudio de los potenciales de acción cardíacos es útil para caracterizar los fenómenos que dan origen a diferentes situaciones fisiológicas y fisiopatológicas del sistema cardiovascular. Por otra parte, la acción terapéutica de drogas cardioactivas puede comprenderse a través del conocimiento del efecto específico sobre determinadas corrientes o canales iónicos de las células cardíacas, que modifican directamente la morfología de los potenciales de acción. El presente trabajo describe la construcción y puesta a punto de un sistema completo para el registro de potenciales de acción de células cardíacas mediante el uso de la técnica de microelectrodos intracelulares. Se trata de una técnica ‘in vitro’: los registros se llevan a cabo sobre trozos de tejido cardíaco colocados en una cámara que le brinda las condiciones ambientales necesarias. Estas condiciones aseguran la supervivencia de los tejidos por varias horas, durante las cuales se realizan las maniobras experimentales. Los potenciales de acción se miden entre un microelectrodo de vidrio insertado en el interior de una célula y un electrodo de referencia extracelular colocado dentro de la solución de perfusión de la cámara. Para registrar los potenciales de acción en células no automáticas, se utiliza un estimulador electrónico. El sistema desarrollado consta de las siguientes cuatro partes, agrupadas de acuerdo a la función que cumplen: ¾ Un sistema para el mantenimiento de las condiciones ambientales, constituido por un control de temperatura para baño termostatizado y los medios necesarios para el suministro de solución fisiológica y de oxígeno. ¾ Un sistema para la observación del tejido, que consta de una lupa binocular y un sistema de iluminación. ¾ Un sistema mecánico, para sostener de manera estable el microelectrodo y poder insertarlo en el tejido mediante movimientos precisos, constituido por una mesa antivibratoria, un micromanipulador y una estructura de soporte. ¾ Un sistema electrónico, constituido por un amplificador para acondicionar las señales de los potenciales de acción, un estimulador, un osciloscopio digital para visualizarlas en tiempo real, una placa conversora A/D para digitalizarlas y una PC que maneja el programa de adquisición para la visualización y el almacenamiento de las mismas. El sistema completo constituye el puesto de trabajo de un operario del Laboratorio, por lo que fueron tenidos en cuenta criterios de diseño ergonómicos para el montaje y la ubicación de los distintos sistemas de control y visualización dentro del mismo. El sistema se encuentra actualmente en funcionamiento en el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER donde es utilizado a los fines del proyecto de investigación “Efecto de anticuerpos contra receptores β-adrenérgicos sobre las propiedades eléctricas del corazón”.

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Organización general del documento Los contenidos de este documento se han subdividido en seis secciones, las que se enumeran a continuación : 1. OBJETIVOS Y ANTECEDENTES: se describen los fundamentos teóricos para la delimitación del problema a resolver y un bosquejo general del sistema y los objetivos del proyecto. 2. DESARROLLO DEL PROYECTO: se describen en detalle los desarrollos específicos de cada parte del sistema. 3. PRUEBAS DEL SISTEMA: se describen las pruebas de banco de cada parte y el desempeño del sistema completo en condiciones reales de operación con experimentos ‘in vitro’. 4. ASPECTOS ECONÓMICOS: se detalla el análisis de los costos de investigación y desarrollo de este proyecto. Se realiza además una valoración estimativa de los costos de producción de mismo. 5. APÉNDICES: se desarrollan aspectos teóricos y/o detalles anexos del proyecto. 6. BIBLIOGRAFÍA.

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Sección 1: Objetivos y Antecedentes

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1. CAPÍTULO UNO: OBJETIVOS En el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER, en el marco del PID ¨Efecto de anticuerpos contra receptores beta-adrenérgicos sobre las propiedades eléctricas del corazón¨ se planteó la necesidad de construir un sistema capaz de llevar a cabo el registro de los potenciales de acción cardíacos, con la técnica de microelectrodos intracelulares. Por lo tanto se generó el presente proyecto, con los siguientes objetivos : 1.1 Objetivos Generales ¾ Analizar los considerandos teóricos para optimizar el montaje de un sistema completo para el registro de potenciales de acción cardíacos mediante microelectrodos intracelulares. 1.2 Objetivos Específicos ¾ Desarrollar y poner en funcionamiento un puesto de trabajo apto para el registro de potenciales de acción cardíacos mediante microelectrodos intracelulares.

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2. CAPÍTULO DOS: ANTECEDENTES 2.1 Actividad eléctrica del corazón Para poder definir los requisitos que debe cumplir el sistema para el registro de los potenciales de acción, es necesario conocer cuáles son las propiedades del sistema biológico objeto de estudio. Se comenzará entonces con una breve reseña anatómica y fisiológica del corazón, para luego hablar de las propiedades eléctricas de las células que lo componen. Finalmente se enumeran los métodos utilizados para llevar a cabo el registro de dicha actividad eléctrica. 2.1.1 El corazón : breve descripción anatómica y fisiológica El corazón es el órgano central del sistema circulatorio. En el humano está situado hacia el frente de la cavidad torácica, apenas desviado del centro hacia la izquierda a nivel de la axila. Tiene la forma de un cono invertido, con su base hacia arriba a la derecha, y el apex apuntando hacia abajo, a la izquierda y adelante. 2

1

2 3

3 3

1

4

4 4

5

6

6

5 8 7

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Figura 2-1 : El corazón (a) vista anterior (b) vista posterior. Los números indican (1) vena cava superior, (2) aorta, (3) arteria pulmonar, (4) vena pulmonar, (5) aurícula izquierda, (6) aurícula derecha, (7) ventrículo derecho, (8) ventrículo izquierdo. (adaptada de [1])

Las paredes del corazón están formadas por un músculo hueco, el miocardio, con algunas fibras dispuestas en forma espiral alrededor del cono y otras desde la base hacia el apex. Un tabique muscular a lo largo del eje anatómico divide al corazón en dos partes, una mitad derecha y otra izquierda; el miocardio de la mitad izquierda es considerablemente más grueso que el de la mitad derecha. Cada mitad está subdividida a su vez en dos cámaras, la superior (aurícula) y la inferior (ventrículo) conectadas entre sí por válvulas. Las aurículas son estructuras de paredes relativamente delgadas que actúan como cámaras receptoras de la sangre que retorna al corazón; aquí el miocardio se halla dispuesto en dos capas. Las aurículas cumplen básicamente las funciones de reservorio elástico y de conducción desde el lecho venoso hacia el ventrículo derecho y desde la circulación pulmonar hacia el ventrículo izquierdo; además de servir de bombas de refuerzo, incrementando el llenado ventricular. Los ventrículos, de paredes gruesas, son los

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encargados de bombear un cierto volumen de sangre desde un sistema venoso de baja presión hacia un sistema arterial de distribución, de alta presión. El corazón es entonces una bomba integrada dentro del sistema vascular: su función es asegurar que la sangre fluya continuamente a través de los órganos del cuerpo, proveyéndolos con suficiente oxígeno y nutrientes, y removiendo efectivamente los productos metabólicos de desecho. En términos funcionales, las mitades derecha e izquierda del corazón pueden ser consideradas independientes una de otra. En el corazón derecho, la sangre con contenido reducido de oxígeno es vertida a través de las venas cava superior e inferior dentro de la aurícula, desde donde ingresa luego al ventrículo. La sangre en el ventrículo derecho es expulsada hacia los pulmones a través de la arteria pulmonar. Durante su pasaje a través de los pulmones, la sangre libera dióxido de carbono al aire inspirado y toma oxígeno de él, proceso denominado hematosis. Una vez que esto sucede, la sangre fluye a través de las venas pulmonares hacia la aurícula izquierda, pasando luego hacia el ventrículo, desde donde es bombeada hacia la aorta. Luego, es distribuida a través de arterias grandes y pequeñas, alcanzando finalmente los vasos más pequeños y los capilares en los órganos, donde intercambia con los tejidos las sustancias que transporta. Finalmente, la sangre es recolectada en pequeñas y grandes venas que por último se vacían en las venas cava. La parte del circuito que se desarrolla entre la arteria pulmonar y las venas pulmonares es llamado de circulación pulmonar o menor; la parte que recorre todo el cuerpo es llamado de circulación sistémica o mayor. 2.1.2 Origen de la actividad eléctrica del corazón El corazón es un órgano que presenta una diferenciación estructural y funcional de un mismo tejido básico, el tejido muscular estriado, que permite una optimización de las tres funciones cardíacas relacionadas con la bioelectricidad : la actividad automática (cronotropismo), la propagación del impulso eléctrico (dromotropismo) y la contracción muscular (inotropismo). La función específica del corazón, la actividad contráctil, está controlada por una secuencia muy precisa de señales eléctricas originadas normalmente en una estructura diferenciada (nódulo sinusal) en forma de impulsos eléctricos (potenciales de acción) más o menos periódicos (actividad marcapasos), que son conducidos hacia las aurículas y, con un retardo apropiado, también hacia los ventrículos a través del sistema de conducción (nódulo aurículo-ventricular, haz de His, sus dos ramas y las fibras de Purkinje). Como resultado de esa excitación eléctrica se produce la contracción secuenciada de las aurículas y los ventrículos [2] . Para describir el comportamiento de las membranas biológicas que poseen propiedades eléctricas, a menudo es conveniente el uso de modelos eléctricos análogos. A continuación se describirán los parámetros que describen las propiedades de las células excitables, en base al modelo más utilizado para representarlas. 2.1.2.1 Potencial de membrana. Se denomina potencial de membrana (Em) al voltaje que se mide entre el interior de una célula y el espacio extracelular que la rodea. En condiciones de reposo el espacio intracelular posee un potencial más negativo que el del espacio extracelular.

