Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia

PROFESOR PATROCINANTE: Dra. Carola Otth L. INSTITUTO: Microbiología Clínica FACULTAD: Medicina

“ANÁLISIS INMUNOHISTOQUIMICO DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA Arc INDUCIDA POR INFECCIÓN NEURONAL CON HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1”

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico.

SUSANA ANDREA VALENZUELA CASANOVA VALDIVIA-CHILE 2013

Dedicada a quienes me enseñaron que cada día se construye con paciencia, perseverancia y amor. Que las caídas no son derrotas, sino un desafío de la vida que invitan a crecer y ser un mejor ser Humano. A mis padres Mirta y Rigo Los amo.

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a la Doctora Carola Otth por la oportunidad otorgada para realizar esta tesis, por su comprensión y apoyo que me permitieron poder finalizar esta etapa.

Agradecer a Carolina Martin y Melissa Hott, por ser mis guías en esta investigación, permitiendo desarrollar este trabajo.

Quiero agradecer de forma muy especial a mi familia, a mis Padres por creer en mí, por su confianza y apoyo incondicional, a mi hermana por esos abrazos que me dieron energía para seguir adelante.

Su fe en mi me insto a continuar.

Esta tesis fue financiada por los proyectos: FONDECYT 11080067 and FONDECYT 1120464

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ÍNDICE GENERAL

1.

RESUMÉN .................................................................................................................7 1.2 SUMMARY .......................................................................................................................................... 8

2.

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................9 2.1 HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 ........................................................................................... 9

2.2 HSV-1 Y NEURODEGENERACIÓN ....................................................................................... 15

2.3 PLASTICIDAD SINÁPTICA ........................................................................................................ 19

2.4 PROTEÍNA ASOCIADA A PLASTICIDAD SINÁPTICA, Arc ......................................... 21

2.3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 25

2.4 HIPÓTESIS....................................................................................................................................... 26

2.5 OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................. 26

2.6 OBJETIVO ESPECÍFICO ............................................................................................................ 27 3.

MATERIALES Y MÉTODOS. ..................................................................................28 3.1 MATERIALES .................................................................................................................................. 28

2

3.1.1 HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 ....................................................................................... 28

3.1.2 ANIMALES EXPERIMENTALES ........................................................................................... 28

3.1.3 REACTIVOS .................................................................................................................................. 29

3.2

METODOLOGÍA ........................................................................................................................... 31

3.2.1 DISEÑO EXPERIMENTAL E INFECCIÓN IN VIVO CON HSV-1 .............................. 31

3.2.2 INMUNOHISTOQUÍMICA ........................................................................................................ 34

3.3 4.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO ......................................................................................................... 37

RESULTADOS ........................................................................................................38 4.1 IMPLEMENTACIÓN DEL MODELO MURINO IN VIVO DE INFECCIÓN PRODUCTIVA Y LATENTE POR HSV-1. ....................................................................................... 38

4.2 ANÁLISIS CUALITATIVO DE LOS SUJETOS UTILIZADOS EN EL MODELO IN VIVO .............................................................................................................................................................. 39

4.3 DETECCIÓN DE PROTEÍNAS VIRALES EN CEREBRO DE RATONES INFECTADOS CON HSV-1 .................................................................................................................. 42

4.4 ANÁLISIS EN LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA ARC EN INDIVIDUOS INFECTADOS CON HSV-1 .................................................................................................................. 46

3

5.

DISCUSIÓN .............................................................................................................50

6.

CONCLUSIÓN .........................................................................................................60

7.

BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................61

4

ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1. Morfología del virión de los Herpesvirus. .....................................................13 FIGURA 2. Transporte viral desde y hacia el sitio inicial de infección durante una infección productiva a nivel epitelial. ..............................................................................14 FIGURA 3. Mecanismo propuesto para la regulación de la comunicación entre microglía, neuronas y astrocitos durante la neuroinflamación crónica. ..........................18 FIGURA 4. Mecanismo molecular de la expresión de Arc dependiente de la actividad sináptica. ........................................................................................................................24 FIGURA 5. Esquema de inducción de la infección HSV-1 en ratones Rockefeller........33 FIGURA 6. Evaluación cualitativa de sintomatología clínica de ratones Rockefeller en un modelo in vivo. ...............................................................................................................41 FIGURA 7. Detección de la proteína ICP8 en corteza cerebral. .....................................44 FIGURA 8. Detección de la proteína ICP8 en ganglio trigémino. ...................................45 FIGURA 9. Detección de la proteína Arc en corteza cerebral en individuos infectados con HSV-1. .....................................................................................................................48 FIGURA 10. Detección de la proteína Arc en trigémino, en individuos infectados con HSV-1. ............................................................................................................................49

