Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia

PROFESOR PATROCINANTE: Karin Jürgens Sch. INSTITUTO : Farmacia FACULTAD : Ciencias

PROFESOR CO-PATROCINANTE: Lorenzo Villa Z. INSTITUCIÓN : Universidad de Concepción

QUÍMICA Y EVALUACIÓN DEL EFECTO HIPOGLICEMIANTE DE PRÓPOLIS EN RATONES DIABÉTICOS INDUCIDOS CON ALOXANO

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico

ERNESTO ALEJANDRO CÁRDENAS RUIZ VALDIVIA-CHILE 2008

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A mi madre, que con amor y esfuerzo me ha apoyado en todo momento, siendo fundamental en mis años de estudio. A Ruth, quien me ha acompañó y animó cuando necesité fuerzas para continuar. También quiero dedicar este trabajo a Jaime y Eva, quienes me acogieron y brindaron su apoyo incondicional.

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Agradecimientos Numerosas han sido las personas que de manera directa o indirecta han participado en la realización de este trabajo de tesis. Hoy, cuando he finalizado este trabajo quiero dejar constancia de todos ellos y expresarles mi más sincero agradecimiento. En primer lugar quiero agradecer a los profesores Q. F. Karin Jürgens y Q. F. Lorenzo Villa, quienes idearon y participaron activamente en la realización de este trabajo y cuyo apoyo fue fundamental para concretar mi tesis. Agradezco a la Dra. Mónica Salas y el Dr. Jorge Muskdi, quienes participaron en la realización de esta tesis. Quiero expresar mi gratitud a la Universidad de Talca, Instituto de Química de Recursos Naturales y especialmente al Dr. Guillermo Schmeda, por su colaboración en este estudio. Quiero agradecer a don Joel Pardo, quien me orientó cada vez que tuve dudas durante la realización de mi trabajo de laboratorio. Quiero expresar mi agradecimiento a todo el personal docente de la universidad que de una u otra forma contribuyeron en mi formación profesional. Por último, agradecer a mis amigos de la universidad, con quienes nos apoyamos en los buenos y malos momentos y de quienes guardo los mejores recuerdos.

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Índice

1. Resumen

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1.1. Summary

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2. Introducción

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2.1. Hipótesis

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2.2 .Objetivos

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2.2.1. Objetivo General

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2.2.2. Objetivos Específicos

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3. Materiales y métodos

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3.1. Materiales

31

3.2. Métodos

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3.2.1. Recolección del material vegetal

33

3.2.2. Purificación del própolis y obtención de fracciones activas

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3.2.3 Ensayo de actividad antioxidante “in vitro”. Decoloración del

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radical libre DPPH. 3.2.4. Actividad hipoglicemiante

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3.2.4.1. Inducción de diabetes mellitus en ratones

39

3.2.4.2. Preparación y administración del extracto de própolis

42

3.2.4.3. Evaluación del efecto hipoglicemiante de própolis

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3.2.4.4. Determinación de glucosa sanguínea

45

3.2.5. Estudio Histopatológico

47

5

3.2.6. Análisis Estadístico

47

4. Resultados

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4.1. Identificación de metabolitos secundarios en própolis

48

4.2. Ensayo de capacidad antioxidante. Decoloración del radical

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libre DPPH˙ 4.3. Efecto hipoglicemiante de própolis

58

4.4. Estudio histopatológico

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5. Discusión

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6. Conclusiones

80

7. Literatura citada

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8. Anexos

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Índice de figuras

Figura 1.

Insulina.

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Figura 2.

Recolección de resinas para la elaboración del própolis.

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Figura 3.

Própolis obtenido por raspaje desde la colmena.

24

Figura 4.

Obtención de própolis mediante raspaje de una colmena.

33

Figura 5.

Extracción con éter de petróleo.

35

Figura 6.

Extracción con diclorometano.

35

Figura 7.

Extracción con acetato de etilo.

35

Figura 8.

Estructura química del aloxano.

39

Figura 9.

Mecanismo de generación de la especie oxígeno reactiva

41

inducida por aloxano en las células β del páncreas. Figura 10.

Rotavapor con extracto etanólico en su interior.

42

Figura 11.

Administración de extracto.

42

Figura 12.

Recolección de sangre en un microtubo.

45

Figura 13.

Microcentrífuga con microtubos en su interior.

45

Figura 14.

Extracto de própolis crudo.

51

Figura 15.

Extracto Diclorometano.

51

Figura 16.

Patrón de pinocembrina 0,125 mg/ml.

52

Figura 17.

Extracto diclorometano y coinyección de pinocembrina

52

0,125 mg/ml. Figura 18.

Patrón de pinobanksina 0,125 mg/ml.

53

Figura 19.

Extracto diclorometano y coinyección de pinobanksina.

53

7

Figura 20.

Patrón de crisina 0,175 mg/ml.

54

Figura 21.

Extracto diclorometano y coinyección de crisina.

54

Figura 22.

Patrón de galangina 0,125 mg/ml.

55

Figura 23.

Extracto diclorometano y coinyección de galangina 0,25

55

mg/ml. Figura 24.

Estructura de los flavonoides identificados en la muestra de própolis analizado.

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Índice de gráficos

Gráfico 1.

Rendimiento de las extracciones realizadas al própolis.

49

Gráfico 2.

Actividad atrapadora de radicales libres de própolis.

57

Gráfico 3.

Glicemias basales y pre-tratamiento para todos los

60

grupos. Gráfico 4.

Glicemias de la primera semana de tratamiento para

61

todos los grupos. Gráfico 5.

Glicemias de la segunda semana de tratamiento para

61

todos los grupos. Gráfico 6.

Glicemias de la tercera semana de tratamiento para

62

todos los grupos. Gráfico 7.

Glicemias de la cuarta semana de tratamiento para

62

todos los grupos. Gráfico 8.

Glicemias de la quinta semana de tratamiento para

63

todos los grupos. Gráfico 9.

Glicemias de la sexta semana de tratamiento para todos

63

los grupos. Gráfico 10.

Glicemias de la séptima semana de tratamiento para

64

todos los grupos. Gráfico 11.

Glicemias de la octava semana de tratamiento para todos los grupos.

64

9

Gráfico 12.

Comparación de medias de glucosa sanguínea para todos los grupos.

65

10

Índice de tablas

Tabla 1.

Rendimiento de las fracciones obtenidas por extracción con

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éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo. Tabla 2.

Variación del gradiente de la fase móvil durante el

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transcurso del análisis. Tabla 3.