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Figura 2-2: Potencial de reposo en una célula cardíaca. (extraída de [3])

Las mayoría de las células poseen un potencial de membrana de aproximadamente -80 mV, producto de diferencias en la concentración de iones dentro y fuera de la célula y en las pemeabilidades membranales a los mismos. La permeabilidad a los distintos iones está mediada por canales específicos, constituídos por grandes proteínas incrustadas en la membrana celular. Estos canales se abren ante estímulos apropiados, lo que permite a las cargas iónicas atravesar la membrana y crear flujos de corrientes. Se puede encontrar una mayor descripción de los canales iónicos en la referencia [3]. 2.1.2.2 Modelo de las conductancias en paralelo Si se supone que cada especie iónica migra a través de la membrana en forma independiente de la presencia de las demás, es posible utilizar una analogía eléctrica para la membrana celular. Se conectan en paralelo una rama para cada ion, cada rama compuesta por una pila de valor Eion en serie con una conductancia. Para la mayoría de las células (excitables o no), en el estado de reposo sólo es necesario considerar las permeabilidades a los iones K+, Cl- y Na+, en ese orden de importancia. El modelo circuital para la membrana en reposo tendrá pues tres ramas en paralelo, una para cada ion, tal como se puede observar en la figura 1.3. exterior

exterior

gK

gNa

gCl Em

EK

ENa

ECl

Rm

Em

Er

interior

interior

Figura 2-3 : Modelo circuital de conductancias en paralelo para la membrana celular en estado de reposo. A la derecha se representa un circuito equivalente simplificado.

Para un ion determinado, la corriente (Iion) en cada rama está determinada por la resistencia de membrana y el potencial de membrana (Em) de acuerdo con la ley de Ohm : iion = g ion .( E m − Eion )

donde gion y Eion son la conductancia de la membrana y el potencial de equilibrio para dicho ion, respectivamente.

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2.1.2.3 La ecuación de Nernst La ecuación de Nernst define la relación existente entre las actividades de un ion a cada lado de una membrana semipermeable con el potencial que se establece a través de dicha membrana en condiciones de equilibrio electroquímico. El potencial de equilibrio de un ion a través de una membrana plasmática está dado por la ecuación de Nernst : Eion =

RT a o ln zF ai

donde Eion es el potencial de equilibrio para el ion, R la constante universal de los gases, T la temperatura absoluta, z la valencia del ion, F la constante de Faraday, ao y ai las actividades del ion fuera y dentro de la célula respectivamente. Se utiliza la actividad en lugar de la concentración, ya que esta última incluye a los iones inmovilizados. En el músculo cardíaco en reposo, donde la concentración extracelular de potasio es aproximadamente 5.4 mM y la concentración intracelular es aproximadamente 120 mM (las actividades correspondientes son aproximadamente 4 y 100 mM), la ecuación de Nernst predice que el potencial de equilibrio del potasio es aproximadamente igual a -86 mV. Debido a que el potencial de reposo celular es cercano al potencial de reposo para el potasio predicho mediante la ecuación de Nernst, las variaciones en el potasio extracelular influyen directamente sobre el potencial de reposo. Un aumento en la concentración de potasio extracelular causa despolarización, mientras que reducción en el potasio extracelular tiende a hiperpolarizar la membrana. 2.1.2.4 La ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz El potencial de reposo se calcula a través de la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz, que toma en cuenta las permeabilidades y las actividades de todas las especies iónicas que contribuyen al potencial de membrana. Para un membrana permeable al sodio, al cloro y al potasio, esta ecuación es : Em =

RT PK a Ko + PNa a Nao + PCl a Cli ln zF PK a Ki + PNa a Nai + PCl a Clo

La contribución de cualquier ion al potencial de membrana esta determinado tanto por el gradiente de actividades a través de la membrana como por la permeabilidad de la membrana a dicho ion. Un gradiente de actividad ausente o una permeabilidad nula cancelaría la contribución de dicho ion al potencial de membrana. 2.1.3 Potencial de acción cardíaco Todas las células del miocardio son capaces de modificar el potencial de reposo para desarrollar una excitación transitoria, conocida como potencial de acción: la distribución de cargas a través de la membrana invierte su polaridad momentáneamente, haciendo el espacio intracelular positivo con respecto al espacio extracelular. Los potenciales de acción son generados por la apertura y cierre de canales iónicos en la membrana plasmática. La morfología del potencial de acción, difiere en las distintas zonas del corazón, como puede verse en la siguiente figura.

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NODO SA

NODO AV

HAZ DE HIS

AURICULA

FIBRAS DE PURKINJE

VENTRICULO

300 ms

Figura 2-4: Morfología del potencial de acción en las distintas zonas del corazón en mamíferos. La escala de voltaje está expresada en mV. (adaptada de [3] y [4])

En las células contráctiles del miocardio normalmente se generan potenciales de acción sólo bajo la influencia de un estímulo externo, como por ejemplo el potencial de acción de las células vecinas o el pulso de voltaje de un marcapasos artificial. Este estímulo despolariza la membrana, y si el potencial de membrana alcanza cierto valor umbral, se genera un potencial de acción. Los potenciales de acción normales son siempre muy semejantes entre sí en amplitud y forma. El potencial de acción que se describe típicamente es el correspondiente al miocardio ventricular, por ser el tejido cardíaco más estudiado. Debe recordarse que el potencial de acción difiere en las distintas zonas del corazón, donde las características distintivas están relacionadas con roles electrofisiológicos particulares. A modo de ejemplo, se describirá en primer lugar el potencial de acción ventricular y luego el del nódulo sinusal. Una descripción más detallada de los otros potenciales así como de los mecanismos que se describirán a continuación puede encontrarse en las referencias [3] y [4] 2.1.3.1 El potencial de acción en el miocardio ventricular El potencial de acción consiste de varias fases, cada una con un flujo de iones distinto en dirección y especie: Fase 0: corresponde a la despolarización rápida de la membrana, motivada por un rápido aumento de la permeabilidad al Na+; este aumento de conductancia hace tender el potencial de membrana al potencial de equilibrio del Na+ (+52 mV), aunque sin alcanzarlo, elevando el potencial de membrana hasta cerca de los +20 mV. Cuando el voltaje a través de la membrana se invierte (el potencial interior de la célula positivo con respecto al extracelular), el flujo hacia adentro de sodio decrece abruptamente, dando paso a la siguiente fase. Fase 1: se produce una leve repolarización (rápida y breve), causada por un aumento de la permeabilidad al K+, disminuyendo el potencial de membrana hasta cerca de 0 mV.

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Fase 2: el potencial de membrana permanece cerca de 0 mV por 200-250 ms; esta meseta es característica del músculo cardíaco, y se debe a una corriente lenta y sostenida de Ca++ hacia adentro, casi equilibrada por una corriente de K+ hacia afuera. Fase 3: luego sigue una repolarización más rápida, de una duración cercana a los 50 ms, donde la corriente de calcio es progresivamente inactivada, predominando la corriente de salida de potasio. Como resultado, el potencial intracelular negativo es restablecido y la membrana se repolariza hasta su potencial de reposo. Fase 4: el potencial de membrana alcanza el valor de reposo, mantenido principalmente por la corriente saliente de K+. El potencial de acción puede tener una duración total que va desde 180 a 380 ms, dependiendo de la frecuencia cardíaca. tiempo (ms) 1 0

2 3 4

4

10 µA

tiempo (ms) Figura 2-5 : Relación entre las fases del potencial de acción y los flujos de iones en una célula miocárdica ventricular de mamífero. El potencial de acción se representa en el trazo superior, mientras que las corrientes generadas por cada uno de los iones se grafican debajo. Para la corriente de potasio se muestran sus tres componentes principales: IK (rectificador tardío), Ito (transitoria de salida) e IK1 (rectificador anómalo). (adaptada de [3])

2.1.3.2 El potencial de acción en el nódulo sinusal En este grupo de células la diferencia principal en el potencial de acción con el resto del tejido cardíaco es la denominada despolarización diastólica espontánea, despolarización en

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fase 4 o “potencial de marcapasos”. Estas células son capaces de autoexcitarse, generando potenciales de acción en forma repetitiva que se propagan a los tejidos adyacentes, los cuales sólo responden ante la presencia de un estímulo en condiciones fisiológicas.