5

FIGURA 11. Esquema del sistema nervioso central ......................................................59

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LISTA DE ABREVIATURAS

Arc: Activity-Regulated Cytoskeleton-associated protein

ADN: Ácido desoxirribonucleico

ARN: Ácido ribonucleico

AZ: Alzheimer DAB: 3,3’ diaminobenzidina

dpi: días post-infección

HSE: Encefalitis aguda causada por HSV-1

HSV-1: Virus herpes simplex tipo 1

H2O2: Peróxido de hidrogeno IEG: Gene inmediatamente tempranos

Kb: Kilobases

LAT: Transcrito asociado a latencia

SNC: Sistema nervioso central

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1. RESUMEN

El Herpes Simplex Virus Tipo 1 (HSV-1) es ubicuo, neurotrófico, y el patógeno más común que causa la encefalitis aguda esporádica en humanos. La encefalitis por Herpes Simplex está asociada con un alto rango de mortalidad y significativas secuelas neurológicas, neuropsicológicas y neuroconductuales, que afectan al paciente de por vida. HSV-1 infecta estructuras del sistema límbico en el sistema nervioso central, y se ha sugerido como un factor ambiental de riesgo para la enfermedad de Alzheimer. La proteína asociada al citoesqueleto regulada por actividad (Arc) es una proteína de expresión inmediatamente temprana que ha emergido como un regulador clave de la plasticidad sináptica y consolidación de la memoria. Aunque el rol de Arc en neurogénesis y estrés es claro, ningún estudio ha analizado los efectos de infección neuronal en la expresión de Arc y modulación de la plasticidad neuronal. El objetivo de este estudio fue evaluar la expresión de Arc durante infección neuronal con HSV-1 en un modelo murino in vivo a través de inoculación intranasal de HSV-1. Los resultados mostraron que el número de células presentan un aumento en la expresión de Arc durante la infección productiva y latente, alcanzando un máximo después de 7 días post-infección. Estos resultados sugieren que el aumento en los niveles de la proteína Arc observadas durante la infección por HSV-1 neuronal podría dar lugar a la alteración de la dinámica del citoesqueleto y funcionalidad neuronal. Financiamiento: FONDECYT 11080067 and 1120464.

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1.2

SUMMARY

Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1) is ubiquitous, neurotropic, and the most common pathogenic cause of sporadic acute encephalitis in humans. Herpes simplex encephalitis is associated with a high mortality rate and significant neurological, neuropsychological, and neurobehavioral sequelae, which afflict patients for life. HSV-1 infects limbic system structures in the central nervous system, and has been suggested as an environmental risk factor for Alzheimer’s disease. The activity-regulated cytoskeleton-associated protein (Arc) is an immediate early expression protein that has emerged as a key regulator of synaptic plasticity and memory consolidation. Although, the role of Arc in neurogenesis and stress resistance is clear, no studies have analyzed the effects of neuronal infection on Arc expression and neuronal plasticity modulation. The aim of this study was to evaluate Arc expression during HSV-1 neuronal infection in in vivo murine model by intranasal inoculation of HSV-1. The results showed that the number of cells that display increase Arc expression during productive and latent infection, reaching a maximum after 7 days post-infection. These results suggest that incremented levels of Arc protein observed during HSV-1 neuronal infection could result in alteration of the cytoskeleton dynamics and neuronal functionality. Funding: FONDECYT 11080067 and 1120464.

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2. INTRODUCCIÓN

2.1

HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1

El herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1)

es un virus que infecta frecuentemente a

humanos, causando ocasionalmente un rango de enfermedades que van desde inofensivos herpes labiales, herpes oculares con probables ceguera y hasta neuroinflamación con riesgo de muerte o secuelas neurológicas, estableciendo latencia y disminución en la calidad de vida del hospedero.

El HSV-1 pertenece a la familia Herpesviridae, subfamilia Alphaherpesvirinae y al género Simplex virus (Mori et al., 2006). Los viriones del HSV-1, presentan una molécula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 152kb (Turner et al., 1996). Protegiendo el genoma viral se encuentra la cápside icosahédrica, la cual se encuentra rodeada por una estructura de característica amorfa llamada tegumento. El tegumento está formado por un complejo de proteínas que tiene como función actuar en los estadios iniciales de infección del virus. Envolviendo el tegumento, se encuentra una estructura de naturaleza lipídica llamada manto o envoltura viral, que contiene las glicoproteínas involucradas en la entrada del virus a la célula diana y en la evasión del sistema inmune del huésped (Itzhaki et al., 2006) (Figura 1).