Actividad atrapadora de radicales libres de extractos

57

metanólicos, etanólicos y acuosos de própolis. Tabla 4.

Valores de glicemias de los grupos de ratones en estudio.

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1. Resumen Introducción: Própolis es una resina cérea de consistencia viscosa, elaborado por las abejas (Apis sp.). Su composición es compleja y variable de acuerdo a la vegetación existente en las distintas zonas de recolección. Ha sido ampliamente utilizado desde la antigüedad con diversas finalidades, cobrando importancia últimamente su uso en medicina. Material y métodos: Se evaluó la capacidad antioxidante de extractos metanólico, etanólico y acuoso de própolis. A partir de una muestra de própolis crudo se realizó una extracción con metanol, la que se fraccionó con éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo. La fracción diclorometano y el extracto crudo de própolis fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se evaluó el efecto hipoglicemiante del própolis utilizando ratones diabéticos inducidos con aloxano (250mg/kg) por vía intraperitoneal. El extracto etanólico resuspendido en agua se administró diariamente por ocho semanas en dosis de 100 y 200 mg/kg por vía intragástrica. Se determinó glicemia semanalmente y se comparó con los controles respectivos. Resultados: Extractos metanólico, etanólico y acuoso de própolis demostraron poseer una elevada capacidad antioxidante en el ensayo del radical libre 2,2-difenil-1picrilhidrazil (DPPH). De la fracción diclorometano se aislaron los flavonoides pinocembrina, pinobanksina, crisina y galangina. Los ratones diabéticos tratados con 100 y 200 mg/kg de extracto de própolis pasaron de la hiperglicemia (p=0,0008 y p=0,0012) a valores de glicemia similares a los del control sano hacia el final del estudio (p=0,4630 y p=0,0786). La observación anatomopatológica de riñón reveló que própolis administrado en dosis de 100 y 200 mg/kg es capaz de revertir el daño tubular agudo observado en ratones diabéticos. La administración de própolis a ratones diabéticos produjo una dilatación quística de la cápsula de Bowman, lo que fue más marcado en la dosis de 200 mg/kg. Conclusiones: Los resultados obtenidos respaldan la actividad hipoglicemiante y antioxidante de própolis.

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1.1. Summary Introduction: Propolis is a waxy resin of viscous consistency produced by bees (Apis sp.). Its composition is complex and varies according to the vegetation present in the different collection zones. Widely used since ancient times, it has several uses and was greatly recognized recently for its medical properties. Material and methods: The antioxidant capacities of methanolic, ethanolic and watery propolis extract were analyzed. An extraction using methanol was made on a sample of crude propolis, which was later fractioned with petroleum ether, dichloromethane and ethyl acetate. The fraction dichloromethane and the crude extract of propolis were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The hypoglycemic effect of propolis was analyzed by inducing diabetic mice with alloxan (250mg/kg i. p.). An ethanolic extract suspended in water was administered intragastrically, on a daily basis over an eight-week period, in doses of 100 and 200 mg/kg respectively. Glycaemia was determined weekly and compared with the respective controls. Results: The methanolic, ethanolic and watery propolis extracts demonstrated raised antioxidant capacities in the free radical 2,2-diphenyl-1-picrilhidrazil (DPPH) test. From the dichloromethane fraction were isolated the flavonoids pinocembrin, pinobanksin, chrisyn and galangin. Diabetic mice treated with 100 and 200 mg/kg of propolis extract changed from a hyperglycaemic state (p=0.0008 and p=0.0012) to glycaemic values similar to those of normal controls towards the end of the study period (p=0.4630 and p=0.0786). Anatomophatological

observations

of

the

kidney

revealed

that

propolis

administrated in doses of 100 and 200 mg/kg is capable of reverting the acute tubular damage observed in diabetic mice. Diabetic mice administered with propolis produced the cystic dilatation of the Bowman's capsule. This was greatly marked during the 200 mg/kg doses. Conclusions: The results obtained support the hypoglycaemic and antioxidant activities of propolis.

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2. Introducción La diabetes mellitus (DM) era conocida antes de la era cristiana. Esto se ve reflejado en el manuscrito del siglo XV a.C. descubierto por Ebers en Egipto, en el que se describen síntomas que parecen corresponder a DM. Galeno, en el siglo II d.C., también hizo referencia a la diabetes. Sin embargo, fue Areteo de Capadocia, quien durante el siglo II d.C., le dio a esta afección el nombre de diabetes, que en griego significa sifón, refiriéndose a la exagerada eliminación de orina de quienes la padecen. En los siglos posteriores no se encuentra en los escritos médicos referencia a esta enfermedad hasta que, en el siglo XV, Avicena habla con clara precisión de esta afección en su famoso Canon de la Medicina. Tras un largo intervalo fue Tomás Willis quien, en 1679, hizo una descripción magistral de la diabetes, quedando desde entonces reconocida por su sintomatología como entidad clínica. Fue él, quien refiriéndose al sabor dulce de la orina, le dio el nombre de diabetes mellitus (sabor a miel) (Roca y Plá, 1963). Actualmente, sabemos que la DM no es una entidad patológica aislada, sino un grupo de trastornos metabólicos cuya característica común es la hiperglicemia. La hiperglicemia en la diabetes es la consecuencia de defectos en la secreción de insulina, en la acción de la misma o, más frecuentemente, de ambos (Robbins y Cotran, 2005). Diabetes mellitus es un peligro agudo para la salud humana (Fuliang et al., 2005) y según la Federación Internacional de Diabetes (FID), la enfermedad afecta aproximadamente el 6% de la población mundial adulta (Intramed, 2006). Además, se estima que la mortalidad a causa de la diabetes aumentaría un 25% a lo largo de la