Figura 2-6 : (A) Potencial de acción en el nódulo sinusal de conejo; (B) principales corrientes involucradas. (adaptada de [4])

El potencial de acción en esta región es más pequeño que en otras (aproximadamente 60 mV pico a pico), con una fase 0 más lenta, por la falta de canales funcionales de Na+. La fase 0 de este potencial de acción es producida en gran parte por la corriente entrante de Ca++. Como se dijo anteriormente, las células del nódulo sinusal producen un potencial de marcapasos, es decir que son capaces de desarrollar espontáneamente un potencial de acción, a intervalos de tiempo regulares (ritmo sinusal). El ritmo sinusal está regulado por diferentes factores que pueden modificar : • la pendiente de despolarización diastólica (PP), • el valor del potencial diastólico máximo (PDM) y/o • el umbral de activación (PU), alrededor de -40 mV, que da origen a la fase de despolarización rápida, o sea a la fase 0. (ver figura 2.7)

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Figura 2-7 : Factores que diminuyen la frecuencia de disparo del nódulo sinusal. (adaptada de [3])

Estos factores, que regulan la frecuencia de disparo del nódulo sinusal, se deben a la interacción de mecanismos complejos con los canales iónicos de la membrana celular. El estudio de estos mecanismos puede ser llevado a cabo mediante una serie de técnicas electrofisiológicas de registro, cada una de las cuales brinda diferente información. Si bien hoy en día existen técnicas de estudio que son capaces de identificar y caracterizar las corrientes iónicas en parches de membrana con canales únicos (método de “patch-clamp”), no se ha llegado a explicar por completo el mecanismo por el cual las células marcapasos mantienen su ritmicidad espontánea [5]. 2.1.4 Registro de la actividad eléctrica del corazón La electrofisiología cardíaca se dedica al estudio del corazón a partir de su actividad eléctrica. Por medio de las señales eléctricas obtenidas del corazón se pueden estudiar los mecanismos involucrados en la generación y transmisión del impulso excitatorio que dan origen a la contracción mecánica. Los estudios de electrofisiología cardíaca permiten explicar la fisiología y fisiopatología de la actividad eléctrica del corazón, y sirven para estudiar los mecanismos de acción de las diferentes estrategias terapéuticas. A continuación se enumeran brevemente los métodos electrofisiológicos empleados para el registro de la actividad eléctrica del corazón, los que pueden ser divididos en métodos “in vivo” e “in vitro”. Una descripción más detallada puede hallarse en la bibliografía específica citada en cada caso. 2.1.4.1 Métodos in vivo Las técnicas de registro “in vivo” permiten el estudio de las señales provenientes del corazón en organismos vivos. Estas son técnicas que, debido a su relativa simpleza y difundida aplicación, se utilizan con mayor frecuencia en la práctica clínica con fines diagnósticos. Se pueden citar: ¾ Electrocardiograma (ECG) : El ECG fue descripto por primera vez por Einthoven en 1903. La observación fundamental fue que la actividad eléctrica del corazón podía ser registrada mediante electrodos colocados en la superficie del cuerpo, y que dicha actividad poseía un ritmo que coincidía con el pulso. Los componentes individuales de la señal eléctrica que se registra coinciden con eventos que se producen en las diferentes regiones del corazón. De esta forma, los intervalos entre los componentes específicos de la señal de ECG representan el retardo de tiempo entre la activación de las diferentes regiones del corazón. Por ejemplo, el llamado intervalo PR representa el intervalo de tiempo que hay entre la activación de la

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aurícula y la de los ventrículos, por lo que refleja el retardo de conducción que se produce en el nódulo AV. Las anomalías del ECG representan por lo tanto anomalías en iniciación y propagación de la actividad eléctrica del corazón. Esto ha permitido que el ECG se transforme en una herramienta diagnóstica primaria de enfermedades cardíacas, tales como la hipertrofia o el infarto de miocardio, o de enfermedades de otro tipo que indirectamente afectan al corazón. Ya que la propagación eléctrica en el corazón es unidireccional, puede representarse mediante un vector. La configuración del ECG depende de la localización de los electrodos de registro, los que pueden ubicarse sobre la piel del paciente, en los miembros y/o en el tórax, (ECG de superficie), a través de la cavidad nasofaríngea (ECG intracavitario) o directamente sobre el corazón cuando se está realizando una intervención a tórax abierto. Cada ubicación específica permite una visualización diferente de las componentes del vector cardíaco [6]. Como se mencionó anteriormente la despolarización espontánea de las células marcapaso inicia el ciclo cardíaco. La propagación célula a célula está sincronizada y produce la una activación ordenada de todas las regiones del corazón. La activación comprende fases de despolarización y repolarización, cada una de las cuales produce una señal detectable en el ECG. La señal de ECG está compuesta por diferentes fases, las cuales se identifican mediante las letras P, Q, R, S y T como puede observarse en la Figura 2-8. También puede observarse el correlato temporal de la señal de ECG con los potenciales de acción de las diferentes estructuras cardíacas.

Figura 2-8 : El registro de ECG en relación con los potenciales de acción de las diferentes estructuras cardíacas. NSA : nódulo sinusal, NAV : nódulo aurículo-ventricular. (extraída de [2])

¾ Potenciales de Acción Monofásicos (MAP) : Una técnica para registrar actividad eléctrica de manera extracelular, ya sea en animales de laboratorio o en la práctica clínica, es la de los potenciales de acción monofásicos (MAP’s)[6]. Las señales registradas por este método se asemejan en su curso temporal a los potenciales de acción registrados de manera intracelular. Se utilizan dos electrodos especiales de contacto que se insertan mediante cateterización: un electrodo “de punta” no polarizable y un electrodo de referencia, ambos de Ag/AgCl. Mediante el electrodo de punta se ejerce una presión de 10 a 30 gr/mm sobre el tejido, sin llegar a penetrarlo. 19

El diámetro de la punta es usualmente de 1 a 2 mm, por lo que se registran varias células a la vez, las que se hallan despolarizadas a causa de la presencia de este electrodo. Las señales son generadas por la despolarización de las células miocárdicas alrededor de la punta del electrodo, las que producen una diferencia de potencial entre la punta y el electrodo de referencia. Este método ofrece ventajas sobre otras técnicas electrofisiológicas de registro. La mayor ventaja ofrecida por el MAP es que requieren menor cantidad de equipamiento asociado que los potenciales registrados en forma intracelular. Los MAP brindan información cuantitativa acerca del proceso de repolarización, lo que no es posible con el uso de ECG. Se puede mencionar como desventaja que no se obtiene información acerca del potencial de reposo de las células, debido al carácter extracelular de este tipo de registro. Otra desventaja es el hecho de ser una técnica invasiva, ya que como se mencionó previamente es necesario emplear cateterización para la colocación de los electrodos en contacto con la pared del corazón. 2.1.4.2 Métodos in vitro Las técnicas “in vitro” permiten la obtención de registros eléctricos sobre estructuras aisladas del organismo, las que se mantienen en condiciones viables a partir del suministro de soluciones de perfusión que contienen los nutrientes necesarios. De esta forma es posible la obtención de registros a partir de corazones enteros, trozos de tejido, células y hasta trozos de membrana celular aislados. A continuación se describen las técnicas más comunes de registro. ¾ Electrograma : El electrocardiograma obtenido de un corazón aislado, produce un registro denominado electrograma. Este método sólo se utiliza en pequeños corazones de animales de experimentación. Los corazones aislados son perfundidos mediante un aparato de Lagendorff, el que le suministra continuamente una solución fisiológica a través de la aorta. (una descripción detallada de este método de perfusión puede hallarse en la referencia [6]). Para realizar el registro de la señal se emplean tres “electrodos”, uno representado por la cánula metálica que se inserta en la aorta, el otro (usado como tierra) conectado a la solución de perfusión y el tercero, por lo general, constituído por un alambre de acero inoxidable insertado en la pared del ventrículo. La posición de este último electrodo determina el eje sobre el cual se realizan las mediciones de la señal y por lo general se coloca en el ápex del ventrículo. Con esta técnica, al igual que con el ECG, pueden evaluarse los intervalos entre los diferentes eventos del ciclo cardíaco, así como también la presencia de arritmias u otras patologías cardíacas. Como ventaja se tiene que los estudios sobre corazones aislados permiten un análisis independiente de ciertas variables que se hallan presentes en el organismo “in vivo”, como por ejemplo la regulación autónomica de la frecuencia cardíaca. ¾ Registro con microelectrodos intracelulares : En 1949, Ling y Gerard introdujeron el empleo de microelectrodos de vidrio llenos con una solución conductora en el estudio de las células excitables. Efectivamente ellos pudieron registrar el potencial de acción del músculo sartorio de rana. En 1951, Weidmann y Woodbury los adaptaron para el estudio del músculo cardíaco, haciéndolos flexibles por medio de un hilo de tungsteno, lo que les posibilita acompañar los movimientos del corazón. Los registros intracelulares obtenidos con microelectrodos de vidrio han puesto en evidencia las variadas morfologías de los potenciales de acción de 20

las distintas estructuras cardíacas y contribuyeron a aclarar los movimientos iónicos que dan lugar a sus fases. La técnica consiste entonces en insertar un microelectrodo de vidrio lleno con una solución conductora en el interior de una célula y medir la diferencia de potencial con respecto a un electrodo de referencia, colocado en el exterior de la célula. Se pueden medir así potenciales de reposo y potenciales de acción en preparados multicelulares (trozos de tejido) y en preparados unicelulares (células aisladas). Las células cardíacas aisladas se obtienen a través de métodos de disociación enzimática[6]. ¾ Registros mediante fijación de voltaje y fijación de corriente : Estos métodos también utilizan microelectrodos intracelulares, pero se controlan electrónicamente las propiedades eléctricas de la célula. En un método se fija el voltaje (en inglés “voltage clamp”) y en el otro la corriente (“current clamp”) a través de la membrana celular. Como las conductancias iónicas dependen del potencial de membrana y del tiempo, la técnica de fijación de voltaje permite estudiar el curso temporal de las conductancias iónicas, separadamente de la acción del voltaje (que se mantiene constante). Equivale matemáticamente al método de separación de variables. Si por cualquier circunstancia el tejido modifica su conductancia, se deberá modificar el valor de la corriente necesaria para mantener la relación óhmica. En 1952, Hodgkin y Huxley publicaron determinaciones de las corrientes obtenidas en el axón gigante de calamar mediante la técnica de fijación de voltaje. La utilización de esta técnica demoró algún tiempo en aplicarse al músculo cardíaco, por las dificultades inherentes a la obtención de una fijación del voltaje de manera uniforme en la estructura sincicial de compleja geometría como es el corazón. ¾ Registro mediante “patch-clamp” : La aparición de métodos relativamente simples que permiten obtener cardiomiocitos aislados mediante disociación enzimática hizo posible superar la mencionada dificultad inherente a la compleja organización geométrica del tejido cardíaco. La técnica de patch-clamp permite hacer una fijación de voltaje de pequeñísimos “parches” de membrana (alrededor de 1 µm de diámetro) para estudiar corrientes que atraviesan canales únicos (“single channel recording”) o la membrana completa de una sola célula aislada (‘whole cell recording”). Este método, descripto por Neher y Sakmann en el año 1976, trajo aparejado un enorme desarrollo en el estudio de las células cardíacas, proporcionando nuevos e importantes datos acerca de sus propiedades electrofisiológicas[7].