La expresión de los genes virales está bien regulada de forma temporal y se dividen en tres amplias clases: genes α o inmediatamente tempranos (IE, immediate-early), genes

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β o tempranos (E, early), y genes γ o tardíos (L, late). Los genes IE no requieren la síntesis previa de proteínas, mientras que la expresión de las proteínas E, las cuales incluyen predominantemente proteínas esenciales para la síntesis viral del DNA, es regulada por las proteínas IE. Posterior a la síntesis de proteínas E y la replicación del DNA viral, son expresados los productos de genes L, que consisten principalmente en proteínas de la estructura viral involucradas en el ensamblaje y maduración del virión (Olesky et al., 2005).

El HSV-1 se encuentra ampliamente diseminado en la naturaleza. A nivel mundial, más de un 90% de la población adulta evidencia seropositividad para el HSV-1 (Whitley et al., 2001; Diefenbach et al., 2008), siendo mayor en grupos poblacionales de menor nivel socioeconómico y en países subdesarrollados. Sin embargo, sólo un 20-40% de las personas infectadas desarrolla sintomatología (Schillinger et al., 2004).

Una de las características del HSV-1 es la capacidad de residir en estado de latencia en el hospedero por toda la vida con pocos o ningún signo de manifestación de infección (Olsson et al., 2009). Esto se debe a que es capaz de mantener su genoma en forma episomal en el núcleo de la célula infectada, expresando genes específicos que ayudan al mantenimiento del estado de latencia (transcritos LAT) sin producir nuevos virus, lo que constituye una forma de evadir la repuesta inmune y de persistir en el individuo infectado

(Stevens, 1989).

Solo se ha demostrado la presencia de un pequeño

trascrito asociado a latencia LAT el cual es responsable del bloqueo de genes

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asociados con el inicio de una infección productiva (Baringer et al., 1973; Wagner et al., 1997)

El estado de latencia del HSV-1 lo establece al infectar neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. La infección primaria por HSV-1 se inicia cuando el virus entra en contacto con células epiteliales donde inicia un ciclo de replicación con destrucción de la célula infectada. Luego la progenie viral producida es capaz de infectar terminales nerviosos de neuronas de ganglios sensoriales. Una vez que el virus ingresa a la neurona, la cápside es transportada desde el nervio terminal a lo largo del axón en dirección retrógrada hasta alcanzar el núcleo del ganglio trigémino donde el genoma ingresa al núcleo y se establece la infección latente. La reactivación periódica se produce por el transporte del HSV-1 en dirección anterógrada, desde el cuerpo neuronal (soma) al terminal nervioso del axón, donde los viriones producidos vuelven a infectar células epiteliales produciendo lesiones recurrentes en la misma zona afectada, facilitando con ello su transmisión (Diefenbach et al., 2008), (Figura 2).

El

HSV-1

infecta

principalmente

la

piel

y mucosa

facial,

y en

pacientes

inmunocomprometidos y neonatos es capaz de causar un amplio espectro de enfermedades, por ejemplo, puede propagarse al encéfalo y causar encefalitis herpética, también puede provocar enfermedades oculares crónicas, tales como queratitis y conjuntivitis (Steiner et al., 2007). Se reactiva frente a ciertos estímulos como exposición a radiación ultravioleta, stress, disminución de las defensas, cambios

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hormonales, trauma local, fiebre, infecciones, etc., volviendo por los axones hasta el sitio inicial de infección o cercano a éste, manifestándose como un herpes labial o sólo excretándose en forma asintomática por la saliva, siendo igualmente infectivo para otro individuo, contribuyendo de manera insidiosa a la propagación del virus (Ortiz et al., 2003; DeLano et al., 1984).

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Figura 1. Morfología del virión de los Herpesvirus. Es posible diferenciar cuatro estructuras: El core, que contiene el DNA lineal de doble hebra, una cápside icosaédrica rodeada por un tegumento proteico y la envoltura lipídica que contiene insertas proteínas glicosiladas. Mettenleiter, 2003.

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HSV-1

Epitelio

Ganglio

SNC Neurona sensorial

Figura 2. Transporte viral desde y hacia el sitio inicial de infección durante una infección productiva a nivel epitelial. Al infectar la célula epitelial, HSV-1 viaja por transporte axonal retrogrado hacia el ganglio sensorial donde establece latencia. Al salir del estado de latencia los viriones regresan al sitio inicial de infección o lugares cercanos a éste mediante transporte axonal anterógrado. Bajo ciertas condiciones, HSV-1 alcanza el SNC, probablemente vía neuronal. HSV: Herpes simplex virus; SNC: Sistema nervioso central. Adaptado de Perkins, (2002).