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próxima década (Intramed, 2006). La Asamblea General de las Naciones Unidas aprobó durante diciembre del 2006 una resolución histórica que reconoce como amenaza global a la epidemia de la diabetes. Por primera vez, los gobiernos reconocieron que una enfermedad no infecciosa impone una amenaza tan seria para la salud del mundo como las enfermedades infecciosas VIH/SIDA, tuberculosis y malaria. De hecho, la mortalidad provocada por la diabetes es tan elevada como la que causa el SIDA, pero existe una extraordinaria falta de conciencia al respecto (Intramed, 2006). En Estados Unidos se calcula que la diabetes afecta a 16 millones de personas, la mitad de las cuales no están diagnosticadas. Cada año, unos 800 mil individuos desarrollan diabetes en este país, y 54 mil fallecen de causas relacionadas con la diabetes. La diabetes es una de las causas responsables de enfermedad renal terminal, ceguera de aparición en el adulto y de amputaciones no traumáticas de extremidades inferiores en Estados Unidos. Para la población nacida en Estados Unidos en el año 2000, el riesgo estimado de desarrollar diabetes mellitus a lo largo de su vida es de 1 de cada 3 para hombres y de 2 de cada 5 para mujeres. El riesgo es de 2 a 5 veces mayor en los afroamericanos, hispanos y comunidades nativas americanas, en comparación con los blancos no hispanos (Robbins y Cotran, 2005). La Organización Mundial de la Salud (OMS) calcula que en el mundo hay más de 180 millones de personas con diabetes, y es probable que esta cifra aumente a más del doble para el año 2030 (OMS, 2006). Los países con el mayor número de diabéticos son India, China y Estados Unidos (Robbins y Cotran, 2005). De acuerdo a las estimaciones de la OMS para las Américas, Chile se encuentra en el grupo de países con las mayores prevalencias de diabetes en poblaciones adultas

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junto a Estados Unidos, Canadá, Argentina y Uruguay, con valores entre 6,1 y 8,1% (Carrasco et al., 2004). Por su parte, cifras entregadas por el Ministerio de Salud de Chile hablan de una prevalencia de diabetes de 0,1% antes de los 44 años, subiendo a 9,4% entre los 45 y los 64 años llegando a un 15,2% en los mayores de 64 años, sin existir diferencias entre las zonas urbanas y rurales (Ministerio de Salud, 2003). De acuerdo al comité de expertos de la Asociación Americana de Diabetes (ADA) y la OMS la diabetes se clasifica en: diabetes tipo 1 (antes conocida como diabetes mellitus insulina-dependiente o de inicio en la infancia), diabetes tipo 2 (antes conocida como diabetes mellitus no insulina-dependiente o de inicio en la edad adulta), diabetes gestacional y otros tipos específicos de diabetes (OMS, 2006; López, 1998). La diabetes tipo 1, aunque puede presentarse a cualquier edad, aparece con mayor frecuencia en la infancia o la adolescencia y es el tipo predominante de diabetes mellitus que se diagnostica antes de los 30 años de edad. Este tipo de diabetes representa del 10 al 15% del total de casos de diabetes mellitus y se caracteriza clínicamente por hiperglicemia y tendencia a la cetoacidosis diabética. El páncreas produce escasa o ninguna insulina (Beers y Berkow, 1999). Alrededor del 80% de los pacientes con diabetes tipo 1 tienen fenotipos antígenos leucocitarios humanos (HLA) específicos asociados con anticuerpos detectables en el suero contra citoplasma de las células de los islotes y anticuerpos contra la superficie de esas células (los anticuerpos contra la decarboxilasa del ácido glutámico y contra la insulina se encuentran en similar proporción de casos). Estos anticuerpos pueden participar en el desarrollo de la enfermedad o pueden ser el resultado de la lesión celular mediada por células T y la liberación de antígenos normalmente secuestrados (Robbins y Cotran, 2005; Beers y

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Berkow, 1999). En estos pacientes, la diabetes tipo 1 se debe a una destrucción selectiva, mediada por la inmunidad y condicionada genéticamente, de más del 90% de las células β secretoras de insulina. Además del antecedente genético, los factores ambientales afectan a la presentación de la diabetes tipo 1. Esta clase de factores ambientales pueden ser virus (los virus de la rubéola congénita, la parotiditis y los virus Coxsackie B pueden provocar el desarrollo de una destrucción autoinmunitaria de células β) que produzcan proteínas que se asemejen a los autoantígenos, con lo que la respuesta inmune contra las proteínas virales produciría reacciones cruzadas frente a los tejidos propios, y la exposición a la leche de vaca en lugar de la leche materna durante la lactancia (una secuencia específica de la albúmina procedente de la leche de vaca puede presentar reacción cruzada con proteínas de los islotes). La geografía puede tener un papel en la exposición a la enfermedad, ya que la incidencia de diabetes mellitus tipo 1 es particularmente alta en Finlandia y Cerdeña (Robbins y Cotran, 2005; Beers y Berkow, 1999). La diabetes tipo 2 suele ser el tipo de diabetes que se diagnostica en pacientes mayores de 30 años, aunque también se presenta en niños y adolescentes. Se caracteriza clínicamente por hiperglicemia y resistencia a la insulina (Beers y Berkow, 1999). Es el tipo de diabetes más común, abarcando el 80 a 90% de todos los casos de diabetes (Guyton, 2001). En su patogenia, juegan un papel importante el estilo de vida sedentario, los hábitos dietéticos y el excesivo peso corporal (Robbins y Cotran, 2005; OMS, 2006). La diabetes tipo 2 forma parte del grupo heterogéneo de trastornos en los cuales la hiperglicemia se debe a un deterioro de la respuesta secretora insulínica a la glucosa y también a una disminución de la eficacia de la insulina en el estímulo de la

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captación de glucosa por el músculo esquelético y en la restricción de la producción hepática de glucosa (resistencia a la insulina) (Beers y Berkow, 1999). En la diabetes tipo 2, los islotes pancreáticos conservan una proporción de células β en relación a las células α que no se altera de una forma constante, y la masa de células β normales parece estar conservada en la mayoría de los pacientes (Beers y Berkow, 1999). La diabetes gestacional, se desarrolla en un 2% a un 5% de todos los embarazos, pero desaparece al final del embarazo. La obesidad también está asociada con un alto riesgo de desarrollar este tipo de diabetes. Las mujeres que han tenido diabetes gestacional tienen un riesgo más alto de desarrollar diabetes de tipo 2 en el futuro. Según estudios, cerca del 40% de las mujeres con diabetes gestacional desarrolló diabetes (Centro para el Control y Prevención de las Enfermedades, 1998). Otros tipos específicos de diabetes comprenden, en un listado ordenado de la A a la H, los tipos de diabetes de causa conocida, la que se podría incrementar a medida que progrese la investigación. A. Defectos genéticos de la función de la célula beta. B. Defectos genéticos en la acción de la insulina. C. Enfermedades del páncreas exocrino. D. Endocrinopatías. E. Drogas. F. Infecciones. G. Formas no comunes de diabetes mediada por fenómenos inmunes.

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H. Otros síndromes genéticos asociados a veces con diabetes. La hiperglicemia crónica y la desregulación metabólica concomitante pueden asociarse con lesiones secundarias en múltiples órganos, destacándose: •

La retinopatía diabética debida al daño de los pequeños vasos de la retina, acumulado a lo largo del tiempo, es una importante causa de ceguera. Al cabo de 15 años con diabetes, aproximadamente un 2% de los pacientes están ciegos, y cerca del 10% sufren un grave deterioro de la visión.