21

2.2 Metodología para el registro microelectrodos intracelulares

del

potencial

de

acción

con

Como se mencionó al comienzo, el objetivo principal de este proyecto es la construcción y puesta a punto de un sistema para el registro de potenciales de acción cardíaco con microelectrodos intracelulares. Para obtener los registros intracelulares de potenciales de acción, es necesario contar con una estación de trabajo (llamada comunmente ´setup´) que se puede dividir básicamente en cuatro subsistemas, cuyos requisitos se describen a continuación: 2.2.1 Sistema ambiental La realización exitosa de registros de los potenciales de acción cardíacos requiere que el tejido sometido a estudio, denominado comunmente ‘preparado’, permanezca durante varias horas en estado viable. El sistema ambiental comprende entonces los medios necesarios para mantener a la preparación celular en estado viable, el que debe cumplir con los siguientes requisitos : ¾ Contener una concentración de iones y nutrientes similar a la del líquido extracelular del organismo de donde proviene el tejido. Esta solución se conoce como solución fisiológica. Se debe mantener circulando para proveer una renovación constante de los nutrientes (oxígeno y glucosa) y poder eliminar los productos de desecho. ¾ Estar a temperatura controlada, dentro de los rangos de supervivencia celular, que para el caso de los cardiomiocitos está aproximadamente entre los 25 y los 38oC. ¾ Estar a pH controlado, en un rango de 7.25 a 7.45. Para el mantenimiento de las condiciones ambientales se debe implementar por lo tanto un sistema para suministrar la solución fisiológica, a la que se le deben controlar la temperatura, el pH y la saturación de oxígeno. 2.2.1.1 Perfusión de solución fisiológica Este sistema está destinado al suministro de solución fisiológica al preparado bajo estudio. Para alojar los preparados se utilizan por lo general cámaras de acrílico o policarbonato. El “piso” de la cámara debe poseer un material que permita la inserción de agujas para sostener el tejido. El material que se utiliza por lo general es el “Sylgard®”, un elastómero siliconado fabricado por la compañía Dow Corning. La solución debe ser ingresada a la cámara a través de tuberías, preferentemente de PVC. La perfusión puede realizarse por gravedad o por bombeo. Es necesario prever además la construcción de un sistema auxiliar que permita descartar la solución que debe ser retirada de la cámara. Puede implementarse un drenaje por gravedad, un sistema de succión o emplearse un bomba. En todos los casos, debido a que la solución fisiológica contiene electrolitos, las tuberías que la transportan se comportan como conductores eléctricos, llevando ruido al lugar de registro. Por lo tanto también es necesario realizar una conexión a tierra de esta “línea” en alguna parte de su recorrido. La composición iónica de la solución fisiológica depende de la especie cuyo tejido esté bajo estudio. Las soluciones más empleadas para los preparados de cardiomiocitos son el Tyrode con buffer bicarbonato y el Tyrode con buffer HEPES (ver página siguiente). Los denominados sistemas buffer o tampón se agregan para mantener el pH de la solución de perfusión dentro de los límites aceptables. 22

Las soluciones buffer contienen un ácido débil y su sal o una base débil y su sal. Poseen la capacidad de resistir a los cambios en la concentración de hidrogeniones cuando se le agregan pequeñas cantidades de ácidos o bases fuertes. Las células poseen naturalmente sistemas buffer, pero su capacidad para mantener un pH constante en soluciones débilmente tamponadas o no tamponadas es muy limitada. La disminución del pH, normalmente conduce a la muerte celular. La acidificación puede ser explicada, al menos en parte, en base a la disociación irreversible de macromoléculas proteicas en péptidos de bajo peso molecular y el consecuente incremento de grupos carboxilo ionizables. El tamponado de la solución de perfusión puede neutralizar esta acidificación del tejido y así evitar su daño[8,9]. Los principales buffers usados son llamados buffers "fisiológicos", ya que exhiben un rango de acción efectivo entre 7,2 y 7,4. A continuación se describen dos de los buffers más usados en preparados de células cardíacas.

• Buffer HEPES: El buffer HEPES (Ácido sulfónico N-2-Hidropiperazin-N'-2-etano) es un buffer que posee un pK de 7,31 a 37ºC. Es un buffer amino-terciario heterocíclico, por lo que puede interferir con las reacciones amino-aldehídos del tejido. Massie y col. (1972) indican que este buffer es un sustituto no tóxico del buffer bicarbonato en los medios usados para cultivos celulares.

• Buffer bicarbonato: Este buffer es uno de los más fisiológicos que existen, debido a que se encuentra en los sistemas vivos en la forma bicarbonato/ácido carbónico (CO3HNa/CO3H2). Su acción puede comprenderse si se considera la se considera la ecuación : CO2 + H2O ⇔ CO3H2 ⇔ CO3H- + H+ Si se agregan iones H+ al sistema, algunos se combinarán con bicarbonato y la reacción se desplazará a la izquierda. Por consiguiente, no todos los iones hidrógeno que se incorporen a la solución quedarán bajo la forma iónica. Si se agrega una base, en cambio, el H+ será extraído en parte y la reacción se desplazará hacia la derecha provocando una disociación del CO3H2 en H+ y CO3H-. Por lo tanto existe una relación inversa entre el H+ y el CO3H- cuando se agrega un ácido o una base al sistema. Puede verse que el nivel de CO2 (la PCO2) también interviene en la determinación del pH, pero de manera diferente a la que lo hacen los ácidos y bases. Si se agrega o se extrae CO2, en este caso las concentraciones de H+ y de CO3H- cambian en el mismo sentido. Concretamente, el valor de pH está dado por la ecuación de HendersonHasselbach :

pH = pK + log

[CO3 H − ] [CO3 H 2 ]

pK es el valor de pH donde existen iguales cantidades del ácido y de la sal acompañante, que en este caso vale 6,1 a 37oC. La concentración de CO3H2 depende de la presión parcial de CO2 y del coeficiente de solubilidad a. Por lo tanto se puede reescribir la ecuación de la forma: pH = 6,1 + log

[CO3 H − ] a. PCO2

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Puede verse así que este sistema buffer requiere un nivel constante de CO3H- y de CO2 para cumplir su función. Esto se logra colocando en la solución de perfusión una concentración determinada de bicarbonato y burbujeándola luego con CO2. Este gas se suministra a través de carbógeno, que es una mezcla que contiene 95% de O2 y el restante 5% de CO2. Como se verá más adelante, el O2 también debe burbujearse dentro de la solución de perfusión, por lo que burbujeando carbógeno se realiza una doble función. 2.2.1.2 El control de la temperatura

Como se mencionó previamente, en las experiencias de laboratorio “in vitro” los preparados celulares utilizados deben mantenerse bajo determinadas condiciones de temperatura. En ocasiones se debe mantener dentro de límites estrictos la temperatura de la solución que baña los preparados. ¾ Estrategias para mantener la temperatura

Existen distintas estrategias que para calentar y mantener la temperatura de los preparados. Entre ellas podemos citar :

• Calentamiento directo de la solución: en esta estrategia se usan mantas térmicas, que se enrollan alrededor del recipiente que contiene la solución que necesita ser calentada. Son láminas constituidas por una resistencia eléctrica recubierta con una goma de silicona. Pueden aplicarse con cintas adhesivas o cementos especiales para una fijación permanente. Los modelos comerciales se alimentan con tensión alterna de 120 o 220 V y son capaces de suministrar potencias en un rango de 180 a 1440 W[10]. En función de esto último, su precio oscila entre los 100 y los 480 dólares (en EE.UU.). Necesitan de un controlador adicional, que se vende en forma separada, que provee el control de encendido o apagado según se requiera. Su ventaja estriba en su sencillez y en su fácil montaje. Como principal desventaja se puede citar que no son capaces de un control fino de la temperatura de la solución que llega al preparado, requisito indispensable para nuestra aplicación. Además son difíciles de conseguir en el mercado local.

• Calentamiento indirecto de la solución: en este caso se hace circular a la solución a calentar a través de tuberías sumergidas en un recipiente que contiene líquido a temperatura controlada. Este elemento, que se denomina comunmente baño termostatizado, está constituido por un recipiente donde se puede alojar el líquido calefactor, un elemento capaz de entregar la potencia requerida y algún sistema para controlar la temperatura. Los modelos comerciales se componen básicamente de un recipiente de acero inoxidable donde se aloja el líquido, que se mantiene a la temperatura deseada mediante una resistencia eléctrica. Los baños están diseñados comunmente para una alimentación de línea (220 ó 110 V de corriente alterna) y vienen en rangos de potencia de 500 a 1500W, de acuerdo a la capacidad de agua que alojan.