15

2.2

HSV-1 Y NEURODEGENERACIÓN

La neurodegeneración es un evento patológico irremediable que ocurre durante enfermedades inflamatorias crónicas del SNC, mientras que la inflamación puede ser capaz de generar la perdida de espinas dendríticas y promover la degeneración sináptica (Centonze et al., 2009).

Recientes hallazgos, sugieren una relación entre HSV-1 y la enfermedad de Alzheimer (EA). Esto último basado en la evidencia que HSV-1 afecta las mismas zonas cerebrales que se ven involucradas en la EA, hipocampo, sistema límbico, corteza, (Johnson et al., 2010; Conrady et al., 2010). Estos antecedentes demuestran la importancia de los estudios tendientes a dilucidar aspectos relacionados con el posible efecto neurodegenerativo asociado a infección neuronal por HSV-1.

Se ha demostrado que la patogenicidad neuronal por HSV-1 y las secuelas que lo acompañan probablemente abarcan, tanto desde la forma directa el daño neuronal provocado por el virus, como el proceso degenerativo mediado por inmunidad innata, puesto que la microglía en el cerebro sirve como primera línea de defensa contra la invasión de microbios neurovirulentos como el HSV-1. Sin embargo, la activación de la microglía puede tener un efecto protector y/o destructivo sobre las neuronas (Mori et al., 2005). Destructivo porque está relacionado con la secreción de moléculas potencialmente perjudiciales tales como citoquinas proinflamatorias, especies reactivas

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del oxígeno y proteínas del complemento resultando en una neuroinflamación crónica lo cual puede comprometer la funcionalidad sináptica de las neuronas (Carter, 2008), como por ejemplo en la proteína Arc, figura 3.

Por razones que hasta la fecha se desconocen, una vez que el virus alcanza las neuronas sensoriales, específicamente los ganglios, lugar donde establece una infección latente, puede seguir avanzando por transporte retrogrado hasta llegar a neuronas del SNC y ahí establecer una infección latente pudiendo generar daño neuronal, que en algunos casos puede producir encefalitis herpética (HSE), (Norgren et al., 1998). HSE es una de las manifestaciones más severas de la infección por HSV-1. Se clasifica como una encefalitis esporádica, la cual tiene una incidencia anual de 1 caso cada 250.000-500.000 habitantes, en la que de no recibir un tratamiento antiviral efectivo, la posibilidad de fallecer es de un 70%. Del 30% restante, un pequeño porcentaje de las personas recupera la función cerebral normal (Johnson, 1998; Whitley et al., 1986; Whitley et al., 2002), mientras que el resto desarrolla deterioro cognitivo, de memoria y personalidad (Levitz, 1998; Tyler, 2004), secuelas similares a las observadas histopatológicamente en la enfermedad de EA.

Se ha demostrado que HSV-1 alcanza el SNC de personas mayores de 50 años posiblemente debido a que su sistema inmune se ve debilitado con el transcurso de los años por lo que no es capaz de controlar la infección (Jamieson et al., 2002; Wozniak et al., 2005). Las principales regiones cerebrales afectadas por HSE son lóbulo temporal,

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lóbulo frontal y sistema límbico, las mismas regiones que presentan características neuropatológicas en la EA. Se han propuesto dos vías por las cuales el virus podría infectar neuronas del SNC. Una de ellas sería a través de la porción V1 del nervio trigémino, la cual conecta con las meninges basales. La otra vía de entrada sería a través del nervio olfatorio, llegando al bulbo olfatorio, región del SNC donde HSV-1 puede alcanzar la amígdala, ínsula y sustancia perforada, componentes del sistema límbico, lo que puede explicar las lesiones en este sistema, en pacientes que desarrollan HSE (Perkins, 2002). Independiente de la vía de entrada del HSV-1, el transporte hacia y desde los ganglios de neuronas sensoriales es de tipo axonal, en dirección retrógrada y anterógrada respectivamente.

18 Neurona presináptica Astrocito

Microglía

Síntesis de novo Arc

Figura 3. Mecanismo propuesto para la regulación de la comunicación entre microglía, neuronas y astrocitos durante la neuroinflamación crónica. En respuesta a las diferentes lesiones del SNC, células de la microglía son activadas y ellas liberan factores proinflamatorios, tales como TNF-α y IL-1β. Consecuentemente estos componentes proinflamatorios influencian la actividad de astrocitos y neuronas circundantes. Este ambiente neuroinflamatorio resulta en la trasmisión alterada de glutamato y promueve indirectamente daño neuronal por el aumento de glutamato. El gen inmediatamente temprano Arc es expresado en respuesta a la actividad sináptica en neuronas glutamatérgicas, debido a los niveles elevados de glutamato encontrados durante condiciones inflamatorias los que pueden alterar la síntesis de novo de Arc. Adaptado de Rosi, (2011).