•

La neuropatía diabética se debe al daño de los nervios a consecuencia de la diabetes, y puede llegar a afectar a un 50% de los diabéticos. La neuropatía diabética puede causar muchos problemas diferentes, pero los síntomas más frecuentes son hormigueo, dolor, entumecimiento o debilidad en los pies y manos.

•

Combinada con la disminución del flujo sanguíneo, la neuropatía incrementa el riesgo de úlceras en los pies y, finalmente, de amputación del miembro inferior.

•

La diabetes se encuentra entre las principales causas de insuficiencia renal. Un 10% a 20% de los pacientes con diabetes fallecen por esta causa.

•

La diabetes aumenta el riesgo de cardiopatía y accidente vascular cerebral. El 50% de los pacientes con diabetes fallecen de enfermedades cardiovasculares (principalmente cardiopatías y accidentes vasculares cerebrales).

•

En general, el riesgo de muerte de los diabéticos es al menos el doble que el de los no diabéticos (OMS, 2006).

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El tratamiento actual del enfermo diabético exige un abordaje múltiple, dirigido no sólo a ajustar en lo posible los niveles de glicemia de forma permanente, sino a prevenir y a tratar la constelación de alteraciones metabólicas antes señaladas, así como las complicaciones que tan frecuentemente surgen en el curso de la enfermedad. Este tratamiento se basa, lógicamente, en la dieta ajustada a las necesidades vitales de cada persona, en la insulina y en los diversos fármacos orales que, por uno u otro mecanismo, consiguen reducir los niveles de glicemia (Flórez et al., 1997). La insulina, que es inyectable, está indicada para el tratamiento continuado de la DM de tipo 1, la cetoacidosis diabética, el coma hiperosmolar no cetósico en pacientes con DM de tipo 2, la acidosis láctica diabética y la diabetes gestacional (Flórez et al., 1997). La insulina es un polipéptido de 51 aminoácidos (5,8 kD) sintetizado preferentemente por las células β del páncreas. Consta de dos cadenas, la A, con 21 aminoácidos, y la B, con 30, unidas entre sí por dos puentes disulfuro; la cadena A tiene además otro puente disulfuro entre sus aminoácidos 6 y 11 (Figura 1) (Flórez et al., 1997).

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Figura 1. Insulina; el péptido C está representado por la línea continua a partir de los dos puntos negros (Flórez et al., 1997).

Hasta hace pocos años, la insulina utilizada clínicamente procedía de la extracción de páncreas bovinos y porcinos. En la mayoría de los países, ahora sólo se usa insulina humana obtenida por tecnología recombinante a partir de plásmidos ADN inyectados en Escherichia coli (Flórez et al., 1997). Las preparaciones de insulina pueden clasificarse según su duración, en insulina de acción corta, intermedia y prolongada (Goodman et al., 2006). Aunque el efecto más visible de la insulina es la reducción de la glicemia, su influencia real es la de promover el almacenamiento de las fuentes energéticas (glucosa y lípidos) y su utilización en las correspondientes células especializadas (Flórez et al., 1997; Goodman et al., 2006). Los hipoglicemiantes orales se utilizan en la DM tipo 2, pero no en la DM tipo 1, ya que en este último grupo de pacientes no pueden prevenir la hiperglicemia sintomática ni la cetoacidosis diabética. Los fármacos hipoglicemiantes orales son las sulfonilureas.

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Los fármacos antihiperglicémicos son las biguanidas, los inhibidores de la α-glucosidasa y los sensibilizadores a insulina (tiazolidindionas ["glitazonas"]) (Beers y Berkow, 1999). Sulfonilureas: causan hipoglicemia al estimular la liberación de insulina preformada en las células β del páncreas porque aumentan su sensibilidad a la glucosa. Biguanidas: el único derivado biguanídico actualmente aceptado es la metformina. Producen un aumento del metabolismo de la glucosa en los tejidos, en particular de la glucólisis anaerobia, reducción de la gluconeogénesis hepática e inhibición de la absorción de glucosa, aminoácidos y otros compuestos a nivel intestinal. Tiazolidinedionas: sensibilizan o incrementan la acción de la insulina sin que aumente su secreción. Activan el receptor nuclear del proliferador activo de los peroxisomas (PPARγ), provocando un incremento de la transcripción de genes de enzimas que normalmente son inducidos por la insulina e intervienen en el metabolismo hidrocarbonado y lipídico. Por consiguiente, estos fármacos exigen la presencia de insulina ya que, en definitiva, van a facilitar o incrementar su acción al disponer de un sustrato enzimático más abundante. Inhibidores de α-glucosidasas: para que los carbohidratos de la dieta se absorban, deben ser hidrolizados en monohidratos en el tubo intestinal. La inhibición de las α-glucosidasas reducirá la formación de monosacáridos y, consiguientemente, la disponibilidad de la glucosa y otras hexosas para ser absorbidas en el intestino (Flórez et al., 1997). La diabetes y sus complicaciones tienen importantes consecuencias económicas para los pacientes, sus familias, los sistemas de salud y los países (OMS, 2006). Se ha

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demostrado que el costo de la atención médica de las personas con diabetes puede ser entre 2-3 veces mayor que el de la población no afectada por la diabetes (Asociación Latinoamericana de Diabetes, 2004). Por esta razón, podemos presumir que parte de la población afectada por la DM no podrá costear los medicamentos. Ante tal situación, toma importancia el uso de la medicina tradicional, al ofrecer una alternativa de bajo costo en la terapéutica antidiabética. De hecho, existen en el mundo numerosas plantas que son usadas tradicionalmente para el tratamiento de la diabetes (Navarro et al., 2004). En la búsqueda de nuevas alternativas hipoglicemiantes, Fuliang et al. (2005) realizaron un estudio para evaluar el efecto de própolis chino sobre los niveles sanguíneos de glucosa, lípidos y radicales libres en ratas diabéticas. Se determinó la concentración de fructosamina en suero. Fructosamina es un subproducto de la reacción entre la glucosa y la albúmina. Su concentración en el suero es relativamente constante y no se ve afectada por la dieta. Entonces, fructosamina refleja los cambios de la glucosa sanguínea por 2-3 semanas de forma similar

que la proteína

hemoglobina glicosilada. Los resultados mostraron que las ratas diabéticas tratadas con própolis tienen concentraciones inferiores de fructosamina en suero al ser comparadas con ratas diabéticas no tratadas. Esto demuestra que própolis puede controlar eficazmente la glucosa sanguínea por algún tiempo. Además, a partir de las concentraciones semanales de glucosa en sangre de ratas en ayuno se observó que própolis disminuye los niveles de glucosa sanguínea, lo que se vio amplificado con el tiempo (Fuliang et al., 2005).