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Figura 2-9 : Baño termostatizado comercial de 7 litros de capacidad, 1300 W de potencia. Emplea un control si-no, con el que mantiene la temperatura alrededor de ±0,4oC de la temperatura prestablecida. Posee un agitador mecánico con el que homogeneiza la temperatura. Su valor de catálogo es de U$S 811. (extraída de [21])

Como ventaja se puede citar, dependiendo del tipo de control utilizado, que mantienen la temperatura del agua que alojan en valores muy estables. Además son fáciles de conseguir en el mercado local y se le pueden realizar modificaciones para adaptarse a las situaciones particulares. Como desventajas se puede citar que ocupan mucho espacio y no se pueden colocar próximos al lugar de registro porque producen interferencias eléctricas en el sistema de registro.

• Calentamiento directo de la cámara: en este tipo de estrategia se utiliza un sistema que es capaz de mantener la temperatura del preparado, calentando o enfriando en forma directa la cámara donde se encuentra el mismo. Para ello se utilizan los denominados dispositivos de efecto Peltier. Los modelos comerciales manejan rangos de temperatura de -20 a 100oC. Necesitan de un volumen de agua circulando para remover o entregar el calor necesario. Entregan potencias del orden de los 300 a 400 W y vienen con un módulo de control que logra un ajuste muy preciso de la temperatura (±0,1oC). Como desventaja se puede citar que producen interferencias electromagnéticas sobre los sistemas de registro y sólo se puede utilizar para volúmenes pequeños. Debido a esto último su aplicación principal es para el termostatizado de platinas de microscopio, donde los preparados son de pequeño tamaño. Además tienen un elevado costo: aproximadamente de 4000 dólares[11,12].

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Figura 2-10 : Platina termostatizada modelo TS-4 de Physitemp. Tiene capacidad para alojar un cápsula de Petri de 35 mm. El módulo lateral posee los elementos Peltier y la tubería de recirculación de agua. (extraída de [11])

• Calentamiento indirecto de la cámara: en estos sistemas se utiliza un fluido circulante que es capaz de transferir la energía térmica a la cámara donde se aloja el preparado. El control preciso de la temperatura del preparado se logra haciendo circular líquidos frío y caliente a través de un bloque donde se sostiene la cámara. Utilizando estrategias de control adecuadas, una computadora personal envía las señales de apertura y cierre de distintas válvulas que regulan la mezcla del fluido térmico. En la siguiente figura se puede ver un diagrama en bloques de un sistema comercial.

Figura 2-11 : Diagrama en bloques del sistema de control de temperatura TLC-MI de ALA Science. (extraída de [13])

El modelo de la figura posee un rango de temperaturas de 4 a 45oC y brinda una precisión en el control de ±0.3oC en el baño del preparado. El sistema incluye la interfase para la computadora, el bloque térmico, los sensores de temperatura (termistores) y los accesorios de conexión. La potencia que maneja es de 250 W para calentamiento y 80 W para enfriamiento. Como ventaja se puede decir que se eliminan los problemas de interferencia electromagnética que existen en los sistemas como los descriptos anteriormente. Como desventaja se puede decir que es un sistema muy complejo para para la precisión que alcanza, a la vez que posee un elevado costo (aproximadamente 5000 dólares)[13]. ¾ Controladores de temperatura

En los sistemas que utilizan un elemento calefactor para entregar el calor, para regular la potencia que se suministra al mismo se utilizan diversos sistemas de control de temperatura. Para realizar un control preciso de temperatura se emplean controladores de lazo cerrado, donde en todo instante se trata de mantener la variable controlada (temperatura) cercana a un valor de referencia. En todos ellos se dispone un elemento

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transductor de temperatura que sensa la temperatura del elemento a calentar y desarrolla una señal de error, que es igual a la diferencia entre el valor de referencia y el valor actual. Esta señal de error se realimenta para indicar si debe entregarse potencia o no al elemento calefactor. Pueden utilizarse varias estrategias de control. La diferencia entre ellas está en la forma en que la señal de error es realimentada. Así, por ejemplo, la señal de error puede ser multiplicada por una constante (controlador proporcional), integrada (controlador proporcional-integral), etc. Los controladores de lazo cerrado más sencillos, los denominados controladores si/no o apagado/encendido, realimentan la señal de error para indicar si se debe encender o no la alimentación del elemento calefactor. Tienen la ventaja de ser de construcción simple, requiriendo de pocos componentes para su implementación. Como desventaja se puede decir que cuando el sistema presenta retardos temporales (o tiempos muertos) el error en estado estacionario toma valores elevados. ¾ Termómetro

El sistema debe contar con un termómetro independiente para indicar en todo momento la temperatura de la cámara que contiene el preparado. Dado que la temperatura se encuentra controlada dentro de márgenes estrechos, el termómetro debe brindar una lectura precisa, con una resolución menor o igual al margen que se está controlando. 2.2.1.3 Perfusión de oxígeno

Se debe implementar un sistema para burbujear oxígeno dentro de la solución que baña los tejidos celulares. El oxígeno se burbujea para mantener el metabolismo celular. En los casos que se utilice el Tyrode con buffer bicarbonato, se burbujea con carbógeno, que como se dijo anteriormente está constituido por un 95% de oxígeno y un 5% de CO2 . 2.2.2 Sistema óptico

Comprende los medios destinados a visualizar la preparación. Por el tamaño de los preparados se puede usar un microscopio binocular o lupa de disección con un sistema auxiliar de iluminación. El rango de magnificación que se necesita es relativamente bajo, extendiéndose desde 6X hasta 50X. La lupa puede apoyarse sobre la base que trae de fábrica, o bien puede atornillarse a la superficie de trabajo. Es conveniente que se la pueda mover para acceder fácilmente a la cámara experimental o para su limpieza. La iluminación del preparado debe realizarse preferentemente con lámparas halógenas, que pueden alimentarse a través de tensión continua y proporcionan una luz blanca lo suficientemente intensa. La iluminación puede implementarse mediante una variedad de sistemas disponibles comercialmente. En algunos sistemas la luz se trasmite hacia el sitio a iluminar a través de fibras ópticas. Poseen una fuente de alimentación de tensión continua o alterna y se puede variar en forma continua el nivel de iluminación. En lo posible se recomienda utilizar sistemas que permitan colocar la fuente de alimentación fuera de la jaula de Faraday, para evitar las interferencias electromagnéticas sobre el sistema de registro (la función de la jaula de Faraday se discutirá en detalle más adelante, en el apartado 2.2.4.2)

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2.2.3 Sistema mecánico

El sistema mecánico comprende todos los medios destinados a posicionar de manera estable el microelectrodo y el preparado. Las vibraciones que se transmitan a la punta del microelectrodo, cuando éste se halla insertado en el interior de una célula, pueden provocar interferencias en los registros que se estén llevando a cabo. Si las vibraciones son de baja amplitud (décimas de micrómetros), pueden introducir ruido en los registros debido a un fenómeno piezoeléctrico, producido en el vidrio del microelectrodo cuando el mismo es sometido a pequeñas deformaciones. Si en cambio las vibraciones son de mayor amplitud (del orden de unos pocos micrómetros) pueden provocar la rotura del microelectrodo o de la célula sobre la que se está llevando a cabo el registro, con la consiguiente interrupción del mismo y las pérdidas de tiempo que esto genera, ya que hay que recambiar el microelectrodo y buscar otro sitio para la inserción. El sistema antivibratorio por lo general comprende la implementación de una superficie de trabajo libre de vibraciones, así como también un sistema de soporte para el microelectrodo que permita moverlo con facilidad y otorgue una rigidez adecuada. A continuación se describen las características que deben poseer cada uno de los componentes del sistema mecánico. 2.2.3.1 Mesa antivibratoria

La superficie de trabajo y las estructuras de acoplamiento entre ésta y el suelo constituyen en conjunto la denominada “mesa antivibratoria”. Las características de una mesa antivibratoria están dadas por las de los elementos que la constituyen y fueron descriptas en los párrafos precedentes. Por lo tanto, en este apartado se realizará una breve descripción de las principales particularidades de los modelos comerciales de las mesas antivibratorias. ¾ Modelos comerciales

Existen varios modelos comerciales de mesas antivibratorias (en la Figura 2-12 se muestra un modelo de mesa antivibratoria comercial). Se puede realizar una clasificación de las mismas de acuerdo al tipo de soporte con el que vienen provistas: • Mesas con soportes pasivos: poseen aisladores neumáticos sobre las que se apoya la superficie de trabajo. Los aisladores están constituidos por un diafragma de goma sostenido por un cilindro rígido lleno con aire. Poseen frecuencias naturales de resonancia muy bajas (comunmente 1 o 2 Hz). Por encima de estos valores de frecuencia, las vibraciones se atenúan en forma abrupta. • Mesas con soportes activos: los aisladores pasivos presentan un comportamiento pobre a muy bajas frecuencias, sobre todo en el valor de la frecuencia de resonancia, donde se produce una pequeña amplificación de las vibraciones. Para solucionar esto, se han diseñado soportes que emplean un sistema activo de cancelación de las vibraciones. Mediante sensores se miden las vibraciones producidas y se produce una realimentación sobre actuadores apropiados a fin de cancelar las mismas. Alcanzan así frecuencias de resonancia horizontal menores a 1 Hz.