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2.3

PLASTICIDAD SINÁPTICA

La plasticidad sináptica, consiste en una serie de cambios en las conexiones sinápticas, inducida por la experiencia, estos cambios pueden ser duraderos y son la base de la memoria, es decir, son la base del almacenamiento de información en el cerebro, lo cual en gran medida determina quienes somos (Bramham et al, 2010). La memoria de largo plazo requiere la modificación y eficacia de la señalización sináptica que esta mediada por la síntesis de nuevas proteínas (Cajigas et al., 2010).

Las sinapsis excitatorias están localizadas en espinas dendríticas que reciben entradas presinápticas glutamatérgicas. A su vez las forma y tamaño de la espinas se correlacionan con su fuerza, movilidad y plasticidad estructural, por ejemplo, en sinapsis pequeñas se encuentran las llamadas “espinas de aprendizaje”, porque ellas son muy móviles y probablemente cambien de forma en respuesta a la actividad, mientras que las “espinas de memoria” son menos móviles y más estables (Peeblesa et al., 2010).

Para que se formen nuevas sinapsis es vital que el citoesqueleto neuronal se reorganice. El citoesqueleto neuronal corresponde a la estructura interna principal que define la forma y polaridad neuronal. Esta estructura se compone de microtúbulos, neurofilamentos y filamentos de actina (Georgiev et al., 2004). En las neuronas, actina corresponde a la proteína del citoesqueleto más abundante en sinapsis, ya que es posible encontrarla tanto en la membrana pre y post-sináptica (Landis, 1982). Además

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es el componente del citoesqueleto principal en espinas dendríticas, determinando la morfología espinal y su plasticidad (Chiaramello et al., 1995)

La participación activa de los microtúbulos en el proceso de polarización neuronal, junto al rol dinámico del citoesqueleto de actina permite la propagación e integración de información a nivel neuronal.

Muchas proteínas han sido implicadas en plasticidad sináptica, en una investigación reciente se ha visto la implicancia de la proteína Arc asociada al citoesqueleto que actúa como un regulador de múltiples vías de señalización neuronal, y que se localiza en las espinas dendríticas como resultado de la actividad sináptica produciendo cambios morfológicos en la espina en respuesta a la intensa actividad neuronal (Shepherd et al., 2011).

En efecto la disfunción de la plasticidad sináptica puede ser causa tanto de procesos naturales como de envejecimiento o de enfermedades patológicas neurodegenerativas como el Alzheimer. En recientes estudios se ha observado que la desregulación de la expresión de Arc resulta en la perdida de las funciones de memoria y es característica de muchas enfermedades neurodegenerativas. (Leslie et al., 2011)

21

2.4

PROTEÍNA ASOCIADA A PLASTICIDAD SINÁPTICA, Arc.

La capacidad de nuestro cerebro para la formación de la memoria de largo plazo se basa en la capacidad de la neurona de modular conexiones sinápticas en respuesta a los estímulos que recibe del ambiente, lo que implica modulación de la fuerza y eficacia de la señalización sináptica que está mediado por la expresión de genes de novo y síntesis de nuevas proteínas (Rosi, 2011).

Los patrones de actividad neuronal se traducen en diversas formas de expresión de síntesis de proteínas dependientes de plasticidad sináptica, proteínas que pertenecen a la familia de proteínas de genes inmediatamente temprano, IEG, cuya expresión es requerida para los procesos de plasticidad duradera que son la base de la consolidación de la memoria (Bramham et al., 2008). En 1995, dos laboratorios de forma independiente identificaron una proteína involucrada en plasticidad sináptica y cuya expresión es inducida cuando hay un aumento de la actividad neuronal (Korb et al., 2011), la proteína asociada al citoesqueleto regulada por actividad Arc y que es expresada por el gen Arg3.1 (Grinevich et al., 2009).

La proteína Arc se localiza exclusivamente en la densidad postsináptica, en dendritas y se acumula en las espinas dendríticas en respuesta al aumento de la

reciente

actividad sináptica en neuronas glutamatérgicas en diferentes estructuras del cerebro,

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como por ejemplo, corteza, hipocampo, amígdala y cuerpo estriado (Shepherd et al., 2011).

Aunque la cascada precisa de señalización que involucra la transcripción de Arc no está bien definida, una de las vías de transcripción que se ha propuesto es que Arc se expresa en el núcleo celular rápidamente en respuesta a la actividad sináptica que dependen de la activación del receptor NMDA y de la cascada de señalización de proteínas kinasas ERK (Bramham et al., 2010) (Figura 4).