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Por otro lado, en múltiples trabajos se ha demostrado que própolis es una fuente natural de antioxidantes, los que protegen a las lipoproteínas séricas de la oxidación. Sus propiedades antioxidantes se deben a su actividad antirradicalaria (radicales alcoxi y, en menor grado, superóxido) y al efecto inhibidor sobre el ión cuproso, iniciador de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (Farré et al., 2004). Claramente esta acción va en directo beneficio de quienes padecen DM, pues la oxidación hace más aterogénicas a las lipoproteínas de baja densidad (Beers y Berkow, 1999). El própolis es una resina cérea, de composición compleja y consistencia viscosa, que las abejas elaboran a partir de partículas resinosas de diferentes vegetales (Farré et al., 2004). Las abejas (Apis mellifera) recogen con sus mandíbulas las partículas resinosas de las yemas, brotes y pecíolos de las hojas de diferentes vegetales que, una vez en la colmena, mezclan con cera y secreciones salivares para obtener el própolis (Figura 2). Por su contenido en aceites esenciales, el própolis es muy aromático y en función de su origen botánico y de la época de recolección, difiere en color y sabor (Figura 3) (Farré et al., 2004). Su punto de fusión depende de la temperatura media de la zona, en sitios fríos es más baja y en zonas cálidas es más elevada (se mantiene duro a 25ºC), en general oscila entre los 60º y los 120ºC, teniendo por media unos 80ºC. Dentro de las colonias de abejas, el própolis desempeña un papel significativo, ya que asegura la perfecta pureza e higiene de la colmena; es utilizado por las abejas para sellar porosidades o aberturas, momificar a sus enemigos dentro de la colmena (ratones, mariposas, etc.), evitando propagación de gérmenes de putrefacción y como material constructivo al achicar la entrada en invierno (Farré et al., 2004; Huber, 1989).

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Figura 2. Recolección de resinas para

Figura 3. Própolis obtenido por raspaje

la elaboración del própolis.

desde la colmena.

Fuente: http://propolis-sana.com/

Fuente: Álbum personal.

espagnol/es_propolis.htm

Con respecto a su composición, el própolis está formado por más de 160 compuestos. Los metabolitos mayoritarios son del tipo fenólico, donde tenemos entre otros, flavonoides. También se ha detectado la presencia de ceras, lípidos, terpenos y bioelementos como Mn, Cu y Zn (Trease and Evans, 2002). Aunque claro, no se puede generalizar porque su composición varía en función de la vegetación del área en la que fue recolectado, de la especie de la abeja y del periodo de colecta (Russo et al., 2004; Neira et al., 2000). A pesar de esta variabilidad, se ha encontrado que la actividad biológica del própolis, especialmente su actividad contra microorganismos están siempre presentes en muestras de diversas zonas geográficas y climáticas. Así es como surge la pregunta si tendrán algún sentido los estudios biológicos realizados con muestras de própolis sin caracterización química. Recientemente casi cada publicación

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sobre la actividad biológica del própolis incluye una cierta caracterización química del própolis en estudio (Bankova, 2005). No obstante, debe señalarse que la mayoría de los estudios no pretenden determinar la composición química completa, sino tan sólo algunos componentes de interés, en especial los flavonoides (Farré et al., 2004). Por otra parte, si los compuestos activos no se conocen o están aún bajo discusión, el extracto total se considera como el “principio activo” (Bankova, 2005). El própolis es un producto de extraordinario interés para la medicina e industria farmacéutica, al que mediante numerosos estudios se le han demostrado versátiles actividades farmacológicas: antibacteriano, antifúngico, antiviral, antiinflamatorio, hepatoprotector,

antioxidante,

antitumoral,

inmunoestimulante,

antiprotozoario,

anestésico, regeneración tisular, etc. (Farré et al., 2004; Bankova, 2005). Algunas de estas actividades farmacológicas han sido adjudicadas a constituyentes específicos, como por ejemplo, la flavona pinocembrina es activa contra gran variedad de bacterias y hongos. En tanto, sus ácidos fenólicos tienen propiedades antidiabéticas e inhiben selectivamente las células tumorales del melanoma (López, 2004). La asociación con la galangina y los ácidos cafeico y ferúlico es, probablemente, responsable de la mayoría de sus propiedades biológicas (López, 2004). En veterinaria, su uso como estimulante del crecimiento animal, ha recibido poca atención; sin embargo, en aves se reporta una ganancia de peso (mayor del 20%), cuando se proporciona en la dieta a razón de 500 partes por millón (López, 2004).

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Debido a la gran cantidad de acciones farmacológicas atribuidas, el própolis se ha convertido en producto de intensos estudios farmacológicos y químicos en los últimos 30 años (Bankova, 2005). Sin embargo, su efectividad en medicina tradicional ya era reconocida desde los más remotos tiempos. Los sacerdotes del antiguo Egipto lo conocían como medicina y lo utilizaban como ungüento o crema para la momificación (Harnaj, 1975). El própolis era bien conocido por los antiguos griegos, hecho que se demuestra por el nombre griego de este producto (pro: delante y polis: ciudad) indica que para la colmena (la “ciudad” de las abejas) el própolis sirve como muralla de defensa. Aristóteles habla de él en su historia de animales y lo considera como "remedio para las infecciones de la piel, llagas y supuraciones". El famoso médico y filósofo persa Avicena, en su conocida obra “Canon de la Medicina”, también se refiere al própolis (Harnaj, 1975). Su máxima utilización se dio durante la Guerra de los Boers, en África del Sur, alrededor del año 1900, en el tratamiento de heridas infectadas y como sustancia cicatrizante (Harnaj, 1975). Debido a su elevada efectividad, su utilización se ha mantenido hasta llegar a nuestros días. La actividad hipoglicemiante adjudicada al própolis es relativamente nueva, razón por la cual, existe muy poca información al respecto. En Chile, no existen trabajos sobre el tema. Para aquellas personas que padecen diabetes, própolis surge como una nueva opción dentro de la medicina tradicional, pudiendo actuar como coadyuvante en el tratamiento de la diabetes mellitus. Pero en Chile, el própolis es considerado de limitado

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interés por los apicultores y muy poco se sabe de sus actividades biológicas y composición química (Astudillo et al., 2000). Entre los pocos trabajos en nuestro país, se cuenta un estudio realizado con própolis de la Región del Maule, en donde, Astudillo et al. (2000) lograron aislar 6 flavonoides y constataron la actividad antioxidante de dicho própolis. Sin embargo, no existe información sobre própolis de la zona sur (Región de Los Ríos). Los antecedentes antes descritos y la falta de estudios científicos que avalen el uso de própolis chileno como hipoglicemiante son factores que justifican la presente investigación, a fin de establecer el potencial benéfico de própolis en el tratamiento de la diabetes mellitus.