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Figura 2-12 : Mesa antivibratoria para registros electrofisiológicos de la firma Intracel[14]. La superficie de trabajo está construida por un núcleo en “panal de abejas” entre dos planchas de acero inoxidable de 5 mm de espesor. Los aisladores de soporte son pasivos y pueden llenarse con aire o nitrógeno a presión. (extraída de [14])

2.2.3.2 Micromanipulador

El propósito de este apartado no es realizar una descripción exhaustiva acerca del funcionamiento de los micromanipuladores, sino más bien mencionar cuáles son las características principales que han de tenerse en cuenta a la hora de escoger un micromanipulador para este tipo de aplicación. Para registrar los potenciales de acción hay que posicionar el microelectrodo dentro las células. En primer lugar se realiza una aproximación “gruesa” hasta las estructuras donde se pretende realizar la penetración, para lo cual el microelectrodo debe poder moverse dentro de rangos de 20 a 40 mm. Una vez escogido el sitio, se lleva a cabo la inserción del microelectrodo en el tejido, hasta alcanzar el interior de una célula (más adelante se explicará en detalle este procedimiento). Teniendo en cuenta las dimensiones de las células (largo 50 a 100 µm ; diámetro 5 a 20 µm), está claro que el movimiento del micromanipulador deberá poseer una resolución del orden de unos pocos micrómetros. Esto último es importante sobre todo en la dirección axial del microelectrodo, a través del cual se realiza la penetración. En el caso más común, este es el eje X del micromanipulador, el cual debe poseer un movimiento fino con resolución menor al diámetro de la célula. Otro de los requisitos importantes que debe satisfacer el micromanipulador es el de proveer un posicionamiento rígido y estable para el microelectrodo; esto es, no debe presentar desplazamientos relativos ni deriva lenta (“drift”) a partir de su posición de reposo. Para el posicionamiento de los electrodos de estimulación, pueden usarse micromanipuladores de características menos exigentes en cuanto a la resolución y a la estabilidad, los que por ende resultan más económicos. Los micromanipuladores que existen hoy en día en el mercado son capaces de satisfacer los requerimientos antes mencionados, superándolos en la mayoría de los casos. Los mas sencillos utilizan transmisión manual de los movimientos y el mecanismo es totalmente mecánico. Existen otros modelos impulsados mediante motores paso a paso, mecanismos hidráulicos o piezoeléctricos. La transmisión de los movimientos se puede controlar a distancia a través de un pequeño teclado o con un joystick[26,29].

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2.2.3.3 Elementos de fijación

Una forma adicional de controlar las vibraciones consiste en maximizar la rigidez de los sistemas de soporte del microelectrodo y de la cámara donde se encuentra el preparado. Además, es necesario eliminar cualquier movimiento relativo entre estos dos componentes y la superficie de trabajo. Esto involucra el uso de soportes firmes para el micromanipulador y para la cámara donde se coloca el preparado. Existen numerosos sistemas que permiten la fijación del micromanipulador a la superficie de trabajo. Los mismos pueden ser sujetados desde varillas metálicas, las que a su vez se fijan a la superficie de trabajo. La fijación puede llevarse a cabo atornillando directamente las varillas a la superficie de trabajo. Otro método consiste en utilizar bases de fijación magnética, cuando la superficie de trabajo es de un material ferromagnético. 2.2.4 Sistema para el registro analógico de la señal

El sistema para el registro analógico provee todos los medios necesarios para capturar, acondicionar y visualizar la señal. Un sistema de registro analógico completo debe estar constituido por un microelectrodo, un amplificador de señal, un estimulador, un osciloscopio. También es necesario contemplar un sistema para eliminar las interferencias eléctricas (jaula de Faraday y puestas a tierra). 2.2.4.1 Microelectrodos

Los microelectrodos representan los elementos “transductores” del sistema de registro y debido a sus características particulares merecen un tratamiento separado. Los microelectrodos intracelulares están formados por un alambre de Ag metálica recubierto con AgCl, colocado en el interior de una micropipeta de vidrio llena con una solución electrolítica. Esta solución provee una conexión desde la célula hasta el electrodo. Así, los “electrodos” de vidrio no son más que conductos de geometría apropiada que sirven para establecer la conexión. Por esta razón, se utiliza el término micropipeta para el conducto de vidrio solo (ver Figura 2-13). Cuando se llena con la solución electrolítica y se provee un conexión mediante un electrodo de Ag/AgCl, se los denomina microelectrodos. hombro punta 1 mm espina Figura 2-13: Las partes de una micropipeta. (adaptada de [42])

¾ Propiedades físicas generales

La precisión con la cual las mediciones pueden ser llevadas a cabo usando microelectrodos, muchas veces está limitada por las propiedades físicas que estos poseen. Es necesario entonces conocer las propiedades físicas de los microelectrodos y tener en cuenta cómo estas propiedades pueden afectar los registros. A continuación se describen brevemente las más importantes. Una discusión más detallada puede encontrarse en las referencias [42] y [15]. • Forma y tamaño Como se verá más adelante, la forma de las micropipetas depende mucho del tipo de vidrio empleado y del procedimiento de estiramiento. Por lo general, las micropipetas que se 30

fabrican para los microelectrodos intracelulares, tienen una forma aproximadamente cónica en la región de la punta. La resistencia eléctrica es uno de los parámetros que más depende del ángulo subtendido por el cono y la relación diámetro externo/diámetro interno en la punta. La característica más importante de un microelectrodo es el diámetro de la punta. Para evitar el daño en la célula sobre la que se pretende realizar el registro, se necesita que éste sea menor o igual al 0,5% del diámetro de la célula. Las células nodales tienen diámetros que oscilan entre 5 y 10 µm, y las células miocárdicas contráctiles entre 10 y 20 µm. Esto establece que pueden ser penetradas a lo sumo por microelectrodos de 0,05 µm y 0,1 µm de diámetro en la punta respectivamente. Estos tamaños están por debajo del límite de resolución de los microscopios ópticos. Por lo tanto para obtener una imagen de la punta se recurre al uso de microscopía electrónica de barrido (SEM). 0,5 µm

Figura 2-14 : Fotografía tomada con un microscopio electrónico de barrido (magnificación x40000) de la punta de una micropipeta estirada con el equipo Sutter P-97 (foto provista por el fabricante del equipo)

• Resistencia eléctrica Debido a la poca facilidad que existe para observar las puntas de las micropipetas a través de la microscopía óptica, la resistencia eléctrica del microelectrodo se vuelve el parámetro más importante para caracterizarlo. Una “regla de oro” establece que cuanto más pequeño sea el diámetro de la punta, mayor será la resistencia. Una resistencia muy elevada afecta el potencial de punta del microelectrodo, genera más ruido e incrementa la constante de tiempo del circuito. Por lo tanto, se puede ver que existe un compromiso entre lograr una resistencia baja y a la vez una punta larga, flexible y con diámetro pequeño. • Comportamiento mecánico Se puede decir que las micropipetas que poseen una punta más larga y fina son muy flexibles. Por el contrario, aquellas con punta corta y gruesa resultan muy rígidas. Las micropipetas usadas para el registro intracelular de células cardíacas deben poseer puntas flexibles para no quebrarse cuando el tejido se contrae mecánicamente.

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¾ Circuito eléctrico equivalente[15]

La Figura 2-15(a) representa a un microelectrodo insertado en el interior de una célula para la medición de los potenciales de acción. La parte (b) de la figura esquematiza el circuito equivalente de esta situación. Tanto el electrodo interno a la micropipeta como el electrodo de referencia pueden ser representados por una resistencia en paralelo con un capacitor, ambos en serie con una pila que representa el potencial de unión electrodo-electrolito. A partir del electrodo interno de la micropipeta se encuentra una resistencia Rl correspondiente a la resistencia del electrolito. Conectado a ella se encuentra la capacitancia distribuida Cd correspondiente a la capacitancia a través de la pared del vidrio. Luego se presentan dos potenciales, asociados con la punta de la micropipeta : un potencial de unión líquida (Ej) que se establece debido a la diferencia de concentración ente el electrolito y el fluido intracelular y otro potencial “de punta” (Et) que se produce debido a que el vidrio de la punta se comporta al igual que un electrodo de membrana de vidrio. El circuito equivalente presenta además las resistencias de los fluidos intracelular (Ri) y extracelular (Re), las que se hallan acopladas al microelectrodo a través de la capacitancia distribuida. A A

al amplificador

alambre de conexión solución electrolítica

B

B

Rma micropipeta

Cma

Ema

Rl Cd

Rl

líquido extracelular

célula

Rmb electrodo de referencia

citoplasma

Cmb

Cd

Ej

Emb

Et

Ri

Em

Re

Figura 2-15 : (a) Esquema representando un microelectrodo insertado en el interior de una célula. (b) Circuito equivalente para esta misma situación. Las referencias están en el texto. (adaptada de [15])

El circuito equivalente representado en la figura precedente puede ser simplificado, despreciando algunos componentes y agrupando los parámetros más relevantes. Así, las resistencias de los conductores Rma y Rmb, las resistencias de los fluidos intra y extracelular pueden ser despreciadas, ya que la mayor contribución a la resistencia total está dada por la resistencia Rl de la micropipeta, que se halla en el orden de 1 a 100 MΩ. La capacitancia de los electrodos metálicos puede despreciarse y la capacitancia distribuida puede agruparse en un único capacitor. Todos los potenciales pueden también agruparse en una única fuente. El circuito simplificado es el más empleado para describir el comportamiento de los microelectrodos. El mismo se esquematiza en la Figura 2-16 .

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Rl A

Em

Cd Eeq B

Er Cm Rm

Figura 2-16 : Circuito equivalente simplificado del microelectrodo insertado en el interior de una célula. Em representa el potencial de membrana (o de acción), Cd la capacitancia total distribuida, Rl la resistencia del microelectrodo y Eeq la sumatoria de los potenciales de unión líquida, de punta y de las interfases electrodoelectrolito (adaptada de [15]).