Una vez transcrito el mRNA de Arc es exportado desde el núcleo al citoplasma y viaja como ribonucleoproteina a las extremidades más distales de las dendritas, acumulándose en regiones de las espinas dendríticas donde la sinapsis ha sido recientemente activada. Esto es dependiente de la polimerización de actina y la señalización a través de NMDA y Rho kinasa.

No existe un mecanismo preciso por el cual Arc participa en plasticidad sináptica, su acción depende del estímulo y de la vía de señalización que se active. Sin embargo, se ha demostrado que Arc juega un rol regulatorio en el tráfico de los receptores AMPA vía su interacción con componentes de la maquinaria endocítica, tales como dinamina y endofilina 2/3, dos proteínas que juegan un rol importante en la endocitosis sináptica (Chowdhury et al., 2006). También ha sido implicada en la modulación de la morfología

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de la espina dendrítica regulando el tamaño y tipo de espina (Peeblesa et al., 2010); todas estas acciones modulan la fuerza sináptica (Kerrigan et al., 2013).

La expresión de Arc es exquisitamente regulada en muchos niveles diferentes, incluyendo transcripción, degradación del mRNA, traducción y degradación de proteínas. Esto sugiere que la ruptura de la expresión de Arc puede tener profundos efectos en la plasticidad sináptica. Su desregulación ha sido implicada en múltiples enfermedades neurodegenerativas entre ellas la enfermedad de Alzheimer (Bramham et al., 2008)

24

Figura 4. Mecanismo molecular de la expresión de Arc dependiente de la actividad sináptica. Tras la fuerza de activación sináptica, se inicia un aumento transiente de la concentración de calcio intracelular por el influjo de calcio a través de los receptores de glutamato tipo NMDA, lo que induce la activación de varias vías de kinasas intracelulares y fosfatasas. Los canales de calcio dependientes de voltaje y los receptores IP3, también pueden contribuir a aumentar el calcio intracelular. La señalización sináptica converge en el elemento clave regulador SARE, mediante la formación de un complejo formado por los factores de transcripción dependientes de la actividad, CREB, MEF2 Y SRF así como sus coactivadores. El putativo complejo SARE recluta el complejo de preiniciación cerca del sitio de inicio de transcripción e inicia la transcripción del gen Arc. Adaptado de Okuno, (2011).

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2.5

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Considerando que el herpes simplex virus tipo 1, es un virus ubicuo que tiene una alta tasa de infección en la población humana y que permanece en el individuo infectado de por vida en estado de latencia reactivándose frente a determinadas condiciones ambientales o propias del hospedero como por ej., disminución del sistema inmunológico y stress, teniendo como consecuencia una disminución en la calidad de vida del individuo. Es de nuestro interés estudiar la dimensión del daño real y las posibles consecuencias provocadas por el HSV-1 en el huésped infectado, ya que estudios previos han demostrado que es una de las principales causas de encefalitis herpética en humanos, asociada con una alta incidencia de mortalidad o con significativas secuelas neurológicas, neurofisiológicas y cognitivas que afectan a los pacientes por toda la vida (Mori et al., 2005). Sumado a esto, están los estudios que involucran el HSV-1 como posible factor de riesgo de la EA, ya que el daño provocado por el HSV-1 sería en las mismas zonas de EA. También se ha visto en recientes hallazgos la asociación de la neuroinflamación crónica con la alteración en la expresión de la proteína Arc, pudiendo alterar los procesos de plasticidad sináptica asociados con la consolidación de la memoria.

De acuerdo a la evidencia expuesta se propone analizar la magnitud del daño neuronal evaluando la expresión de la proteína Arc durante una infección productiva y latente con HSV-1 en ratones Rockefeller.

26

2.6

HIPÓTESIS

Durante una infección neuronal con HSV-1 se generan cambios en la expresión de la proteína asociada con plasticidad neuronal Arc, lo cual puede generar consecuencias en el normal funcionamiento de la neurona.

2.5

OBJETIVO GENERAL

Evaluar cambios en la expresión de la proteína Arc en trigémino y cerebro durante infección productiva y latente en ratones infectados intranasalmente durante 7; 15; 60; y 220 días post-infección.

27

2.6



OBJETIVO ESPECÍFICO

Determinar mediante inmunohistoquímica cambios en la expresión de la proteína Arc en cerebro y trigémino, durante infección productiva (7 y 15 dpi) y latente (60 y 220 dpi) en ratones infectados intranasalmente con HSV-1.



Analizar mediante inmunohistoquímica cambios en la expresión de la proteína de expresión temprana del virus, ICP-8, en cerebro y trigémino, durante infección productiva (7 y 15 dpi) y latente (60 y 220 dpi) en ratones infectados intranasalmente con HSV-1.