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2.1. Hipótesis

La administración oral del extracto etanólico de própolis resuspendido en agua produce una disminución de los niveles sanguíneos de glucosa en ratones diabéticos inducidos con aloxano. La administración oral del extracto etanólico de própolis resuspendido en agua produce una disminución de los niveles sanguíneos de glucosa en ratones normoglicémicos. El extracto metanólico, etanólico y acuoso de própolis posee actividad antioxidante.

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2.2. Objetivos

2.2.1. Objetivo general Caracterizar químicamente própolis del sur de Chile, determinar su capacidad atrapadora de radicales libres y evaluar su efecto sobre los niveles sanguíneos de glucosa en ratones normoglicémicos y en ratones diabéticos inducidos con aloxano.

2.2.2. Objetivos específicos 1. Recolectar el material vegetal mediante raspaje. 2. Obtener y fraccionar un extracto metanólico de própolis. 3. Obtener un extracto etanólico de própolis resuspendido en agua. 4. Identificar los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en el extracto metanólico de própolis. 5. Evaluar la actividad atrapadora de radicales libres del extracto metanólico, etanólico y acuoso de própolis. 6. Inducir diabetes en ratones mediante inyección intraperitoneal de aloxano. 7. Evaluar el efecto sobre los niveles sanguíneos de glucosa tras la administración oral del extracto etanólico de própolis resuspendido en agua en ratones normoglicémicos.

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8. Evaluar el efecto sobre los niveles sanguíneos de glucosa tras la administración oral del extracto etanólico de própolis resuspendido en agua en ratones diabéticos inducidos con aloxano. 9. Comparar el efecto sobre los niveles sanguíneos de glucosa del extracto etanólico de própolis resuspendido en agua con el de glibenclamida administrado a ratones normoglicémicos. 10. Comparar el efecto sobre los niveles sanguíneos de glucosa del extracto etanólico de própolis resuspendido en agua con el de glibenclamida administrado a ratones diabéticos inducidos con aloxano. 11. Realizar estudio histopatológico de cortes de riñón.

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3. Materiales y métodos

3.1. Materiales

Material vegetal •

Própolis procedente de Pichirropulli, 14ª Región en las coordenadas geográficas Latitud 40° 9'57.93"S; Longitud 72°53'43.68"O, recolectado en noviembre y diciembre del año 2006.

Instrumentos • Aparato de evaporación a presión reducida, marca Tamayo, modelo BM 100. • Microcentrífuga para microtubos, marca Eppendorf. • Equipo HPLC, marca Merck-Hitachi, modelo L-6200. •

Columna: RP 125-4.

• Espectrofotómetro Unicam, UV visible.

Material de Laboratorio •

Jaula para ratones

•

Dispensadores de agua

•

Sonda intragástrica con punta esférica

•

Jeringas tuberculina de 1 ml

•

Micropipetas Eppendorf, volumen variable

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•

Tips para micropipetas

•

Material de vidrio

•

Guantes de goma

•

Balanzas

•

Mechero

•

Tijera para disección

•

Papel filtro, Advantec MFS, Inc. Diametro 11 cm, N° 2

•

Baño de ultrasonido, marca Elma

•

Kitasato

Reactivos •

Aloxano® monohidrato. Sigma-Aldrich

•

Glibenclamida micronizada®. Laboratorio Reutter

•

Metanol p.a., (CH3OH) Merck

•

Diclorometano p.a., (CH2Cl2) Merck

•

Etanol p. a., (CH3CH2OH) Merck

•

Acetato de etilo p. a., (CH3CO2CH2CH3) Merck

•

Éter de petróleo p. a., Merck

•

Suero fisiológico (NaCl 0,9%)

•

Agua destilada

•

Sephadex LH-20

•

Sílica gel

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•

2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH˙), Sigma

Animales de laboratorio •

Ratones macho Mus musculus de la cepa Rockefeller.

Enzima • Kit enzimático para la determinación de glucosa en sangre y otros líquidos biológicos. Wiener Lab®.

3.2. Métodos

3.2.1. Recolección del material vegetal. El própolis fue recolectado mediante raspaje (Figura 4), desde colmenares del poblado de Pichirropulli, Región de Los Ríos.

Figura 4. Obtención de própolis mediante raspaje de una colmena. Fuente: http://www.elaguijonuruguay.com/html/Productos.html

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3.2.2. Purificación del própolis y obtención de fracciones activas La muestra de própolis obtenida por raspaje (508 g) se dejó macerar con metanol (750 ml x 6 veces) a temperatura ambiente por 24 horas. Por filtración se separaron los restos insolubles, donde se incluyen restos de planta, insectos y ceras. Del filtrado se obtuvo el extracto crudo metanólico, el que fue concentrado a presión reducida hasta obtener un jarabe. Este jarabe se resuspendió en una mezcla MeOH: H2O 1:1 y luego se fraccionó con distintos solventes orgánicos de polaridad creciente: éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo, respectivamente (Figuras 5, 6 y 7). Las fracciones obtenidas fueron concentradas a sequedad y se continuó trabajando con la que presentó mayor rendimiento, lo que correspondió a la fracción diclorometano (218,40 g, 42,99% de rendimiento). El extracto crudo y la fracción diclorometano fueron sometidos a la reacción de la cianidina

para la detección de flavonoides, la que

consiste en adicionar magnesio a disoluciones acuosas o alcohólicas de la muestra analizada en medio ácido, produciéndose coloraciones rojizas. Posteriormente, tanto el extracto crudo como la fracción diclorometano fueron evaluados por HPLC analítico. Paralelamente, la fracción diclorometano se cromatografió por columna flash utilizando como soporte sílica gel, obteniéndose 30 fracciones. Mediante cromatografía en capa fina se compararon las 30 fracciones, combinándose las de características similares, obteniéndose finalmente 9 fracciones. Por cromatografía en capa fina se determinó que las fracciones 6, 7 y 8 eran las fracciones de interés por presentar los metabolitos mayoritarios, las que fueron combinadas y repurificadas por permeación en columna Sephadex LH-20, obteniéndose 70 fracciones de aproximadamente 100 ml

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cada una. Se compararon por cromatografía en capa fina, combinándose las de características cromatográficas similares, obteniéndose finalmente 6 fracciones.