¾ Electrodo de referencia

Para medir la diferencia de potencial entre dos puntos se necesita tener un segundo electrodo, en este caso en el medio extracelular. El electrodo colocado en el baño se conoce como electrodo indiferente o electrodo de referencia. Un método muy difundido consiste en colocar como electrodo de referencia un alambre de Ag/AgCl. ¾ Vidrio utilizado en la fabricación de micropipetas

Los vidrios utilizados para la fabricación de las micropipetas de vidrio pueden ser clasificados en base a sus constituyentes químicos principales, de acuerdo a su temperatura de ablandamiento o bien a sus propiedades eléctricas. Los vidrios más difundidos para la fabricación de microelectrodos se detallan en la siguiente tabla : Tabla 2-I : Propiedades eléctricas y térmicas de los diferentes vidrios Corning. (modificado de[16]) Vidrio

Constante dieléctrica

Temperatura de ablandamiento (oC)

Descripción

7490

3,8

1580

cuarzo

7760

4,5

780

borosilicato

0080

7,2

695

carbonato de sodio

¾ Fabricación de las micropipetas

Las micropipetas se fabrican a partir de tubos capilares de vidrio, mediante un equipo especial denominado estirador de micropipetas. Existe una gran variedad de equipos estiradores comerciales, los que van desde modelos reativamente simples, con controles manuales, hasta modelos más sofisticados, controlados por microprocesador. En todos ellos, el tubo de vidrio se coloca en entre dos mordazas, muy próximo a un filamento destinado al calentamiento. Un vez fijado el tubo, se ejerce un fuerza de tracción sobre el mismo, a la vez que se aplica una corriente eléctrica al filamento, que eleva la temperatura del vidrio y comienza a ablandarlo. Cuando esto ocurre, las mordazas comienzan a 33

separarse gradualmente, la parte central del tubo se estira y se vuelva más delgada. En la mayoría de los estiradores (los denominados de dos etapas), se activa un interruptor cuando el vidrio llegó a estirarse hasta una determinada longitud. Este interruptor activa un mecanismo que provoca un súbito tirón entre ambas mordazas, provocando finalmente la separación del tubo en dos partes, las que constituyen las dos micropipetas. ¾ Llenado de las micropipetas

Los microelectrodos se llenan usualmente con soluciones concentradas de KCl (3M). Esto se debe en primer lugar a que el K+ y el Cl- tienen movilidades similares, lo cual reduce el valor del potencial de unión líquida. Para soluciones con igual composición pero con distinta actividad, el potencial de unión líquida está dado por la expresión : Ej =

µ + − µ − RT ⎛ a' ⎞ . ln⎜ ⎟ µ + + µ − F ⎝ a' ' ⎠

donde Ej representa el potencial de unión líquida, µ+ y µ- la movilidad de los iones positivos y negativos respectivamente, R la constante universal de los gases ideales, T la temperatura absoluta, F la constante de Faraday, a’ y a” las actividades de las soluciones a ambos lados de la unión. Puede verse así que si las movilidades son similares, el potencial Ej será pequeño. Por otra parte, la existencia de una alta concentración de iones en la punta del microelectrodo le otorga al mismo una baja resistencia eléctrica. El llenado de las micropipetas con solución electrolítica representa una tarea dificultosa, debido al flujo viscoso del aire que debe ser expulsado. De acuerdo a la relación de HagenPoiseuille, la resistencia viscosa que presenta un tubo cilíndrico es inversamente proporcional a la cuarta potencia del radio. En un tubo cónico de longitud suficiente, la resistencia viscosa es inversamente proporcional a la tercera potencia del radio, pero aún así la resistencia en contra del flujo a través de una micropipeta es muy elevada. Existen varios métodos para el llenado de las pipetas cada una de las cuales recurre a una técnica diferente[42]. Se diferencian principalmente de acuerdo al tiempo que se tarda para el llenado de las micropipetas, tardándose desde un par de días en algunos hasta unos pocos segundos en otros. En la siguiente figura se pueden ver algunos de ellos.

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Figura 2-17 : Ilustración de algunos métodos para el llenado de las micropipetas. (a) Directamente a través de la punta. Si bien es sencillo, resulta muy lento (b) Directamente a través del vástago, con una jeringa y a presión. Resulta relativamente lento y requiere cierta destreza manual. (c) Por ebullición, calentando a 7080oC la solución de agua y metanol dentro del matraz y aplicando luego vacío por el tubo auxiliar. Requiere de un procedimiento complicado y el calor puede dañar las puntas. (d) Por destilación, donde moléculas de agua pura difunden hacia la punta llenándola. Al igual que el primero, resulta muy lento. (e) Por fibra de vidrio, en la figura se muestran los conductos hidráulicos a cada lado de la fibra. (f) Por fibra de vidrio, en esta figura se muestra el mecanismo de transporte de la burbuja.(extraída de [42])

El método más difundido para el llenado de las micropipetas es el que utiliza la fibra de vidrio interna, ya que sólo se tardan unos pocos segundos para llenar las mismas. Los capilares de vidrio usados para su fabricación poseen una fibra de vidrio de unos 20 µm de diámetro en la pared interna de la pipeta y se los conoce como vidrios “omega dot” por la forma particular que posee su perfil. Su funcionamiento se basa en la existencia de dos conductos hidráulicos (Figura 2-17-e) a ambos lados de la fibra que permiten que la solución avance hacia la punta, transportando en forma simultánea las burbujas de aire en sentido opuesto (Figura 2-17-f). 2.2.4.2 Preamplificador

Esta parte del instrumento posee funciones muy importantes. Aunque su nombre lo indique, no necesariamente se produce una amplificación del voltaje de entrada en esta etapa. Sus funciones principales son : • Debe conducir la señal de entrada (voltaje de membrana) hacia la siguiente etapa del circuito sin introducir ninguna modificación a la misma, es decir con ganancia unitaria dentro de la banda de interés de la señal. Es el tipo de circuito conocido comunmente como “seguidor de voltaje”. (antiguamente “seguidor por emisor” en los circuitos de transistores).

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• Debe prevenir que fluya un valor de corriente elevado a través del microelectrodo. Especificaciones:

Para describir con mayor detalle cómo se alcanzan estos requisitos, se brinda a continuación una lista de especificaciones que definen a un preamplificador para registro intracelular : 1. Corriente de bias: es la corriente que fluye del terminal de entrada en ausencia de señal aplicada. Debido a que esta corriente atravesará el microelectrodo se necesita que su valor sea pequeño, de lo contrario se produciría un voltaje muy grande a la entrada del amplificador. Si se tolera como máximo un aumento de voltaje de 1 mV y el microelectrodo puede tener una impedancia de hasta 100MΩ, la corriente de bias no debe ser mayor a 10 pA. (ver Figura 2-18) Vi

Vo x1

Ibias RµE

Vo = Vi = RµE * Ibias Figura 2-18 : Efecto de la corriente de bias sobre el voltaje de salida en ausencia de señal aplicada. El sentido de circulación indicado por las flecha es arbitrario.

2. Resistencia de entrada: este parámetro también mide cuánto se opone el preamplificador a que fluya corriente a través de él, en este caso cuando se le aplica un voltaje a la entrada. Normalmente se busca que la resistencia de entrada del preamplificador sea de 100 a 1000 veces superior a la resistencia del microelectrodo (1010 a 1011 Ω). Actualmente los dispositivos con entradas FET presentan muy poco inconveniente en alcanzar valores superiores a 1012 Ω. Vi RµE

Vo

Rin

Vo=Vi = Em* Em

Rin Rin+RµE

Figura 2-19 : Efecto de la impedancia de entrada del amplificador sobre la señal. Como puede verse, si se logra que Rin>>RµE, se tiene que Vi≈Em.

3. Tiempo de establecimiento: esta especificación mide la velocidad con la cual el preamplificador puede seguir señales de variación rápida. El tiempo de establecimiento (ts) es el tiempo requerido para que la salida pase de un 10% a un 90% de su valor final, luego de aplicar un escalón de voltaje en la entrada. Un valor aceptable para ts es 1/(5*fmax), donde fmax es el valor de la mayor componente frecuencial de la señal bajo estudio. El tiempo de establecimiento debe especificarse para valores de resistencia de microelectrodo razonables, por lo general 10 ó 20 MΩ. 4. Rango dinámico de entrada: es el rango de voltajes de entrada con los que trabaja el preamplificador. Por lo general se trabaja con rangos superiores a ±2 V.