Colocalizar mediante inmunohistoquímica la expresión de proteína Arc por la infección de HSV-1 utilizando como marcador viral la proteína ICP-8.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1

MATERIALES

3.1.1 HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1

Se utilizó la cepa F del virus HSV-1, la cual es usada como cepa de referencia en estudios a nivel mundial debido a su reconocida neurovirulencia.

3.1.2 ANIMALES EXPERIMENTALES

Se utilizó ratones Rockefeller hembra, de 3 meses de edad, con sistema inmune competente, que fueron provistas por el bioterio del Instituto de Inmunología de la Universidad Austral de Chile, se mantuvieron bajo condiciones estándar de temperatura, alimentación, luz y agua.

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3.1.3 REACTIVOS

Anticuerpos:

De ABCAM, Company, se obtuvo el anticuerpo Arc, anticuerpo policlonal de conejo

De Santa Cruz, Biothechnology, se obtuvo el anticuerpo ICP8, Anticuerpo monoclonal de ratón santa cruz.

Reactivos:

De Dako Biotinylated Link Universal, se obtuvo el anticuerpo secundario biotinilado, y el complejo estreptavida peroxidasa, Dako Streptavidin-HRP.

De Merck, Darmstadt, fueron adquiridos los siguientes reactivos: Cloruro de sodio (NaCl), Hidróxido de sodio (NaCl),

Hidrógeno fosfato disódico dihidratado

(Na2HPO4x2H2O), Dihidrogenofosfato potásico (KH2PO4), Tris Base, Tritón X-100, Ácido Cítrico.

De Roche Diagnostics se obtuvo DAB.

De Winkler Ltda., se obtuvieron los siguientes reactivos: Alcohol metílico, Alcohol etílico, Xilol.

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Equipamiento:

Para el análisis de las fotos se utilizó el microscopio Olympus BX 51 y el software Image-Pro 6.2, además del software Adobe Photoshop 8.0.1, ImageJ y el software GraphPad Prism 5.

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3.2

METODOLOGÍA

3.2.1 DISEÑO EXPERIMENTAL E INFECCIÓN IN VIVO CON HSV-1

De acuerdo al modelo experimental previamente establecido en el laboratorio (Martin, 2009) se trabajó en una cinética de infección neuronal in vivo, con el propósito de analizar la alteración en la expresión de la proteína Arc provocada por una infección productiva y latente por HSV-1.

Se analizaron cortes de cerebro de ratones hembra de la cepa Rockefeller a diferentes tiempos de infección por HSV-1, utilizando tres muestras de cada tiempo y condición (infectado y control).

La infección se realizó en base a un modelo murino que logra caracterizar la patogénesis neuronal del HSV-1 donde se establece como infección productiva el séptimo día post-inoculación y posterior a los 30 días es considerado como infección latente (Meyding-Lamadé et al., 1998; Meyding-Lamadé et al., 2002; Dvorak et al., 2004). Se procedió a infectar vía intranasal con HSV-1, cepa F (2x105 pfu), ratones Rockefeller hembra de tres meses de edad, los cuales fueron sacrificados a los 7, 15, 60 y 220 días post-inoculación.

En paralelo se dispuso de ratones hembra, de tres meses de edad, de la misma cepa Rockefeller solo con suero fisiológico, 10µL, vía intranasal, los cuales fueron

32

sacrificados para el posterior análisis de los cerebros, se utilizaron como control, en distintos tiempos 7, 15, 60 y 220 días. Figura 5.

Ambos grupos, control e infectados, fueron mantenidos en jaulas separadas (para evitar el contagio) y en igualdad de condiciones de alimentación, agua, luz y temperatura. Los animales fueron controlados clínicamente en apariencia, postura, hábitos alimenticios y signos neurológicos.

Una vez cumplido el tiempo de infección, los animales fueron anestesiados con solución éter y sacrificados mediante decapitación.

El cerebro obtenido mediante microcirugía fue fijado en paraformaldehido al 4% e incluido en parafina. Se obtuvieron cortes de 4 μm de espesor que fueron montados en portaobjetos de vidrios pre-tratados con silano (Polyscience).

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Ratones Rockefeller de 3 meses

Suero Fisiológico

HSV-1

Inoculación vía Intranasal

Cinética 7,15, 60, 220 dpi Bajo condiciones estándares de T°, luz, agua y alimentación.

Infectado

Control

Observación de sintomatología clínica

Adormecimiento con éter Microcirugía

Obtención de cerebro para su posterior análisis

FIGURA 5. Esquema de inducción de la infección HSV-1 en ratones Rockefeller.