Figura 5. Extracción con éter de petróleo.

Figura 6. Extracción con diclorometano.

Figura 7. Extracción con acetato de etilo.

Fuente: Álbum personal.

Fuente: Álbum personal.

Fuente: Álbum personal.

El proceso de extracción y obtención de las distintas fracciones de própolis está representado en el esquema 1.

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Muestra (508 g) + MeOH 0,75 L × 6

Filtración

Restos MeOH-insolubles (insectos, ceras, hojas, etc)

Fracción MeOH-soluble

Extracto Metanólico jarabe

Concentrar

Resusp. MeOH:H2O 1:1

Fraccionamiento con S.O. polaridad creciente (EP, DCM y EtOAc) Fracción EP + Fracción DCM + Fracción EtOAc

(Se utilizó el extracto con mayor rendimiento)

Fracción DCM HPLC analítico Cromat. columna sílica flash 30 fracciones

Cromat. en capa fina Columna flash fr. 1-9 Columna flash Fr. 6/8

Cromat. columna Sephadex LH-20

70 fr.

Cromat. en capa fina Flash 6/8 Sephadex Fr. 1- 6

Esquema 1: Esquema de extracción y fraccionamiento de própolis

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3.2.3. Ensayo de actividad antioxidante “in vitro”. Decoloración del radical libre DPPH. El ensayo de decoloración de DPPH· se fundamenta en que el radical 2,2-difenil-1picril hidrazilo hidratado (DPPH˙) de color violeta intenso, al ser capturado por compuestos atrapadores de radicales libres forma un compuesto estable incoloro. Con esto, es posible cuantificar la capacidad capturadora de radicales libres que poseen distintas sustancias mediante la determinación del grado de decoloración que dichos compuestos provocan a una solución metanólica de DPPH· (Pedrasa, 2004). Para determinar la capacidad antioxidante del própolis, se prepararon distintos extractos de la materia prima por maceración con metanol (MeOH) y etanol (EtOH) durante 24 horas. El extracto acuoso se obtuvo por decocción con agua destilada a 80ºC por 12 horas. Posteriormente, todos estos extractos fueron filtrados y llevados a sequedad. Para evaluar la capacidad atrapadora de radicales libres del própolis se utilizó una solución metanólica recién preparada del radical DPPH· a una concentración de 20 mg/L. Se prepararon soluciones metanólicas de extractos metanólico, etanólico y acuoso de própolis en una concentración de 1 mg/mL. Se mezclaron volúmenes de DPPH· y soluciones de la muestra para luego de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos leer la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda 517 nm de acuerdo al siguiente protocolo:

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Muestra

Blanco

Muestra (μL)

750

0

DPPH· (μL)

1500

1500

Metanol (μL)

0

750

2250

2250

Vol. Total (μL)

Cada determinación se realizó por quintuplicado. El cálculo del porcentaje de decoloración (capacidad atrapadora de radicales libres), se determinó utilizando la siguiente fórmula:

% Decoloración = [1-(Abs compuesto/ Abs blanco)] x100

De aquí, un valor igual a 100 corresponde a la máxima capacidad atrapadora de radicales libres y un valor cercano a cero indica una nula capacidad, por lo que el grado de decoloración indicará la eficiencia del própolis como capturador de radicales libres.

3.2.4. Actividad hipoglicemiante Recientemente, se han publicado trabajos atribuyendo actividad hipoglicemiante al própolis, destacandose el de Fuliang y colaboradores (2005) con própolis recolectado en China, en el que tras ocho semanas de administración de extractos acuosos y etanólicos de própolis se confirmó su acción hipoglicemiante. Sin embargo, en el mundo hay muy pocas investigaciones sobre el tema, no existiendo ninguna en Chile.

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3.2.4.1. Inducción de diabetes mellitus en ratones La experimentación animal tiene una larga historia en el campo de la investigación de la diabetes (Rees, 2005). Esto se fundamenta en que existe mucha semejanza en las manifestaciones clínicas y metabólicas de la diabetes experimental y la diabetes humana (Roca y Plá, 1963). La inducción de la diabetes experimental usando productos químicos que destruyen selectivamente las células β pancreáticas es muy conveniente y simple de utilizar. Por esta razón, el aloxano (Figura 8) se utiliza extensamente para inducir diabetes experimental en animales (Szkudelski, 2001).

Figura 8. Estructura química del aloxano. Fuente: http://www.axxora.com/obesity__diabetes_other_ products-LKT-A4547/opfa.1.1.LKT-A4547.1638.4.1.html

La inducción de la diabetes mellitus en el ratón, se realizó mediante una inyección intraperitoneal de aloxano al 2% en suero fisiológico, en una dosis de 250 mg/kg. El aloxano (2,4,5,6-tetraoxipirimidina) y el producto de su reducción, ácido dialúrico, establecen un ciclo redox con la formación de radicales superóxido. Estos

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radicales experimentan una dismutación a peróxido de hidrógeno. Luego, los radicales hidroxilos altamente reactivos son formados por la reacción de Fenton. La acción de la especie oxígeno reactiva junto a un aumento masivo y simultáneo en la concentración citosólica de calcio causa la destrucción rápida de las células β del páncreas (Figura 9) (Szkudelski, 2001). Los fenómenos consecutivos a la inyección del aloxano pasan por tres fases y se traducen en oscilaciones del perfil glicémico. En las primeras cuatro horas inmediatas a la inyección, se comprueba un aumento de la glicemia que es seguido en la segunda fase por un descenso progresivo y prolongado de la misma. En la tercera fase se manifiestan los signos de la diabetes: hiperglicemia, glucosuria, cetosis, los cuales se completan, en general, después de las 48 horas de la inyección de aloxano (Roca y Plá, 1963). El aloxano afecta directa y selectivamente las células β y sólo cuando se emplean dosis excesivas o repetidas produce lesiones en otros órganos, especialmente en el hígado y en el riñón (Roca y Plá, 1963).

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Figura 9.

Mecanismo de generación de la especie oxígeno reactiva inducida por

aloxano en las células β del páncreas. respectivamente;

GKa, GKi - glucokinasa activa e inactiva,

HA• - radicales aloxano;

[Ca2+]i - concentración intracelular del

calcio (Szkudelski, 2001).