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5. Deriva y estabilidad : son especificaciones que se dan en diferentes maneras de acuerdo a cada fabricante. Pueden estar expresadas en unidades de voltaje sobre tiempo o sobre temperatura. Un valor aceptable para la deriva térmica debe ser menor a 200 µV/oK. 6. Ancho de banda : esta especificación se expresa en términos de la frecuencia de corte del preamplificador, que es el valor de frecuencia para el cual la amplitud de la salida del mismo cae 3 dB con respecto a su valor a bajas frecuencias. Hay que diferenciar entre el ancho de banda propio del preamplificador (usualmente del orden de los MHz) y el ancho de banda del circuito limitador adicional (un filtro pasabajo) que poseen algunos circuitos. Por lo general, los fabricantes de este tipo de equipos especifican el ancho de banda con respecto al filtro pasabajo incorporado, el cual posee a su vez varias frecuencias de corte. Esto permite establecer el ancho de banda acorde con las necesidades particulares de cada tipo de registro. 7. Amplitud de ruido : es un parámetro que se utiliza para cuantificar la magnitud de ruido introducido en la señal por el preamplificador y se mide en la salida del mismo cuando la entrada se encuentra conectada a tierra. Algunos fabricantes especifican su valor para una resistencia conectada entre la entrada y tierra, lo que introduce una fuente de ruido adicional. La amplitud de ruido puede expresarse en valores de voltaje pico a pico (p-p) o eficaces (rms), los que a su vez dependen del ancho de banda del preamplificador. Una especificación aceptable es de 200 µV (rms) para un ancho de banda de 10 kHz. 8. Velocidad de cambio (slew rate) : este parámetro expresa la razón de cambio del voltaje de salida del amplificador, cuando éste funciona en la región activa normal, en respuesta a un escalón en la señal de entrada que provoca una salida próxima a la saturación. Su valor se indica en V/seg. En este caso, por tratarse de un amplificador con ganancia unitaria que nunca se encuentra cercano a las condiciones de saturación, este parámetro no se tiene en consideración. 2.2.4.3 Guarda electrostática

El circuito equivalente del microelectrodo conectado a la entrada del amplificador está representado por una resistencia en paralelo con un capacitor. En la parte (a) de Figura 220 se muestra el circuito equivalente, en el cual la resistencia total es prácticamente la del microelectrodo y la capacitancia distribuida está compuesta de tres componentes : la capacidad del microelectrodo y las capacitancias parásitas del cable de conexión y del circuito de entrada. Tal como se mencionó, la presencia de estas capacidades parásitas trae aparejado un efecto indeseable de filtro pasa bajo, disminuyendo de manera considerable el tiempo de establecimiento de la señal. Este último toma un valor de aproximadamente 2,2*Rµe*Ctot. Por lo tanto la premisa consiste en hacer que la resistencia y la capacitancia distribuida tomen valores pequeños. Para ello existen varias recomendaciones, entre ellas usar microelectrodos de baja resistencia, no colocar los preparados muy profundamente para no sumergir demasiado la punta de la pipeta en la cámara y minimizar el trayecto del cable de conexión del microelectrodo al preamplificador. Las dos primeras recomendaciones se satisfacen fácilmente, pero la tercera requiere que el circuito del preamplificador sea montado y encapsulado próximo al microelectrodo. Un método adicional de reducir la capacitancia distribuida es la llamada “guarda electrostática”. El principio que se aplica es el siguiente : cuando las placas de un capacitor son sometidas al mismo potencial no se produce flujo de carga alguno en el mismo. En la Figura 2-20(b) puede verse el efecto de colocar un blindaje conectado a tierra alrededor del 37

cable de conexión del microelectrodo. El efecto es retrógrado, ya que si bien se elimina la capacitancia Cs, se la reemplaza por una mucho mayor Cc. Si en lugar de ello se adopta el conexionado de la Figura 2-20(c), se observa que el efecto de la capacitancia desaparece ya que ambas placas se encuentran siempre al mismo potencial.

Figura 2-20 : Desarrollo de la guarda electrostática. (a) Los tres componentes de la capacitancia total distribuida del circuito de entrada. (b) Una guarda a tierra elimina Cs pero la reemplaza por una capacidad mucho mayor Cc..(c) La guarda es mantenida al mismo potencial que la entrada. (extraído de [42])

2.2.4.4 Compensación de capacitancia

Para eliminar la capacitancia distribuída algunos preamplificadores proveen lo que se denomina circuito de compensación de capacitancia. El principio que se utiliza es la realimentación positiva de una parte de la señal de salida a través de un capacitor (ver figura siguiente). De esta forma, se coloca un valor “negativo” de capacitancia en paralelo con la capacitancia total distribuida y ésta puede ser disminuida[42]. -

Vo

+ RµE ≈10M C≈12pF

Figura 2-21 : Circuito de compensación de capacidad

38

2.2.4.5 Circuito amplificador

Esta parte del circuito de registro es la encargada de acondicionar la señal proveniente del preamplificador. Su misión es la de amplificar dicha señal (de ahí su nombre) aunque también cumple con otras funciones. A continuación se describen las características que debe poseer, de acuerdo a la función específica : ¾ Amplificación de la señal a los niveles requeridos por la etapa siguiente : la señal de los potenciales de acción se encuentra en un rango de aproximadamente -100 a +50 mV, A los fines de visualizar la misma, no es necesario proveer amplificación, ya que los instrumentos utilizados comunmente pueden manejar estos rangos. Sin embargo, si se quiere digitalizar la señal para poder almacenarla, será necesario amplificarla para poder aprovechar al máximo la resolución del sistema de conversión analógico/digital (esto se discutirá con más detalla en el apartado 2.2.5) ¾ Corrección del voltaje de offset : como se mencionó previamente, existen una serie de potenciales de offset asociados con la técnica de medición, que aparecen sumados al potencial de membrana que se desea registrar. Se requiere entonces que el circuito amplificador tenga la posibilidad de compensar la presencia de tales potenciales, en un rango de aproximadamente ±200 mV. ¾ Limitador del ancho de banda de la señal : esta sección del circuito se implementa a través de un filtro pasabajo y tiene como finalidad reducir el ancho de banda de la señal antes de ingresarla a la placa conversora. De esta forma se evita el “aliasing” que se produciría si están presentes en la señal componentes frecuenciales que estén por encima de la frecuencia de Nyquist. Este tipo de filtro pasabajo también recibe el nombre de “filtro antialiasing”. De acuerdo a la función de transferencia que lo representa, existen muchos tipos de filtros, cada uno de los cuales posee características que lo hacen más apropiado para una aplicación en particular. Para señales que se analizan en el dominio del tiempo, como es el caso de los potenciales de acción, se recomienda el uso de los filtros Bessel[16], ya que poseen una respuesta al escalón sobreamortiguada. Esto implica que las señales no son distorsionadas al pasar por el filtro. El inconveniente de los filtros Bessel es que presentan una transición suave entre las bandas de paso y de rechazo, por lo que para lograr una separación más abrupta se necesita incrementar el orden del filtro. Un filtro Bessel de orden 4 resulta suficiente para este tipo de aplicación. ¾ Medición de la resistencia del microelectrodo : La medición de la resistencia del microelectrodo resulta útil para verificar el estado del mismo durante la realización de los experimentos. Para ello se utiliza el denominado método de inyección de corriente constante. Se envía una corriente de valor conocido a través del microelectrodo, lo que provocará una diferencia de potencial a la entrada del circuito de medición proporcional a la resistencia. Usualmente los equipos proveen un botón pulsador mediante el cual se activa un circuito que inyecta 1 nA, lo que resulta un valor de 1mV/MΩ. El mismo puede ser leído en el voltímetro asociado al sistema de registro.

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Figura 2-22 : Esquema funcional del método de inyección de corriente constante para la medición de la resistencia del microelectrodo. (extraído de [42])

2.2.4.6 Estimulación del preparado

En la mayoría de los experimentos es necesario iniciar los potenciales de acción mediante estímulos a intervalos controlados. La excepción a esto es el estudio de actividad espontánea, como es el caso del nódulo sinusal. La iniciación regular de los potenciales de acción se logra a través de la estimulación de los tejidos con estímulos eléctricos. Los esímulos pueden ser aplicados tanto intra como extracelularmente. A continuación se mencionan las principales características de cada uno de los métodos.

• Estimulación intracelular: se realiza a través de un microelectrodo de estimulación, que es constructivamente idéntico al utilizado para el registro. En los preparados multicelulares, debe utilizarse un mismo microelectrodo para cumplir ambas funciones. Para estimular una célula aislada es necesario inyectar una corriente despolarizante, que es del orden de unos pocos nA. Debido a las conexiones de baja resistencia existentes entre los miocitos en un tejido, se requiere una cantidad de corriente más grande para los preparados multicelulares, tanto mayor cuanto más grande sea el preparado. El pulso de voltaje necesario se relaciona tanto con el valor de corriente a inyectar como con el de resistencia del microelectrodo. Si por ejemplo se debe inyectar un pulso de corriente de 100 nA a través de un microelectrodo de 10 MΩ, es necesario aplicar un pulso de 1V. Este pulso produce un artefacto considerable sobre el registro si no se toman las medidas para eliminarlo. Los dispositivos modernos poseen circuitos electrónicos que desconectan la entrada del preamplificador durante la aplicación del estímulo. Este método está limitado por los tamaños del preparado, por lo que se usa preferentemente en los registros de potenciales de acción de células aisladas. • Estimulación extracelular: se utiliza con mayor frecuencia para la estimulación de preparados multicelulares. Se establece un diferencia de potencial entre dos electrodos metálicos que están en contacto con la superficie del preparado, lo que produce la despolarización de las células y la iniciación de un potencial de acción que se propaga a través de todo el tejido. Para minimizar la amplitud de los artefactos introducidos en el electrodo de registro por acople capacitivo, los dos electrodos se colocan muy próximos entre sí (1 o 2mm), lo que produce un campo de estimulación muy localizado. Adicionalmente los conductores que llevan la señal hasta los electrodos y los propios electrodos se trenzan entre sí, dejando separadas solamente las puntas. Como los electrodos no pueden tocarse entre sí, una solución constructiva consiste en fabricar los electrodos con alambres de plata teflonada, a la que se le quita la aislación en la punta. El electrodo se posiciona en la superficie del preparado con la ayuda de un micromanipulador. No es necesario que los electrodos entren en contacto con el tejido, 40

ya que los potenciales de acción pueden ser iniciados aún cuando los electrodos están ubicados muy próximos al preparado (1011 Ω

1012 Ω

1011 Ω

1015 Ω

corriente de bias

10 pA

10 fA

ajustable a cero

4 pA

-

100 fA

ganancia de voltaje

x1

x1

x 1 ó x 10 seleccionable

x 10

rango de voltaje máx.

±5 V

±15 V

-

±1 V

-

±15V

nivel de ruido

500 µV p-p[a]