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3.2.2 INMUNOHISTOQUÍMICA

Se trabajó con un total de 3 cinéticas por condición infectada y control en los tiempos 7, 15, 60, 220 dpi.

Una vez obtenidas las muestras de cerebro y trigémino, fueron fijados en paraformaldehido

e

incluidos

en

parafina.

Posteriormente

los

cortes

fueron

desparafinados en xilol (CH3)2C6H4 (tres isómeros, orto, meta y para-xileno. M=106,17g/mol) por 10 minutos, posterior a esto fueron sometidas a rehidratación en alcohol etílico a concentraciones decrecientes, 100°, 95°, 80° y 70°, por 5 minutos respectivamente y finalmente se lavaron en agua destilada por 5 minutos tres veces.

Para evitar una reacción inespecífica del tejido,

la muestras fueron sometidas al

bloqueo de la actividad de peroxidasa endógena del tejido con una solución de alcohol metílico más peróxido de hidrogeno al 3%, por 10 minutos y se procedió a lavar con H20 destilada.

Finalizada la etapa anterior se procedió al desenmascaramiento del antígeno con buffer Citrato de Sodio pH 6,0 calentando al microondas a potencia media, en intervalos de 2 minutos por cuatro veces, revisando en cada intervalo que el tejido permanezca siempre cubierto por el buffer, luego se dejó enfriar en agua destilada. Una vez fría se procedió a lavar con buffer Tris-HCl 1X a pH 7,8 por tres veces, cada vez por 5 minutos.

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Para evitar una coloración excesiva de fondo se procedió a la máxima dilución posible del primer anticuerpo, en una solución compuesta por tampón TCT, (Tris-CarrageninaTritón). En el caso de Arc se utilizó una dilución de 1:500 y para ICP8 una dilución de 1:50.

Una vez diluido el primer anticuerpo se procedió a la incubación en cámara

húmeda a 4°C por 18 hrs aproximadamente.

Terminada la incubación con el primer anticuerpo se procedió a lavar con buffer TrisHCl 1X a pH 7,8 tres veces por cinco minutos cada vez y luego para revelar la unión del primer anticuerpo con su antígeno se incubó con kit Dako biotina/estreptavidina. Primero se incubo con el anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón biotinilado por 30 minutos en cámara húmeda a 4°C. Terminado este paso se lavaron nuevamente con buffer Tris-HCl 1X a pH 7,8 por tres veces y por cinco minutos. Para finalizar se incubó con el complejo Streptavidina-HRP por 30 minutos a 4°C en cámara húmeda y se lavó nuevamente tres veces por cinco minutos con buffer Tris-HCl 1X a pH 7,8.

Se reveló en oscuridad con una solución compuesta por 0,07g de DAB más 35mL de Tris-HCl 1X y 100uL de H2O2 30%, por 15 minutos para la muestra de trigémino y por 10 minutos para la muestra de cerebro, aproximadamente. Luego se lavó con agua destilada y se procedió a la deshidratación sometiendo las muestras a una batería de alcoholes de concentraciones crecientes, etanol de 70°, 80°, 95°, 100°, por cinco minutos cada vez y xilol fenicado para quitar el exceso de DAB y finalmente dos lavados por 10 minutos con xilol. Para validar los resultados de la reacción

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inmunohistoquímica, se realizaron controles negativos para cada tejido que consistió en incubar los cortes con TCT en ausencia del anticuerpo primario para luego seguir con el procedimiento antes descrito.

Terminada la inmunohistoquímica se procedió al montaje de las muestras con Bálsamo de Canadá para finalmente ser analizadas con el microscopio modelo Olympus BX 51 equipado con una cámara de video digital (NikonDXM1200) facilitado por el Instituto de Bioquímica y Microbiología de la Universidad Austral de Chile. Las imágenes fueron tomadas a través del software Image-Pro 6.2, las que fueron procesadas con el programa Adobe Photoshop 8.0.1 para su posterior análisis.

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3.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

A través del programa para análisis de imagen Image J versión 4.1, se realizó la cuantificación de células inmunoreactivas en las imágenes que se obtuvieron a un aumento de 20X para cada tejido por triplicado. Este estudio fue realizado en triplicado para calcular el área del tejido en mm2, usando una regla de medición de 200µm y así poder obtener el número de células inmunoreactivas en una determinada área del tejido en mm2 para cada tejido en estudio.

El valor obtenido de la cuantificación, expresado en número de células/mm2 fueron graficados y analizados en el programa Grad Phad Prism versión 5.0; utilizando el test student- no paramétrico, donde los valores se consideraron significativo con una p