El diagnóstico de la diabetes se confirma mediante la determinación de la glicemia. En este estudio se utilizó la glicemia casual (tomada en cualquier momento) y los parámetros bioquímicos para ésta consideran valores inferiores a los 140 mg/dl para la normoglicemia e iguales o superiores a los 200 mg/dl para la diabetes (con signos y síntomas clásicos) (Robbins y Cotran, 2005; Gaw et al., 2001).

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3.2.4.2. Preparación y administración del extracto de própolis. El extracto etanólico de própolis se preparó a partir de una muestra cruda de própolis (40 gramos) obtenida mediante raspaje. Esta se disolvió en etanol y se dejó macerar por 2 horas. El extracto etanólico se filtró para separar los restos insolubles y fue llevado a sequedad en un aparato de evaporación a presión reducida (Figura 10), obteniéndose 24 gramos. El rendimiento de extracción fue 60%. Al extracto seco se le adicionó agua y se llevó al baño de ultrasonido, para obtener una suspensión acuosa de extracto etanólico de própolis de concentración 10 mg/ml. La administración del extracto de própolis se realizó por medio de una sonda intragástrica de acero inoxidable, de forma curva y con punta esférica (Figura 11).

Figura 10. Rotavapor con extracto etanólico en su interior. Fuente: Álbum personal.

Figura 11. Administración de extracto. Fuente: Álbum personal.

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3.2.4.3. Evaluación del efecto hipoglicemiante de própolis. Para la realización de este estudio se utilizaron ratones macho Mus musculus de la cepa Rockefeller provenientes del bioterio del Instituto de Inmunología de la Universidad Austral de Chile, de dos meses de edad y peso mayor a 30 gramos. Se les permitió libre acceso al agua y alimento durante todo el estudio. Fueron mantenidos a temperatura ambiente (alrededor de 20 ºC), bajo un ciclo de 12/12 horas de luz/oscuridad. Para evaluar el efecto hipoglicemiante del extracto etanólico resuspendido en agua de própolis se trabajó con un total de 57 ratones divididos en 7 grupos, a los que se les constató su estado normoglicémico antes de iniciar el estudio. A cuatro grupos de ratones se les indujo diabetes con aloxano, dos de estos grupos fueron tratados con extracto etanólico de própolis resuspendido en agua, a dosis de 100 y 200 mg/kg para evaluar el efecto hipoglicemiante, al tercero se le administró suero fisiológico para ser utilizado como control diabético y el cuarto fue tratado con glibenclamida 2 mg/kg como control positivo. De los tres grupos de ratones sanos, uno se trató con própolis, otro con suero fisiológico como control sano y al último se le administró glibenclamida 2 mg/kg. Semanalmente se evaluó la glicemia de todos los grupos, comprendiendo 2 muestreos previos al inicio del tratamiento con extracto etanólico de própolis y 8 una vez iniciado el tratamiento con éste extracto.

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Al final del estudio, los animales se sacrificaron y se dispusieron en cumplimiento de la reglamentación del Comité de Bioseguridad y Bioética de la Universidad Austral de Chile. Los grupos en estudio se definieron como sigue: •

Control Sano: grupo de ratones normoglicémicos, se les administró suero fisiológico por vía intragástrica diariamente.

•

Sano P100: grupo de ratones normoglicémicos, se les administró extracto etanólico de própolis resuspendido en agua (100 mg/kg) por vía intragástrica diariamente.

•

Sano Glib: grupo de ratones normoglicémicos, se les administró glibenclamida (2 mg/kg) por vía intragástrica diariamente.

•

Control Diabético: grupo de ratones diabéticos inducidos con aloxano, se les administró suero fisiológico por vía intragástrica diariamente.

•

Diabético P100: grupo de ratones diabéticos inducidos con aloxano, se les administró extracto etanólico de própolis resuspendido en agua (100 mg/kg) por vía intragástrica diariamente.

•

Diabético P200: grupo de ratones diabéticos inducidos con aloxano, se les administró extracto etanólico de própolis resuspendido en agua (200 mg/kg) por vía intragástrica diariamente.

•

Diabético Glib: grupo de ratones diabéticos inducidos con aloxano, se les administró glibenclamida (2 mg/kg) por vía intragástrica diariamente.

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3.2.4.4. Determinación de glucosa sanguínea. Para la determinación de la glicemia, se obtuvo una muestra de sangre, mediante una incisión en una de las cuatro venas (dilatadas por calor) de la cola de los ratones. La muestra se recolectó en microtubos (Figura 12) y luego se centrifugó a 2000 r.p.m. por 10 minutos para obtener el suero y determinar la glucosa sanguínea (Figura 13).

Figura 12. Recolección de sangre en un microtubo.

Figura 13. Microcentrífuga con microtubos en su interior.

Fuente: Álbum personal.

Fuente: Álbum personal.

El método utilizado para la determinación de glucosa sanguínea fue el de glucosa oxidasa/peroxidasa (GOD/POD). Este método se basa en que la glucosa oxidasa actúa directamente sobre el sustrato (glucosa) originando ácido glucónico y peróxido de hidrógeno. Este último, por acción de la peroxidasa, libera un oxígeno el cual interactúa con un aceptor de oxígeno, dando lugar a un cromógeno que puede cuantificarse fotométricamente y cuya absorbancia es directamente proporcional a la concentración de glucosa (Instituto de Bioquímica, 2006). Los fundamentos del método están representados en el esquema 2.

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Esquema 2: Fundamentos del método de determinación de glucosa sanguínea.

La determinación de glucosa se hizo utilizando el respectivo kit de diagnóstico clínico Wiener Lab®. La reacción enzimática se llevó a cabo en cubetas transparentes, con un camino óptico de 10 mm y la absorbancia del complejo coloreado se determinó en espectrofotómetro a una longitud de onda de 505 nm.

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3.2.5. Estudio Histopatológico Se utilizaron cortes de riñón de ratones de los distintos grupos en estudio. La observación de órganos se realizó mediante microscopía óptica y tinción de hematoxilina-eosina con el fin de observar la existencia de cambios a nivel celular y confirmar la existencia de daño. Esta tinción resulta conveniente ya que la hematoxilina colorea los núcleos celulares y la eosina permite evidenciar componentes y orgánulos citoplasmáticos. El proceso de corte, fijación y teñido se realizó en el Instituto de Histología y Patología de la Universidad Austral de Chile. La observación histopatológica se realizó en la unidad de nefrología del Hospital Clínico Regional Valdivia.

3.2.6. Análisis Estadístico Los datos obtenidos se analizaron usando estadística descriptiva, para lo cual se utilizó test de Kruskal-Wallis, donde un nivel de probabilidad de p